SK67895A3 - Displacement chromatography process and purified hemoglobin product - Google Patents

Description

SPÔSOB PURIFIKÁCIE HEMOGLOBÍNU METÓDOU VYTESŇOVACEJ CHROMATOGRAFIE

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka purifikácie hemoglobínu pomocou chromatografie a obzvlášť chromatografických procesov zahrňujúcich purifikácie hemoglobínu v komerčnom rozsahu tak, aby sa získal roztok, v ktorom hemoglobínové zložky tvoria aspoň 99 % roztoku. Vzťahuje sa tiež k novým hemoglobínovým produktom, ktoré majú neočakávané, užitočné charakteristiky na použitie ako náhrada krvi.

Doterajší stav techniky

Vývoj substituentov krvi na báze hemoglobínu pokračuje a vynucuje si komerčnú pozornosť, pričom nedávny -vývoj v týchto oblastiach ukázal, že hemoglobín z cicavčích krvných buniek po vhodnej modifikácii ako je intramolekulárne zosieťovanie a v niektorých prípadoch polymerizácia sú perspektívnou bázou v oblasti krvných náhrad. Ako vývoj pokračoval, požiadavky na čistotu hemoglobínu sa však postupne zvyšovali. Kedysi sa predpokladalo, že z hemoglobínu stačí jednoducho odstrániť stromu, bezfarebnú štrukturálnu časť červených krviniek, čo sa dosiahlo premývaním a jemnou lýzou červených krviniek a následne filtráciou lyzátu. Neskôr sa zistilo, že prítomnosť stopových množstiev rezíduí nečistôt, ako sú fosfolipidy, viedlo ku viacerým špecifickým reakciám, ako napr. ku vazokonstrikcii po aplikácii produktu v pokusoch na zvieratách. Dokonca, i keď bol produkt podrobený niekoľkým diafiltračným krokom, stále ešte obsahoval neakceptovateľné vysoké stopové množstvá potenciálne nebezpečných nečistôt, ako sú enzýmy erytrocytov, modifikované a rôzne formy hemoglobínu, fosfolipidy a povrchové antigény.

Jedna z najnaliehavejších výziev v oblasti krvných substituentov, špeciálne nosičov kyslíka na hemoglobinovom základe sa týka vývoja cenovo výhodných metód na dostatočnú a ekonomicky výhodnú purifikáciu hemoglobínu v komerčnom rozsahu. Tento musí byť schopný konkurencie s inými potenciálnymi látkami zväčšujúcimi objem krvi a tekutinami, ktoré sú nosičmi kyslíka, určenými na použitie ako substituenti krvi.

Zatiaľ čo v analytických separáciách je dôležitá úroveň rozdelenia frakcií a čas analýzy, v preparatívnej chromatografii pre komerčnú alebo semi-komerčnú mieru využitia sú kritickými parametrami:

množstvo materiálu izolované za jednotku času pri určitej hladine čistoty (throughput); a ekonomika procesu, ako sú veľkosti kolón, média, tlmivé roztoky, prístroje, recyklácia a opätovné využitie komponentov a činidiel, a podobne.

V minulosti neboli publikované metódy, týkajúce sa purifikácie hemoglobínu, ktoré by spĺňali kritéria pre cenovo výhodné produkčné procesy.

Krvné substituenty na hemoglobinovom základe vyžadujú, aby boli buď v jednej forme hemoglobínu, alebo ak je prítomná viac ako jedna forma, dôkladnú kontrolu zloženia známych hemoglobínových foriem. Podľa toho, úspešný proces purifikácie hemoglobínu vyžaduje aby bol schopný separácie jednej hemoglobinovej formy od druhej, rovnako aj separácie želanej formy hemoglobínu od kontaminujúcich červených krviniek, ako i od komponentov, ako sú enzýmy erytrocytov, proteíny, fosfolipidy a antigény.

Na purifikáciu hemoglobínových roztokov boli pužité chromatografické metódy. U.S. Patent 4 924 474 Hsia a spol. opisuje aplikáciu techniky afinitnej chromatografie na purifikáciu hemoglobínu za použitia kolón, pri ktorých ligand - vykazujúci preferenčnú chemickú väzobnú afinitu ku DPG väzobnému miestu na hemoglobíne bol naviazaný na stacionárnu fázu kolóny.

Pri purifikácii hemoglobínu sa použili i metódy ionomeničovej chromatografie. Základné princípy techník, týkajúcich sa ionomeničovej chromatografie sú dobre známe. Zmes rôznych druhov látok v roztoku sa aplikuje na vhodne upravenú ionomeničovú kolónu. Každý druh látky v zmesi má rozdielnú afinitu ku chemickej skupine reaktantu v kolóne. Zmenou podmienok v kolóne, napr. zmenou pH roztoku, jednotlivé druhy látok môžu byt upravené tak, aby boli naviazané alebo uvoľnené z kolóny selektívne, a tak je umožnené separovať samotný jeden druh látky zo zmesi. Aplikácia techniky purifikácie takých proteínov ako je hemoglobín je ekonomicky neatraktívna, okrem použitia v malom rozsahu a pre analytickú prácu. Keď sa hemoglobín purifikuje na veľkovýrobnej úrovni pre použitie napríklad ako resuscitačnej tekutiny nesúcej kyslík (krvná náhrada), technika, ktorá sa obvykle aplikovala, je nepraktická. Množstvo hemoglobínu, ktoré sa absorbovalo a následne uvoľnilo z chromatografickej kolóny je tak veľké, že požiadavky na veľkosť, kolóny sú potom neúmerne veľké a drahé.

Christensen a spol., J. Biochem. Phys. 17 (1988), 143-154, opísali chromatografickú purifikáciu ľudského hemoglobínu. Použitá metóda reprezentuje štandardný ionomeničový chromatografický prístup, ktorý neposkytuje možnosti pre ekonomicky vhodnejšie rozšírenie výrobného procesu, poskytujúceho zodpovedajúce produkčné množstvá.

Winslow a Chapman, Pilot-Scale Preparation of Hemoglobín Solutions, Methods in Enzymology, Vol. 231, p3 (1994) opísali prípravu hemoglobínu neobsahujúceho stromu (SFH), vysoko purifikovaného hemoglobínu AO a zosieťovaného hemoglobínu s použitím expirovanej ľudskej krvi ako východiskového materiálu. SFH sa pripravuje filtráciou. Hemoglobín AO je pripravovaný z SFH sústavou chromatografických metód s použitím silného anión-\^ýmenného média a gradientu iónovej sily.

