SK83995A3

SK83995A3 - New peptides

Info

Publication number: SK83995A3
Application number: SK839-95A
Authority: SK
Inventors: Peter Schiller
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1993-01-05
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 1996-09-04
Also published as: LV10962A; CN1096515A; EP0678099A1; SI9400005A; SE9300012D0; NO952650D0; EE9400326A; AP9400605A0; CZ171195A3; CA2152380A1; HUT72597A; NO952650L; AP508A; FI953302A0; FI953302A; AU5844894A; LV10962B; JPH08505386A; MX9400255A; AU681372B2

Description

Sú opísané zlúčeniny všeobecného vzorca (I), spôsob ich výroby, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sú vhodné v terapii, zvlášť ako analgetiká a prípravky znižujúce imunitu. R³, R⁴, R⁵ a R⁶ znamenajú vždy H alebo R⁴ a R⁵ znamenajú obidva H a R³ a R⁶ obidva znamenajú nižšie alkylové skupiny alebo R³, R⁵ a R⁶ znamenajú vždy H a R⁴ predstavuje F, Cl, Br, OH, NH2 alebo NO2, R⁷ znamená C=O alebo CH2, R⁸ znamená H alebo nižšiu alkylovú skupinu, R⁹ znamená rôzny aromatický alebo heterocyklický substituent. R¹¹ znamená OH, NH2 alebo IX, kde R¹² predstavuje H, NO2, F, CL, Br alebo I, m predstavuje 0 až 2, R¹³ znamená COOH, CONH2, CH2OH alebo ľubovoľný ďalší aminokyselinový alebo peptidový reťazec alebo R¹¹ znamená X, kde R¹⁴ znamená COOH, CONH2, CH2OH alebo ľubovoľný ďalší aminokyselinový alebo peptidový reťazec, s podmienkou, že sú vylúčené zlúčeniny, kde R¹, R², R, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸ znamenajú vždy H.

Ρν Γ39-?Γ

Nové peptidy

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka novej skupiny opioidových analógov peptidov, ktoré· sú δ opioidovými receptorovými antagonistami, rovnako ako spôsob ich syntézy a ich použitia ako analgetických zlúčenín a zlúčenín znižujúcich imunitu.

Doterajší stav techniky

Známy nepeptidový δ opioidový antagonista je naltrindol; ktorý popísal P. S. Portoghese a kol. v J. Med. Chem. 31, 281-282 /1988/. Natrindol má podobnú δ-antagonistickú účinnosť, ako zlúčeniny podlá tohto vynálezu, ale je omnoho menej δ-selektívny. Okrem toho naltrindol má tiež úplne vysokú μ opioidovu receptorovu afinitu (K^ - 12 nmol) pri teste- viazania receptora a má silné antagonistické vlastnosti (Κθ = 29 nmol) pri testovaní ilea morčaťa, porov. P. S. Portoghese a kol., J. Med. Chem. 34., 1757-1762 /1991/.

Iný známi δ-antagonista je enkefalinový analóg N,N-dialyl-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH (ICI 174864), ktorý popísal

R. Cotton a kol. v Eur. J. Pharmacol. 97, 331-332 /1984/. V porovnaní s δ-antagonistami popísanými v tomto patente je ICI 174864 omnoho menej δ-selektívny (desaťkrát až tristokrát menej ) a má omnoho menšiu antagonistickú účinnosť pri teste sťahov semenovodu myši (MVD) (štyridsaťkrát až tisíckrát menej účinný).

Tetrapeptidy, ktoré sú účinnými δ-antagonistami, nedávno uviedol P. W. Schiller a kol. vo FASEB J. 6 (č. 4), A 1575 /1992/ na stretnutí pri International Narcotics Research Conference (INRC), Keystone, CO (USA), konanom v dňoch 24. až 29.6. 1992 a na 2. japonskom sympóziu o chémii peptidov, Shizuoka (Japonsko), konanom od 9. do 13. novembra 1992.

Podstata vynálezu

Neočakávane teraz bolo vynájdené, že zlúčeniny ďalej uvedeného všeobecného vzorca I sú

- mimoriadne selektívne pre δ-receptory,

- majú vysoký účinok ako δ- anfagonisti,

- prejavujú celkový nedostatok μ antagonistických vlastností a

7- v niektorých prípadoch majú zmiešané μ-agonistické a δ-antagonistické vlastnosti (TIPP analógy s C-koncovou karboxamidovou skupinou).

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu majú všeobecný vzorec I

v ktorom

znamená atóm vodíka, skupinu vzorca CH₃(CH₂)_n, kde n predstavuje číslo 0 až 12, skupiny vzorca CH₂CH₂

ch₂-ch=ch₂

alebo arginín,

R²	znamená atóm vodíka, skupinu vzorca CH₂(CH₂)_n, kde n predstavuje čílo 0 až 12, alebo skupinu vzorca CH₂, CH₂—, ch₂-ch=ch₂,
R³, R⁴, R⁵ a R⁶	znamenajú vždy atóm vodíka a
- R⁴ a R⁵	znamenajú obidva atóm vodíka a
< R³ a R⁶	znamenajú obidva nižšie alkylové skupiny alebo
R³, R⁵ a R⁶	znamenajú vždy atóm vodíka a
R⁴	predstavuje atóm fluóru, chlóru alebo brómu, hydroxyskupinu, aminoskupinu alebo nitroskupinu,
R⁷	znamená skupinu vzorca C=0 alebo metylénovú skupinu,
R⁸	znamená a'ťóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu,
R⁹	znamená skupinu vzorca (^CH ₂)m-CH kde m predstavuje číslo 0 až 2, alebo skupiny vzorca f~\ ^H \ / ^N ch₂-ch

dl-tbo

kde R¹⁰ znamená atóm vodíka, fluóru, chlóru, brómu alebo jódu a m predstavuje číslo 0 až 2,

	R¹¹	znamená hydroxyskupinu, aminoskupinu alebo
-		skupinu vzorca	1
w			. 13
		-O	R
ŕ		\| ~(CH₂)m^—CH — NH
		\=J

kde R¹² predstavuje atóm vodíka, nitroskupinu, atóm fluóru, chlóru, brómu alebo jódu, m predstavuje číslo 0 až 2,

t.

