CZ171195A3

CZ171195A3 - Novel peptides

Info

Publication number: CZ171195A3
Application number: CZ951711A
Authority: CZ
Inventors: Peter Schiller
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1993-01-05
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 1996-09-11
Also published as: LV10962A; CN1096515A; LV10962B; FI953302A; IL108169A0; CA2152380A1; FI953302A0; YU394A; SI9400005A; SK83995A3; NZ259597A; EE9400326A; AU681372B2; HU9502041D0; ZA9455B; PL309778A1; IS4115A; WO1994015959A1; JPH08505386A; AP508A

Description

Oblast techniky .. ____~:

Tento vynález se týká nové skupiny op·’ oiJv_/-h analogů peptidů, které jsou δ opioídovýmí receptorovými antagonísty, stejně jako způsobu jejich syntézy a jejich použití jako analgetických sloučenin a sloučenin snižujících imunitu.

Dosavadní stav techniky

Známý nepeptidový 5 opioidový antagonista je naltrindol, který popsal P. S. Portoghese a kol, v J. Med. Chem. 31, 281-282 /1988/. Naltrindol má podobnou δ-antagonistickou účinnost, jako sloučeniny podle tohoto vynálezu, ale je mnohem méně S-selektivní. Kromě toho naltrindol má také zcela vysokou μ opioidovou receptorovou afinitu (K^= 12 nmol) při testu vázání receptorů a má silné antagonistické vlastnosti (K_e = 29 nmol) při testováni ilea morčete, srov.

P. S. Portoghese a kol., J. Med. Chem. 34, 1757-1762 /1991/.

Jiný známý S-antagonista je enkefalinový analog N,N-diallyl-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH (ICI 174864), který popsal

R. Cotton a kol. v Eur. J. Pharmacol. 97, 331-332 /1984/.

V porovnání s δ-antagonísty popsanými v tomto patentu je ICI 174864 mnohem méně S-selektivni (desetkrát až třistakrát méně) a má mnohem menší antagonistickou účinnost při testu stahů chámovodu myši (MVD) (čtyřicetkrát až tisíckrát méně účinný).

Tetrapeptidy, které jsou účinnými δ-antagonisty, nedávno uvedl P. W. Schiller a kol. v j, 6 (č. 4),

A 1575 /1992/ na setkání při International Narcotics K^search Conference (INRC), Keystone, CO (USA), konaném ve dnech 24.

až 29. června 1992 a na 2. japonském symposiu o chemii peptidů, Shizuoka (Japonsko), konaném od 9. do 13. listopadu 1992.

Podstata vynálezu

Neočekávaně nyní bylo nalezeno, že sloučeniny dále uvedeného obecného vzorce I jsou

- mimořádně selektivní pro δ-receptory,

- mají vysoký účinek jako δ-antagonosty,

- projevují celkový nedostatek μ antagonistických vlastností a

- v některých případech máji smíšené μ-agonistické a δ-antagonistické vlastnosti (TIPP analogy s C-koncovou karboxamidovou skupinou).

Sloučeniny podle tohoto vynálezu meg-í obecného vzotce I

znamená atom vodíku, skupinu vzorce kde n představuje číslo 0 až 12, skupiny vzorce CH2'^CH ch₂—<3, ch₂-ch=ch₂ nebo arginin, í?2 znamená atom vodíku, skupinu vzorce CHg(CH₂)_n, kde n představuje číslo 0 až 12, nebo skupinu vzorce Cf-^.CHj —<X ch₂-ch=ch_?,

Rg , R₄ , a R₆ znamenají vždy atom vodíku nebo

R₄ a R₅ znamenají oba atom vodíku a

R₃ a Rg znamenají oba nižší alkylové skupiny nebo

R₃, R₅ a Rg znamenají vždy atom vodíku a

R₄ představuje atom fluoru, chloru nebo bromu, hydroxyskupinu, aminoskupinu nebo nitroskupinu,

R-, znamená skupinu vzorce C=0 nebo methylenovou skupinu,

Rg znamená atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu.

Rg znamená skupinu vzorce

kde m představuje číslo 0 až 2, nebo skupiny vzorce

nebo /CH₂—CH

ΓΛ ¹

V-^NH

R

(CH₂)_m-CH kde R₁₀ znamená atom vodíku, fluoru, chloru, bromu nebo jodu a m představuje číslo 0 až 2,

R_1:l znamená hydroxyskupmu, aminoskupinu nebo skupinu V Z Ο ί* C θ

R- 2

R₁₂—Z \—(CH₂)_m— CH —ŇH kde R₁₂ představuje atom vodíku, nitroskupinu, atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu, m představuje číslo 0 až 2,

R₁₃ znamená skupinu vzorce COOH, CONH₂, CH₂OH nebo libovolný další řetězec nebo

R_li znamená skupinu aminokyselinový nebo peptidový vzorce

NH kde R₁₄ znamená libovolný další skupinu vzorce COOH, aminokyselinový nebo

CONH₂, CH₂OH nebo peptidový řetězec,

- b -

s podmínkou, že jsou vyloučeny sloučeniny, kde R_lř R₂· ^R3>

R₄, R₅, Rg a R_g znamenají vždy atom vodíku, R_? znamená fs.a. £ kJLJΓL 'J -LU VUU. DJ\U£j±nU f

Rg představuje skupinu vzorce

CH₂ -CH _a

R^ znamená Phe-OH, Phe-NH₂, OH nebo NH₂.

Nižší alkylová skupina obsahuje podle tohoto popisu od 1 do 6 atomů uhlíku. Zvláště výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou sloučeniny, kde R_? znamená skupinu vzorce CH₂(jako část redukované peptidové vazby). Redukovaná peptidová vazba poskytuje sloučeniny o vyšším δ-antagonistickém účinku, zvýšené δ-selektivitě, lepší stabilitě v organických rozpouštědlech a odolnosti vůči enzymatické degradaci.