Obidve práce Christensen a spol. a Winslow a spol. boli uskutočnené na pracovisku Letterman Army Inštitúte for Research (LAIR), teraz známom ako Walter Reed Army Inštitúte of Research.

U.S. Patent 5, 084,588 Rausch and Feola (Biopure), opisuje štandardnú ionomeničovú chromatografiu, pri ktorej sa uskutočňuje výmena aniónov a katiónov, aplikovanú na separáciu a purifikáciu hemoglobínu. V prípade ionomeničovej chromatografie, uskutočňujúcej výmenu aniónov sú v patente uvedené tri štandardné prístupy:

a) väzba Hb pri zvýšenom pH a elúcia pri klesajúcom gradiente pH, alebo postupná zmena gradientu pri nižšom pH;

b) väzba Hb pri vysokom pH, nízka iónová sila a elúcia s gradientom soli;

c) plnenie pri podmienkách pH, kedy hemoglobín sa neviaže na aniónový iónomenič, ale prechádza cez kolónu nezachytený, zatiaľ čo nečistoty (kyslejšie kontaminanty) sú zachytávané na kolóne.

Prístupy a) a b) boli rozsiahlo dokumentované, ale nie sú atraktívne na produkciu vo veľkom rozsahu, nakoľko existuje obmedzenie z hľadiska zaťažiteľnosti (náložovej kapacity), nevyhnutnej na dosiahnutie dostatočného delenia hemoglobínových produktov. Tieto náložové kapacity sú v bežnej praxi len 20- 30 mg/ml, a predpisujú nedostupne veľké a drahé kolóny pre komerčnú škálu purifikácie hemoglobínu. Napríklad, jedna 50 mg dávka finálneho kyslíkového nosiča na báze hemoglobínu (HBOC) by mohla vyžadovať kolónu o objeme 1,5 - 2,5 litra.

Zatiaľ čo prístup c) zdá sa byť navonok najlepšie uskutočniteľným, v praxi je to naopak, kvôli chromatografickým vlastnostiam normálneho, nemodifikovaného hemoglobínu dospelého človeka Ao a niektorým hlavným kontaminantom, ako je HbAlc, ktoré nie sú dostatočne odlišné pre praktickú aplikáciu tohto prístupu.

Štandardné prípravy, týkajúce sa katiónovej výmennej chromatografie hemoglobínu cicavcov majú podobné obmedzenia.

USA patent 5 084 588 tiež poukazuje, že v roztokoch hovädzieho hemoglobínu, viac ako 99,9 sú hovädzie hemoglobíny, ale nie identifikujúce proteínové zložky.

% prítomného proteínu sú uvedené údaj e,

Podstata vynálezu

Podstatou tohto vynálezu je poskytnúť novú chromatografickú metódu na purifikáciu hemoglobínu.

Ďalšou podstatou tohto vynálezu je poskytnúť chromatografickú metódu, umožňujúcu získať z vodného roztoku obsahujúceho nečistoty a zároveň aspoň 60 % hemoglobínu, vodný roztok hemoglobínu o čistote presahujúcej 99 %, a to v

- 5 komerčnom rozsahu a v ekonomicky prijateľnej forme.

Ďalšou, špecifickejšou podstatou tohto vynálezu je poskytnúť v komerčných množstvách vodný roztok hemoglobínu alebo zosieťovaného hemoglobínu, v ktorom zložky hemoglobínu alebo zosieťovaného hemoglobínu tvoria aspoň 99 %, sú v čistom stave a v prípade ich využitia ako krvnej náhrady in vivo, vykazuje vlastnosti, ktoré neboli predtým zverejnené.

Tento vynález poskytuje metódu, pri ktorej vodný roztok, vopred vybraných druhov hemoglobínu, Hb, v ktorom zložky hemoglobínu predstavujú približne od 60 % do 99 % rozpustného materiálu je podrobený dvojstupňovej ionomeničovej chromatografii. Jedným zo stupňov je aniónová výmenná chromatografia, druhým je katiónová výmenná chromatografia. Oba typy ionomeničovej chromatografie sa môžu uskutočniť v ľubovoľnom poradí. Nepurifikovaný roztok vopred vybraných druhov hemoglobínu, napríklad HbAO je aplikovaný v prvom stupni chromatografie, napríklad v ionomeničovej chromatografii, uskutočňujúcej výmenu aniónov a to pri takých podmienkach, kedy sú všetky zložky zmesného roztoku najprv adsorbované na pevnú fázu chromatografickej kolóny. Pre výmenu aniónov sa vyžaduje relatívne vysoká hodnota pH. Výber podmienok je taký, aby sa dosiahlo účinné naplnenie kolóny, za použitia plniaceho roztoku o nízkej iónovej sile, kedy dôjde k stavu, v ktorom v podstate všetky dostupné miesta na pevnom chromatografickom médiu sú obsadené druhmi z aplikovaného roztoku. V tomto stupni zozbieraný výluh je zbavený proteínového produktu. Vytesnenie HbAO a nečistôt, majúcich nižšiu afinitu k pevnému médiu kolóny sa v danom stave dosiahne prívodom ďalších objemov vodného plniaceho roztoku, ako bolo už vyššie uvedené. Takto dosiahnutý stav, tu uvádzaný ako stav presýtenia spôsobuje, že znečistené druhy, majúce vyššiu afinitu ku kolóne vytesňujú vybraný druh hemoglobínu a znečistené druhy majúce nižšiu afinitu k náplni kolóny sú vyluhované z kolóny. Ak prvým krokom chromatografickej separácie je ionomeničová chromatografia uskutočňujúca výmenu aniónov, nečistoty, ktoré sú kyslejšie ako vybrané druhy Hb sú adsorbované na pevnú fázu chromatografickej kolóny a tak separované z vybraných druhov Hb, ktorý sa vo výluhu objavuje spolu so zásaditej sírni nečistotami. V prípade, keď bola ionomeničová chromatografia uskutočňujúca výmenu katiónov vybraná ako prvý stupeň, alkalickejšie nečistoty sa oddelili na základe ich vyššej afinity k pevnej fáze kolóny, kyslejšie nečistoty a vybrané druhy hemoglobínu sa objavili vo výluhu.