π o ,

R^XJ znamena skupinu vzorca COOH, CONH₂, CH₂OH alebo ľubovoľný ďalší aminokyselinový alebo pepticový reťazec alebo

R¹¹ znamená skupinu vzorca

CH₂~CH

NH kde R¹⁴ znamená skupinu vzorca COOH, CONH₂,

CH₂OH alebo ľubovoľný ďalší aminokyselinový alebo peptidový reťazec s podmienkou, že sú vylúčené zlúčeniny, kde R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸ znamenajú vždy atóm vodíka, R⁷ znamená

karbonylovú skupinu, predstavuje skupinu vzorca

R¹¹ ŕ

znamená Phe-OH, Phe-NH₂, OH alebo NH₂.

Nižšia alkylová skupina obsahuje podlá tohto popisu od 1 do 6 atómov uhlíka. Mimoriadne výhodné zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú zlúčeniny, kde R⁷ znamená skupinu vzorca CH₂ (ako časť redukovanej peptidovej väzby). Redukovaná peptidová väzba poskytuje zlúčeniny o vyššom δ-antagonistickom účinku, zvýšenej δ-selektivite, lepšej stabilite v organických rozpúšťadlách a odolnosti voči enzymatickej degradácii.

Ďalšie výhodné zlúčeniny poddľa tohto vynálezu sú zlúčeniny, kde R⁴ a R⁵ predstavujú atóm vodíka a R³ a R⁶ znamenajú oba metylovú skupinu.

Syntéza

Väčšina Boc-aminokyselinových derivátov používaných pri syntéze peptidov je komerčne dostupná. 2,6-Dimetyltyrozín (Dmt) sa vyrába ako popísal J. H. Dygos a kol., Synthesis 8, 741-743 /august 1992/ a kyselina 2-aminotetralin-2-karboxylová sa vyrába ako popísal P. W. Schiller a kol. v J. Med. Chem. 34, 3125-3132 /1991/.

Všetky peptidy sa vyrábajú technickým postupom na tuhej fáze. Zvyčajná živica z polystyrénu/divinylbenzénu sa používa na syntézu peptidov s volnou karboxylovou skupinou na koncovom atóme uhlíka uskutočňovanou na tuhej fáze, zatiaľ čo peptidamidy sa syntetizujú za použitia p-metylbenzhydrylaminovej živice.

Boe ochrana aminoskupiny sa používa pri výrobe všetkých peptidov. Syntéza sa uskutoční podlá zaznamenaného pracovného postupu, ktorý sa rozsiahle používa v laboratórií pôvodcov (P. W. Schiller a kol., Biochemistry 16, 1831-1832 /1977/). Kondenzácia sa uskutočňuje v dichlórmetáne alebo v dimetylformamide a za použitia- dicyklohexylkabodiimidu/l-hydroxybenzotriazolu (DCC/HOBt) ako kondenzačných činidiel. Úplnosť kondenzácie sa starostlivo skúša po každom kondenzačnom stupni pomocou ninhydrínového farebného testu. Úplne zostavený peptidový reťazec sa • odštiepi od živice a úplne sa zbaví chrániacich skupín spracovaním s kvapalnou kyselinou fluorovodíkovou pri teplote 0 °C v s prítomnosti anizolu ako zachytávacieho prostriedku (počas 60 až minút).

Analógy obsahujúce CH₂NH peptidovo viazané izostéry sa vyrábajú syntézou na tuhej fáze spôsobom, ktorý vyvinul Sasaki a Coy (Y. Sasaki a D. H. Coy, Peptides 8, 119-121 /1987/). Týmto spôsobom sa CH₂NH peptidová väzba môže priamo zaviesť reduktívnou alkylačnou reakciou medzi aldehyd Boc-aminokyseliny a aminoskupinu na peptide viazanom k živici, za použitia nátriumkyánbórhydridu v okyslenom dimetylformamide. Pri tomto spôsobe sa nepozoruje žiadna významná racemizácia. Boc-Tic aldehyd sa syntetizuje cez zodpovedajúci Boc-Tic-N-Metoxy-N-metylamid redukčnou metódou využívajúcou lítiumalumíniumhydrid, ktorá ako je uvedené, je ušetrená racemizácie (J. A. Fehrentz a B. Castro, Synthesis, 676-678 (1983/). Peptidy obsahujúce redukované peptidové väzby sa odštepujú od živice a zbavujú chrániacich skupín a spracovaním s kyselinou fluorovodíkovou a anozilom, ako je popísané vyššie.

Surový peptid získaný syntézou peptidov na tuhej fáze vyžaduje rozsiahle čistenie rôznymi chromatografickými postupmi kyselinou fluorovodíkovou a zvyčajným spôsobom gelová (G-15 alebo G-25). Rôzne zahrňujú chromatografické

G-25 (za použitia rôznych kyseliny octovej, pyridínu a alebo inými metódami. Po štiepení extrakcii živice sa uskutoční filtrácia na živici Sephadex nasledujúce stupne čistenia rozdelovanie na živici Sephadex dvojfázových systémov z butanolu, vody), ionomeničovou chromatografiou (DEAE-Sephadex, SP-Sephadex a CM-celulóza) a chromatografiou s reverznou fázou v kolóne naplnenej oktadekasilyl-silikou, za použitia lilneárneho gradientu metanolu v 1 % kyseline trifluóroctovej (nízky tlak). Ak je potrebné, konečné čistenie na dosiahnutie homogenity sa uskutoční semipreparatívnou vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou. Používajú sa semipreparatívne kolóny μ-Bondapak C-18 (Waters, 0,7 x 25 cm), ktoré v závislosti na problémoch delenia, dovoľujú čistenie 2 až 20 mg peptidového materiálu na pokus. Používajú sa jednotlivé vysoko selektívne a účinné analytické metódy na doloženie homogenity vyrábaných peptidov a overenie ich štruktúry. Na stanovenie čistoty sa používa chromatografía na tenkej vrstve v najmenej dvoch rozdielnych rozpúšťadlových systémoch. Okrem toho sa zvyčajne používa v laboratóriu analytická vysoko účinná kvapalinová chromatograf ia vo dvoch alebo v troch rozdielnych systémoch rozpšťadiel, rovnako ako vysoko citlivý test na čistotu. Overenie peptidovej štruktúry je hlavne založené na analýze aminokyselín a hmotnostnej (FAB-MS). Na v 6-normálnej spektrometri! s bombardovaním rýchlymi atómami hydrolýzu aminokyselín sa peptidy hydrolyzujú kyseline chlorovodíkovej, ktorá obsahuje malé množstvo fenolu, pri teplote 110 C počas 24 hodín v deaeratovaných skúmavkách (v niektorých prípadoch hydrolýza trvajúca počas 12 a 48 hodín sa tiež uskutočňuje, aby sa dosiahol určený rozsah degradácie aminokyselín). Hydrolyzáty sa analyzujú na prístroji na analýzu aminokyselín Beckman Model 121 C, ktorý je vybavený počítačovým integrátorom AA. Hmotnostné spektrometrie FAB sa používajú na stanovenie správnej molekulovej hmotnosti peptidov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklady určitých analógov