Další výhodné sloučeniny podle tohoto vynélezu jsou sloučeniny, kde R^ a Rg představují atom vodíku a Rg a Rg znamenají oba methylovou skupinu.

Syntéza

Většina Boc-aminokyselinových derivátů používaných _J h syntéze peptidů je komerčně dostupná. 2,6-Dimethyltyrosin (Dmt) se vyrábí jak popsal J. H. Dygos a kol., Synthesis 8, 741-743 /srpen 1992/ a kyselina 2-aminotetralin-2-karboxylová se vyrábí jak popsal P. W. Schiller a kol. v J. Med. Chem.

34, 3125-3132 /1991/.

Všechny peptidy se vyrábějí technickým postupem na tuhé fázi. Obvyklá pryskyřice z polystyrenu/divinylbenzenu se používá pro syntézu peptidů s volnou karboxylovou skupinou na koncovém atomu uhlíku prováděnou na tuhé fázi, zatímco peptidamidy se syntetizují za použití p-methylbenzhydrylaminově pryskyřice. Boc ochrana aminoskupiny se používá při výrobě všech peptidů. Syntéza se provádí podle zaznamenaného pracovního postupu, který se rozsáhle používá v laboratoři původců (P. W. Schiller a kol., Biochemistry 16, 1831-1832 /1977/). Kondenzace se provádí v dichlormethanu nebo v dimethylformamidu a za použiti dicyklohexylkabodiimidu/1-hydroxybenzotriazolu (DCC/HOBt) jako kondenzačních činidel. Úplnost kondenzace se pečlivě zkouší po každém kondenzačním stupni pomocí ninhydrinového barevného testu. Plně sestavený peptidový řetězec se odštěpí od pryskyřice a zcela zbaví chránících skupin zpracováním s kapalnou kyselinou fluorovodíkovou za teploty 0 °C v přítomnosti anisolu jako zachycovacího prostředku (po dobu 60 až 90 minut).

Analogy obsahující CH₂NH peptidově vázané isostery se vyrábějí syntézou na tuhé fázi způsobem, který vyvinul Sasaki a Coy (Y. Sasaki a D. H. Coy, Peptides 8, 119-121 /iyay/j. Tímto způsobem se CH₂NH peptidová vazba může přímo zavést reduktivní alkylačni reakci mezi aldehyd Boc-aminokyseliny a aminoskupinu na peptidů vázaném k pryskyřici, za použiti natriumkyanborhydridu v okyseleném dimethylformamidu. Pří tomto způsobu se nepozoruje žádná významná racemizace.

Boc-Tic aldehyd se syntetizuje přes odpovídající

Boc-Tic-N-methoxy-N-methylamid redukční metodou využívající

.........

_l citiuiLux cm n i.

lumhydrid, která jax je uvedeno, je oproštěna od racemizace (J, A. Fehrentz a B. Castro, Synthesis, 676-678 /1983/), Peptidy obsahující redukované peptidové vazby se odštěpují od pryskyřice a zbavují chránících skupin zpracováním s kyselinou fluoro; a íak je popsáno výše.

Surový peptid získaný syntézou peptidu na tuhé fázi vyžaduje rozsáhlé čistění různými chromatografickými postupy nebo jinými metodami. Po štěpení kyselinou fluorovodíkovou a extrakci pryskyřice se provede obvyklým způsobem gelová filtrace na pryskyřici Sephadex (G-15 nebo G-25). Různé následující stupně čistění zahrnuji chromatografické rozdělování na pryskyřici Sephadex G-25 (za použití různých dvoufázových systémů z butanolu, kyseliny octové, pyridinu a vody), iontoměničovou chromatografii (DEAE-Sephadex, SP-Sephadex a CM-celulóza) a chromatografii s reversní fází na koloně naplněné oktadekasilyl-silikou, za použití lineárního gradientu methanolu v 1% kyselině trifluoroctové (nízký tlak). Pokud je zapotřebí, konečné čistění k dosaženi homogenity se provádí semipreparativni vysoko účinnou kapalinovou chromatografií. Používají se semipreparativni kolony μ-Bondapak C-18 (Waters, 0,7 x 25 cm), které v závislosti na problémech dělení, dovolují čištěni 2 až 20 mg peptidového materiálu na pokus. Používají se jednotlivé vysoce selektivní a účinné analytické metody k doložení homogenity vyráběných peptidu a ověření jejich struktury. Ke stanoveni čistoty se používá chromatografie na tenké vrstvě v nejméně dvou rozdílných rozpoustědlových systémech. Kromě toho se obvykle používá v laboratoři analytická vysoko účíniiu. kapalinová chromatografie ve dvou nebo ve třech rozdílných systémech rozpouštědel, stejně jako vysoce citlivý test na čistotu. Ověření peptidové struktury je hlavně založeno n. analýze aminokyselin a hmotnostní spektrometrii s bombardováním rychlými atomy (FAB-MS). Pro hydrolýzu aminokyselin se peptidy hydrolýzují v 6-normální kyselině chlorovodíkové, kte rá obsahuje malé množství fenolu, za teploty 110 °C po dob, hodin v deaeratovaných zkumavkách (v některých případech hydrolýza trvající po dobu 12 a 48 hodin se také provádí, aby se dosáhlo určeného rozsahu degradace aminokyselin). Hydrolýzáty se analýzuji na přístroji pro analýzu aminokyselin Beckman Model 121 C, který je vybaven počítačovým integráto9 rem AA. Hmotnostní spektrometrie FAB se používá ke stanovení správné molekulové hmotnosti peptidu.