Potom, v druhom chromatografickom kroku metódy, uvedenom vo vynáleze sa uskutoční vo výluhu z prvej kolóny pri odlišnom pH ďaľšia výmena iónov čiastočne purifikovaných druhov hemoglobínu. Ak výluh z prvej kolóny obsahuje druhy hemoglobínu a alkalickejšie zložky, druhým chromatografickým krokom je ionomeničová chromatografia, uskutočňujúca výmenu katiónov, a naopak. Napĺňanie druhej kolóny roztokom obsahujúcim nečistoty sa opäť, uskutočňuje za podmienok nasýtenia a pokračuje sa ďalej, pokým sa nedosiahne stav presýtenia kolóny. Za podmienok presýtenia, predom vybraný druh hemoglobínu je vyluhovaný z kolóny prostredníctvom nečistôt, ktoré, pri zvolených podmienkach majú vyššiu afinitu k pevnej fáze kolóny a tak umožňujú získať, vo výluhu druhej kolóny, druh hemoglobínu o veľmi veľkej čistote. Metóda uvedená vo vynáleze sa môže potom vo všeobecnosti nazývať ako dvojstupňová vytesňovacia chromatografia.

Výsledkom toho je, že druh hemoglobínu je vyluhovaný z kolóny vo výnimočne čistej forme, bežne o čistote viac ako 99 % a to v komerčne atraktívnom výťažku. Kyslejšie nečistoty ako sú vybrané druhy hemoglobínu zostávajú viazané na jeden druh pevnej fázy ionomeniča a nečistoty, ktoré sú alkalickejšie ako vybrané druhy hemoglobínu zostávajú naviazané na inej pevnej fáze ionomeniča. Kolóny sa môžu ľahko regenerovať, za použitia bežných čistiacich a regeneračných procedúr.

Dôležitým faktorom pre úspešný priebeh procesu, najmä vo veľkom, výrobnom rozsahu je dôsledné presýtenie kolón s nečistotami, ktoré umožňujú vyluhovanie druhov hemoglobínu.

Ak je metóda uvedená vo vynáleze aplikovaná na purifikáciu ľudského hemoglobínu AO, je možné získať nový ľudský hemoglobín, ktorý má zloženie a vlastnosti, ktoré neboli doposiaľ opísané. Tento hemoglobínový produkt podľa toho tvorí ďaľší aspekt predkladaného vynálezu, nezávislého od opisu metódy purifikácie, uvedenej v tomto vynáleze. Vlastnosti a charakteristiky tohto produktu sú veľmi žiadúce a doposiaľ neboli poznané alebo opísané, v súvislosti s akýmkoľvek známym produktom hemoglobínu AO, a je obzvlášť výhodný na použitie ako základ krvnej náhrady. K týmto vlastnostiam patrí i to, že produkt je v podstate zbavený vírových častíc, najmä častíc opuzdrených lipidmi, keď je podávaný in vivo, nedochádza k výrazným prejavom vazoaktivity, toxicita voči porovnaní s inými zníženým uvoľňovaním laktát sa týka požadovaných štandarných majú lepšie prípravkami a ďaľších pri in vitro endoteliálnym prípravkami dehydrogenázy. Ďalej, vlastností hemoglobínu produkty, ktoré vlastnosti, hemoglobínu, pyrogénov.

inkubáciách neprejavuje sa jeho bunkám, čo bolo potvrdené v hemoglobínu, čo pre požitie ako krvnej náhrady, predmetom tohto vynálezu porovnaní s inými známymi sa týka obsahu endotoxínov sú v

čo

Prehľad obrázkov na výkresoch

OBRÁZOK 1 je schématickým znázornením začiatočnej časti aniónovej výmeny výhodnej metódy podľa tohto vynálezu;

je obdobným znázornením druhej časti výhodnej metódy podľa tohto vynálezu;

reprezentuje chromatogram analytickej s použitím výsledkov z ďalej uvedených reprezentuje chromatogram analytickej s použitím výsledkov z ďalej uvedeného predstavuje grafické znázornenie výsledkov z ďalej uvedeného Príkladu 8;

OBRÁZOK 6 reprezentuje kópiu papierových páskov izoelektrickej fókusačnej analýzy produktov z ďalej uvedeného Príkladu 13 ,·

OBRÁZOK 7 predstavuje kópiu výsledkov z pokusov, týkajúcich sa farbenia a blotov uvedených z nižšie uvedeného Príkladu 13;

OBRÁZOK katiónovej výmeny

OBRÁZOK aniónovej výmeny Príkladov 2 a 3;

OBRÁZOK katiónovej výmeny Príkladu 4;

OBRÁZOK

OBRÁZOK 8 reprezentuje grafické znázornenie výsledkov z nižšie uvedeného Príkladu 14;

OBRÁZOK 9a 9A reprezentujú grafické znázornenie výsledkov z nižšie uvedeného Príkladu 15; a

OBRÁZOK 10 reprezentuje grafické znázornenie výsledkov z ďalej uvedeného Príkladu 16.

Vytesňovacia chromatografia, alebo vytesňovacia elúcia v obecnom názve, predstavuje známu techniku v oblasti separácie proteínov. Je jednou z troch spôsobov, ktorým je možné získať, vzorku z chromatograf icke j kolóny. Ak sa aplikuje na separáciu príslušných proteínov zo zmesi proteínov v roztoku, proteíny o väčšej afinite vytesnia z matrice proteíny o nižšej afinite, takže od vstupnej po výstupnú časť kolóny sa klesajúcej afinity. V veľmi zriedka dochádza proteíny usporiadajú v poradí podľa prípade vytesňovania proteínov však k vytvoreniu ostrej hranice medzi jednotlivými druhmi proteínov, čo na prípravu veľmi čistých roztokov jedného proteínu, ako napríklad hemoglobínu nie je žiadúce. Ak sa pre systém vyberú jednotlivé, proteín neobsahujúce druhy, ktoré sú schopné vzájomne sa vytesniť, výsledkom môže byť to, že chromatografická matrica ich ako vysokoafinitné zložky naviaže, výsledkom čoho je veľmi zlá možnosť jej regenerácie pre jej ďalšie použitie.

Prednosťou metódy na prípravu čistého ľudského hemoglobínu, Ao (HbAo) z dospelých jedincov, je veľká komerčná využiteľnosť, čo bude v d'aľšom podrobne opísané s odkazom na výhodnosť. Metóda, však nemá obmedzené použitie len pre purifikáciu HbAo, ale je ďalej využiteľná i pre ďalšie vopred vybrané druhy hemoglobínu,ako sú vybrané zosieťované deriváty hemoglobínu, vybrané varianty hovädzieho hemoglobínu, ďalšie varianty hemoglobínu, ako je fetálny hemoglobín, hemoglobín z kosákovitých buniek, atď., genetickými metódami pripravený hemoglobín, atď.