Príklad 1

Spôsob výroby H-Tyr-Tic-Hfe-Phe-OH g (0,61 mmol Boc-Phe/g živica, Peninsula, Belmont, Kalifornia, USA) Boc-Phe-O-živica sa premyje reakčnými činidlami v nasledujúcom poradí: dichlórmetán (3 x 1 min), objemovo 50 % kyselina trifluóroctová v dichlórmetáne (30 min), dichlórmetán (5x1 min), objemovo 10 % diizopropyletylamín v dichlórmetáne (2x5 min), dichlórmetán (5 x 1 min). Potom sa kondenzuje 425 mg (1,52 mmol) Boc-Hfe-OH za použitia 205 mg (1,52 mmol)

1-hydroxybenzotriazolu a 313 mg (1,52 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu v dichlórmetáne a v dimetylformamide (v objemovom pomere 3 : 1) počas 17 hodín. Živica sa potom premýva dichlórmetánom (3x1 min), etanolom (1 min) a dichlórmetánom (3x1 min). Tento reťazec sa premyje a reakcia sa opakuje pre adíciu každého zvyšku s týmito úpravami;

Po kondenzácii Boc-Tic-OH sa živica trikrát premyje zmesou dichlórmetánu a dimetylformamidu v objemovom pomere 3:1. Opätovný kondenzačný stupeň za použitia rovnakého množstva Boc-Tic-OH, 1-hydroxybenzotriazolu a dicyklohexylkarbodiimidu v zmesi dichlórmetánu a dimtylformamidu o objemovom pomere 3 : 1 sa uskutočňuje ďalších 17 hodín. Rovnaký opätovný kondenzačný stupeň sa tiež uskutočňuje ku kondenzácii Boc-Tyr(Boc)-OH. Po konečnom odstránení chrániacich skupín objemové 50 % kyselinou triflúóroctovou v dichlórmetáne (30 min) sa živica premyje dichlórmetánom (3 x 1 min) a etanolom (3 x 1 min) a vysuší v exikátore. Suchá živica sa potom spracováva s 20 ml kyseliny fluorovodíkovej a 1 ml anizolu najskôr za teploty 0 “C počas 90 minút a potom za teploty miestnosti počas 15 minút. Po odparení kyseliny fluorovodíkovej sa živica trikrát extrahuje dietyléterom a potom trikrát 7 % kyselinou octovou. Surový peptid sa potom získa v tuhej forme lyofilizáciou spojených extraktov v kyseline octovej.

Peptid sa čistí gélovou filtráciou za použitia kolóny naplnenej živicou Sephadex G-25 v 0,5-normálnej kyseline octovej, s nasledujúcou chromatografiou s reverznou fázou v kolóne naplnenej oktadekasilyl-silikou s lineárnym gradientom 0 až 80 % metanolu v 1 % kyseline triflóroctovej. Potom ako sa rozpúšťadlo odparí, surový peptid sa rozpustí v koncentrovanej kyseline octovej a lyofilizáciou sa dosiahne tuhá forma.

Výťažok činí 45 mg.

FAB-MS: MH⁺ = 648.

I

Chromátografia na tenkej vrstve (oxid kremičitý):

R_f 0,75, zmes n-butanolu, kyseliny octovej a . vody v pomere

4:5:1 (organická fáza),

Rf 0,70, zmes n-butanolu, pyridínu kyseliny octovej a vody v pomere 15 : 10 : 3 : 12.

Analýza aminokyselín: Tyr 0,96, Hfe 1,03, Phe 1,00.

Príklad 2

Spôsob výroby H-Tyr-TicHCI^-NHjPhe-Phe-OH

Syntéza tohoto peptidu sa uskutočňuje ako v príklade 1 za použitia rovnakej živice s tým rozdielom, že zavedením redukovanej peptidovej väzby medzi zvyšky Tie² a Phe³ vyžaduje redukčnú alkylačnú reakciu medzi Boc-Tic aldehydom a aminoskupinou z dipeptidu H-Phe-Phe viazaného na živicu.

Spôsob výroby N-terc.-butoxykarbonyl-L~l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-aldehydu (Boc-Tic aldehyd) cez N-terc.-butoxykarbonyl-L-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-N-metoxy-N-metylamid

3,48 g (lOmmol) benzotriazo-l-yloxytris (dimetylamino) f osfóniumhexafluórfosfátu (BOP) sa pridá k miešanému roztoku

2,8 g (10 mmol) Boc-Tic-OH a 1,33 ml (10 mmol) trietylamínu v dichlórmetáne. Po 5 minútach sa pridá roztok 1,2 g (12 mmol) hydrochloridu dimetylhydroxylamínu a 1,68 ml (12 mmol) trietylamínu. Reakcia sa uskutočňuje počas 17 hodín. Potom sa reakčná zmes zriedi dichlórmetánom a premyje 3-normálnou kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného. Organická vrstva sa vysuší síranom horečnatým predtým, ako sa rozpúšťadlo odparí. Výsledná surová látka, N-terc.-butoxykarbonyl-L-

1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-N-metoxy-N-metylamid, sa čistí chromatograficky na stĺpci silikagélu a za použitia zmesi etylacetátu a hexánu v objemovom pomere 1:2.

	Výťažok činí 2,1 g (65 %	teórie), olej. ,
	Chromatografia na tenkej	vrstve (oxid kremičitý)
^Rf	0,57, zmes etylacetátu a	hexánu v pomere 1:1,
^Rf	0,30, zmes etylacetátu a	hexánu v pomere 1 : 2
	NMR (CDC1₃) δ 1,45 (91	[, terc.-butyl) , 3,00	(2H,	H-4) ,
3,18	(3H, NCH₃), 3,8 (3H,	OCH₃), 4,42-4,90	(3H,	2H-1

a 1H-3), 7,17 (4H, ar) ppm.