Příklady provedení vynálezu

Příklady určitých analogů

Příklad 1

Způsob výroby H-Tyr-Tic-Hfe-Phe-OH g (0,61 mmol Boc-Phe/g pryskyřice, Peninsula, Belmont, Kalifornie, USA) Boc-Phe-O-pryskyřice se promyje reakčními činidly v následujícím pořadí: dichlormethan (3 x 1 min), objemově 50% kyselina trifluoroctová v dichlormethanu (30 min), dichlormethan (5x1 min), objemové 10% diisopropylethylamin v dichlormethanu (2x5 min), dichlormethan (5x1 min). Potom se kondenzuje 425 mg (1,52 mmol) Boc-Hfe-OH za použití 205 mg (1,52 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a 313 mg (1,52 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu v dichlormethanu a dimethylformamidu (v objemovém poměru 3 : 1) po dobu 17 hodin. Pryskyřice se potom promývá dichlormethanem (3 x 1 min), ethanolem (1 min) a dichlormethanem (3x1 min). Tento řetězec se promyjo a reakce se opakuje pro adici každého zbytku s těmito úpravami:

Po kondenzaci Boc-Tic-OH se pryskyřice třikrát promyje nuqax n x l- 1i x lj x mc u iq i i u. a n.

V ObjSmOVGIa pOTuGITu.

3:1. Opětovný kondenzační stupeň za použiti stejného množství Boc-Tic-OH, l-hydroxybenzotriazolu a dicyklohexylkarbodiimidu ve směsi dichiormetímr-u <.. dimethylformamid; · o objemovém poměru 3 : 1 se provádí dalších 17 hodin. Stejný opětovný kondenzační stupeň se také provádí ke kondenzaci Boc-Tyr(Boc)-OH. Po konečném odstraněni chránících skupin objemové 50% kyselnou trifluoroctovou v dichlormethanu (30 min) se pryskyřice promyje dichlormethanem (3x1 min) a ethanolem (3x1 min) a vysuší v exikátoru. Suchá pryskyřice se potom zpracovává s 20 mi kyseliny fluorovodikové a 1 ml anisolu nejprve za teploty 0 ’C po dobu 90 minut a potom za teploty místnosti po dobu 15 minut. Po odpaření kyseliny fluorovodíkové se pryskyřice třikrát extrahuje diethyletherem a potom třikrát 7% kyselinou octovou. Surový peptid se potom dostane v tuhé formě lyofilizací spojených extraktu v kyselině octové.

Peptid se čistí gelovou filtrací za použití kolony naplněné pryskyřicí Sephadex G-25 v 0,5-normální kyselině octové, s následující chromatografií s reversní fází na koloně naplněné oktadekasilyl-silikou s lineárním gradientem 0 až 80 % methanolu v 1% kyselině trifloroctové. Poté co se rozpouštědlo odpaří, surový peptid se rozpustí v koncentrované kyselině octové a lyofilizací se dosáhne tuhá forma.

Výtěžek činí 45 mg.

FAB-MS: MH⁺ = 648.

Chromatografie na tenké vrstvě (oxid křemičitý):

Rf 0,75, směs n-butanolu, kyseliny octové a vody v poměří : 5 : 1 (organická fáze),

Rf 0,70, směs n-butanolu, pyridinu kyseliny octové a vody v poměru 15 : 10 : 3 : 12.

Analýza aminokyselin: Tyr 0,96, Hfe 1,03, Phe 1,00.

Přiklad 2

Způsob výroby H-Tyr-Tic^[ CH₂“NH]Phe-Phe-OH

Syntéza tohoto peptidu se provádí jako v příkladu 1 za použití stejné pryskyřice s tím rozdílem, že zavedení redukované peptidove vazby mezi zbytky Tic² a Phe² vyžaduje redukční alkylační reakci mezi Boc-Tic aldehydem a aminoskupinou z dipeptidu H-Phe-Phe vázaného na pryskv!ící.

Způsob výroby N-terc.-butoxykarbonyl-L-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-aidehydu (Boc-Tic aldehyd) přes N-terc.-butoxykarbonyl-L-1,2,3,4-tetrahydroisGchinuÍiu-3-N-methoxy-N-methylamid

3,48 g (10 mmol) benzotriazo-l-yloxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfátu (BOP) se přidá k míchanému roztoku 2,8 g (10 mmol) Boc-Tic-OH a 1,33 ml (10 mmol) triethylamínu v dichlormethanu. Po 5 minutách se přidá roztok

1,2 g (12 mmol) hydrochlorídu dimethylhydroxylaminu a 1,68 ml (12 mmol) triethylamínu. Reakce se provádí po dobu 17 hodin. Potom se reakční směs zředí dichlormethanem a promyje

3-normálni kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se se vysuší síranem hořečnatým předtím, než se rozpouštědlo odpaří. Výsledná surová látka, N-terc.-butoxykarbonyl-L-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-N-methoxy-N-methylamid, se čistí chromatograficky na sloupci silikagelu a za použití směsi ethylacetátu a hexanu v objemovém poměru 1:2.

Výtěžek činí 2,1 g (65 % teorie), olej.

Chromatografie na tenké vrstvě (oxid křemičitý):

Rf 0,57, smés ethylacetátu a hexanu v poměru 1:1,

Rj 0,30, směs ethylacetátu a hexanu v poměru 1 : 2

NMR (CDC1₃) 5 1,45 (9H, terč.-butyl), 3,00 (2H, H-4),

3,18 (3H, NCH₃), 3,8 (3H, OCH₃), a 1H-3 ) , 7,17 (4H, ar) ppm.