Metóda, ktorá je predmetom vynálezu je ekonomicky mimoriadne výhodná, umožňujúca purifikovaú hemoglobín HbAo v komerčnom rozsahu za účelom prípravy krvných substituentov. Poskytuje mimoriadne vel'mi efektívne možnosti z pohľadu plniacich kapacít kolóny. Je preto možné využiť, kolóny o relatívne malej veľkosti na purifikáciu veľkých objemov roztoku nečistého hemoglobínu. Môže sa uskutočňovať v jednom dávkovom množstve, alebo kontinuálne za účelom purifikácie daného dávkového množstva roztoku hemoglobínu, získaného z červených krviniek štandardnými technikami, pričom roztoky na tento účel bežne obsahujú 80 % hemoglobínu, avšak obsahujú aj široké spektrum nečistôt proteínového alebo neproteínového charakteru. Ďalej, samotný roztok nečistého hemoglobínu sa použije ako vytesňovacie médium. Použitie iného vytesňovača pre tento účel, ktorého sprievodným znakom sú nevýhodnosť, komplikovanosť a finančná náročnosť sa týmto vylúči.

Typická, všetky kroky zahrňujúca metóda na prípravu roztoku obsahujúceho purifikovaný hemoglobín, zahrňujúca techniku uvedenú v tomto vynáleze, vychádza z normálnych ľudských červených krviniek z dospelých jedincov. Tieto sú spájané a nemusia byť filtrované za účelom odstránenia leukocytov. Bunky sú premývané, aby boli odstránené sérové proteíny a podrobené lýze za účelom extrakcie hemoglobínu a ostatných bunkových komponentov. Lyzát sa filtruje, aby sa odstránili membrány červených krviniek a výsledný hemoglobín je diafiltrovaný a zahusťovaný. Extrakt nečistého hemoglobínu je spracovaný s oxidom uhoľnatým tak, aby sa vytvoril kompex

Co-Hb, pasterizuje sa zahriatím, inaktivovali kontaminanty vírového sa extrakt centrifuguje a filtruje za aby sa v roztoku pôvodu. V ďalšom účelom odstránenia ďalších rozbitých zvyškov buniek. V tomto štádiu je extrakt pripravený na spracovanie vytesňovacou metódou ako je uvedené v tomto vynáleze.

Vychádzajúc z podstaty predloženého vynálezu, prvým krokom chromatografickej metódy je spôsob výneny aniónov a v druhom stupni spôsob výmeny katiónov. Tento prvý proces, aniónovej výmeny sa výhodne uskutočňuje pri vysokom pH, napríklad pH 7 - 10, respektíve, s výhodou pri pH 8.5 - 9.0 za podmienok nízkej iónovej sily, t.j. nízkej vodivosti. Je vhodné, ak vodivosť je menšia ako 3 mS (milisiemens) avšak s výhodou, menej ako 1 mS. V týchto podmienkach proces zahrňuje použitie tlmivého roztoku bez prítomnosti soli. Za daných podmienok sa požadované druhy hemoglobínu najprv naviažu na médium kolóny spolu s ostatnými druhmi hemoglobínu. Ako napĺňanie znečisteného roztoku hemoglobínu pokračuje, tieto druhy, ktoré vykazujú vyššiu afinitu ako HbAo k matrici, kyslejšie kontaminanty, charakteristicky postupne vytesnia z kolóny HbAo a alkalickejšie nečistoty.

Nakoniec, ak sa dosiahne stav presýtenia kolóny, tak celé množstvo hemoglobínu a alkalickejšie nečistoty sú vytesnené z náplne kolóny, pričom len nečistoty kyslejšieho charakteru zostávajú k plneniu naviazané.

kolóny s

Vo väčšine prípadov, dochádza tu ovel'a väčším, nadmerným množstvom materiálu ako j e odporúčané výrobcom. Chromatografické oddelenie kyslejších nečistôt z HbAo sa takto dosiahne v tomto stupni.

Plnenie kolóny s roztokom obsahujúcim nečistý hemoglobín sa uskutočňuje pri pomalej, lineárnej rýchlosti prietoku, nie väčšej ako 10 cm za minútu, s výhodou, približne 1 cm za minútu. Toto umožňuje vytvorenie kinetického rovnovážneho stavu kolóny. Rozpätie koncentrácie pri napĺňaní kolóny nie je kritické, avšak je vhodné ak je v rozpätí 0,1 - 20 %, s výhodou v rozpätí 2 - 7 %.

Dosiahnutie podmienok presýtenia možno monitorovať analyzovaním vzoriek vytekajúcich z kolóny, pričom ak zloženie roztoku vytekajúceho z kolóny neobsahuje žiadne, alebo obsahuje len stopy nečistôt kyslého charakteru, maximálné naplnenie kolóny sa prakticky dosiahlo.

OBR.l z výkresov v prílohe schématicky ilustruje časť metódy výmeny aniónov, uvedenej v tomto vynáleze.

Ionomenič kolóny, ktorý obsahuje chemické skupiny, N⁺R₃ (typický anión-ionomeničová živica, anex, avšak len ako príklad), naznačený v stupni A tejto metódy, na Obr. 1, je plnený s označených a elipsami plnenia skupiny elektrostatického roztokom hviezdičkami alkalickejšie nečistoty obdĺžnikmi, stupni n-r₃ obsahujúcim zmes druhov hemoglobínu, pre kyslejšie nečistoty, HbAo kapacite chemické

B, v pevného náboja podstate média naviažu

Pri všetky aktívne kolóny sa na pomocou j eden z druhov obsiahnutých v zmesi.

Väčšie množstvo rovnakého roztoku až k hranici kapacity kolóny je napĺňané tak, aby sa dosiahol stav presýtenia, ako je ilustrované v stupni C obr. 1. Za tohto stavu sú

- 11 všetky alkalickejšie nečistoty (obdĺžniky) a určité množstvo HbAo (znázornené elipsami) vytesnené z kolóny kyslejšími komponentami (znázornenými hviezdičkami), ktoré za daných podmienok vykazujú väčšiu afinitu k pevnej náplni kolóny. Na obr. 1 je znázornené napĺňanie kolóny ešte väčším množstvom rovnakého roztoku, takže presycovanie kolóny pokračuje tak, aby bol dosiahnutý stav D, pri ktorom kyslé druhy majúce za zvolených podmienok vyššiu afinitu k matrici, vytesnili skutočne všetok HbAo z kolóny. V tomto stave, v kvapaline vytekajúcej z kolóny sa nenachádza detekovateľné množstvo kyslých nečistôt. Získa sa tak úplne čistý roztok HbAo, ktorý * však stále obsahuje určité množstvo alkalickejších druhov (nečistôt).