K miešanému roztoku 1,2 g (4 mmol) N-terc.-butoxykarbonylL-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-N-metoxy-N-metylamidu v 30 ml éteru sa pridá 190 mg (5 mmol) lítiumalumíniumhydridu. Redukčná reakcia sa uskutočňuje počas 1 hodiny a reakčná zmes sa potom hydrolyzuje roztokom 954 mg (7 mmol) hydrogénsíranu draselného v 20 ml vody. Potom sa vodná fáza oddelí a trikrát extrahuje vždy podielmi 50 ml éteru. Štyri organické fázy sa spoja, premyjú 3-normálnou kyselinou chlorovodíkovou, nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a nasýteným vodným roztokom chloridu sodného. Nakoniec sa reakčná zmes vysuší síranom horečnatým. Po odparení rozpúšťadla sa získa aldehyd v čistej forme, ktorú tvorí olej.

Výťažok činí 635 g (60 % teórie), olej.

Chromatografia na tenkej vrstve (oxid kremičitý): Rf 0,84, zmes etylacetátu a hexánu v pomere 1:1,

Rf 0,57, zmes etylacetátu a hexánu v pomere 1 : 2

NMR (CDC1₃) δ 1,5 (9H, terc.-butyl), 3,00 - 3,27 (2H,

H-4), 4,4 - 4,8 (3H, 1H-3 a 2H-1), 7,0 - 7,2 (4H, ar), 9,43 (1H, CHO) ppm.

Redukčná alkylačná reakcia medzi Boc-Tic-aldehydom a H-Phe-Phe-O-živocou

Živica sa premyje dimetylformamidom (2x1 min) a potom sa k živici pridá 392 mg (1,52 mmol) Boc-Tic-aldehydu v dimetyloformamide, ktorý obsahuje 1 % kyseliny octovej. Potom sa po častiach pridá 115 mg (1,83 mmol) nátriumkyánbórhydrydridu v priebehu 40 minút a reakcia sa nechá pokračovať 3 hodniny.

Po kondenzácii N-koncového tyrozinového zvyšku a odstránení chrániacej skupiny sa peptid odštiepi od živice, čistí a lyofilizuje, ako je popísané v príklade 1.

Výťažok činí 180 mg.

FAB-MS: MH⁺ = 633.

Chromatografia na tenkej vrstve (oxid kremičitý):

Rf 0,73, zmes n-butanolu, kyseliny octovej a vody v pomere

4:1:5 (organická fáza),

R_f 0,69, zmes n-butanolu, pyridínu, kyseliny octovej a vody v pomere 15 : 10 : 3 : 12.

Analýza aminokyselín: Tyr 0,95, Phe 1,00.

Ďalej uvedené zlúčeniny podlá tohto vynálezu sa syntetizujú a testujú ako antagonisti.

Farmakologické testovanie δ-opioidových antagonistov in vitro

a) Biologické testovanie je založené na inhibícii elektricky vyvolaných sťahov myšieho semenovodu (MVD) a ilea morčaťa (GPI). Pri testovaní ilea morčaťa je účinnosť opioidov primárne sprostredkovaná μ-opioidovými receptormi, zatial čo pri testovaní sťahov myšieho semenovodu inhibícia sťahov je väčšia v dôsledku interakcie s δ-opioidovými receptormi. Antagonistické účinnosti pri týchto testoch sa vyjadrujú ako takzvaná hodnota Κθ (H. W. Kosterlitz a A. J. Watt, Br. J. Pharmacol. 33 , 266-276 /1968/). Agonistické účinnosti sa vyjadrujú ako hodnoty IC_5Q (koncentrácia agonistov, ktorá vytvára 50 % inhibície elektricky vyvolaných sťahov).

I

Biologické skúšky izolovaných orgánových preparátov

Biologické testovanie sťahov ilea morčaťa (GPI) a myšieho semenovodu (MVD) sa uskutočňuje, ako popísal P.W . Schiller a kol, Biochem. Biophys. Res. Commun 85, 1332-1338 /1978/ a J.Di Maio a kol., J. Med. Chem. 25, 1432-1438 /1982/. Logaritmická krivka dávka-odozva sa stanoví s [Leu⁵]enkefalínom ako štandardom pre každý preparát z ilea a semenovodu a hodnoty IC₅₀ zlúčenín určených na testovanie sa normalizujú, ako popísal A. A. Waterfield a kol. v Eur. J. Pharmacol 58, 11-18 /1979/. Hodnoty Κθ pre TIPP príbuzné antagonisty sa určia z pomeru hodnôt IC₅₀ (DR) získaných v prítomnosti a neprítomnosti pevných koncentrácií antagonistov (a) [Κθ = a/(DR-l)] (H. W. Kosterlitz a A. J. Watt, Br. J. Pharmacol 33., 266-276 /1968/). Tieto stanovenia sa uskutočňujú testovaním sťahov myšieho semenovodu za použitia troch rozdielnych δ-selektívnych agonistov ([Leu⁵]enkefalínu, DPDPE a [D-Ala²]deltorfínu I).

V nižšie zaradenej tabuľke 1 sú uvedené výsledky.

Tabuľka 1

Hodnoty Ke peptidov príbuzných TIP(P) pri testovaní myšieho semenovodu (MVD) (antagonistické účinnosti proti δ-agonistom [Leu⁵]enkefalínu, i-----------------------------------------1 [D-Pen², D-Pen⁵]enkefalínu (DPDPE) a [D-Ala²Jdeltorfínu I)

Skôr známe zlúčeniny sú označené symbolom (P)

