SK77393A3 - Pharmaceutical mixture for treatment of illnesses by inhibition of intercellular adhesion by elam-1 - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka prostriedkov na liečbu a spôsobov liečby zápalov a iných patologických stavov sprostredkovaných medzibunkovou adhéziou. Menovite sa týka inhibicie bunkovej adhézie s použitím nových imunoglobulinov ktoré selektívne viažu funkčné epitopy povrchového bunkového receptoru (ELAM-1) zapojeného do medzibunkovej adhézie.

Doterajší stav odboru

Cievne endotélium má klúčovú úlohu vo väzbe niektorých buniek z krvného obehu pred ich prienikom cez cievnu stenu do tkaní čo ju obklopujú. Napríklad: Niektoré látky spúšťajúce zápal, ako bakteriálny endotoxín, faktor nekrózy nádorov a interleukín 1 pôsobia priamo lebo nepriamo na cievnom endotéliu a podporujú väzbu - leukocytov a lymfocytov. Tieto bunky sa potom pohybujú cez cievnu stenu a do oblasti zranenia lebo infekcie. Bunková adhézia k cievnemu endotéliu sa predpokláda aj pri metastáze nádorov. Cirkulujúce nádorové bunky akoby využívali normálne telesné zápalové mechanizmy a viazali sa k tým oblastiam krvného riečišťa, kde je endotélium aktivované..

Novšie práce ukázali, že špecializované povrchové bunkové receptory na edoteliálnych bunkách, krvných doštičkách a leukocytoch (označované LEC-CAM, LECAM lebo selektíny) sú zapojené do rôznych medzibunkových interakcii. Tieto receptory sú povrchové glykoproteíny s lektínom-podobnou doménou, s oblasťou homológnou k epidermálnemu rastovému faktoru a oblasťou homológnou regulačným bielkovinám komplementu (pozri: Bevilacqua et al., Science, 243:1160 (1989), ako sa tu zahrnuje odkazom). Napríklad: Pre selektín nazývaný LECAM-2 lebo ELAM-1 sa ukazuje, že sprostredkuje endoteliálnu adhéziu leukocytov k aktivovaným endotelialinym bunkám, čo je prvý krok v zápalovej odozve. Špecificky sa zisťuje, že ELAM viaže ľudské neurofily, monocyty, a bunky promyelocytickej línie HL-60.

Povrchové bunkové receptory týchto obecných tried sa môžu exprimovať v rade buniek. Napríklad: GMP-140 (známy tiež ako PADGEM, LECAM-3 a CD62) je iný selektínový receptor, ktorý je prítomný na povrchu aktivovaných doštičiek, kde sprostredkuje interakcie dostička-leukocyt. Podobne LAM-1 (známy tiež ako LECAM-1) je konštitutívne exprimovaný povrchový bunkový receptor cirkulujúcich lymfocytov, a pôsobí ako receptor záchytu [homing) do lymfatických uzlín.

Boli vyvinuté rôzne metódy na blokovanie pôsobenia týchto receptorov a tým na inhibíciu bunkovej adhézie. Napríklad: Monklonálne protilátky proti ELAM-1 boli navrhnuté ako agens na inhibíciu adhézie- endothéli-um^leukocyt. - Vzťah- medzi protilátkovou inhibíciou adhézie a in vivo účinnosťou však zostáva nejasný. Takto existuje potreba dôkazu účinnej lečby zápalových chorôb s použitím protilátok reagujúcich s ELAM-1 Podstata vynálezu

Podľa tohoto vynálezu sa získávajú imunoglobulíny schopné viazať sa na funkčné epitopy ELAM-1 a takto inhibovať medzibunkovú adhéziu v pacientoch. Tieto imunoglobulíny sú účinné najmä pri liečení rôznych chorobných zápalových reakcií sprostredkovaných ELAM-1, ako sú septický šok, poststresový respiračný syndróm dospelých [adult respirátory distress syndróme] lebo sepsa spojená s poranením. Osobitne preferovaný imunoglobulín je secernovaný bunkovou líniou označenou A.T.C.C. Accession No. HB 10591, uloženou podľa Budapeštskej dohody [Budapest Treaty] 30. októbra 1990.

Podľa tohoto vynálezu sa získávajú farmaceutické prostriedky a metódy na liečenie a diagnózu zápalových reakcií pacienta. Prostriedky sú preferovane podávané intravenózne. Účinná terapeutická dávka je medzi 1 mg / kg telesnej váhy a 20 mg / kg telesnej váhy, prednosť sa dáva 5 mg /kg telesnej váhy až mg / kg telesnej váhy. Prostriedok môže obsahovať aj cielené lipozómy, do ktorých je imunoglobulín zabudovaný. Lipozómy môžu obsahovať protizápalové chemoterapeutické prostriedky. Typicky sú imunoglobulíny značené ak sa používajú ako diagnostické agens.

Obr. 1 ukazuje profylaktický podané monoklonálne protilátky proti ELAM-1 ako zábranu lipopolysacharidmi vyvolanej smrti potkanov.

Obr. 2 ukazuje terapeuticky podané monoklonálne protilátky proti ELAM-1 ako zábranu lipopolysacharidmi vyvolanej smrti potkanov.

Obr. 3 ukazuje schopnosť monoklonálnych protilátok podlá tohoto vynálezu inhibovať pleuritídu potkanov vyvolanú lipoteichoovou kyselinou.

Obr. 4' ukazuje optimálne koncentrácie lipoplysacharidov' a· lipoteichoovej kyseliny potrebné na vyvolanie adhézie neutrofilov k ludským endoteliálnym bunkám.

Obr. 5 ukazuje časový priebeh adhézie neutrofilov vyvolaný lipopolysacharidmi a lipoteichoovou kyselinou a to, že táto adhézia je inhibovaná protilátkami k ELAM-1.

Obr. 6 podáva profil krvného očisťovania [blood clearance] od monoklonálnej protilátky podlá tohoto vynálezu, EB3-1.

Obr. 7 ukazuje efekt EB3-1 a jej modifikovaných foriem lipopolysacharidmi vyvolanú letalitu potkanov.

vynález sa’ týka prostriedkov a metód na inhibíciu a iných chorôb do ktorých je zpojený ELAM-1. tento vynález používa imunoglobulíny ktoré majú inhibovať adhéziu buniek in vivo sprostredkovanú

Tento zápalových Konkrétne, schopnosť selektínmi. Imunoglobulíny podlá tohoto vynálezu selektívne viažu funkčné epitopy na ELAM-1 a účinne blokujú adhéziu leukocytov k cievnemu endotéliu. Tento vynález tiež poskytuje spôsoby prípravy imunoglobulínov a vyhladávacieho [screening] testovania na identifikáciu tých imunoglobulínov, čo špecificky inhibujú medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAM-1.. Navyše poskytuje diagnostické a terapeutické využitie týchto látok.

Ako sa rozoberá vyššie, selektíny sú unikátne glykoproteiny exprimované na povrchu radu buniek. Napríklad: endoteliálna molekula leukocytovej adhézie 1 [endothelial leucocyte adhesion molecule 1] (ELAM-1) je indukované exprimovaná (Bevilacqua et al., vyššie a Hession et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:1673-1677 (1990), ako sa tu zahrnuje odkazmi). 0 tomto receptore sa ukázalo, že je indukovaný zápalovými cytokininmi ako interleukín Ιβ (IL-Ιβ), faktor nekrózy nádorov alfa (TNFalfa), ako aj bakteriálny endotoxín (lipopolysacharid) (pozri Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:9238-9248, ako sa tu zahrnuje odkazom). Tieto látky pôsobia priamo na endoteliálnych bunkách podstatné zvyšovanie adhézie polymorfojadrových leukocytov (granulocy.tov) a. monocytovX Bevilacq.ua .. .et. al.. ,. Proc.. Natl.. Acad. Sci. , vyššie).

Novšie práce preukázali oligosacharidový ligand rozoznávaný ELAM-1. Tento ligand, známy ako sialyl Lewis X (SLX) je terminálna štruktúra, ktorá sa nachádza na povrchových glykoproteinoch a glykolipidoch granulocytov. Pozri Philips et al, Science, 250:1130-1132 (1990); a Walz et al., Science, 2'50:1132-1135 (1990).

Ako sa rozoberá vyššie, GMP-140 je membránový glykoproteín doštičiek a endoteliálnych sekréčnych granuli (Geng et al., Náture, 343:757-760 (1990) ako sa tu zahrnuje odkazom). 0 aktivovaných doštičkách ktoré exprimujú GMP-140 na svojom povrchu je známe, že sa viažu k monocytom a neutrofilom (Jungi et al., Blood 67:629-636 (1986)) a aj monocytom-podobným bunkovým líniám, napr. HL60 a U937 (Jungi et al., vyššie; Silverstein et al., J. Clin. Invest. , 79:867-874 (1987), ako sa tu zahrnuje odkazom). GMP-140 je membránový proteín alfa granuli s molekulovou váhou 140 000, ktorý je exprimovaný na povrchu aktivovaných doštičiek po stimulácii doštičiek a granulovej sekrécii (Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem. , 259:9121-9126 (1984); Stenberg et al., J. Celí Biol., 101:880-886 (1985); Berman et al., J. Clin. Invest., 78:130-137 (1986)). Takisto sa našiel v magakaryocytoch (Beckstead et al., Blood, 67:285-293 (1986)) ä v endoteliálnych bunkách (McEver et al., Blood, 70:355a (1987)) vo vnútri Weibelových-Paladeho teliesok (Bonfanti et al. Blood, 73 :1109-1112 (1989)). Fúrie et al. U.S. Patent No. 4,783,330 popisujú monoklonálne protilátky reaktívne k GMP-140. Všetky predchádzajúce referencie sú tu zahrnuté odkazom.

Tretí selektínový receptor je lymfocytový záchytový [homing] receptor (LHR, označovaný tiež ako gp⁹⁰MEL (myšací) lebo LAM-1 (ludský)). Viď Siegellman et al., Science, 243:1165-1172 (1989); Rosen, Celí Biology, 1:913-919 (1989) a Lásky et al. Celí, 56:1045-1055 (1989) ako sa tu zahrnuje odkazom. Navyše k lymfocytovému záchytu sa o LHR súdi, že pôsobí na počiatku v zápalových reakciách a sprostredkuje väzbu neutrofilov na endotélium.

Štruktúra ä funkcia'šélektínôvých receptorov bola objasnenia pomocou klónovania a expresie cDNA plnej dĺžky pre každý z vyššie uvedených receptorov (viď napr. Bevilacqua et al., Science, vyššie, (ELAM-1), Geng et al., vyššie (GMP 140), a Lásky et al., vyššie (MEL-14)). Extacelulárna časť selektínov sa dá rozdeliť na tri segmenty podlá homológií so skôr popísanými bielkovinami. Amínokoncová oblasť (asi 120 aminokyselín) je príbuzná s rodinou cicavčích lektínových bielkovín C-typu, ktorá zahrnuje nízkoafinitný IgE receptor CD23. Zvyšky 121 - 155 sú príbuzné s bielkovinami obsahujúcimi motív [motif] epidermálneho rastového faktoru (EGF). Po EGF doméne následuje 3 až 6 tandemových repetitívnych motívov, príbuzných tým, čo sa nachádzajú v regulačných bielkovinách komplementu.