4,42 - 4,90 (3H, 2H-1

ΙΛ tn á r< k o n Xmn

Xiix^ilax icxuu χ. <j· c, v

Λ l.»»5

XUilUJ X )

T 4— λ y, V\’ · a · » ·» <-* lcíL· · “Duluáy — karbonyl-L-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-N-methoxy-N-methvlamidu ve 30 ml etheru se přidá 190 mg (5 mmol) lithiumaluminiumhydridu. Redukční reakce se provádí po dobu 1 hodiny a reakční směs se potom hydrolýzuje roztokem 954 mg (7 mmol) hydrogensíranu draselného ve 20 ml vody. Potom se vodná fáze oddělí a třikrát extrahuje vždy podíly 50 ml etheru. Čtyři organické fáze se spojí, promyjí 3-normálni kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Nakonec se reakční směs se vysuší síranem hořečnatým. Po odpaření rozpouštědla se dostane aldehyd v čisté formě, kterou tvoří olej.

Výtěžek činí 635 g (60 % teorie), olej.

Chromatografie na tenké vrstvě (oxid křemičitý):

Rf 0,84, směs ethylacetátu a hexanu v poměru 1:1,

Rf 0,57, směs ethylacetátu a hexanu v poměru 1:2.

NMR (CDC1₃) £ 1,5 (9H, terč.-butyl), 3,00 - 3,27 (?H, H-4), 4,4 - 4,8 (3H, 1H-3 a 2H-1), 7,0 - 7,2 (4H, ar), 9,41 (1H, CHO) ppm.

Redukční alkylační reakce mezi Boc-Tic-aldehydem a H-Phe-Phe-O-pryskyřici v

Pryskyřice se promyje dimethylformamidem (2x1 min) a potom se k pryskyřici přidá 392 mg (1,52 mmol) Boc-Tic-aldehydu v dimethylformamidu, který obsahuje 1 % kyseliny octové. Potom se po částech přidá 115 mg (1,83 mmol) natriumkyanborhydridu během 40 minut a reakce se nechá pokračovat 3 hodiny.

Po kondenzaci N-koncového tyrosinového zbytku a odstranění chránící skupiny se peptid odštěpí od pryskyřice, čistí a lyofilizuje, jak je popsáno v příkladu 1,

Výtěžek činí 180 mg.

< -> >

i rtu-no . rii i — O /> j ♦

Chromatografie na tenké vrstvě (oxid křemičitý):

Rf 0,73, směs n-butanolu, kyseliny octové a vody v poměru

4:1:5 (organická fáze),

Rj 0,69, směs n-butanolu, pyridinu, kyseliny octové a vody v poměru 15 : 10 : 3 : 12,

Analýza aminokyselin: Tyr 0,95, Phe 1,00.

Dále uvedené sloučeniny podle tohoto vynálezu se syntetizují a testují jako antagonisty.

Farmakologické testováni δ-opioidových antagonistů in vitro

a) Biologické testováni je založeno na inhibici elektricky vyvolaných stahů myšího chámovodu (MVD) a ilea morčete (GPI), Při testování ilea morčete je účinnost opioidú primárně zprostředkována μ-opioidovými receptory, zatímco při testování stahu myšího chámovou inhibice stahů je větší v důsledku interakce s δ-opioidovými receptory. Antagonistické účinností při těchto testech se vyjadřují jako tak zvaná hodnota Κθ (H. W. Kosterlítz a A. J. Watt, Br. J. Pharmacol.

3 , 266-276 /1963/). Agonisticke uc±.ti se vyjadřují jako hodnoty IC₅₀ (koncentrace agonistu, která vytvár.. 5υ ϊ inhibici elektricky vyvolaných stahů).

Biologické zkoušky izolovaných orgánových preparátů

Biologické testování stahů ilea morčete (GPI) a myč ·· chámovodu (MVD) se provádí, jak popsal P. W. Schiller a kol,,. Biochem. Biophys. Res. Commun 85, 1332-1338 /1978/ a J. Di Maio a kol., J. Med. Chem. 25, 1432-1438 /1982/. Logaritmická křivka dávka-odezva se stanoví s [Leu⁵]enkefalinem jako standardem pro každý preparát z ila a chámovodu a hodnoty IC_5Q sloučenin určených k testováni se normalizují jak popsal A. A. Waterfield a kol. v Eur. J. Pharmacol. 58, 11-18 /1979/. Hodnoty Κθ pro TIPP příbuzné antagonisty se určí z poměru hodnot IC₅₀ (DR) získaných v přítomnosti a nepřítomnosti pevných koncentraci antagonisty (a) [K = a/(DR-l)] (H. W. Kosterlitz a A. J. Watt, Br. J. Pharmacol. 33., 266-276 /1968/). Tato stanovení se provádějí testováním stahů myšího chámovodu za použiti tří rozdílných δ-selektivních agonistů ([Leu⁵]enkefalinu, DPDPE a [D-Ala²jdeltorfinu I),

V dále zařazené tabulce 1 jsou uvedeny výsledky.

při testování myšího

Tabulka 1

Hodnoty Κθ peptidú příbuzných TIP(P) chámovodu (MVD) (antagonistické účinnosti proti S-ag

Γ T . .

j.

,, 5 ’ 1

u. j e i ra i

I I [D-Pen²,D-Pen⁵]enkefalinu (DPDPE) a [D-Ala²jdeltorfinu I)

Dříve známé sloučeniny jsou označené symbolem (P)

Hodnota K_£ (nmol)^a

Sloučenina	[Leu⁵]- -enkefalin	DPDPE	[D-Ala²]-
-deltorfin	I
H-Tyr-Tic-Phe- Phe-OH(P)(TIPP)	5,86	+	0,33	4,80	±	0,20	2,96	+	0	,02
H-Tyr-Tic-Phe-	15,7	+	2,4	18,0	+	2,0	14,4	+	2	,2
Phe-NH₂(P)(TIPP-NH₂:	!^b
H-Tyr-Tic-PheOH(P)(TIP)	11,7	+	1,8	16,1	-i-	1,9	12,6	+	1	,8
H-Tyr-Tic-PheNH₂(P)(tip-nh₂)	43,9	±	3,9	96,8	4-	14,1	58,9	±	7
Tyr (N^Me)-Tic-	1,01		0,15	1,22	±	0,17	0,435	+	0	,071
Phe-Phe-OH
Tyr(N^Cpm)-Tic-	29,6	+	4,4	28,2	4-	0,5	32,5	+	1	,3
Phe-Phe-OH
Tyr(N^Hex)-Tic-	9,'?	-1	1 , 13	4 , 1.,		~ - -	10,6	+	1	,9