Druhý stupeň výhodnej metódy podľa tohto vynálezu využíva kolónu s ionomeničom uskutočňujúcu výmenu katiónov, ktorá sa plní s výluhom z prvej kolóny, za podobných podmienok presýtenia systému. Požadovaný HbAo a ďalšie nepotrebné kyslejšie nečistoty sú naviazané v nadbytočnom množstve. Roztok čiastočne purifikovaného hemoglobínu z prvej kolóny sa postupne plní do druhej kolóny. Používa sa opäť pritom relatívne nízka plniaca rýchlosť, vhodne 10 cm/min alebo menej, s výhodou okolo 1 cm/min, aby sa umožnilo vytvorenie kinetickej rovnováhy medzi pevnou a kvapalnou fázou. Hodnota pH výluhu z prvej kolóny je vhodne upravená « tak, aby bola v rozpätí pH 5 - 9, s výhodou v rozpätí pH 6,5

- 8,5 , najvýhodnejšie v rozpätí pH 7 - 8, predtým ako sa aplikuje na kolónu s ionomeničom uskutočňujúcim výmenu katiónov. Používa sa pritom nízka iónová sila roztoku, t.j.

vodivosť menšia ako 3 mS, s výhodou menej ako 1 mS. Vodivosti tak veľké ako 2,5 mS sú vhodné len v tom prípade, ak systém využíva pomalú rýchlosť prietoku a veľké zriedenie napĺňacieho roztoku. I v tomto prípade sa využíva stav presýtenia. Nečistoty proteínového charakteru o vyššej afinite, t.j. tie alkalickéjšie ako HbAo, vytesnia HbAo z kolóny a HbAo je takto vyluhovaný a získava sa vo výnimočne čistej forme.

OBR.2 z -výkresov v prílohe, obdobným spôsobom ako Obr.l schématicky ilustruje časť procesu, ktorý prebieha v kolóne s ionomeničom uskutočňujúcim výmenu katiónov, poukazujúci na S0₃ skupiny nosiča. Výluh z prvej kolóny, po vhodnej úprave pH je napĺňaný do druhej kolóny a na začiatku, v stupni A, a naplnenie kolóny podía jej kapacity sa dosiahne u oboch druhov zložiek, u HbAo (elipsy) a u alkalickejších nečistôt (obdĺžniky), ktoré sa elektrostaticky naviažu na chemické skupiny náplne kolóny. Zatiaľ, čo tieto sú tu znázornené ako sulfonylové skupiny, možno rovnocenne dobre vybrať na použitie i iné alternatívné skupiny, ako sú karboxylové skupiny. Plnenie roztoku výluhu do kolóny pokračuje tak, aby bol dosiahnutý stav presýtenia, ilustrovaný v stupni B, Obr. 2, v ktorom za daných podmienok alkalickej ši kontaminant, majúci vyššiu afinitu k náplni kolóny, vymení si miesto s HbAo. Pri ďalšom plnení presýtenej kolóny, ako je ilustrované v stupni C na Obr. 2, sa získa vytesnením výluh obsahujúci roztok s takmer 100 % čistým HbA. Čím je väčšie plnenie kolóny, tým je väčšie percento výťažku purifikovaného HbAo z kolóny. Monitorovanie výluhu sa uskutočňuje za účelom detekcie prítomnosti alkalických druhov (obdĺžniky). Stav, kedy bolo dosiahnuté maximálne plnenie kolóny je definovaný v okamihu, keď nie je z kolóny už možné získať ďalší výťažok HbAo.

Alkalickejšie kontaminanty (znečisťujúce látky), výraz, ktorý je tu používaný sa týka tých nečistôt, ktoré sa vylúhujú z kolóny pri vyššom pH ako je požadované na elúciu HbAo. Naopak, výraz kyslešie kontaminanty sa týka tých nečistôt ktoré sa vylúhujú z kolóny pri nižšom pH ako je požadované na elúciu HbAo. U výhodnej metódy podľa vynálezu, kde ionomeničová chromatografia uskutočňujúca výmenu aniónov sa vykoná najprv, pričom alkalickejšie kontaminanty sa vylúhujú pred HbAo a kyslejšie kontaminanty sa vylúhujú po HbAo. Rozdielne elučné profily, s malými zmenami v poradí elúcie je možné pozorovať v závislosti od použitého ionomeničového média v chromatografii.

Rýchlosť prietoku vybranej koncentrácie nepurifikovaného roztoku hemoglobínu by mala byť optimalizovaná pre obidve, prvú i druhú kolónu. Optimálne lineárne rýchlosti prietoku roztokov hemoglobínu v koncentrovanejšom rozpätí 2 - 7 % sú lcm/min alebo menej. Rýchlosti prietoku až 2 cm/min možno úspešne aplikovať na delenie viac zriedených roztokov, napríklad menej ako 1 % Hb.

Deliaca schopnosť, ionomeničovej chromatografie pri nízkych plniacich množstvách nie je obvykle citlivá od lineárnej prietokovej rýchlosti, avšak pre metódu podľa tohto vynálezu, kinetická rovnováha počas chromatografie je veľmi závislá od prietokovej rýchlosti. Koncentrácia náplne však nie je kritická pre žiaden stupeň.

S vytesňovacou metódou tohto vynálezu, pri použití v prvom rade ionomeničovej chromatografie, uskutočňujúcej výmenu aniónov, za účelom odtránenia kyslejších zložiek a v druhom rade ionomeničovej chromatografie, uskutočňujúcej výmenu katiónov, za účelom odstránenia alkalickejších zložiek, možno z komerčného hľadiska dosiahnúť vysoké výťažky výnimočne čistého HbAo, skoro úplne zbaveného detekovateľných množstiev iných proteínov, ako sú sérové proteíny a membránové proteíny. Hodnoty čistoty produktu, stanovené analytickou ionomeničovou chromatografiou, uskutočňujúcou výmenu aniónov sú vyššie ako 99 %, bežne viac ako 99,5 %.