Imunoglobulíny podía tohoto vynálezu rozoznávajú a selektívne viažu funkčné epitopy na ELAM-1 a takto inhibujú medzibunkovú adhéziu v in vitro testoch. Imunoglobulíny popísané tu ako príklady môžu byť využité v rôznych štandartných vyhladávacích postupoch na identifikáciu daíších imunoglobulínov v rozsahu tohoto vynálezu. Navyše, tu poskytnuté in vivo dôkazy preukazujú, že nárokované protilátky sú tiež účinné v liečení zápalových stavov sprostredkovaných ELAM-1. Funkčný epitop tak, ako sa tu používa, je antigénne miesto na ELAM-1, ktoré je selektívne viazané takou protilátkou, ktorá podstatne inhibuje väzbu Ugandu ELAM-1 k ELAM-1 receptoru a takto inhibuje chorobnú zápalovú reakciu v pacientovi. Pre účele tejto prihlášky, podstaná inhibícia je najmenej okolo 60 %, lepšie okolo 70 % až 90 % a častejšie okolo 99 % alebo viac (podlá merania v in vitro teste ako je popísané nižšie).

Rad protilátok bol identifikovaný vyhladávaním [screening] aktivovaných endoteliálnych buniek. Viď napr. Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., vyššie; Pober et al., J. Immunol., 136:1680 (1986); Graber et al., J. Immunol., 1.45:819-830 (1990); Leeuwenberg et al., J. Immunol., 156:2110-2114 (1990); Wellicome et al., J. Immunol., 144: 2558-2568 (1990); a PCT publikácie [PCT Publications] čís. WO 90/05768, WO 90/05539 a WO 90/13300, ako je tu zahrnuté odkazom.

Nárokované imunoglobulíny sú vhodné -m. namodifikácie s použitím velkého radu techník dostupných tým, čo sú zruční v produkcii a manipulácii rôznych imunoglobulínových molekúl. Niekoľko možných modifikácií sa podrobnejšie rozoberá nižšie.

Základná štruktúrna jednotka imunoglobulínu je tvorená známym tetrmérom. Každý teramér sa skladá z dvoch identických párov polypeptidových reťazcov, a každý pár má jeden ľahký (asi 25 kD) a jedn ťažký reťazec (asi 50 - 70 kD). Amínokoniec každého reťazca určuje variabilnú oblasť okolo 100 až 110 lebo viac aminokyselín primárne zodpovednú za rozoznanie antigénu. Karboxykoniec každého reťazca určuje konštantnú oblasť primárne zodpovednú za efektorovú funkciu.

Výraz imunoglobulin ako sa tu používa, označuje bielkovinu pozostávajúcu z jednoho lebo viac polypeptidov v podstate kódovaných imunoglobulínovými génmi. Poznané imunoglobulínové gény zahrnujú kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon a mí [mu] gény konštantných oblastí ako aj desaťtisíce [myriad] génov variabilných oblastí. Ľahké reťazce sa triedia na kapa a lambda. Ťažké reťazce sa triedia na gama, mi, alfa, delta, lebo epsilon, čo potom definuje príslušné triedy imunoglobulínov, IgG, IgM, IgA, IgD a IgE.

Imunoglobulíny môžu, vedia kompletných protilátok, existovať v rede rôznych foriem, ktoré zahrnujú napríklad Fv, Fab, F(ab’)₂, ako aj v jednovláknových formách (napr. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 85:5879-5883 (1988); Bird et al.

Science, 242:423-426 (1988), a Hunkapiller a Hood, Náture, 323:

15-16 (1986), ako je tu zahrnuté odkazom).

Pôsobením proteázy papaínu sa molekula štepí na tri fragmenty, z ktorých dva sa označujú Fab fragmenty a jeden F_c fragment. Každý Fab fragment sa skladá z domény viažúcej antigén a z C_H1 domény. Ďalšie proteolytické spracovanie Fab fragmentov uvolňuje Fv fragment, ktorý obsahuje len variabilnú oblasť. Proteáza pepsín štepí ťažký reťazec pri aminokyselinových zvyškoch 234 a 233 a poskytuje fragmenty F(ab')₂ a pFc'.

Fragment F_c, ktorý sa skladá z a C_H3 domén, je tou časťou imunoglobulínovej molekuly, ktorá sprostredkuje -rôzne efektorové funkcie. V závislosti na ťažkých reťazcoch v imunoglobulínoch existuje rad rôznych efektorových funkcií. Zahrnujú fixáciu komplementu, stimuláciu B buniek, pretrvanie v cirkulácii, a väzbu na F_c receptory na granulocytoch a makrofágoch pred fagocytózou. Viď, všeobecne, Fundamental Immunology, 2. vydanie, W.E. Paul, ed., Ravens Press N.Y. (1989), a Winkelhake, Immunochem., 15:695-714 (1978), ako je tu zahrnuté odkazom.

Imunoglobulíny podlá tohoto vynálezu-môžu byť produkované radom rôznych spôsobov. Produkcia monoklonálnych protilátok iných ako ludských, napr. myšacích, hlodavčích, konských atd. je dobre známa a dá sa vykonal, napríklad, imunizáciou zvieraťa izolovaným ELAM-1 receptorom, aktivovanými endoteliálnyini bunkami, lebo bunkami transformovanými DNA kódujúcou ELAM-1 receptor. Bunky prodkujúce protilátky, získané z imunizovaných zvierat, sa imortalizujú a hodnotia (are screened], alebo napred hodnotia na produkciu žiadanej protilátky a potom imortalizujú. Pre rozbor obecných postupov na produkciu monoklonálnych protilátok viď Harlow a Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) ako sa tu zahrnuje odkazom. K metódam vhodným na vytvorenie protilátok k ELAM-1 viď Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., vyššie;

Pober et al., J. Immunol., 136:1680 (1986); Graber et al., J. Immunol., 145:819-830 (1990); Leeuwenberg et al., J. Immunol., 156:2110-2114 (1990); Wellicome et al., J. Immunol., 144: 2558-2568 (1990); EP publikáciu [EP Publication] čis 408,859 A2; a PCT publikácie [PCT Publications] čís. WO 90/05768, WO 90/05539 a WO 90/13300, ako je tu zahrnuté odkazom.

Monoklonálne protilátky podía tohoto vynálazu sa prednostne hodnotia podía schopnosti inhibovať adhéziu sprostredkovanú ELAM-1 a inými selektinovými receptormi v testoch ako sú popísané nižšie v Príklade 1. Testy, ideálne, umožňujú vyhľadávanie a hodnotenie imunoglobulínov vo veíkom in vitro merítku. Mnohé priame a nepriame metódy na in vitro vyhľadávanie inhibítorov interakcií ligand-receptor sú dostupné a známe tým, čo majú príslušnú zručnosť. Mapríklad: Dá sa stanoviť schopnosť inhibovať adhéziu-buniek nesúcich ligand, ako sú-PMN, k bunkám exprimujúcim osobitný selektín. Ako sa rozoberá vyššie, gény selektinových receptorov boli boli naklónované, a tak tieto gény môžu byť vnášané a exprimované v širokej palete rôznych buniek, ako sú COS bunky, CHO bunky a podobné. Typicky, testovaný imunoglobulín sa inkubuje so značenými bunkami nesúcimi ligand a s aktivovanými bunkami nesúcimi selektín, ktoré sú imobilizované na pevnom povrchu. Inhibícia bunkovej adhézie sa potom, stanoví detekciou značky naviazanej k povrchu po vhodnom premývaní. V príklade stanovenia popísanom nižšie sa použili bunky PMN a aktivované ľudské endoteliálne bunky lebo aktivované doštičky.

Imunoglobulíny identifikované pomocou stanovení popísaných vyššie sú vhodné na rad rôznych farmaceutických, diagnostických a iných použití. Navyše k lečeniu a diagnostikovaniu selektínmi sprostredkovaných ochorení, plnšie poisaných nižšie, imonoglobuliny sa dajú použiť na vyhľadávanie iných monoklonálnych protilátok, čo rozoznávajú funkčný epitop. Takéto protilátky moču byť identifikované podľa ich schopnosti blokovať väzbu nárokovaných imunoglobulínov k bunkám exprimujúcim selektinový receptor.

Terapeutická účinnosť na ľuďoch však je, pokiaľ ide o iné ako ľudské protilátky, často obmedzená, pretože majú krátky poločas v sére a vyvolávajú ludské imunitné reakcie. Môže byť teda žiaduce modifikovať protilátky pre lepšie terapeutické využitie. Rad rôznych stratégií je dostupný na vylepšenie diagnostiky a terapie s použitím monoklonálnych protilátok, viď Waldmann, Sience 252:1657-1662 (1991), ako sa tu zahrnuje odkazom.

Jedna metóda vhodná na modifikáciu protilátok podlá tohoto vynálezu je prenesenie oblasti viažúcej antigén z protilátok iných ako ludských k častiam ludských protilátok. Napríklad: F(ab’)₂ fragment môže byť pripojený k ludskej konštantnej oblasti za tvorby chimérnych protilátok. Alternatívne: Hypervariabilné oblasti sa dajú pripojiť k základným [framework] ludským oblastiam za tvorby toho, čo sa tu nazýva poľudštené [humanized] protilátky. Takéto metódy sú všeobecne známe v obore a - sú popísané napríklad v'-U.S . Patent No4,816,397 , U.S. Patent No. 4,816,567, a EP publikáciách 173,494 a 239,400, PCT publikácii čís. WO/90/07861 a Reichmann, L. et al., Náture, 332:323-327 (1988), ako sa tu zahrnuje odkazom.

Chimérické a poludštené protilátky sa typicky konštruujú technikami rekombinantnej DNA zo segmentov génov patricich k rôznym druhom. Napríklad: Variabilný (V) segment z génu pre myšací imunoglobulín sa môže spojiť s ludským konštantným segmentom, ako je a τ₃· Preferovaná terapeutická chimérna protilátka je takto hybridná bielkovina pozostávajúca z V čiže antigén-viažucej domény myšacej protilátky a z C čiže efektorovej domény ludskej protilátky, aj keď sa dajú použiť aj iné cicavčie druhy.

Chimérické a poludštené protilátky majú rad potenciálnych výhod oproti myšacím protilátkam pri použití v humánnej terapii. Napríklad: Ľudský imunitný systém nemusí rozoznávať C oblasti chimérnych protilátok ako cudzie, a preto protilátková reakcia proti inekčne podanej chimérnej protilátke bude menšia ako proti celkom cudzej myšacej protilátke. Navyše, o inekčne podaných myšacích protilátkach sa hovorí, že majú v ludskom obehu o moc kratší poločas ako ludské protilátky tej istej triedy (Shaw et al., J. Immunol., 138:4534-4538 (1987). Je možné, že inekčne podané chimérne protilátky budú mať poločas bližší ludským protilátkam a umožnia dávať menšie a menej časté dávky.