Zlúčenina

Hodnota Κθ (nmol)^a[Leu⁵]- DPDPE

-enkefalín [D/Ala²]-deltorfín I

H-Tyr-Tic-PhePhe-OH(P)(TIPP)	5,86	+	0,33	4,80	+	0,20	2,96	+	0,02
H-Tyr-Tic-Phe- Phe-NH₂(P)(TIPP-NH₂)^b	15,7	+	2,4	18,0	+	2,0	14,5	+	2,2
H-Tyr-Tic-Phe- OH(P)(TIP)	11,7	+	1,8	16,1	+	1,9	12,6	+	1,8
H-Tyr-Tic-Phenh₂(p)(tip-nh₂)	43,9	+	8,9	96,8	+	14,1	58,9	+	7,7
Tyr(N* Me)-Tic- Phe-Phe-OH	1,01	+	0,15	1,22	+	0,17	0,436	+	0,071
Tyr(N^eíCpm)-Tic- Phe-Phe-OH	29,6	+	4,4	28,2	+	0,5	32,5	+	1,3
Tyr(N^Hex)-Tic- Phe-Phe-OH	9,37	+	1,18	4,28	+	0,56	10,6	+	1,9
Tyr(N⁴ Et₂)-Tie- Phe-Phe-OH	3,39	+	0,16	0,893	+	0,112	2,30	+	0,18
H-Dmt-Tic-Phe- Phe-OH	0,169	+	0,015	0,196	+	0,022	0,130	+	0,017
H-Dmt-Tic-Phe- Phe-NH₂ ^b	0,221	+	0,028	0,209	+	0,037	0,260	+	0,064
H-Tyr(3—F)-Tic- Phe-Phe-OH	5,88	+	0,72	13,0	+	0,7	8,73	+	1,21
H-Tyr(3-Cl)-Tic- Phe-Phe-OH	18,0	+	2,2	20,4	+	1,5	19,9	+	1,7

Tabulka 1 - pokračovanie

Hodnota Κθ (nmol)^a

Zlúčenina [Leu⁵]- DPDPE [D/Ala²]-enkefalín -deltorfin I

H-Tyr(3-Br)-TÍC- 18,2 ± 2,7 31,3 ± 4,2 23,9 ±2,7

Phe-Phe-OH

H-Tyr-TicTtC^-NH]- 9,12 ± 1,57 9,6 ± 0,70 8,24 ±1,12

Phe-OH

H-Tyr-TicyiCH₂-NH]- 2,46 ± 0,35 2,89 ± 0,23 2,85 ±0,13

Phe-Phe-OH

H-Dmt-Ticý[CH₂-NH]- 0,259 ± 0,043 0,196 ± 0,033' 0,157 ± 0,028

Phe-Phe-OH

H-Dmt-TÍcy’[CH₂-NH]- 0,470 ± 0,078 0,420 ± 0,049 0,486 ± 0,058 Phe-Phe-NH₂ ^b

H-Tyr-TicŤ[CH₂- 6,28 ± 0,14 4,76 ± 0,48 2,89 ± 0,31

NCH₃]Phe-Phe-OH

H-Tyr-Ticy[CH₂- 2,22 ± 0,31 2,64 ± 0,47 1,90 ± 0,17

NH]Hfe-Phe-OH

H-Tyr-Tic-Hfe- 1,23 ± 0,18 0,609 ± 0,043 0,408 ± 0,039

Phe-OH

Tyr(NMe)-Tic [CH₂ 0,780 ± 0,082 0,902 ± 0,135 0,418 ± 0,098 NH]Hfe-Phe-OH

H-Tyr-Tic-Phg- 13,8 ± 1,2 21,5 ± 2,9 8,31 ±1,75

Phe-OH

H-Tyr-Tic-Trp-OH 10,6 ± 2,1 6,23 ± 0,79 5,36 ± 0,77

H-Tyr-Tic-Trp-Phe- 2,37 ± 0,54 2,56 ± 0,21 1,65 ± 0,18

OH(P)

Tabuľka 1 - pokračovanie

Hodnota Κθ (nmol)^a

Zlúčenina [Leu⁵]- DPDPE [D/Ala²]-enkefalín -deltorfin I

H-Tyr-Tic-Trp-Phenh₂(p)	3,24 ±	0,43	4,65 ± 0,92	2,31	+	0,17

H-Tyr-Tic-His-Phe- OH	20,1 ±	1,83	18,2 ± 1,6	18,7	+	0,7
H-Tyr-Tic-2-Nal-Phe- OH	2,64	± 0,17	4,41 ± 0,65	4,17	+	0,58
H-Tyr-Tic-Atc-Phe- OH	1,63	±0,14	1,85 ± 0,16	0,927	+	0,14
H-Tyr-Tic-Phe- Phe(pNO₂)-OH	3,62	± 0,46	3,30 ± 0,35	2,79	+	0,46
H-Tyr-Tic-Trp- Phe(pNO₂)-OH	1,83	±0,10	4,40 ± 0,55	2,27	+	0,14
H-Tyr-Tic-Phe- Trp-NH₂	49,5	± 4,6	41,3 ± 5,2	38,6	+	3,3
H-Tyr-Tic-Phe-Phe- Val-Val-Gly-NH₂	6,48	± 0,59	6,36 ± 1,32	4,96	+	0,77
H-Tyr-Tic-Phe-Phe- Tyr-Pro-Ser-NH₂	4,78	± 0,80	4,63 ± 0,43	3,90	±	0,63
H-Tyr-Tic-Trp-Phe- Tyr-Pro-Ser-NH₂	4,20	± 1,13	3,65 ± 0,94	3,65	±	0,14
H-Tyr-Tic-Trp-	3,68	± 0,79	2,48 ± 0,34	3,91	+	0,38

Phe(pNO₂)-Tyr-ProSer-NH₂

Tabuľka 1 - pokračovanie

Zlúčenina

Hodnota Κθ (nmol)^a[Leu⁵]- DPDPE

-enkefalin [D/Ala²]-deltorfin I

NatrÍndol(P) 0,850 ± 0,221 0,632±0,161 0,636±0,105 ^a Hodnoty značia stred z 3 až 8 stanovení ± smerodatná odchýlka b H-Tyr-Tic-Phe-Phe-NH₂, H-Dmt-Tic-Phe-Phe-NH₂ a

H-Dmt-Tic^[CH₂-NH]-Phe-Phe-NH₂ sú zmiešané μ-agonisty/δ-antagoyisti, ktoré majú hodnoty IC_5Q 1700 ± 220 nmol, 18,2 ± 1,8 nmol a 7,71 ± 0,32 nmol pri testovaní sťahov ilea morčaťa (GPI).