Phe-Phe-OH [D-Ala²]-deltorfin I

Tabulka 1 - pokračování

Sloučenina

Hodnota K_e {nmol)^a[Leu⁵]- DPDPE

-enkefalin

Tyr(Ň^3tEt₂)-Tic- 3,39 ± 0,16 0,893 + 0,112 2,30 ± 0,18

Phe-Phe-OH

H-Dmt-Tic-Phe- 0,169 ± 0,015 0,196 ± 0,022 0,130 + 0,u

Phe-OH

H-Dmt-Tic-Phe- 0,221 ± 0,028 0,209 ± 0,037 0,260 + 0,064

Phe-NÍÍ₂ ^b

H-Tyr(3-F)-TÍc- 5,88 ± 0,72 13,0 ± 0,7 8,73 ± 1,21

Phe-Phe-OH

H-Tyr(3-Cl)-Tic- 18,0 ± 2,2 20,4 + 1,5 19,9 ± 1,7

Phe-Phe-OH

H-Tyr(3-Br)-Tic- 18,2 ± 2,7 31,3 ± 4,2 23,9 ± 2,7

Phe-Phe-OH

H-Tyr-Tic/[CH₂-NH]- 9,12 ± 1,57 9,06 ± 0,70 8,24 + 1,12

Phe-OH

H-Tyr-Tíc^[CH₂-NH]- 2,46 + 0,35 2,89 + 0,23 2,85 ± O.i

Phe-Phe-OH

H-Dmt-TÍC?<>[CH₂-NH] - 0,259 ± 0,043 0,196 + 0,033 0,157 + 0,028 Phe-Phe-OH

Tabulka 1 - pokračování

Hodnota Κ_θ (nmol)^a

Sloučenina [Leu-¹]-- _Ll>· ,1^ j-enkefalin -deltorfin I

H-Dmt-Tic^[CH₂-NH]- 0,470 + 0,078 0,420 ± 0,049 0,486 ± 0,058 Phe-Phe-NH₂ ^b

H-Tyr-TÍc^[CH₂- 6,23 i 0,14 4,76 ± 0,48 2,89 ± 0,31

NCH₃]Phe-Phe-OH

H-Tyr-TÍcjí'[CH₂- 2,22 ± 0,31 2,64 ± 0,47 1,90 ± 0,17

NH]Hfe-Phe-OH

H-Tyr-Tic-Hfe- 1,23 + 0,18 0,609 ± 0,043 0,408 ± 0,039

Phe-OH

Tyr(NMe)-Tic [CH₂-	0,780	+	0,082	0,902	+	0,135	0,418	+	0,098
NH]Hfe-Phe-OH
H-Tyr-Tic-Phg-	13,8	4-	1,2	21,5	+	2,9	8,31	+	1,75
Phe-OH
H-Tyr-Tic-Trp-OH	10,6	+	2,1	6,23	+	0,79	5,36	+	0,77
H-Tyr-Tic-Trp-Phe-	2,37	-L	0,54	2,56	v	0,21	1,65	Γ	0,18
OH(P)
H-Tyr-Tic-Trp-Phe-	3,24	+	0,43	4,65	+	0,92	2,31	+	0 ,17
NH₂(P)
H-Tyr-Tic-Hl··· -	2v. , _		X ,	18,2		1,6	18,7	+	0,7

OH

Tabulka 1 - pokračování

Hodnota Κθ (nmol)^a

- (Leu⁵]-- DPDPE [D-Ala²]-enkefalin -deltorfin I

H-Tyr-TÍC-2-Nal-Phe- 2,64 ± 0,17 4,41 ± 0,65 4,17 + 0,58

OH

H-Tyr-Tic-Atc-Phe- 1,63 ± 0,14 1,85 ± 0,16 0,927.+ 0,7 1?

OH

H-Tyr-Tic-Phe- 3,62 + 0,46 3,30 ± 0,35 2,79 + 0,46

Phe(pNO₂)-OH

H-Tyr-Tic-Trp-	1,83	+	0,10	4,	40	+	0,55	2,	27	+	0,14
Phe(pNO₂)-OH
H-Tyr-Tic-Phe-	49,5	+	4,6	41	,3	±	5,2	38	,6	+	3,3
Trp-NH₂
H-Tyr-Tic-Phe-Phe-	6,48	±	0,59	6,	36	±	1,32	4,	96		0,77
Va1-Val-Gly-NH₂
H-Tyr-Tic-Phe-Phe-	4,78	±	0,80	4,	63	+	0,43	3,	90	+	0,63
Tyr-Pro-Ser*-NH₂
H-Tyr-Tic-Trp-Phe-	4,20	+	1,13	3,	65	±	0,94	3,	65	+	0 _; Ί

Tyr-Pro-Ser-NH₂

H-Tyr-Tic-Trprhí(pNC₂)-Tyr-Pr'

Ser-NH-,

3,68 ± 0,79 2,48 + 0,34 3,91 ± 0,38 *

Tabulka 1 - pokračování

Sloučenina

Natrindol(P

Hodnota K_e (nmol)^a[Leu⁵]- DPDPE

-enkeřaiin [D-Ala²]-deltorfin τ

0,850 + 0,221 0,632 ± 0,161 0,636 + 0,105 ^a Hodnoty značí střed ze 3 až S stanovení ± směrodatná odchylka ^b H-Tyr-Tic-Phe-Phe-NH₂, H-Dmt-Tic-Phe-Phe-NH₂ a

H-Dmt-Tic}ť[CH₂~NHj-Phe-Phe-NH₂ jsou smíšeně μ-agonisty/Č-antagonisty, které mají hodnoty IC_5Q 1700 ± 220 nmol,

18,2 + 1,8 nmol a 7,71 + 0,32 nmol při testováni stahů ilea morčete (GPI).