Skutočné kapacity stupňov sú prinajmenšom o jeden rád väčšie ako kapacity, ktoré možno pozorovať pri bežných chromatografických prístupoch. Ďalej, čo kontaminantov proteínového charakteru, sa týka odstránenia metóda podľa tohto vynálezu tiež umožňuje takmer úplné odstránenie modifikovaných a ďalších nežiadaných foriem hemoglobínu, čo poskytuje takmer čistý (99,5 %) HbAo.

Naviac, ako je nižšie detailnejšie opísané, tiež je možné dosiahnúť takmer úplné odstránenie opúzdrených aktívnych alebo neaktívnych vírových častíc.

Zvýšenie výhod metódy podľa tohto vynálezu, ak sa porovná s metódou využívajúcou štandardnú ionomeničovú adsorpčo-elučnú chromatografiu sú názorne dokumentované v nasledovnej Tabuľke 1. Čísla v kolónke vytesnenie sú odvodené z nižšie uvedených pracovných príkladov metódy podľa tohto vynálezu. Údaje, uvedené v kolónke Adsorpcia-Elúcia boli získané z predtým spomenutého článku Winslow a spol.

TABUĽKA 1

OPERAČNÉ PARAMETRE NA PURIFIKÁCIU HEMOGLOBÍNU AO PRI POUŽITÍ ADSORBČNO-ELUČNEJ CHROMATOGRAFIE * vs VYTESŇOVACEJ CHROMATOGRAFIE

	VYTESŇOVANIE	ADSORBCIAELÚCIA
Objem kolóny	5 a 3 1	120 1
Kapacita kolóny	200-300 mg/ml	15 mg/ml
g Hb naplnených	1234	1818
% Výúažok	81	55
g Hb získaných	1000	1000
Pracovný objem tlmivého roztoku a	132 1	900 1

*Winslov a Chapman, op. cit.

Z týchto obrázkov je jasné, že vytesňovací chromatograf ický spôsob podľa tohoto vynálezu môže prebehnúť, rýchlejšie, v podstate s malými kolónami. Proces môže prebehnúť pri nízkych tlakových podmienkach a pri teplote okolia. Môžu byť dosiahnuté efektívne kapacity plnenia, ktoré sú 10 až 20 krát väčšie ako kapacity opísané pre konvenčný chromatografický proces, čím vzniká možnosť použitia relatívne malých objemov kolón. Toto vedie k zníženiu požiadaviek na vodu, zmenšia sa problémy, týkajúce sa odstraňovania odpadu, znížia sa požiadavky na tlmivé roztoky, čo všetko významne zlepšuje možnosť komerčného využitia tohto spôsobu.

Prečistený hemoglobinovy roztok tvorený výluhom z kolóny obsahujúcej ionomenič, uskutočňujúci výmenu katiónov môže byť diafiltrovaný do tlmivého roztoku podľa výberu a upravený do želanej koncentrácie HbAo.

Nie je nič zvlášť kritické pri výbere iónomeničového gélového materiálu, ktorý sa používa v procese podľa tohto vynálezu ako stacionárna fáza. Výber gélu závisí od skúseností prevádzkovateľa metódy. Môžu byť. použité bežné, komerčne dostupné gély, s podmienkou, že ich je možné úspešne derivátizovať tak, aby pracovali v režime iónomeničov s určenými afinitnými podmienkami pre druh materiálu, ktorý má byť separovaný. Základné skupiny materiálov pre iónomeniče zahrňujú typy materiálov s veľkými pórmi, makroretikulárne, neporózne typy, polystyrény alebo polymetakryláty krížovozosieťované s divinylbenzénom, polyalkylénamíny, celulóza, dextrán, agaróza, kremičitany, keramické materiály, sklo, hliníkové, alebo kovové častice a ďalšie. Komerčne dostupné materiály zahrňujú tie predávané pod ochrannými známkami - POROS média, Fractogel, HyperD, Dowex, Amberlite, Duolite, Bio-Rex, Chelex, Sephadex, Sepharose, Toypearl, Macro-prep, Bio-protocol, Accel, Mono types a ďalšie. Funkčné skupiny pripojené na tieto materiály, za účelom iónovej výmeny, sú sulfónan, sulfopropyl, karboxymetyl, karboxylát, fosforečná skupina, kvartérny amín, kvartérny aminoetyl, polyetylénimín, trimetylaminoetyl, dietylaminoetyl, dimetylaminoetyl, aspartátamid a ďalšie.

Vynález môže byť taktiež použitý na výrobu HbAo roztoku s čistotou prinajmenšom 99,5 % a neočakávane bez obsahu vírusových častíc, aktívnych alebo neaktívnych, obzvlášť nebude obsahovať lipidmi opuzdrené vírusy ako napríklad HIV, vírus herpes simplex (HSV), hovädzí vírus spôsobujúci hnačky, ktorý je mnohých prípadoch modelom ľudskej hepatitídy typu C. To sú niektoré z najdôležitejších a najnepríjemnejších vírusov kontaminujúcich ľudskú krv. To, že roztok získaný touto metódou nebude obsahovať žiadne virálne častice je významná výhoda, ktorá sa nemohla využiť predtým, než bola metóda vyskúšaná a výsledky analyzované. Zatiaľ čo vyššie uvedené metódy, ako je uvedené vo vynáleze zahrňujú pasterizačný krok, za účelom inaktivácie vírusov, dosiahnutie odstránenia vírových častíc v rámci metódy purifikácie je mimoriadne výhodné. Z materiálu nahradzujúceho krv odstráni akékoľvek aktívne vírusové častice, ktoré by mohli prežiť pasterizáciu a tiež akékoľvek zvyšky neaktívnych vírusových častíc. To všetko sa dá dosiahnuť bez použitia ďalšieho špecifického kroku na odstránenie vírusových častíc a bez pridania akýchkoľvek špeciálnych činidiel alebo látok za účelom odstráňovania vírusov. Môže byť dosiahnuté celkom úplné odstránenie lipidmi opúzdrených vírusov. Takisto sa dosiahne významná redukcia v kvantite ostatných vírusov.

Pokiaľ sú si prihlasovatelia vynálezu vedomí, hemoglobínové produkty tohto vynálezu majú väčší stupeň čistoty ako akékoľvek predtým opísané hemoglobínové produkty, Možno, že kvôli ich mimoriadnej čistote, alebo doteraz nie plne vysvetleným faktorom, produkty vynálezu prejavujú neočakávané a vysoko výhodné vlastnosti, doteraz neopísané pre hemoglobínové produkty, alebo aspoň nie pre tie, ktoré sú vyrábané vo veľkom.