Iná metóda na produkciu protilátok podľa tohoto vynálezu je izolácia DNA sekvencii ktoré kódujú ludskú monoklonálnu protilátku k iudskému lebo jej časti, selektinovému v knižnici

DNA z ludských čo sa špecificky viaže (viažu) receptoru, pomocou vyhľadávania B buniek podlá obecného protokolu načrtnutého v Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989), ako sa tu zahrnuje odkazom, a potom klónovaním a amplifikácoiu sekvencie, čo kóduje protilátku (lebo väzobný fragment) so žiadanou špecifitou.

V jednom smere je tento vynález zameraný na úseky rekombinantnej DNA kódujúce variabilné lebo hypervariabilné oblasti lahkých a/lebo ťažkých reťazcov z nárokovaných monoklonálnych protilátok. Úseky DNA·> kódujúce tieto oblasti sa typicky pripoja k úsekom DNA kódujúcim patričné konštantné oblasti, ako sú oblasti ludských gama ťažkých reťazcov lebo oblasti ludských lambda lahkých reťazcov. Kdo má skúsenosti rozpozná, že pre degeneráciu kodónov a substitúcie nie kritických aminokyselín, tieto sekvencie môžu byť lahko [readily] nahradené inými sekvenciami, ako sa rozoberá nižšie.

Úseky DNA budú typicky dalej zahrnovať DNA sekvencie na riadenie expresie funkčne naviazané ku kódujcim sekvenciam chimérnych protilátok, vrátane prirodzene príslušných lebo heterológnych promótorových oblastí. Prednostne, sekvencie riadiace expresiu budú eukaryotické promótorové systémy vo vektoroch schopných transformovať lebo transfekovať eukaryotické hostiteľské bunky. Akonáhle sa vektor inkorporuje do patričného hostiteľa, hostite! sa udržuje v podmienkach vhodných pre vysokú hladinu expresie nukleotidových sekvencii a môže nasledovať, podlá toho čo sa žiada, zbieranie a čistenie lahkých reťazcov, ťažkých reťazcov, dimérov lahkých a ťažkých reťazcov, alebo intaktných protilátok.

Dobre sa vie, že prirodzené imunoglobulinov sa budú, pokial ide o ich v dôsledku delécií, substitúcií, inzercií formy matúrnych dĺžku, trochu líšiť lebo adícií jednej lebo viac aminokyselín v danej sekvencii. Takto sú aj variabilné aj konštantné oblasti predmetom podstatnej prirodzenej modifikácie, ale stále sú v podstate identické a stále si môžu podržiavať svoje príslušné aktivity. DNA sekvencie ľudských konštantných oblastísa môžu izolovať podľa dobre známych postupov z radu rôznych ľudských buniek, ale prednostne z imortalizovaných B-buniek lebo dlhodobých ľudských B-buniek (Banchereau, et al., Science, 251:70-72 (1991), ako sa tu zahrnuje odkazom). Vhodný zdroj buniek pre DNA sekvencie a hostitelských buniek na expresiu a sekréciu sa dá získať z početných zdrojov, ako je Američan Type Culture Collection (Catalogue of Celí Lines and Hybridomas, Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, U.S.A., ako sa tu zahrnuje odkazom).

Navyše k týmto prirodzene sa vyskytujúcim formám imunoglobulínových reťazcov,., y podstate identické modifikované ťažké a ľahké reťazce sa dajú ľahko nevrhnúť a vyrobiť s použitím techník rekombinantnej DNA, dobre známych tým, čo sú zbehlí v obore. Napríklad: Reťazce sa môžu odlišovať od prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie na úrovni primárnej štruktúry niekoľkými substitúciami aminokyselín, koncovými a vnútornými adíciami a deléciami, a tak podobne. Alternatívne sa môžu produkovať polypeptidové fragmenty obsahujúce len časť (zvyčajne najmenej okolo 60-80 %, štruktúry, a tieto fragmenty typicky 90-95 majú jednu

%) primárnej lebo viac imunoglobulínových aktivít (napr. komplementu) pričom ale vykazujú nižšiu aktivitu vo imunogénicitu.

fixácii

Osobitne sa súdi, že tak ako mnohé gény, (aj) gény patriace imunoglobulínom obsahujú oddelené funkčné oblasti, z ktorých každá zodpovedá jednej lebo viac distinktným biologickým aktivitám. Tieto oblasti môžu byť fúzované k funkčným oblastiam z iných génov (napr. enzýmov) z vzniku fúznych bielkovín (napr. imunotoxínov), ktoré majú nové vlastnosti. Všeobecne sa môže modifikácia týchto génov vykonávať radom rôznych dobre známych techník, ako je cielená mutagenéza (viď Gillman a Smith, Gene, 8:81-97 (1979) a Roberts, S. et al., Náture, 328:731-734 (1987), ako sa tu zahrnuje odkazom).

Sekvencie nukleových kyselín podlá tohoto vynálezy schopné konečnej expresie žiadanej chimérnej protilátky môžu byt vytvárané z radu rôznych polynukleotidov (genomóvej lebo cDNA, RNA, atď.) a zložiek (napr. V, J, D, a C oblasti), ako aj radom rôznych techník. Spájanie patričných gen=omových sekvencii je v súčasnosti najbežnejšou metódou produkcie, ale dajú sa použiť, tiež sekvencie cDNA (European Patent Application Nos. 85102655.S,

85305604.2, 84302356.0 a 85115311.4, ak aj PCT Applications Nos. GB85/00392 a US86/02269, ako sa tu zahrnuje odkazom).

Ak bolo povedané už skôr, DNA sekvencie budú v hostitelovi exprimované po praktickom pripojení (to je po umiestnení, ktoré zaručuje fungovanie) vektory expresie sú organizmoch, či už k sekvenciam riadiacim typicky replikovatelné ako epizómy lebo ako expresiu. Tieto v hostitelských integrálna časť hostiteľskej chromozornáInej DNA. Bežne budú vektory expresie obsahovať selekčný marker, napr. tetracyklínový lebo neomycínový, aby bola umožnená detekcia tých buniek, čo sú transformované žiaducimi DNA sekvenciami (viď napr. U.S. Patent 4,704,36 2, ako je tu zahrnuté odkazom).

E. coli je jeden prokraryotický hostiteľ, osobitne užitočný na klónovanie DNA sekvencii podľa tohoto vynálezu. Ďalší mikrobiálni hostitelia vhodní pre použitie sú Bacillus subtilis, iné enterobaktérie ako Salmonella a Serratia, a rôzne druhy Pseudomonas. V týchto prokaryotických hostiteľoch sa dajú aj pripraviť vektory expresie, ktoré budú typicky obsahovať sekvencie riadiace expresiu kompatibilné s hostiteľskou bunkou (napr. počiatok replikácie). Navyše bude prítomný akýkoľvek počet z radu dobre známych promótorov, ako sú laktózový promótorový systém, tryptofánový promótorový systém (trp), beta-laktamázový promótorový systém lebo promótorový systém z fága lambda. Promótory budú typicky riadiť expresiu, podľa voľby aj s operátorovou sekvenciou, a budú mať sekvencie väzobného miesta ribozómu a tak podobne, na začatie a dovŕšenie transkripcie a translácie.

Iné mikróby, ako kvasinky, sa tiež dajú použiť na expresiu. Saccharomyces je preferovaný hostiteľ, s vhodnými vektormi majúcimi sekvencie riadenia expresie, ako sú promótory, vrátane 3-fosfoglycerát kinázového lebo iného glykolytického enzýmu, počiatky replikácie, terminačné sekvencie a tak podobne, ako sa žiada.

Navyše k mikroorganizmom, cicavčie bunky tkaňových kultúr sa tiež dajú použiť na produkciu polypeptidov podľa tohoto vynálezu {pozri Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987), ako sa tu zahrnuje odkazom). Eukaryotické bunky sú vo skutočnosti preferované, pretože v tomto obore bol vyvinutý istý počet vhodných hostiteľských bunečných línii schopných sekrécie intaktných imunoglobulínov, čo zahrnuje CHO bunečnú líniu, rôzne COS bunečné línie, HeLa bunky, myelómové bunečné línie, atď, ale prednostne transformované B-bunky a hybridómy. Vektory expresie pre tieto bunky môžu zahrnovať sekvencie riadenia expresie,.. ako. sú. počiatok, replikácie, promótor,.. enhancer (Queen, C. et al., Immunol. Rev., 89:49-68 (1986), ako sa tu zahrnuje odkazom), a potrebné miesta spracovania informácie, ako sú väzobné miesto ribozómu, miesto zostrihu RNA, polyadenylačné miesto, a sekvencie transkripčnej terminácie. Preferované sekvencie riadenia expresie sú promótory odvodené od imunoglobulínových génov, SV40, adenovírusu, vírusu bovinného papilómu, a podobné.

Vektory obsahujúce úseky DNA o ktoré je záujem (napr. sekvencie kódujúce ťažké a ľahké reťazce a sekvencie riadiace expresiu) sa dajú preniesť do hostiteľských buniek dobre známymi metódami, rozličnými v závislosti na type bunečného hostiteľa. Napríklad, transfekcia s chloridom vápenatým sa bežne používa pre prokaryotické bunky, zatiaľ čo pôsobenie fosforečnanu vápenatého sa dá použiť pre iných bunečných hostiteľov. Viď, obecne, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, (1989), ako je tu zahrnuté odkazom.

Akonáhle sú exprimované, celé chimérne protilátky, ich diméry, lebo individuálne ľahké a ťažké reťazce podľa tohoto vynálezu sa dajú purifikovať štandartnými postupmi tohoto oboru, vrátene zrážania síranom amónnym, frakčnej kolónovej chromatografie, gelovej elektroforézy a podobných {pozri, obecne,

Scopes, R., Proteín Purification, Springer-Verlág, N.Y. (1982)). Akonáhle sú purifikované, čiastočne lebo do homogenity, ako sa žiada, polypeptidy sa môžu používať terapeuticky lebo na vývoj a vykonávanie analytických postupov, imunofluorescentné farbenie a podobne (pozri, obecne, Immunological Methods, Zv. I a II, edit. Lefkovits a Pernis, Academic Press, new York, N.Y. (1979 a 1981) .

Prípravky podlá tohoto vynálezu obsahujú monoklonálne protilátky ktoré sa selektívne viažu k selektínovým receptorom na bunkách vo spojení s početnými poruchámi. Napríklad: Početné zápalové poruchy sú spojené so selektínmi exprimovanými na cievnych endoteliálnych bunkách. Termín zápal sa to používa ako odkaz na reakcie aj špecifického aj nešpecifického obranného systému. Reakcia špecifického obranného systému je reakcia špecif ického ...imúnneho.,!,., .systému ... . na .... antigén. ... Príklad reakcie špecifického obranného systému zahrnuje protilátkovú odpoveď na antigény, ako sú vírusy, a hypersenzitivitu následného typu [delayed-type]. Reakcia nešpecifického obranného systému je zápalová odpoveď sprostredkovaná leukocytmi, obecne neschopná imunologickej pamäti. Takéto bunky zahrnujú granulocyty a makrofágy. Príklady nešpecifických reakcií zahrnujú zbieranie PMN leukocytov v miestach bakteriálnej infekcie (napr. pulmonárne infiltráty pri bakteriálnych pneumóniach a tvorbu hnisu v abscesoch)·

Zápalové stavy liečitelné podlá tohoto vynálezu zahrnujú napr. septický šok, sepsu spojenú s poranením, reumatickú artritídu, postischemické leukocytmi sprostredkované poškodenie tkaní (reperfúzne poranenie), akútne leukocytmi sprostredkované poškodenie plúc (napr. poststresový respiračný syndróm despelých), poškodenie tkaní (napr. plúc) sprostredkované imunitným komplexom, a chronické zápalové stavy, vrátane atopickej dermatitídy a psoriázy. Navyše, metastézovaniu nádorov sa dá brániť inhibíciou adhézie cirkulujúcich nádorových buniek. Príklady zahrnujú karcinóm tlstého čreva a melanómy.