Závěry μ-antagonistické nebo μ-agonistické chování δ-agonistú příbuzných TIPP

- Žádná ze sloučenin neprojevuje žádnou μ-antagonistickou aktivitu při GPI testu v koncentracích ve výši 10 Jimol.

- Peptidy příbuzné s TIPP s volnou C-koncovou karboxyiovou skupinou máji velmi slabý μ-agonisticky účinek při testování stahů ilea morčete (IC₅₀ je větší než 10 μιηοΐ). Naproti tomu peptidy odvozené od TIPP s C-koncovou karboxamidovou funkcí projevují plný μ-agonistický účinek při testování stahů ilea morčete (například

H-Dmt-Tic-Phe-Phe-NII₂ má hodnotu ICu^ 13,2 ± 1,8 nmol při testováni stahů ilea morčete).

Testy vázání opioidového receptorů

Konstanty vázání μ- a δ-opioidových receptorů cf (Kj_ ) sloučenin sg stanovuji náhradou relativné „ _n Ί - 1..1. 4 , ociSaliv nich μ- a δ-radioiigandů z vázacích míst v přípravcích mozkových blan krysy (vypočítá se ze změřených hodnot IC_5Q na základě vztahu, který určil Cheng a Prusoff (Y. C. Cheng a W. H. Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3102 /1973/)).

V dále zařazené tabulce 2 jsou uvedeny výsledky testování vázáni opioidového receptorů. Poměr /Kj_ je kvantitativním měřítkem δ-selektivity. Vyšší poměr ukazuje na lepší S-selektivitu.

Studie vázáni opioidového receptorů μ, δ a k-opioidové (kappa-opioidové) receptorové afinity všech nových analogů se stanovuji testem vázání, založeným na náhradě μ, δ- a k-selektivních radioaktivních ligandů z vázacích míst mozkových blan krysy. V případě k-ligandů se použijí mozkové homogenáty morčete, protože relativní poměr k-vazacích míst je vyšší v mozku morčete nez v krysím mozku. Experimentální postup, který se používá v laboratoři původců, představuje modifikovanou verzi testu vázání, kterou popsal Pasternak a kol, (Mol. Pharmacol. 11, 340-351 /1975/). Samčí krysy kmene Sprague-Dawley o hmotrr 300 až 350 g z Canadian Breeding Laboratories se usmrtí oddělením hlavy a po odstranění cerebella se mozky homogenizují ve 30 objemech ledově chladného standardního pufru (50 mmol Tris-HCl, hodnota pH 7,7). Po odstředění zó přetížení 30 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 ’C se blány rekonstituují v původním objemu standardního pufru za teploty 37 °C během 30 minut (k uvolnění vázaných endogenních ligandů). Následující odstřeďování a opětovné suspendování pelet v počátečním objemu čerstvého standardního pufru poskytne konečnou suspenzi blán. Alikvoty (o objemu 2 ml) přípravků obsahujících blány se inkubují za teploty 25 °C po dobu 1 až 2 hodin s 1 ml standardního pufru, který obsahuje peptid určený k testování a jeden z dále uvedených radioaktivně značených ligandů o konečné koncentrací· [³H]DAMGO, μ-selektivní, 0,7 nmol, [³H]DSLET, [³H]DPDPE nebo [³H]TIPP, δ-selektivni, 1,0 nmol a [³H]U69,563, k-selektivní, 0,5 nmol. Inkubace se ukončí filtrací filtry Whatman GF/B za teploty 4 °C při sníženém tlaku. Poté se provede promytí dvěma podíly o objemu 5 ml ledově chladného standardního pufru, filtry se přenesou do scintilačních zkumavek a zpracovávají s 1 ml Protosolu (New England Nuclear) po dobu 30 minut před přidáním 0,5 ml kyseliny octové a 10 ml Aquasolu (New England Nuclear). Zkumavky se třepou po dobu 30 minut a poté se stanoví účinnost 40 až 45 %. Všechny experimenty se provádějí dvojitě a opakují se alespoň třikrát. Specifické vázání každého ze tří těchto radioaktivně značených ligandů se stanovuje provedením inkubace v přítomnosti studeného DAMGO, DSLET a U69,563 v 1-mikromolární koncentraci. Hodnoty poloviční maximální inhibice (IC_5Q) specifického vázání se dostanou graficky ze semilogaritmického vynesení hodnot. Z naměřených hodnot IC₅₀se potom vypočítají vázací inhibični konstanty (K^) na základě Chengovy a Prusoffovy rovnice (Biochem. Pharmacol.

22, 3099-3102 /1973/). Poměry hodnot 1L při μ-, δa k-representativních testech vázání se změří z receptor^vó selektivity sloučenin určených k vyšetření (například poměr Kj_ /K^ ukazuje selektivitu pro δ-receptory proti μ-receptorúm). Žádná ze sloučenin podle tohoto vynálezu nemá významnou afinitu pro k-receptory.