Závery μ-antagonistické alebo μ-agonistické chovanie δ-agonistov príbuzných TIPP

- Žiadna zo zlúčenín neprejavuje žiadne μ-antagonistické chovanie

- Peptidy príbuzné s TIPP s volnou C-koncovou karboxylovou skupinou majú velmi slabý μ-agonistický účinok pri testovaní sťahov ilea morčaťa (IC₅₀ je väčší ako 10 μπιοί). Naproti tomu peptidy odvodené od TIPP s C-koncovou karboxamidovou funkciou prejavujú plný μ-agonistický účinok pri testovaní sťahov ilea morčaťa (napríklad H-Dmt-Tic-Phe-Phe-NH₂ má hodnotu IC₅₀ 18,2 ± 1,8 nmol pri testovaní sťahov morčaťa).

Testy viazania opioidového receptora

Konštanty viazania μ- a S-opioidových receptorov (K^.k/* ) zlúčenín sa stanovujú náhradou relatívne selektívnych μ- a δ-rádioligandov z viazacích miest v prípravkoch mozgových blán potkana (vypočíta sa zo zmeraných hodnôt IC_5Q na základe vzťahu, ktorý určil Cheng a Prusoff (Y. C. Cheng a W. H. Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3102 /1973/)).

V nižšie zaradenej tabuľke 2 sú uvedené výsledky testovánia viazania opioidového receptora. Pomer /K^ je kvantitatívnym meradlom δ-selektivity. Vyšší pomer ukazuje na lepšiu δ-selektivitu.

Štúdie viazania opioidového receptora μ, δ a Áľ-opioidové (kappa-opioidové) receptorové afinity všetkých nových analógov sa stanovujú testom viazania, založeným na náhrade μ, δ a ^-selektívnych rádioaktívnych ligandov z viazacích miest mozgových blán potkana. V prípade Tc-ligandov sa použijú mozgové homogenáty morčaťa, pretože relatívny pomer Jc-viazacích miest je vyšší v mozgu morčaťa ako v mozgu potkana. Experimentálny postup, ktorý sa používa v laboratóriu pôvodcov, predstavuje modifikovanú verziu testu viazania, ktorú popísal Pasternak a kol. (Mol. Pharmacol. 11, 340-351 /1975/). Samčie potkany kmeňa Sprague-Dawley o hmotnosti 300 až 350 g z Canadian Breeding Laboratories ša usmrtia oddelením hlavy a po odstránení cerebella sa mozgy homogenizujú v 30 objemoch ľadovo chladného štandardného pufra (50 mmol Tris-HCl, hodnota pH 7,7). Po odstredení za preťaženia 30 000 g počas 30 minút pri teplote 4 ’C sa blany rekonštituujú v pôvodnom objeme štandardného pufra pri teplote 37 ’C v priebehu 30 minút (na uvoľnenie viazaných endogénnych ligandov). Nasledujúce odstreďovanie a opätovné suspendovanie peliet v počiatočnom objeme čerstvého štandardného pufra poskytne konečnú suspenziu blán. Alikvoty (o objeme 2 ml) prípravkov obsahujúcich blany sa inkubujú pri teplote 25 ’C počas 1 až 2 hodín s 1 ml štandardného pufra, ktorý obsahuje peptid určený na testovanie a jeden z ďalej uvedených rádioaktívne značených ligandov o konečnej koncentrácii: [³H]DAMGO, μ-selektívny, 0,7 nmol, [³H]DSLET, [³H]DPDPE alebo [³H]TIPP, δ-selektívny, 1,0 nmol a [³H]U69,563 ^-selektívny, 0,5 nmol. Inkubácia sa ukončí filtráciou (filtre Whatman GF/B) pri teplote 4 “C pri zníženom tlaku. Potom sa uskutoční premytie dvomi podielmi o objeme 5 ml ladovo chladného štandardného pufra, filtre sa prenesú do scintilačných skúmaviek a spracovávajú sa s 1 ml Protosolu (New England Nuclear) počas 30 minút pred pridaním 0,5 ml kyseliny octovej a 10 ml Aquasolu (New England Nuclear). Skúmavky sa trepú počas 30 minút a potom sa stanoví účinnosť 40 až 45 %. Všetky pokusy sa uskutočňujú dvojité a opakujú sa aspoň trikrát. Špecifické viazanie každého z troch týchto rádioaktívne značených ligandov sa stanovuje uskutočnením inkubácie za prítomnosti studeného DAMGO, DSLET a U69,563 v 1-mikromolárnej koncentrácii. Hodnoty polovičnej maximálnej inhibície (IC₅₀) špecifického viazania sa získajú graficky zo semilogaritmického vynesenia hodnôt. Z nameraných hodnôt IC₅₀ sa potom vypočítajú viazacie inhibičné konštanty (K^) na základe Chengovej Prusoffovej rovnice (Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3102 /1973/). Pomery hodnôt pri μ-, δa k-reprezentatívnyčh testoch viazania sa zmerajú z receptorovej selektivity zlúčenín určených na vyšetrenia (napríklad potxf mer K^/K^ ukazuje selektivitu pre δ-receptory proti μ-receptorom). Žiadna zo zlúčenín podlá tohto vynálezu nemá významnú afinitu pre ^-receptory.

Tabulka 2

Hodnoty viazania opioidových peptidových analógov³ μ δ μ δ

Zlúčenina	^Ki	(nmol)	^Ki	(nmol)	Ki /Ki
H-Tyr-Tic-Phe-	1720	± 50	1,22	± 0,07	1410
Phe-OH(P)
H-Tyr-Tic-Phe-	78,8	± 7,1	3,00	± 0,15	26,3
Phe-NH₂(tipp-nh₂)^b
H-Tyr-Tic-Phe-	1280	± 140	9,07	± 1,02	1413

ΟΗ(ΤΙΡΡ)

Tabuľka 2 - pokračovanie

Hodnoty viazania opioidových peptidových analógov³

Zlúčenina	μ ^Ki	(nmol)	δ ^Ki	(nmol)	μ δ
					[
H-Tyr-Tic-Phenh₂(tip-nh₂)	624	± 79	12,0	± 1,3	52,0
Tyr (IťSíe) -Tic- Phe-Phe-OH	13400	± 600	1,29	± 0,36	10400
Tyr(N^Hex)-Tic- Phe-Phe-OH	1080	± 80	0,951	± 0,123	.1140
H-Dmt-Tic-Phe Phe-OH	141	± 0,24	0,248	± 0,046	569
H-Dmt-Tic-Phe Phe-NH₂	1,19	± 0,11	0,118	± 0,016	10,1
H-Arg-Tyr-Tic-Phe Phe-NH₂	107	± 2	4,79	± 0,15	22,3
H-Tyr-TicZ[CH₂-NH]Phe-OH	10800	± 1300	1,94	±0,14	5570
H-Tyr-Tic ľ[CH₂-NH]Phe-Phe-OH	3228	± 439	0,308	± 0,060	10500
H-Ditít-TicH CH₂-NH ] -	95,5	± 11,0	1,70	± 0,40	56,2