Protilátky a farmaceutické prostriedky z nich podlá tohoto vynálezu sú osobitne užitočné na parenterálne podanie, t.j.

podkožné, vnútrosvalové a inravenózne. Intaktné imunoglobulíny lebo ich väzobné fragmenty , ako sú Fab, F(ab')₂ atď. , sú vhodné na použitie vo famaceutických prostriedkoch. Navyše, vo vývoji je rad nových prístupov k podávaniu liekov [drug delivery], a farmaceutické prostriedky podlá tohoto vynálezu sú takisto vhodné na podávanie s použitím týchto nových metód. Viď Langer, Science,

249:1527-1533 (1990) ako sa tu zahrnuje odkazom.

V jednom príklade sa dajú protilátky podlá tohoto vynálezu používať na cielenie [to target] konvenčných protizápalových liekov na špecifické miesta poškodenia tkáne. Pri použití protilátok na cielenie lieku k ELAM-1 môže takýto liek dosiahnuť, vyššiu koncentráciu v miestach poškodenia. Vedlajšie efekty konvenčných protizápalových chemoterapeutických agens môžu byt podstatne zmiernené nižšími dávkami, lokalizáciou agens v mieste poškodenia. a/.lebo..inkapsuláciou agens .pred podaním.. . Protilátky môžu byt priamo lebo nepriamo spojené [coupled] s chemoterapeutickým agens. Spojenie, ktoré sa dá realizoval prostriedkami obecne známymi v obore, nesmie podstatne inhibovat schopnosť protilátky viazat receptor ani nesmie podstatne znižovať aktivitu chemoterapeutického agens. Rad rôznych chemoterapeutík sa dá pripájať s účelom cielenia. Napríklad: K protizápaíovým agens ktoré sa dajú pripájať patria imunomodulátory, antagonsti faktoru aktivujúceho doštičky (platelet activating factor,

PAF), inhibítory cyklooxygenázy, inhibítory lipoxygenázy, a antagonisti leukotriénov. Medzi preferované zvyšky [moieties] patria cyklosporín A, indomethacin, naproxen, FK-506, mykofenolová kyselina atď. Podobne, antioxidanty, napr. superoxid dismutáza, sú užitočné na liečenie reperfúzneho poškodenia. Podobne sa dajú cieliť protinádorové agens, ako sú daunomycin, doxorubicín, vinblastine, bleomycín atd.

Cielenie k selektínovému receptoru sa dá dosiahnuť aj pomocou amfipatov, čiže molekúl s podvojným charakterom (polárnym/nepolárnym) ktoré vo vodných roztokoch existujú ako agregáty. Amfipaty zahrnujú nepoláme lipidy, polárne lipidy, mono- a diglyceridy, sulfatidy, lyzolecitíny, fofolipidy, saponiny, žlčové kyseliny a sóle. Tieto molekuly môžu existovať ako emulzie a peny, micely, nerozpustné monovrstvy, tekuté kryštály, fosfolipidové disperzie a lamelárne vrstvy. Tieto sa tu druhovo označujú ako lipozómy. V takýchto prostriedkoch je liek, čo sa má podávať, časťou lipozómu pospolu s protilátkou podlá tohoto vynálezu. Keď sa lipozómy dostanú do blízkosti zasiahnutých buniek, dodávajú vybraný terapeutický prostriedok

Lipozómy podlá tohoto vynálezu sa vytvárajú zo štandartných lipidov tvoriacich vesikule, ktoré obecne zahrnujú neutrálne a záporne nabité fosfolipidy a sterol, ako je cholesterol. Výber lipidov sa riadi vzhíadom na napr. velkosť lipozómov a stabilitu lipozómov v krvnom obehu.

Cielenie lipozómov s použitím radu rôznych cieliacich agens (napr. ligandov, receptorov a monoklonálnych protilátok) je v obore dobre známe.. {Pozri, napr.U.S.. Patent Nos. 4,-957,773 a 4,603,044, ako sa tu zahrnuje odkazom). Dajú sa použiť štandartné metódy na spojenie cieliaceho agens a lipozómov. Lipozómy cielené pomocou protilátok sa dajú konštruovať pomocou, napríklad, lipozómov čo obsahujú proteín A. {Viď Renneisen et al., J. Biol. Chem., 265:16337-16342 (1990) a Leonetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2448-2451 (1990), ako sa tu zahrnuje odkazom).

Náboj lipozómu je dôležitou determinantou pri očisťovaní krvi od lipozómov, ..s tým, že záporne . nabité sú vychytávané retikuloendoteliálnym systémom rýchlejšie (Juliano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63:651 (1975)) a tak majú kratší poločas života v krvnom obehu. Lipozómy s predĺženým poločasom života v obehu sú typicky žiaduce pri terapeutickom a diagnostickom využití. Lipozómy, ktoré sa dajú udržať od 8, 12 lebo až po 24 hodín v krvnom obehu poskytujú trvalé uvoľňovanie protizápalového faktoru. Poločas života v sére môže byť tiež dôležitý ak sú lipozómy lebo protilátky značené na in vivo diagnostické zobrazovanie [imaging].

Rad rôznych metód je dostupných na prípravu lipozómov, ak je popísané napr. v Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. , 9:467 (1980), U.S. Patent NOS. 4,235,871, 4,501,728, a 4,837,028, ako sa tu zahrnuje odkazom. Jedna metóda vytvára multilamelárne vesikule, heterogénne pokiaľ ide o veľkosť. V tejto metóde sú lipidy tvoriace vesikule rozpustené vo vhodnom organickom rozpustidle lebo systéme rozpustidiel, a vysušené vo vákuu lebo pod inertným plynom za tvorby tenkého lipidového filmu. Ak je žiaduce, film sa môže znovu rozpustiť vo vhodnom rozpustidle, ako je terciárny butylalkohol, a potom lyofilizovať, aby sa vytvorila homogénnej šia lipidová zmes, ktorá je v ľahšie hydratovateľnej forme podobnej prášku. Tento film sa pokrýva vodným roztokom cieleného lieku [drug] a cieliacej zložky (protilátky) a ponecháva sa hydratovať, typicky behom 15 - 60 minút, s trepaním [agitation]. Rozdelenie veľkostí výsledných multilamelárnych vesikulí sa dá posunúť k menším veľkostiam za podmienok intenzívnejšieho trepania lebo pridaním solubilizačného detergentu, ako je dezoxycholát....._. ... . ...........

Hydratačné médium obsahuje cielený liek v koncentrácii, ktorá je žiaduce vo vnútornom objeme lipozómov v ich konečnej suspenzii. Typicky roztok lieku obsahuje 10-100 mg/ml v pufrovanej soli. Koncentrácia protilátky je obecne medzi asi 0.1 - 20 mg/ml.

Pretlačenie lipozómov cez polykarbonátovú membránu s malými pórmi lebo asymetrickú keramickú membránu je tiež účinná metóda na zmenšenie veľkosti lipozómov a na dosiahnutie pomerne dobre definovanej distribúcie veľkostí. Typicky suspenzia obieha raz lebo viac razy cez membránu dokiaľ sa nedosiahne žiadaná distribúcia veľkosti lipozómov. Lipozómy sa môžu pretláčať cez membrány so stupňované menšími pórmi na dosiahnutie postupného zníženia veľkosti lipozómov.

Aj s najúčinnejšími enkapsulačnými metódami pôvodné, čo do veľkosti upravené, lipozómy môžu obsahovať až do 50 % lebo viac lieku a cieliaceho agens vo voľnej (neenkapsulovanej) forme. Z tejto príčiny, aby sa maximalizovali výhody lipozomálneho cielenia liečiv, je dôležité odstrániť voľný liek a cieliace agens z konečnej suspenzie vhodnej na inekcie. Je dostupných niekoľko metód na odstránenie nezachytených látok zo suspenzie lipozómov. V jednej metóde sa lipozómy zo suspenzie usadzujú vysokoobrátkovou centrifugáciou a v supernatante zostávajú volné látky a veľmi malé lipozómy. Iná metóda zahrnuje koncentrovanie lipozómov ultrafiltráciou a koncentrované lipozómy sa potom resuspendujú v náhradnom médiu bez liekov. Alternatívne sa dá použiť gelová filtrácia na oddelenie veľkých lipozómov od molekúl v roztoku.

Po opracovaniu zameranom na odstránenie voľného liečiva a/lebo cieliaceho agens, sa lipozómová suspenzia upraví na žiadanú koncentráciu pre intravenózne podanie [administration]. Toto môže zahrnovať resuspendovanie lipozómov vo vhodnom objeme inekčného média, v ktorom boli lipozómy skoncentrované, napríklad centrifugáciou lebo ultrafiltráciou, alebo zahustenie suspenzie v prípade, že krok odstraňovania liečiva zvýšil celkový objem suspenzie. Suspenzia sa potom sterilizuje filtráciou. Preparáty lipozóm-ligand sa- potom môžu podávať ako je popísané nižšie.

Ako sa rozoberá vyššie, farmaceutické prostriedky (obsahujúce lipozómy lebo voľné protilátky) sú osobitne užitočné na parenterálne protilátky lebo podanie. Prostriedok bežne obsahuje roztok koktejl z nich, rozpustený v prijateľnom nosiči [carrier], prednostne vo vodnom nosiči. Rad rôznych nosičov je použiteľných, napr. voda, pufrovaná voda, 0,4 % soľ, 0,3 % glycín a podobne. Tieto roztoku sú sterilné a obecne neobsahujú čiastočkový materiál..Tieto prostriedky môžu byť sterilizované konvenčnými, dobre známymi technikami. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné vedľajšie sustancie, ktoré sú potrebné na priblíženie k fyziologickým podmienkam, ako sú látky na nastavenie pH a na pufrovanie, na úpravu tonicity (napr.

izotonickej) a podobné, napríklad octan chlorid draselný, chlorid vápenatý, sodný, chlorid sodný, laktát sodný, atď.

Koncentrácia protilátky v týchto formuláciách sa dá meniť v širokom rozsahu, od menej ako 0,5 %, cez obvyklých 1 % lebo najmenej 1 %, po tak vysokú ako je 15 až 20 % podľa váhy, a vyberá sa primárne na základe objemov kvapalín, viskozít, atď., v súlade s vybraným konkrétnym spôsobom podávania.