Tabulka 2

Hodnoty vázáni opioidových peptidových analogů³

μ. δ μ S

Sloučenina Kj_ (nmol) Kj_ (nmol) Kf /Kf

H-Tyr-Tic-Phe- 1720 + 50 1,22 ± 0,07 1410

Phe-OH(P)

H-Tyr-Tic-Phe- 78,8+7,1 3,00+0,15 26,3

Phe-NH₂(TIPP-NH₂)^b

H-Tyr-Tic-Phe- 1280 + 140 9,07 + 1,02 141

OH(TIP)

H-Tyr-Tic-Phenh₂(tip-nh₂)

624 + 79 12,0 + 1,3

52,0

Tyr(N*Me)-TicPhe-Phe-OH

13400 + 600 1,29 ± 0,36

10400

TyrílfSlexJ-Tic- 1080 + 80 0,951 ± 0,123 1140

Phe-Phe-OH

H-Dmt-Tic-Phe- 141 + 0,24 0,248 + 0,046 56;

Phe-OH

H-Dmt-TÍC-Phe- 1,19 ±...0,11 0,113 + 0,016 10,1

Phe-NH₂

H-Arg-Tyr-Tic-PhePhe-NH₂

107 + 2

4,79 + 0,15 22,3

Tabulka 2 - pokračování

Hodnoty vázání opioidových peptidových analogů³ μ 5 μ 5

Sloučenina lů (nmol) K| (nmol) /K|

H-Tyr-TÍC?/4CH₂-NH]- 10300 ± 1300 1,94 + 0,14 5570

Phe-OÍÍ

H-Tyr-Tíc>^/[CH₂-NH]- 3228 ± 439 0,308 + 0,060 10500

Phe-Phe-OH

H-Dmt-TÍC^[CH₂-NH]- 95,5 + 11,0 1,70 ± 0,40 56,2

Phe-Phe-OH

H-Tyr-TÍcV^/fCH₂- 13400 ± 700 0,842 ± 0,116 15900

NCH₃]Phe-Phe-OH

H-Tyr-TÍC-Hfe- 1990 + 170 0,277 ± 0,001 ^180

Phe-OH

H-Tyr-Tic-Phg- 29000 ± 7200 3,01 ± 0,54 9630

Phe-OH

H-Tyr-Tic-Trp-Phe- 176 ± 21 0,248 ± 0,009 709 nh₂

H-Tyr-Tic-Trp-Phe- 1790 + 380 0,301 ± 0,042

5950

H-Tyr-Tic-Hís-Phe- 17000 ± 3700 1,48 ± 0,22 13500

OH

Tabulka 2 - pokračování

Hodnoty vázáni opioidových peptidových analogů³ μ δ μ δ

Sloučenina Ky (nmol) Ky (nmol) Ky /Ky

H-Tyr-Tic-l-Nal- 1120 ± 130 1,14 ± 0,17 982

Phe-OH

H-Tyr-Tic-2-Nal- 6330 ± 130 1,31 ± 0,03 4830

Phe-OH

H-Tyr-Tic-Phe- 2890 ± 660 0,703 ± 0,099 4110

Phe(pNO₂)-OH

H-Tyr-Tic-Trp- 1520 ± 42 0,330 ± 0,004 4610

Phe(pNO₂)-OH

H-Tyr-Tic-Phe- 312 ±75 1,21 ± 0,19 258

Trp-NH₂

H-Tyr-Tic-Phe-Phe- 3290 ± 520 1,43 ± 0,25 2300

Val-Val-Gly-NH₂

H-Tyr-Tic-Phe-Phe- 658 ± 136 0,900 ± 0,196 731

Tyr-Pro-Ser-NH₂

Natrindol

12,2 ± 1,9 0,687 ± 0,100 17,8

Hodnoty jsou středem ze 3 stanovení ± směrodatná odchylka

Potenciální využitelnost čistě δ-antagonisty se nohou používán v íembinaci s analgetiky μ-agonistového typu (například morfinem) k zabránění vývoje tolerance a závislosti, jak svými výsledky naznačil Ε. E. Abdelhamid a kol. v j. Pharmacol. Exp. Ther. 258, 299-303 /1991/. Pozdější studie také naznačují, že sloučeniny se smíšenými μ-agonistickými a Ž-antagonistickými vlastnostmi mohou být terapeuticky vhodné jako analgetika, která nevytvářejí toleranci a závislost. Peptidy příbuzné TIPP s C-koncovou karboxamidovou skupinou popsané v tomto patentu jsou první známé smíšené μ-agonisty a δ-antagonisty.

δ-antagonisty popsané v tomto patentu mohou být také terapeuticky vhodné jako prostředky snižující imunitu. Účinky snižující imunitu méně δ-selektivního a méně čistého¹¹antagonisty naltrindolu popisuje K. Arakawa a kol. v Transplantation Proč. 24., 696-697 /1992/ a Transplantation 53, 951-953 /1992/.

2ó

Přehled v tomto patentu v některých případech užívaných zkratek

Aíb = kyselina a-aminoisomáslená

Atc = kyselina 2-aminotetralin-2-karboxylová

Boc = terč.-butoxykarbonyl

Cpm = cyklopropylmethyl

DAMGO = H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(N^Me)-Gly-ol

Dmt = 2,6-dimethyltyrosin I 2 ' 5

DPDPE = [D-Pen , D-Pen jenkefalm

DSLET = H-Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr-OH

Et = ethyl

FAB-MS = hmotnostní spektrometrie s bombardováním rychlými atomy

GPI = ileum morčete

Hex = hexyl

Hfe = homofenylalanin

MVD - chámovod myši

1- říal - 3-(1'-naf tyl)alanin

2- Nal = 3-(2'-naftyl)alanin

Phe(pNO₂) - 4-nitrofenylalanin

Phg = fenylglycin

Tic = kyselina 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylova

TIP = H-Tyr-Tic-Phe-OH

TIP-NH₂ = H-Tyr-Tic-Phe-NH₂

TIP(ý>) = H-Tyr-TicyíCH₂-NH]Phe-OH

TIPP = H-Tyr-Tic-Phe-Phe-OH

TIPP-NH₂ = H-Tvr-Tic-Phe-Phe-NH₂

TIPP(ý) = H-Tyr-Tic [CH₂-NH]Phe-Phe-OH

Tyr(3-Br) = 3-bromtyrosin

Tyr(3-Cl) = 3-chlortyrosin

Tyr(3-F) = 3-fluortyrosin

Tyrfřť*Me) N^-methyltyrosin

U69,593 = (5α,7α,8β)-(-)-N-methyl-/7-(1-pyrrolidinyl)-1 -oxaspiro(4,5]dec-8-yl/benzenacetamid