Phe-Phe-OH

Tabuľka 2 - pokračovanie

Hodnoty viazania opioidových peptidových analógov³

	μ			δ			μ δ
Zlúčenina	^Ki	(nmol)	^Ki	(nmol)	Ki /Ki
H-Tyr-Tic ^r[CH₂-	13400	+	700	0,842	+	0,116	1 1590^!0
NCH₃]Phe-Phe-OH
H-Tyr-Tic-Hfe-	1990	+	170	0,277	+	0,001	7180
Phe-OH
H-Tyr-Tic-Phg-	29000	+	7200	3,01	+	0,54	9630
Phe-OH
H-Tyr-Tic-Trp-Phe-	176	+	21	0,248	+	0,009	709

nh₂

H-Tyr-Tic-Trp-Phe- OH	1790	+	380	0,301	+	0,042	5950
H-Tyr-Tic-His-Phe- OH	17000	+	3700	1,48	+	0,22	11500
H-Tyr-Tic-l-NalPhe-OH	1120	+	1300	1,14	+	0,17	982
H-Tyr-Tic-2-Nal- Phe-OH	6330	+	130	1,31	+	0,03	4830
H-Tyr-Tic-Phe- Phe-(pNO₂)-OH	2890	+	660	0,703	+	0,099	4110
H-Tyr-Tic-Trp-	1520	+	42	0,330	+	0,004	4610

Phe(pNO₂)-OH

Tabuľka 2 - pokračovanie

Hodnoty viazania opioidových peptidových analógov^a μ δ μ δ

Zlúčenina (nmol) (nmol) /Κ^

H-Tyr-Tic-Phe- Trp-NH₂	312 ± 75	1,21	± 0,19	258
H-Tyr-Tic-Phe-Phe- Val-Val-Gly-NH₂	3290 ± 75	1,43	± 0,25	2300
H-Tyr-Tic-Phe-Phe- Tyr-Pro-Ser-NH₂	658 ± 136	0,900	± 0,196	731
Natrindol Val-Val-Gly-NH₂	12,2 ± 1,9	0,687	± 0,100	17,8

^a Hodnoty sú stredom z 3 stanovení ± smerodatná odchýľka

Potenciálna využiteľnosť

Čisté δ-antagonisty sa môžu používať v kombinácii s analgetikami μ-angonistového typu (napríklad morfinom) na zabránenie vývoja tolerancie a závislosti, ako svojimi výsledkami naznačil E. E. Abdelhamid a kol. v J. Pharmacol. Exp. Ther. 258, 299-303 /1991/. Neskoršie štúdie tiež naznačujú, že zlúčeniny so zmiešanými μ-agonistickými a δ-antagonistickými vlastnosťami môžu byť terapeuticky vhodné ako analgetiká, ktoré nevytvárajú toleranciu a závislosť. Peptidy príbuzné TIPP s C-koncovou karboxamidovou skupinou popísané v tomto patente sú prvé známe zmiešané μ-agonisty δ-antagonisty.

δ-antagonisty popísané v tomto patente môžu byť tiež terapeuticky vhodné ako prostriedky znižujúce imunitu. Účinky znižujúce imunitu menej δ-selektívneho a menej čistého antago- 23 nistu naltrindola popisuje K. Arakawa a kol. v Transplantation Proc. 24, 696-697 /1992/ a Transplantation 53, 951-953 /1992/.

Prehľad užívaných skratiek

Aib = kyselina a-aminoizomaslová

Atc = kyselina 2-aminotetralín-2-karboxylová

Boe = terc.-butoxykarbonyl

Cpm = cyklopropylmety1

DAMGO = H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (iČMe)-Gly-ol

Dmt = 2,6-dimetyltyrozín

I---------------------------------------------1

DPDPE = [D-Pen², D-Pen⁵]enkefalín

DSLET = H-Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr-OH

Et = etyl

FAB-MS = hmotnostná spektrometria s bombardovaním rýchlymi atómami

GPI = ileum morčaťa

Hex = hexyl

Hfe = homofenylalanín

MVD = semenovod myši

1- Nal = 3-(l'-naftyl)alanín

2- Nal = 3-(2'-naftyl)alanín

Phe(pNO₂) = 4-nitrofenylalnín

Phg = fenylglycín

Tie = kyselina l,2_/3,4-tetrahydroizochinolín-3-karboxylová

TIP = H-Tyr-Tic-Phe-OH

TIP-NH₂ = H-Tyr-Tic-Phe-NH₂

TIP (Τ’) .= H-Tyr-Ticý[CH₂-NH]-Phe-OH

TIPP = i H-Tyr-Tic-Phe-Phe-OH

TIPP-NH₂ = H-Tyr-Tic-Phe-Phe-NH₂

ΤΙΡΡ(Γ) = H-Tyr-Tic-[CH₂-NH]Phe-Phe-OH

Tyr(3-Br) = 3-brómtyrozín

Tyr(3-Cl) = 3-chlórtyrozín

Tyr(3-F) = 3-fluórtyrozín

TyrfN^Me) = N^xmetyltyrozín

U69,593 = (5a,7a,83)-(-)-N-metyl-/7-(l-pyrolidinyl)-l-oxaspiro [ 4,5]dec-8-yl/benzénacetamid p/

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptid všeobecného vzorca I

OH

R₂ O Rg O v ktorom

znamená atóm vodíka, skupinu vzorca CH₃(CH₂)_n, kde predstavuje číslo 0 až 12,

skupiny vzorca

CH2-CH alebo arginín,

R² znamená atóm

CH₃(CH₂)_n, , _Ch₂—<|. ch₂-ch=ch₂ vodíka, skupinu vzorca kde _n predstavuje číslo 0 až 12, alebo skupinu vzorca

CHj.CHj—CH₂-CH=CH₂.