Takto sa typický farmaceutický prostriedok pre vnútrosvalové inekcie dá pripraviť tak, že obsahuje 1 ml sterilnej pufrovanej vody a 50 mg protilátky. Typický prostriedok pre intavenóznu infúziu sa dá pripraviť tak, že obsahuje 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 150 mg protilátky. Konkrétne metódy na prípravu parenterálne podávaných prostriedkov budú známe lebo jasné tým, čo sú zbehlí v obore a sú podrobnejšie popísané v napr. Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985), ako sa tu zahrnuje odkazom.

Protilátky podlá tohoto vynálezu sa dajú lyofilizovať na skladovanie a rekonštituovať vo vhodnom nosiči pred použitím. Táto technika sa ukázala ako efektívna s konvenčnými imunoglobulínmi a lyofilizačné a rekonštitučné techniky, ako sú známe v obore, sa dajú využiť. Tí, čo sú zbehli v obore uznajú, že lyofilizácia a rekonštitúciá môžu viesť; v rôznom stupni, ku stratám aktivity protilátok (napr. s konvenčnými imunoglobulínmi, IgM protilátky majú tendenciu strácať viac aktivity ako IgG protilátky) a že aplikované hladiny by sa mali prispôsobovať kvôli kompenzácii.

Prostriedky obsahujúce uvádzané protilátky lebo koktejly z nich sa môžu podávať na profylaktické a/lebo terapeutické pôsobenie. pacientovi

Pri terapeutickej aplikácii, v množstve dostatočnom prostriedky sa podávajú na vyliečenie alebo prinajmenšom na čiastočné obmedzenie infekcie lebo jej komplikácií. Množstvo adekvátne na to, aby sa tohoto dosiahlo je definované ako terapeuticky účinná dávka. Množstvá účinné pri takomto použití budú závislé na závažnosti [severity] choroby a na celkovom stave vlastného imunitného systému pacienta, ale obecne budú kolísať medzi asi 1 mg /kg telesnej váhy až asi 20 mg / kg telesnej váhy, s prednosťou medzi asi 5 mg / kg telesnej váhy až asi 15 mg / kg telesnej váhy. Musí sa myslieť na to, že materiály podlá tohoto vynálezu sa môžu obecne používať pri vážnych chorobných stavoch, to je pri situáciách ohrozujúcich život lebo potenciálne ohrozujúcich život. V takýchto prípadoch, so zretelom na minimalizáciu cudzorodých látok a na nízku pravdepodobnosť odmietnutia cudzích látok, ktorá sa dosahuje ludskými chimérnymi protilátkami podlá tohoto vynálezu, je možné a ošetrujúci lekár môže pociťovať ako žiaduce, podávať podstatný prebytok týchto protilátok.

Pri profylaktickej aplikácii sa prostriedky obsahujúce uvádzané protilátky lebo koktejly z nich podávajú pacientovi, ktorý ešte nie je v chorobom stave na zvýšenie jeho odolnosti. Takéto množstvo je definované ako profylaktický účinná dávka. Pri takomto použití sú presné množstvá opäť závislé na pacientovom stave a zdraví a obecnej úrovni imunity, ale celkovo sú v rozsahu popísanom vyššie.

Jednorázové lebo opakované podávanie prostriedkov môže prebiehať s dávkovou hladinou a so systémom [pattern], aké vyberie ošetrujúci lekár. V každom prípade majú farmaceutické prostriedky poskytnúť také množstvo protilátky (protilátok) podlá tohoto vynálezu, aké je dostatočné na účinnú -liečbu pacienta.Protilátky podlá tohoto vynálezu sa tiež dajú použiť na diagnostické účele, ako je určenie oblasti zápalu. Pre diagnostické účele môžu byť protilátky buď značené lebo neznačené. Neznačené protilátky možno používať v kombinácii s inými, značenými protilátkami (druhými protilátkami), ktoré reagujú s danou protilátkou, ako sú protilátky špecifické pre konkrétnu konštantnú oblasť imunoglobulínu. Alternatívne môžu byť protilátky priamo značené. Dá sa použiť značenie zo širokého výberu, ako je z rádionuklidov, fluorescenčných zlúčenín, enzýmov, enzýmových substrátov, enzýmových kofaktorov, ligandov (prednostne hapténov), atď. Početné typy imunostanovení sú dostupné a dobre známe tým, čo sú zbehlí v obore.

Pri profylaktickej aplikácii sa prípravky obsahujúce protilátky lebo koktejly z nich podávajú pacientovi, u ktorého je podozrenie na zápalový chorobný stav. Alternatívne sa dá sledovať účinnosť konkrétnej liečby. Množstvo na to potrebné je definované ako diagnosticky účinná dávka. Pri tomto použití presné množstvá budú závisieť na pacientovom stave a zdraví a podobne.

Súpravy s predmentnými protilátkami sa tiež môžu dodávať. Takto sa môžu poskytovať skladby [compositions] predmetnej protilátky, zvyčajne v lyofilizovanej forme a v zásobníku, či už samotnej lebo v kombinácii s ďalšími protilátkami špecifickými k žiadanému typu buniek. Protilátky, ktoré môžu byť konjugované k značke lebo toxínu alebo s puframi, ak je Tris, stabilizátormi, biocidmi, nekonjugované, patria k súprave fosforečnan, uhličitan a p., inertnými bielkovinámi, napr.

sérovým albumínom, a so súborom návodov k použitiu. Obecne budú prídavky materiálu prítomné v menej ako 5 % váhy, počítané na aktívnu protilátku, a obyčajne v celkovom množstve najmenej

0,001 % váhy, počítané opäť na koncentráciu protilátky. Často bude žiaduce zahrnúť inertný zväčšovač objemu lebo excipient na zriedenie aktívnych zložiek, kde excipient môže byť prítomný vo forme 1 až 99 % váhy celkovej skladby. Ak sa vo stanovení používa druhá protilátka schopná väzby na chimérnu protilátku, bude obyčajne obsiahnutá v samostatnej liekovke. Druhá protilátka je typicky konjugoyaná so značkou a formulovaná„podobným spôsobom ako pri formuláciách protilátok popísaných vyššie.

Nasledujúce príklady sa poskytujú ako ilustrácie, nie obmedzenia.

Príklad 1

Tento príklad ukazuje schopnosť monoklonálnych protilátok podlá tohoto vynálezu blokovať adhéziu neutrofilov (PMN) k aktivovaným cievnym endoteliálnym bunkám pri stanovení intracelulárnej adhézie. Postup stanovenie bol ako následuje:

tudské pupočné šnôry boli získané po pôrodoch. Použili sa ich časti dĺžky 20-40 cm a bez stôp po podviazaní. Za sterilných podmienok sa jeden koniec žily časti pupočnej šnôry kanyloval a pripojil k trojcestnému kohútu a inekčnej striekačke. Šnôra bola premytá solou pufrovanou fosfátom [phoshate buffered saline, PBS] neobsahujúcou Ca+/Mg+, aby sa odstránila krv a zrazeniny. Potom sa kanyloval opačný koniec šnôry a pripojil k dvojcestnému kohútu; následovalo krátke prepláchnutie kolagenázou (Boehringer Mannheim) 1 mg/ml a dvojcestný kohút bol uzavretý. Šnôra bola potom naplnená kolagenázou, bol odstránený vzduch, a trojcestný kohút bol uzavretý. Šnôra bola umiestnená do sterilej komôrky a inkubovaná pri 37°C po 15-20 minút. Po inkubácii bola šnôra premytá 30 ml PBS obsahujúceho Ca⁺⁺ a Mg⁺⁺ a eluované endoteliálne bunky sa zbierali v sterilnej skúmavke obsahujúcej 5 ml EGM-UV média (Clonetics) a 10 % FCS aby sa inhibovalo ďalšie pôsobenie kolagenázy. Bunky sa scentrifugovali a resuspendovali v kompletnom médiu obsahujúcom EGM-UV, 10 ng/ml epidermálny rastový faktor, 1 úg/ml hydrokortizón, Gentamicin, Amphotericin-B, a 10 % FCS. Fiaša na tkaňové kultúry vhodnej velkosti (podľa dlĺžky úseku šnôry) bola pokrývaná 0,1 % želatínou (neobsahujúcou endotoxín, izolovanou z bovinného epidermu) po 15 min. pri izbovej teplote a prebytok sa odstránil. Suspenzia endoteliálnych buniek sa preniesla do fľaše a umiestnila v inkubátore s 5 % CO₂ . Médium bolo vymenené po 16 hodinách, .keď sa..... zdalo, že bunky sa prichytávajú. Bunky boli pasážované pred konfluenciou (75 %). Na pasážovanie buniek bolo médium odsaté pomocou vákua, fľaša premytá dva razy HEPES (10 mM) pufrovanou solou na odstránenie FCS a potom sa do fľaše pridalo 1-2 ml 0,025 % trypsín EDTA a flaša sa prezerala v inverznom mikroskope dokiaľ sa endoteliálne bunky dostali do suspenzie (30 sec až 1 min), čerstvé kompletné médium sa potom pridalo do fľaše a rozdelilo 1:2 lebo 1:3 do nových želatínou pokrytých fliaš.

Na vytvorenie monovrstiev endoteliálnych buniek na 96-jamkových testovacích platničkách sa platničky pokrývali želatínou, ako je popísané vyššie. Endoteliálne bunky, ktoré boli pasážované 3 razy, boli zobrané z fliaš s použitím 0,025 % trypsínu ako vyššie a nanesené 5 x 10⁴ buniek na jamku. Bunky boli ponechané narásť do konfluencie. Médium sa vymenilo po nanesení jeden raz.

Neutrofily (PMN) boli pripravené z celej krvi. 50 ml krvi bolo odobraných od dobrovoľného darcu do heparinizovaných vacutainer skúmavok. Vždy 25 ml krvi bolo navrstvených nad 15 ml Mono-Poly separačného média (Mono-Poly Resolving Médium] (Flow Labs). Skúmavky boli centrifugované pri 20°C po 25 minút, pri 2 000 obrátkach za minútu v centrifúge RT6000 a potom bola rýchlosť zvýšená na 2 500 obrátok za minútu na ďalších 25 minút. Vrstva PNM (nižšia zo dvoch vrstiev vznášajúcich sa buniek) bola prenesená do čistej 50 cm³ centrifugačnej skúmavky. Do každej skúmavky bolo potom pridané 30 ml Hankovho soľného roztoku [Hanks Balanced Sált Solution] (HBBS) (Gibco) obsahujúceho 20 mM HEPES (Gibco) a 0,2 % glukózu (Fisher). Skúmavky boli potom centrifugované pri 3 000 obrátkach za minútu po 3 minúty pri izbovej teplote a resuspendované v HBSS/HEPES/glukózovom pufre tri razy a spočítané s pomocou hemacytometru.