Presnejšie, produkty tohto vynálezu, HbAo, neobsahujú žiadne membránové proteíny červených krviniek, čo bolo zistené metódou izoleletrickej fokusácie a pomocou imunoblot analýzy. Ako bolo zistené imunoabsorpčnou technikou, prítomné sú stopové množstvá ľudského sérového albumínu (HSA), v hladinách menších ako 4 g, obvykle v rozpätí od 2-4 g HSA/100 mg Hb. Jediné ďalšie zistiteľné proteíny niekedy nájdené v produktoch vynálezu sú fragmenty a globínových reťazcov hemoglobínu a tieto neprekračujú však ani 1 g na 100 mg hemoglobínu. Svojou extrémne vysokou hladinou čistoty je protukt tohto vynálezu neobyčajne pozoruhodný a demonštruje neočakávané vlastnosti opísané nižšie. Jednou z nich je zníženie alebo neprítomnosť vazokonstrikčnej aktivity. Ďalšou je znížená toxicita voči kultivovaným endoteliálnym bunkám.

V minulosti bolo publikované, že vysoko purifikované hemoglobíny, oba typy, krížovozosieťované a nezosieťované spôsobovali po infúzii zvýšenie tlaku krvi. Keďže produkty boli zdanlivo tak vysoko purifikované, súčasné teórie vychádzajú z predpokladu, že v samotnom hemoglobíne musí byť obsiahnutá vlastnosť, ktorá to spôsobuje. Presnejšie, existuje domienka, že hemoglobín je schopný viazať oxid dusičný ktorý je za tento efekt zodpovedný. Oxid dusnatý, ktorému sa tiež pripisuje vlastnosť relaxujúceho faktora endoteliálneho pôvodu, je účinným vazodilatátorom, ktorý je syntetizovaný endoteliálnymi bunkami cez medziprodukt enzýmu syntázy oxidu dusnatého. Pretože molekuly viažu oxid dusnatý s vysokou súčasnosti je akceptovaný hemoglobínových ktorý a

sa, a v infúzia nie je vyvolá hemoglobínu predpokladalo intravenózna roztokov hemoglobínu, odstráni oxid dusnatý s vazokonstrikciou.

Zistenie, že produkty tohto vazopresorickej aktivity na modeloch izovolemických roztokov, krížovo hyperténznú afinitou, názor, že obzvlášť zosieťovaný odpoveď vynálezu sú zbavené výmien a hemoragickom šoku, je úplne neočakávané a je v protiklade k súčasným teóriám a názorom vo vzťahu k vnútorným intrinsic vlastnostiam hemoglobínu . Tento vynález naznačuje, že to nie zapríčinené vnútornou vlastnosťou hemoglobínu, ktorý je zodpovedný za jeho už predtým opísanú vazokonstrikčnú aktivitu, ale príčinou je prinajmenšom a sčasti vplyvom nečistoty, ktorá je prítomná v extrémne nízkych množstvách a ktorá nebola predtým úspešne odstránená, napriek uvedeným údajom o extrémne vysokej úrovni čistoty predtým uvádzaných hemoglobínov.

Výhody neprítomnosti vazopresorickej aktivity v produktoch podľa tohto vynálezu spočívajú v krížovozosieť-ovaných a polymérizovaných hemoglobínových produktoch vyrobených z produktov podľa tohto vynálezu, napr. použitie metódy opísanej v udelenom U.S. Patente sériového čísla 08/231 945 podaného 21.apríla 1994.

Okrem toho, produkty podľa tohto vynálezu vykazujú vysokú redukciu toxicity voči endoteliálnym bunkám, pri aplikácií in vitro, v porovnaní s predtým opísanými hemoglobínmi. Štúdie, ktoré predtým opísali roztoky oxyhemoglobínu, vrátane chromatograficky purifikovaných hemoglobínov, poukázali na poškodenie buniek, ktoré sa prejavilo významným zvýšením laktátdehyrogenázy v tkanivovom médiu endoteliálnych buniek, v porovnaní k hladinám laktátdehydrogenázy v kontrolnom médiu tkanivových endoteliálnych buniek. Laktátdehydrogenáza je markerom poškodenia buniek. Táto toxicita sa opäť, považuje a akceptuje ako vnútorná vlastnosť oxyhemoglobínu, pretože testovacie roztoky obsahovali oxyhemoglobín vo vysoko purifikovanom stave.

Neočakávane a významne je zistenie, že hemoglobín získaný podľa tohto -vynálezu nevyvoláva uvoľnenie laktátdehydrogenázy. Na rozdiel od hemoglobínu získaného pomocou tohto vynálezu, bolo pozorované významné zvýšenie uvoľnenia laktátdehydrogenázy pri inkubácii endoteliálnych buniek s hemoglobínovými roztokmi, zbavených stromy, ktoré sa získali inými chromatografickými metódami.

Je všeobecne akceptované, a skutočne evidentné, že akákoľvek krvná náhrada a akákoľvek zložka z nepurifikovaného materiálu pre krvné substituenty, by mala byť dostatočne purifikovaná tak, aby bola zbavená všetkých škodlivých kontaminantov. Ako sa predtým zistilo, medzi nebezpečné kontaminanty patria stróma buniek, endotoxíny a iné pyrogény, nehemoglobínové bielkoviny, atď. Staršie umelé krvné náhrady boli označované ako úplne čisté bez jedného alebo viacerých takýchto kontaminantov. Termín úplne čisté je však relatívny, subjektívne chápaný termín, jeho interpretácia a limitácia závisí od spôsobu určenia použitého relevantného parametru a opisu v relevantnom zmysle. Vylepšené purifikačné a analytické techniky sa stali predmetom publikácií o krvných náhradách a hemoglobinových produktoch so stále vyššími a vyššími hladinami čistoty. Napríklad staršia literatúra obsahuje publikácie o hemoglobínových roztokoch,v ktorých viac ako 99,9 % z prítomných proteínov je hemoglobín, v jednej alebo druhej forme (pozri už predtým spomenutý patent 5 084 588 Rausch a spol.). Predpokladá sa, v zhode s týmto vynálezom, že dokonca takáto čistota nie je dostatočná pre výrobu úspešnej krvnej náhrady, pretože charakter zvyškových nečistôt môže spôsobovať vazokonstrikčné účinky a prejavovať toxicitu na úrovni buniek.