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ znamenajú vždy atóm vodíka alebo

R⁴ a R⁵

R³ a R⁶

R³, R⁵, R⁶

R⁴ znamenajú obidva atóm vodíka a znamenajú obidva nižšie alkylové skupiny alebo znamenajú vždy atóm vodíka a predstavuje atóm fluóru, chlóru alebo brómu, hydroxyskupinu, aminoskupinu alebo nitroskupinu, znamená skupinu vzorca C=0 alebo metylénovú skupinu, znamená atóm vodíka alebo nižšiu alkylovú skupinu, znamená skupinu vzorca kde m predstavuje číslo 0 až 2, alebo skupiny vzorca alebo

R.o— kde R¹⁰ znamená atóm vodíka, fluóru, chlóru, brómu alebo jódu a m predstavuje číslo 0 až 2,

R¹¹ znamená hydroxyskupinu, aminoskupinu alebo skupinu vzorca

----- ^13 ζ \—(ΟΗ₂)γγΓ·ΟΗ \=s — NH ί n kde R predstavuje atóm vodíka, nitroskupinu, atóm fluóru, chlóru, brómu alebo jódu, m predstavuje číslo 0 až 2, n □

R znamena skupinu vzorca COOH, CONH₂, CH₂OH alebo íubovoíný ďalší aminokyselinový alebo peptidový reťazec alebo

R znamená skupinu vzorca

NH kde R¹⁴ znamená skupinu vzorca COOH, CONH₂, CH₂OH alebo lubovolný ďalší aminokyselinový alebo peptidový reťazec, s výnimkou zlúčenín

Tyr-Tic-Phe-OH, Tyr-Tic-Phe-NH₂, Tyr-Tic-Phe-Phe-OH, TyrTic-Phe-Phe-NH₂, Tyr-Tic-Trp-Phe-NH₂, Tyr-Tíc-Trp-Phe-OH,

Tyr-Tic-Phe-Phe(p-NO2)-OH, Tyr-Tic-Phe-Phe(p-NO2)-H, TyrTic-Phe-Tip-NH₂> Tyr-Tíc-Phe-Tip-OH, and Tyr-Tič-Phe-PheLeu-Nle-Asp-NH₂.
2. Peptid všeobecného vzorca I podlá nároku 1, kde R⁷ znamená metylénovú skupinu.
3. Peptid všeobecného vzorca I podlá nároku 1, kde R⁴ a R⁵znamenajú atóm vodíka a R³ a R⁶ znamenajú obidva metylové skupiny.
4. Peptid všeobecného vzorca I podlá nároku 1 vybraný zo súboru zahŕňajúceho

Tyr (N^eJ-Tic-Phe-Phe-OH;

H-Dmt-Tic-Phe-Phe-OH;

H-Dmt-Tíc-Phe-Phe-NH₂;

H-Tyr-Ticy[CH₂-NH]Phe-PAe - OH

H-Dmt-ricv[CH₂-NH]Phe-Phe-OH;

H-Dmt-TicY[CH2-NH]Phe-Phe-NH₂;

H-Tyr-Tlc-Hfe-Phe-OH;

Tyr(NMe)-Ticv[CH₂-NH]Hfe-Phe-OH;

H-Tyr-Tic-Atc-Phe-OH;

H-Tyr-Tic-Tip-Phe(pNO 2)-Tyr-Pro-S er-NH₂;

HrTyr-7'cv[CH2-NH]Phe-OH;

H-Tyr-Ticv[CH2-NCH3]Phe-Phe-OH;

H-Tyr-Tic-Phg-Phe-OH;

H-Tyr-Tic-His-Phe-OH;

H-Tyr-Tíc-2-Nal-Phe-OH; and

H-Tyr-Tic-Phe-Phe-Val-Val-Gly-NH₂
5. Peptid podlá nároku 1 na použitie v terapii.
6. Peptid podlá nároku 1 na použitie ako analgetikum.
7. Peptid podlá nároku 1 na použitie ako prípravok znižujúci imunitu.
8. Spôsob výroby peptidov podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa pri ňom používa syntéza na tuhej fáze, pričom sa

i) kopuluje C-zakončenie skupinou Boe chránená aminokyselina na živici, ii) chrániaca skupina sa odstráni kyselinou, iii) sekvenciálne sa kopulujú a zbavujú chrániacich skupín všetky aminokyseliny, potrebné na ukončenie peptidovej sekvencie a iv) peptid sa oddeluje od živice.
9. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa prídavný stupeň pripojenia Boc-Tic-OH zvyšku k dipeptidovej živici (stupeň opätovnej kondenzácie) a prídavný stupeň pripojenia Boc-Tyr(Boc)-OH k peptidovej živici (stupeň opätovnej kondenzácie).
10. Spôsob podlá niektorého z nárokov 8 a 9, vyznačujúci sa tým, že vhodným inertným rozpúšťadlom je dichlórmetán alebo zmes dichlórmetánu a dimetylformamidu v objemovom pomere 3:1a kondenzačným činidlom je dicyklohexylkabodiimid/1hydroxybenzotriazol.
11. Spôsob výroby niektorého z peptidov podlá nároku 1, obsahujúceho redukovanú peptidovú väzbu vzorca -CH₂-NH- medzi zvyškom Tie² a zvyškom v polohe 3, vyznačujúci sa tým, že sa uskutoční redukčná alkylačná reakcia medzi Boc-Tic alde hydom a aminoskupinou z peptidu viazaného na živicu, s použitím nátriumkyanbórhydridu v okyslenom dimetylformamide.

I .
12. Spôsob výroby N-terc-butoxykarbonyl-L-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-aldehydu (Boc-Tic aldehyd) na výrobu peptidov obsahujúcich redukovanú peptidovú väzbu vzorca -CH₂-NHmedzi zvyškom Tie² a zvyškom v polohe 3 podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že

i) sa najskôr pripravuje N-terc-butoxykarbonyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-N-metoxy-N-metylamid reakciou Boc-Tic-OH s BOP a s N-dimetylhydroxylamín hydrochloridom v prítomnosti trietylamínu a ii) N-terc-butoxykarbonyl-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-N-metoxy-N-metylamid, pripravený podlá odstavca (i), sa redukuje a hydrolyzuje.
13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo peptidu podlá nároku 1 spolu s aspoň jednou farmaceutickou nosnou látkou.
14. Použitie zlúčeniny podlá nároku 1 ako účinnej látky na výrobu analgetického farmaceutického prostriedku.
15. Použitie zlúčeniny podlá nároku 1 ako účinnej látky na výrobu farmaceutického prostriedku s účinkom znižujúcim imunitu.