I

JU^- Tvny, HOREČEK

Advomn' ₄‘ μ;ι·.euio-a kancelář 160 'ji θ’·ο:ι; ó :··. -astř sv. Jiří 9 P,O. L·'..'· v⁷o !ϋϋ -U Praha 6 Ceaxa republika

Claims

NÁROKY

PATENTOVÉ k cl β z π 3 ni s π ή

R. l atom v o d í k u , skupinu vzorce C H 3 ( C H 2 ) η , kde n znamená číslo O až 12

R2 skupiny vzorce nebo arginin,

CH₂-CH ^3 CH₂—<], atom vodíku, skupinu vzorce CHz(CH2 ) π , kdo :i znamená číslo neb o skupinu vzorce

CH_o-CW-CHO až 12,

CHo.CHo—<], CHn-CH=CHn.

R 3 ι Κί , R 5 a R 6 v ž d y atom vodíku n e b o -, η ς z n a m n a j i o b a atom vodíku a R 3 a R h znamenájí oba n i ž š í alkylové skupiny nebo

R u

R?

R g

R9

R α

R?

R g

R9

5 a R & z;.·,.·.; ií vždy atom vodíku a atom fluoru, chloru nebo brom.. , hydroxyskupinu, aminoskupinu nebo n i t ros,;·,· i nu , znamená skupinu vzorce C=0 nebo methylenovou skupinu, znamená atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu, znamená skupinu vzorce (CH₂)m CH kde m znamená číslo 0 a Ž 2 , nebo skupiny vzore e _zCH₂—CH xNH nebo \ // (CH₂)rn kde Ri o znamená atom vodíku, fluoru, chloru, bromu nebo jodu a m představuje číslo 0 až 2, h

Rl 1 znamená hydroxyskupinu, aminoskupinu nebo skup.uu vzorce (CH₂)_m ČH — NH kde R i ' ρ ř · I s t a vu j<> atom vodíku, n i t.mskup i fni , atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu, m představu,Je Číslo 0 až 2,

Rl 3 znamená skupinu vzorce COOH, CONH2, CH2OH nebo libovolný další aminokyselinový nebo p e p t i d o v ý řetězec nebo

Rl 1 znamená skupinu vzorce

NH s výj i mkou s1 o uče ni π

Tyr-Tic-Phe-OH, Tyr-Tic-Phe-NH2. TyT-Tic-Phe-Phe-OH, TyrTÍc-Phe-Phe-NH₂, Tyr-Tic-Trp-Phe-NH₂, Tyr-Tic-Trp-Phe-OH, Tyr-ric-Phe-Phe(p-N02)-OH, Tyr-Tic-Phe-Fhe^-NO^H, TyrTic-Phe-Trp-NH₂, Tyr-Tic-Phe-Trp-OH, and Tyr-Tic-Phe-PheLeu-Nle-Asp-NH₂.
2. lept;·! Pieuiiho v.o.ťce I podle nároku 1, kde R·/ znamená methylenovou skupinu.

P O P ! i d h e O 11 8 h o V Z O 1’

R« a R5 znamenají atom vodíku a R
3 a Rs znamenají oba methylové skupiny.
4. Peptid obecného vzorce I podle nároku 1 vybraný ze souboru zahrnujícího

Tyr (řAlej-Tic-Phe-Phe-OH;

H-Dmt-Tic-Phe-Phe-OH;

H-Dmt-Tic-Phe-Phe-NH₂;

H-Tyr-Ticy[CH₂-NH]Phe-fAe - 0 H H-Dmt-ricv[CH₂-NH]Phe-Phe-OH;

H-Dmt-Ticy(CH₂-NH]Phe-Phe-NH₂;

H-Tyr-Tic-Hfe-Phe-OH;

T yr (NMe)-Ticy[CH₂- NH] Hfe-Phe- OH;

H-Tyr-Tic-Atc-Phc-OH;

H-TyT-ric-Trp-Phe(pNO2)-Tyr-Pro-Ser-NH2;

H-Tyr-TÍcy[CH₂-NH]Phe-OH;

H-Tyr-Ticy[CH₂-NCH3]Phe-Phe-OH;

H-Tyr-Tic-Phg-Phe-OH;

H-TyT-Tic-His-Phe-OH;

H-Tyr-Tic-2-Nal-Phe-OH; and H-Tyr-Tic-Phe-Phe- Val-V al-Gly-NH₂
5 . Peptid podle nároku i k použití v terapii
6. Peptid podle nároku 1 k použití jako analgetikum.

i , sni? η -j ί r i ) nm η i 1;

* ι ί Η ř ι v 1

-> 1 !

\ y - i c ;

Μ :,.-.1 :: - < - \) - ,_Ύ: η. ή ,-, , η ;,· y - fí Γη η 1 d_: '. > ' .η Γη , :

'd Ί Ί -3 i me !· !‘, y ^: '. y ' : O X j ; d 'ΪΙ : d íd y dl . . '? t H y ! ».τι . nu <

a ' m d : s u t ι ~ χ y r; d o t .·

JUDr. Ivan KOREČEK

Advokátní a paLemova kancelář 160 00 Praha 6. Ne hasré sv. ,Jiři d P,O. BOX 275. IÓC U Praha fci