Aby sa vykonali stanovenia, testovacie platničky sa vybrali z inkubátora a adherentné bunky sa premývali dva razy HBSS/HEPES/glukózou + 5 mg/ml bovinným sérovým albumínom. 100 μΐ každej testovanej monoklonálnaj protilátky sa pridalo do jamiek testovacej platničky. Protilátky sa inkubovali na platničke 20 minút. 5 x 10⁵ PMN sa pridalo, do jamiek v.50 μΐ. Platničky sa potom inkubovali 6 minút pri izbovej teplote. Neadherované bunky sa odstránili z jamiek obrátením platničky nad výlevkou a pridávaním 200 μΐ média s použitím viackanálovej pipety po štyri razy. Posledná premývacia kvapalina sa odstránila z jamiek a pridalo sa 50 μΐ Solubilizačného pufru. Tento pozostával z citrátového pufru (24,3 ml 0,1 M kyseliny citrónovej,

10,5 g/500 ml + 25,7 ml 0,2 M hydrogenfosforečnanu sodného, 1,42 g/500 ml a SQ H₂0 do 100 ml) obsahujúceho 0,1 % NP-40 detergentu. Platnička sa inkubovala s jemným miešaním 10 minút a potom sa pridalo do každej jamky 50 μΐ OPDA (8 mg o-fenyléndiamínu, Sigma kat. č. P-1526, 8 μΐ 30 % H₂O₂ a 10 ml SQ H₂0). Platničky sa inkubovali 15 minút pri izbovej teplote a potom sa pridalo 15 μΐ 4 M H₂SO₄ do každej jamky na zastavenie reakcie. Kontrolná zmes činidiel bola pripravená zmiešaním 50 μΐ solubilizačného pufru, 50 μΐ roztoku OPDA a μΐ 4 prenieslo

M H₂SO₄. 100 μΐ sa odobralo z každej jamky a do pružnej ELISA testovacej platničky (Falcon).

Platnička bola premeraná [scanned] pri 492 nm do 30 minút.

Navyše sa použili karcinómové bunky colo 205 (ATCC No. CCL 2 25) o ktorých sa vie, že exprimujú SLX. Pretože tieto bunky nenesú F_c receptor, nemalo by dochádzať ku krížovému previazaniu monoklonálnymi protilátkami. Postup stanovenia bol rovnaký ako je popísané vyššie pre PMN. Bunky však boli značené ⁵¹Cr (50 μΟί/Έυη^ po 30 min.). Adhézia bola zisťovaná s použitím gama počítača a štandartných postupov.

Výsledky prezentované v Tabulke 1 nižšie ukazujú, že monoklonálne protilátky podlá tohoto vynálezu účinne blokujú adhéziu PMN a Colo 205 buniek k aktivovaným endoteliálnym bunkám. Predchádzajúca monoklonálna protilátka z oboru, H18/7 (popísaná v PCT Publication No. WO 90/05539, vyššie) bola zahrnutá ako kontrola. Kvantite väazby v neprítomnosti protilátok bola arbitrárne priradená hodnota 1,0. Protilátky, ktoré podporujú väzbu vo stanovení majú hodnotu väčšiu ako 1, zatial čo protilátky ktoré inhibujú väzbu majú hodnotu menej ako 1.

Tabulka 1

Väzba buniek k HUVEC v prítomnosti a neprítomnosti protilátok k ELAM-1

Mab Podtrieda PMN Karcinómové (Colo 205)

Žiadne	IgG1	1,00	1,00
EB1-5	IgGi	1,42	0,08
ENB1-6	IgGi	1,64	0,76
EB1-7	IgGx	1,48	0,10
EB3-1	IgG3	0,18	0,12
EB3-2	IgG3	0,3	0,12
EBM-2	IgGx	0,21	0,12
EBM-4	IgGx	0,28	0,10
H18/7	IgG2 a lebo b	1,20	0,16

Príklad 2

Tento príklad prezentuje dáta kompetitívneho inhibičného stanovenia použitého na porovnanie epitopu rozoznávaného monoklonálnymi protilátkami podlá tohoto vynálezu s epitopom rozoznávaným mononoklonálnou protilátkou prvšie identifikovanou ako viažucou ELAM-1 (H18/7). Aby sa to vykonalo, H18/7 bola biotinylovaná a farbenie HRP-avidinom sa zistovalo pomocou ELISA na pevnej fáze na entoteliálnych bunkách aktivovaných IL-1, podlá štandartných postupov (viď napr. Harlow a Lane, vyššie). Udané hodnoty sú absrobancie pri 492 nm.

Ako ukazujú výsledky v Tabulke 2, našiel sa istý rozsah [a range] inhibicie väzby H18/7.

Tabulka 2

Blokujúca Mab	Biotinylovaná Mab	HRP-avidín
Kontrola	H18/7	1,175
H18/7	H18/7	0,309
EB1-1	H18/7	1,021
EB3-1	H18/7	0,830
ENB1-6	H18/7	0,346

Príklad 3

Tento príklad ukazuje schopnosť monoklonálnych protilátok podlá tohoto vynálezu blokovať adhéziu neutrofilov (PMN) k aktivovaným doštičkám [platelets] (nesúcim GMP-140) v medzibunkovom teste. Výsledky takýchto stanovení sú prezentované v Tabulke 3, ktorá ukazuje relatívnu adhéziu PMN lebo Colo 205 buniek na aktivované doštičky v prítomnosti týchto monoklonálnych protilátok podlá tohoto vynálezu. Postup stanovenia bol ako následuje:

Platničky sa získali z normálneho ludského darcu a boli premyté od plazmatických bielkovín v prítomnosti PGE-^ (100 nM) (pozri Polley a Nachman, J. Exp. Med., 158:603 (1983) ako je tu zahrnuté odkazom). Boli aktivované trombínom (0,25 U/ml; 2 x 10® doštičiek na ml) po 20 minút pri izbovej teplote bez miešania.

Na určenie adhézie sprostredkovanej GMP-140 k aktivovaným doštičkám sa použili dve stanovenia: stanovenie na testovacích platničkách a v kvapalnej fáze. Stanovenie na testovacích platničkách je modifikácia stanovenia adherencie endoteliálnych buniek a neutrofilov popísaného skôr (Dobrina et al., Immunology, 158:502 (1989) ako sa tu zahrnuje odkazom). Suspenzia doštičiek (300 μΐ, 10⁸/ml) bola daná do každej jamky 48-jamkovej testovacej platničky, ktorá bola predom pokrytá 0,1 % želatínou. Platnička bola . inkubovaná 15 minút .. pri. 37°C, potom, centri f ugovaná 2 minúty pri 90 x g a umytá dva razy fosfátom pufrovanou soľou (PBS) aby sa odstránili neadherované doštičky. Na blokovanie dostičkového F_c receptoru sa do každej jamky pridalo 300 μΐ tepelne agregovaného IgG (20 μΐ/ml) a platnička sa nechala stáť pri izbovej teplote 20 minút. Platnička sa premyla raz PBS a potom sa pridalo 300 μΐ monoklonálnej protilátky, čo sa testovala, a platnička sa nechala stáť pri izbovej teplote ďalších 20 minút. Medzitým boli izolované neutrofily z kompletnej ľudskej krvi metódou popísanou vyššie. Boli rádioaktívne oznacene ^xCr (pridalo sa 450 μθί k 3 x 10⁶ buniek v 300 μΐ a inkubovalo sa 60 minút pri 37°C), premyté tri razy RPMI obsahujúcim 10 % fetálne teľacie sérum, a resuspendované na 2 x 10⁸/ml. 50 μΐ tejto suspenzie bolo pridaných do každej jamky testovacej platničky. Platnička bola centrifugovaná 2 minúty pri 90 x g a potom ponechaná stáť 5 minút pri izbovej teplote. Nenaviazané bunky boli odstránené trojnásobným umytím PBS a zostávajúce naviazané bunky boli uvoľnené z platničky pomocou pufru obsahujúceho SDS a potom zpracované na meranie rádioaktivity.

Stanovenie v kvapalnej fáze sa vykonalo modifikáciou popísaného (pozri Larsen et al., Celí, 63:467 (1990) ako sa tu Q zahrnuje odkazom). 20 μΐ aktivovaných doštičiek (2 x 10 /ml) sa dalo do Eppedorfovej skúmavky. Pridalo sa 20 μΐ tepelne inaktivovaného IgG a po premiešaní sa skúmavky nechali stáť pri izbovej teplote 20 minút. Pridalo sa 20 μΐ monoklonálnej protilátky a skúmavky sa nechali stáť ďalších 20 minút pri izbovej teplote. Medzitým sa pripravili PMN ako vyššie (bez rádioaktívneho značenia) a nariedili na 2 x 10°/ml. 20 μΐ tejto supenzie boli pridaných do každej skúmavky a skúmavky sa nechali stáť 20 minút pri izbovej teplote. Adhézia sa hodnotila mikroskopicky a bola vyjadrená ako percento testovaných buniek, ktoré viazali dve lebo viac doštičiek.

Navyše sa vykonali stanovenia s použitím buniek odvodených od karcinómu tlstého čreva, Colo 205 (ATCC No. CCL 222), o ktorých sa vie že exprimujú ligand rozoznávaný selektínovým receptorom. Postup stanovenia bol rovnaký ako postup používaný s PMN. ............................... ....................... . ........ . ...................... ............ .... .. ....

Tabulka 3

Precipituje

MAb	PMN	Karcinómové (Colo 205)	purifikované GMP-140
Žiadne	+	+	• · ·
GBI-1	-	-	+
GBI-2	-	-	+
GNBI-3	+	+	+
Príklad 4

Tento príklad ukazuje účinnosť mAb EB3-1 vo zvieracom modeli liposacharidami indukovanej smrti. Potkaní systém bol vybraný pretože pre EB3-1 sa preukázalo, že krížovo reaguje s potkaním ekvivalentom ELAM-1.

LPS z E. coli 0111:B4 (Sigma, Lot #36F4019) boli čerstvo pripravené z jednej porcie [single lot], jeden deň pred použitím, rozpustením v sterilnom, pyrogénov prostom, soľnom roztoku v koncentrácii 5 mg/ml. Roztok bol sonikovaný na ľade 30 sekúnd s použitím Tekmark Sonic dezintegrátora. Tesne pred použitím bol roztok sonikovaný druhý raz po 30 sekúnd.

Samice Lewisových potkanov váhy 200 g (± 10 g) boli získané z Charles River Breeding Labs a držané najmenej 7 dní po dodávke (na adaptáciu). Používali sa skupiny 10 zvierat ak sa neuvádza inak. Všetky reagencie boli podané inekčne parenterálne, cez chvostovú žilu a 0,5 - 1,0 ml/kg. Ako negatívnu kontrolu dostali zvieratá bud sterilný solný roztok, prostý LPS, lebo myšací IgG3k myelómový proteín (J606, nízky pyrogén - < 2 ng / mg proteínu).

K protokolu EB3-1 dávok a rozvrhu sa dospelo empiricky z farmakokinetických dát získaných s EB3-1 podávanou potkanom profylaktický. Minimálna LD₁₀₀ dávka LPS pre týchto potkanov bola stanovená ako 7,5 mg/Kg.

V jednom experimente sa potkanom podalo 10 mg/kg P6E2 jednu hodinu pred atakom......[chalenge] ..LPS. . Zosilova.cia^dávka... [a. bo.ost. dosej sa podala tri hodiny po ataku (1,0 mg/kg). 4/10 pokusných zvierat prežilo LPS atak. Naproti tomu všetkých 10 kontrol (čo dostali inekciu roztoku soli) zahynulo. Behom 24-hodinového pozorovacieho obdobia mali prežívajúce zvieratá málo klinických známok charakteristických pre zvieratá, na ktoré sa pôsobilo LPS.

Potom sme skúšali dávky EB3-1, ktoré boli (1) dva razy vyššie a (2) o rád nižšie ako dávka 10 mg/kg použitá v prvom experimente. Výsledky ukazujú, že EB3-1 má signifikantný účinok: 80 % zvierat prežilo pri dávke 10 mg/kg (Obr.1). Všimni si, že jedno zviera prežilo vo skupine kontrol čo dostali inekciu roztoku soli - napovedá to, že skupina táto skupina zvierat nebola zasiahnutá atakom LPS tak tvrdo ako boli zvieratá v predošlom pokuse.

Iná štúdia sa vykonala na to, aby sa ukázala terapeutická hodnota EB3-1. Zvieratá dostali iv bolus dávku 10 mg/kg 1 hodinu pred lebo 2, 4, či 6 hodín po ataku LPS.

Odznovu tento raz, prežilo 1 z 10 zvierat čo dostali solný roztok, ako aj zo skupiny čo dostala 10 mg/kg J606 myelomového proteínu v čase T = - 60 minút (Obr. 2). Pritom však EB3-1 mala signifikantný ochranný účinok dokonca keď bola podaná 2 lebo hodiny po LPS.

Záver

Ochrana pozorovaná s Cytel mAb EB3-1 ukazuje, že protilátky podlá tohoto vynálezu sú užitočné ako terapeuticky v liečení zápalových sprostredkovaných ELAM-1.

profylaktický tak aj chorobných reakcií

Príklad 5

Tento príklad ukazuje účinnosť purifikovanej EB3-1 protilátky v inhibícii zápalovej reakcie vyvolanej lipoteichoovou kyselinou (lipotechoic acid, LTA) v potkanej pleurálnej dutine. Schopnosť LTA vyvolávať pleuritídu bola stanovená s lineárnou závislosťou dávkovej koncentrácie a infiltrácie neutrofilov. 0 LTA sa tiež ukázalo, že... aktivuje, endotélium ..prostredníctvom ELAM-1 k adhézii neutrofilov in vitro (viď Príklad 6, nižšie).

V tomto pokuse sme indukovali pleuritídu v potkanoch obojstrannou inekciou LTA do pleurálnej dutiny. V testovaných zvieratách následovalo inekčné podanie mAb do chvostovej žily. Dutiny boli prepláchnuté po 4 hodinách a hodnotenie sa vykonalo podlá koncentrácie neutrofilov v exudátoch.

Postup:

1. LTA (Sigma Cat #L-2515 Lot 89F4061) bola pripravená na mg/ml v sterilnom roztoku soli prostom endotoxínu a pyrogénov a skladovaná pri - 70°C. Z tejto sa pripravil zásobný 750 μg/ml roztok rozpustením 1,41 ml LTA a 2,34 ml soľného roztoku. Finálna koncentrácia 300 μg / 400 μΐ na jednoho potkana.

2. EB3-1 purifikované ascity (šarža 6) boli 4,5 mg/ml a boli zriedené v DPBS na konečnú koncentráciu 3,33 mg/ml. Podaná dávka na jednoho potkana bola 600 μΐ obsahujúcich 2 mg (10 mg/Mg) sonikovaná 1.5 min.

3. Deväť trojmesačných samíc Lewisových potkanov, vážiacich okolo 195 gramov, bolo použitých. Všetky boli narkotizované inhaláciou metaphanu.

4. Potkany boli rozdelené do troch skupín,

A. Kontrola n = 1 : Dostali 200 μΐ DPBS do oboch strán pleurálnej dutiny. Dostali 600 μΐ sterilného roztoku soli, prostého endotoxínu a pyrogénov, inekčne do chvostovej žily jednu hodinu po pleurálnej inekcii.

B. Podrobené účinku LTA a EB3-1: n = 4 Dostali

150 μΐ dutiny, inekčne inekcii.

LTA v 200 μΐ

Dostali 600 μΐ do chvostovej

DPBS do oboch strán pleurálnej (10 mg/'Kg, 2 mg celkovo) žily jednu hodinu po pleurálnej

EB3-1

C. Podrobené len účinku LTA : n = 4 Dostali 150 μΐ LTA v 200 μΐ DPBS do oboch strán pleurálnej dutiny. Dostali

600 μΐ DPBS inekčne do chvostovej žily jednu hodinu po pleurálnej inekcii.

5. Potkanom sa. dávali inekcie medzi...tretím .. a piatym rebrom ihlou čís. 30, s rovnou špicou, a 1 cm³ striekačkou. Inekcie do chvostovej žily sa dávali s predchádzajúcim zohrievaním potkanov pod zohrievacou lampou, aby sa žily stali výraznejšími, a vykonali sa ihlou čís. 26 a 3 cm³ striekačkou.

6. Potkany boli nazad v klietkách 3,5 hodiny po inekcii do chvostovej žily, 4,5 hodiny celkovo.

7. Potkany boli zabité inhaláciou metaphanu.

8. Peritoneálna dutina bola otvorená aby sa odkryla pobrušnica. Spravil sa malý rez na každej strane pobrušnice a každá strana bola premytá 1 ml heparinizovaného DPBS s použitím tupej špice 1 cm³ striekačky (bez ihly) a tekutiny boli spojené.

9. Zaznamenal sa celkový objem, bunky boli spočítané a scentrifugované. Suspendované boli v 100 μΐ solného roztoku a z každej suspenzie sa spravil náter na podložné sklíčko, aby sa farbil rôznymi rýchlymi farbivámi na diferenčnú analýzu.

Výsledky tohoto pokusu sú v Obr. 3, ktorý ukazuje, že EB3-1 je účinná v inhibicii pleuritídy indukovanej LTA. Protilátka inhibovala migráciu PMN do pleurálnej dutiny z 80 %.

Príklad 6

Tento príklad preukazuje, že bakteriálne produkty Lipoplysacharídy (LPS) a Lipoteichoová kyselina (LTA) indukujú expresiu ELAM-l na cievnych endoteliálnych bunkách. Aby sa to dosiahlo, schopnosť ludských neutrofilov (PMN) viazať sa ku kultivovaným ludským endoteliálnym bunkám sa merala po predchádzajúcom in vitro pôsobení rôznych koncentrácií LPS a LTA.

Postup

1. Zásobné roztoky LPS (Lot # 36F4019) a LTA (Sigma

Cat # L-2515 Lot 89F4061) boli pripravené na 1 mg/ml sonikáciou v roztoku soli tesne pred použitím. Zásobné roztoky sa· nariedili čerstvým ...médiom., EGM-UV. (Clonetics) na pracovné koncentrácie 100 μg/ml, 50 p.g/ml, 25 μg/ml, 12 μg/ml, 6 μg/ml, 3 μg/ml, 1,5 μg/ml, 0,75 μg/ml,

0,37 μg/ml, 0,19 μg/ml a 0,09 μg/ml. Z inkubátora sa vybrala jedna 96-jamková klastrovacia platňa (cluster dish] (Costar) následne po narastení buniek HUVEC šnôry # 115, pasáže 4, do konfluencie na želatíne. Médium z každej jamky sa odstránilo Pasteurovou pipetou a nahradilo buď 0,2 ml čerstvého EGM-UV média alebo tým istým objemom pracovných nariedeni LPS lebo LTA. Každé nariedenie sa analýzovalo trojmo. Platňa sa dala nazad do 37°C inkubátora s 5 % CO2 na 4 hodiny.

3. Neutrofily (PMN) boli pripravené ako v Príklade 1. PMN boli držané pri izbovej 1,04 x 10⁸ PMN a istom pufri ale albumínu.

Testovacia platňa teplote behom celej preparácie. Získalo sa resuspendovalo na 6 x 10⁵ / 25 μΐ v tom obsahujúcom 5 mg/ml bovinného sérového so stimulovanými HUVEC bunkami sa vybrala z inkubátora a jamky sa premyli dva razy RPMI 1640 obsahujúcim 5 mg/ml bovinného sérového albumínu (BSA).

Po druhom premytí sa jamky naplnili 100 μΐ toho istého pufru.

.

5. 0,025 ml bunečnej suspenzie sa pridalo do jamiek stimulovanej testovacej platne.

6. Platne sa inkubovali 5 minút pri 37°C.

7. Nenaviazané bunky sa odstránili z jamiek testovacej platne systematickým resuspendovaním s použitím p200 viackanálovej pipety s následným pridaním a odohraním 0,2 ml média.

8. Všetko médium sa odstránilo z jamiek a a pridalo sa 50 μΐ solubilizačného pufru. Tento pozostával z citrátového pufru (24,3 ml 0,1 M kyseliny citrónovej, 10,5 g/500 ml + 25,7 ml 0,2 M hydrogenfosforečnanu sodného, 1,42 g/500 ml a SQ H₂0 do 100 ml) obsahujúceho 0,1 % NP-40 detergentu.

9. Platnička sa inkubovala na rotačnej trepačke 10 minút a potom sa pridalo do každej jamky 0,05 ml OPDA (8 mg o-fenyléndiamínu, Sigma kat. č. P-1526, 8 μΐ 30 % H₂O₂ a 10. ml citrátového pufr.u.,..[ako„...vyšš.ieReakcia., sa nechala vyvýjať 15 minút a potom sa pridalo 25 μΐ 4 M H₂SO₄ ^{do ka}ždej jamky na zastavenie reakcie.

10. Kontrolná zmes činidiel bola pripravená zmiešaním 100 μΐ objemov solubilizačného pufru a roztoku OPDA a 50 μΐ 4 M H₂SO₄.

11. 100 μΐ supernatantu sa odobralo z každých dvoch jamiek a prenieslo do pružnej ELISA testovacej platničky nm do 30

Platnička bola premeraná [scanned] pri 492 (Falcon). minút.

Výsledky ukazuje, že neutrofílov najúčinnejší tohoto pokusu sú predvedené ako LPS tak aj LTA indukujú na ľudských endoteliálnych medzi 0,2 a 5 μg/ml. LTA bola v Obr.

adhézne bunkách.

najúčinnejša medzi

4, ktorý molekuly LPS bol

5a 50 μg/ml. Pri optimálnej koncentrácii každej zlúčeniny indukoval LPS 2-3 razy vyššiu adhéziu neutrofilov. ako LTA.

Príklad 7

Tento príklad preukazuje, že adhézia neutrofilov k LPS a LTA aktivovanému endotéliu pozorovaná v Príklade 6 je sprostredkovaná ELAM-1.

Skúmal sa aj optimálny čas aktivácie endotélia každým endotoxínom. Merali sme schopnosť ludských neutrofilov (PMN) viazat sa k LTA a LPS aktivovaným kultivovaným ludským endoteliálnym bunkám v rôznych časoch po pridaní aktivačného agens, za prítomnosti lebo neprítomnosti EB3-1.

Postup

1. Zásobné roztoky LPS (Lot # 36F4019) a LTA (Sigma

Cat # L-2515 Lot 89F4061) boli pripravené sonikáciou na 1 mg/ml v roztoku soli tesne pred použitím. Zásobné roztoky sa nariedili čerstvým médiom EGM-UV (Clonetics) na pracovné koncentrácie 10 μg/ml LTA a 0,2 μg/ml LPS. Z inkubátora sa vybrala jedna 48-jamková klastrovacia platňa [cluster dish] (Costar) následne po naraistení buniek HUVEC šnôry # 117, pasáže 4, do konfluencie na želatíne. V každom

0.,_.....2hod ôsmich .časových ... bodov,.. T hod., 6 hod., 8 hod., 18 hod. a 24 hod. médium .i./.

hod jamiek sa odstránilo 0,5 ml čerstvého EGM-UV pracovné nariedenia LPS Platňa sa dala nazad

Pasteurovou pipetou média (Clonetics) (tri jamky) lebo LTA do 37°C inkubátora , 4 hod., z každých nahradilo obsahujúcim (tri jamky), s 5 % CO2 na 4 hodiny.

3. Neutrofily (PMN) boli pripravené ako v Príklade 1. PMN boli držané pri izbovej teplote behom celej preparácie. Resuspendovali sa . na 2 x 10^ / 50. μΐ v tom istom pufri ale obsahujúcom 5 mg/ml bovinného sérového albumínu.

4. Testovacia platňa so stimulovanými HUVEC bunkami sa vybrala z inkubátora a jamky sa premyli dva razy RPMI 1640 obsahujúcim 5 mg/ml bovinného sérového albumínu (BSA). Po druhom premytí sa jamky naplnili 300 μΐ toho istého pufru. Médium sa opäť odstránilo z jednej jamky z každej trojice a nahradilo 300 μΐ supernatantu z kultúry hybridómov obsahujúceho EB3-1 mAb. Platňa sa inkubovala 10 minút pri 37°C a potom vybrala z inkubátora.

5. 0,025 ml PMN suspenzie sa pridalo do jamiek stimulovanej testovacej platne.

6. Platne sa inkubovali 5 minút pri 37°C.

7. Nenaviazané bunky sa odstránili z jamiek testovacej platne systematickým resuspendovanim s použitím pipety na opakované dávkovanie s následným pridaním a odohraním 0,3 ml média.

8. Všetko médium sa odstránilo z jamiek a a pridalo sa.

200 μΐ solubilizačného pufru. Tento pozostával z citrátového pufru (24, 3 ml 0,1 M kyseliny citrónovej, 10,5 g/500 ml +

25,7 ml 0,2 M hydrogenfosforečnanu sodného, 1,42 g/500 ml a SQ H₂0 do 100 ml) obsahujúceho 0,1 % NP-40 detergentu.

9. Platňa sa inkubovala na rotačnej trepačke 10 minút a potom sa pridalo do každej jamky 0,2 ml roztoku OPDA (8 mg o-fenyléndiamínu, Sigma kat. č. P-1526, 8 μΐ 30 % H₂O₂ a 10 ml citrátového pufru [ako vyššie]). Reakcia sa nechala vyvýjať 15 minút a potom sa pridalo 50 μΐ 4 M H₂SO₄ do každej jamky na zastavenie reakcie.

10. Kontrolná zmes činidiel... bola pripravená zmiešaním 100 .μΐ . objemov solubilizačného pufru a roztoku OPDA a 50 μΐ 4 M H₂SO₄.

11. 100 μΐ supernatantu sa odobralo z každých dvoch jamiek a prenieslo do pružnej ELÍSA testovacej platničky (Falcon). Platňa bola premeraná [scanned] spektrofotometricky pri 492 nM do 30 minút.

Výsledky tohoto pokusu sú ukázané v Obr. 5, ktorý ukazuje, že LPS a LTA indukcia molekuly adhézie neutrofilov na ludských endoteliálnych bunkách má vrchol medzi 4 a 6 hod. inkubácie s endoteliálnymi bunkami. Tento časový priebeh súhlasí s priebehom ukázným skôr pre indukciu ELAM-1 (pomocou) TNF a IL-Ιβ. V každom testovanom časovom bode sa dá adhézia PMN úplne inhibovať anti-ELAM-1 mAb, čo ukazuje, že ako LPS tak aj LTA indukujú expresiu ELAM-1 na ludskom endotéliu. Expresia ELAM-1 indukovaná týmito zlúčeninámi prudko klesá po 6-tich hodinách expozície, vykazujúc kinetiku podobnú kinetike IL-Ιβ aktivácie.

Príklad 8

Tento príklady preukazuje, že schopnosť EB3-1 inhibovať letalitu indukovanôlx LPS nie je závislá na fixácii komplementu.

Napred sa vykonali experimenty na stanovenie relatívnej blokovacej účinnosti EB3-1 F(ab)'₂ fragmentov a Kyselinou opracovaného EB3-1. Prvšie bolo ukázané, že pôsobenie pH 2,5 na intaktný IgG₃ trvalé ničí schopnosti fixácie komplementu. (Winkelhake, J. et al., 1980, J. Biol. Chem. 2822-2828, zahrnuté tu odkazom).

Adhézia ⁵¹Cr značených HL-60 buniek k IL-Ιβ aktivovaným endoteliálnym bunkám sa merala v prítomnosti titrovaných množstiev dvoch preparátov z EB3-1 mAb (kyselinou opracovaného Ig a F(ab')₂). 50.%-ná inhibícia väzby sa dosiahla s F(ab')₂ pri asi

0,5 μ9/πι1. Asi 2 μ9/πι1 Ig opracovaného kyselinou vznik ekvivalentnej inhibície adhézie.

Ďalej sme jódovali (rádioaktívnym jódom) modifikované formy EB3-1 a určili poločasy na:

bolo treba na predošlé dve nemodifikovaná EB3-1 pH 2,5 opracovaná ÉB3-1 EB3-1 F(ab')₂ alfa-fáza (min)

3.2

1.3 β-fáza (min)

356

408

136

Profil očisťovania krvi od EB3-1 je prezentovaný v Obr. 6. Na základe týchto dát a výpočtov plochy pod krivkou sme použili dve modifikované formy v potkaňom modele LPS-indukovanej letality. Zvieratám sme dali také dávky, aby poskytli približne rovnaké najvyššie koncentrácie a plochy pod krivkou pre všetky tri formy EB3-1 medzi obdobím dvoch a štyroch hodín po letálnom dávkovaní LPS. Takto: 4 skupiny po 10-tich

i.v. letálne dávky LPS v čase T = 0. Potom v

EB3-1 formy ako následuje:

I - žiadna terapia

EB3-1 — i.v. bolus 5 mg/kg pri

III - EB3-1 kyselinou opracovaná — i.v.b.

IV - EB3-1 F(ab)'₂ - 7,5

5,0

2,5 dostali

SKUPINA

SKUPINA

II

SKUPINA

SKUPINA zvieratách dostali

T = 2 hodiny všetky mg/kg mg/kg mg/kg

T = 4 Tento dávkovací režim sa blíži rovnakej očisťovania krvi ako pri 5 mg/ml. Výsledky, mechanizmus(y) ochrany s fixáciou komplementu. potenciálne toxickej ludský komplement a/lebo uvádzať k F_c receptoru.

je ukázané nie sú

Navyše sme schopnosti

1,0 ml/kg

- 5 mg/kg hodiny hodiny hodiny ploche pod krivkou získaná s nemodifikovanou EB3-1 v Obr. 7, napovedajú, že komplikovane spojené postupy, ako sa vyhnúť myšacieho IgG3 fixovať bunky do činnosti väzbou nejako ukázali tohoto

Aj ked predkladaný vynález je popísaný do istých podrobností pomocou ilustrácie a príkladov aby sa dosiahla jasnosť a zrozumiteľnosť, je jasné, že isté zmeny a modifikácie sa dajú prevádzať v rámci pripojených [appended] nárokov.

Claims (8)

1. Farmaceutic ká medzi bunkovú ky prijatéiný ad héz iu nosič a liečenie choroby zahrnujúcej sprostredkovanú a tým , ze imunoglobulin,

   ELAMom-l , obsahuje ťarmaceuticktorý rozoznáva funkčný epitop na ELAMe-1·

   Farmaceutická na liečenie choroby zahrnujúcej medsibunkovú ad héz iu sprostredkovanú ELAMom-l podlá bodu 1 tým, že uvedený imunoglobulin j e I9G3·

   Farmaceutická zmes na liečenie zahrnuj úcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú choroby

   ELAMom-l podlá bodu 1, vyznačujúca sa t ý m ,že imunoglobulin je vylučovaný bunkovou líniou

   A.T.C.C· ..prírastkové číslo HB 10591

   4.

   Farmaceutická zmes na liečenie choroby zahrnujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú

   ELAMom-l ,pod Ía bodu vyznačuj ú c a tým , že uvedený imunog1obuI ín je zabudovaný do lipozómu·

   Farmaceutická na liečenie choroby zahrňujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú

   ELAMom-l podlá bodu 4 vyznačujúca sa tým , že uvedený lipozóm obaiuje protizápa1ovú chemoterapeuticky účinnú látku·
2. 6· Použitie farmaceutickej zmesi pódia bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrnujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l , kde uvedená zmes obsahuje imu.noglobulín, ktorý rozoznáva funkčný epitop na ELAMe—1·
3. 7. Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrňujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l , kde uvedená zmes obsahuje imunog1 obul ín a kde uvedený imunoglobulín je IgGs.
4. 8- Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrňujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l , kde uvedená zmes obsahuje imunog1obu1 ín a kde uvedený imunoglobulín je vylučovaný bunkovou líniou označenou ako A·T.C·C·?prírastkové číslo HB 10591.
5. 9- Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrňujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l ,kde choroba zahrňujúca medzibunkovú adhéziu je zápalová odozva·
6. 10- Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrňujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l ,kde choroba zahrňujúca medzibunkovú adhéziu je septický sok-
7. 11- Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu i na výrobu lieku proti chorobe zahrňujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l _?kde choroba zahrňujúca medzibunkovú adhéziu je syndróm dýchacích tažkostí dospelých- .12· Použitie farmaceutickej zmesi podía bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrnujúcej medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-1? kde choroba zahrňujúca medzibunkovú adhéziu je sepsa, sprevádzajúca zraneneie.

   13· Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu 1 na výrobu 1 i e k u proti chorobe zahrňujúcej med z. i bunkovú ad héz iu

   sprostredkovanú- ELAMom-1 , kde uvedený imunoglobulin je je zabudovaný do lipozómu·
8. 14. Použitie farmaceutickej zmesi podlá bodu 1 na výrobu lieku proti chorobe zahrňujúcej ' * medzibunkovú adhéziu sprostredkovanú ELAMom-l. kde uvedený lipozóm obaluje protizápalovú chemoterapeuticky účinnú látku.