U hemoglobínu, zbaveného stromy, dostupného z Walter Reed Army Research Inštitúte (WRAIR) a všeobecne uznávaného ako priemyselný štandard pre čistotu, je možné preukázať, že obsahuje veľký počet (>10 ) rozdielnych, kontaminujúcich proteínov, mnohé z nich sú prítomné v množstve menšom ako 0,01 % všetkých proteínov. Pretože je to zdanlivo veľmi malé množstvo, faktom zostáva, že hemoglobín ako krvná náhrada je aplikovaný jedincovi v relatívne veľkých množstvách, a tak jeho celkové množstvo aplikovaného kontaminantu určuje, či je alebo nie je škodlivé, nie jeho zmesi. Jedna jednotka hemoglobínu, krvnej náhrady bude obsahovať od takže 0,01 % nečistôt nečistôt. nachádzať extrémne produkt, ktorý má obsah nehemoglobínových proteínov nižší ako nie nevyhnutne rozpoznateľné toxicitu voči Vynález taktiež poskytuje spôsob hemoglobínových roztokov na komerčne ako bolo diskutované vyššie.

ďalšou výzmamnou výhodou produktov podľa ich znížená prokoagulačná aktivita. Zdá obsah látok, ktoré zrážanlivosť krvi, v porovnaní s ostatnými a predtým publikovanými hemoglobínovými zbavenými stromy.

O_ o

V širokej jeden alebo nebezpečné.

koncentrácia v aplikovanej ktorá tvorí základ roztoku

- 50 gramov hemoglobínu, predstavuje 2,5 - 5 miligramov škále prítomných proteínov sa môžu dva proteíny, ktoré sú v tomto množstve Tento vynález poskytuje hemoglobínový

0,5% a skôr pod 0,1 % a pravdepodobne, ale ako vyplýva z výsledkov nemá žiadne vazokonstrikčné účinky a žiadnu signifikantnú endoteliálnym bunkám, prípravy takýchto zaujímavom princípe,

Okrem toho tohoto vynálezu je sa, že produkty majú význame zredukovaný vyvolávajú dostupnými produktami,

Ďaľší opis vynálezu je zameraný na ilustrovanie nasledovných nelimitovaných príkladov.

PRÍKLAD 1

PRÍPRAVA NEPURIFIXOVANÉHO LYZÁTU Hb

Deväťdesiatšesť jednotiek (približne 30 1) červených krviniek (RBCs) rovnakého typu krvi bolo potom rozriedených s 24 1 0,9 % fyziologického i zmes sa potom prefiltrovala cez 20 z 8 filtre, aby sa odstránili akékoľvek zvyšky populácie zmiešaných a roztoku. Táto polypropylénové leukocytov.

Po odfiltrovaní leukocytov sa červené krvinky premyli s 6 objemami 0,9 % fyziologického roztoku a diafiltrovali v konštantnom objeme pri použití plochy 3,5 m² Sepracor membrány z polyétersulfónového vlákna s pórami 0.3 . Premývací tlmivý roztok bol potom nahradený 50mM Tris lyzačným tlmivým roztokom a červené krvinky boli postupne podrobené lýze do 6 objemov tohto lyzačného tlmivého roztoku.

Získaný nepurifikovaný lyzát bol zahustený z približne 2,5 % celkového hemoglobínu (THb) na približne 9,0 % THb za použitia Milipore PTTK membrány, ktorá zachytí molekulové hmotnosti nad 30 K (MWCO). Po zahustení bol tank naplnený s CO plynom,aby konvertoval hemoglobín na formu COHb. Lyzát bol pasterizovaný pri teplote 62 2 C po dobu 10 hodín v uzatvorenom tanku. Pasterizovaný lyzát bol ochladený a potom centrifugovaný. Následná ultrafiltrácia cez 0,8 Milipore filtre pripravila pasterizovaný lyzát na diafiltráciu na inej Milipore 30 K PTTK membráne. Materiál bol diafiltrovaný s 5 mM Tris tlmivým roztokom, pH 8,9,, pokiaľ jeho vodivosť bola < 0,3 mS a pH bolo 8,9 0,2. Potom sa zriedil na 4,5 - 5 % THb a v tomto bode bol systém pripravený na následnú chromatografickú purifikáciu.

PRÍKLAD 2 - VYTESŇOVACIA CHROMATOGRAFIA NA IONOMENIČOVEJ

ŽIVICI_USKUTOČŇUJÚCEJ VÝMENU ANIÓNOV_

Kolóna o rozmeroch 1 x cm, naplnená ionomeničovou živicou, uskutočňuj úcou výmenu aniónov,

PerSeptive Poros HQ-50 sa premyla so objemami kolóny s 1 N NaCI a ekvilibrovala s 5 mM Tris-tlmivým roztokom, pH 8,8. Po ekvilibrácii kolóny sa na túto aplikovalo 50 ml 3,0 % (3 g/lOOml) nepurifikovaného hemoglobinového lyzátu (“85% HbAo) v 5mM Tris-tlmivého roztoku, pH 8,8, 0,78 ml/min (1 cm/min) pripraveného tak, ako bolo opísané v Príklade 1. To viedlo k prípadnému predávkovaniu kolóny - plnenie je 200 mg roztoku na ml živice, v porovnaní s kapacitou pre plnenie 50 mg/ml, ktoré je odporúčané výrobcom. Výluh sa zozbieral. Kolóna sa potom premyla s 2 objemami kolóny s 5 mM Tris-tlmivým roztokom, pH 8,8 a tento výluh bol zmiešaný s výluhom, zozbieraným počas napĺňania. Kolóna sa potom premyla s 1 N NaCI tak, aby sa vymyli zachytené proteíny a tento výluh sa vyleje do odpadu. Kolóna sa regenerovala s použitím 3 objemov kolóny IM NaCl/HCl a 4 objemov kolóny 1 M NaOH. Hemoglobínový výluh z anióny vymieňajúcej ionomeničovej živice sa analyzoval na analytickej anióny výmieňajúcej ionomeničovej kolóne, pri použití gradientu pH, ako je nižšie detailnejšie opísané v Príklade 11. Stanovilo sa približne 95 - 96 % HbAo, ako je uvedené na Obr.'3, s výťažkom 90 % HbAo z množstva aplikovaného do kolóny.

PRÍKLAD 3 - VYTESŇOVACIA CHROMATOGRAFIA NA IONOMENIČOVEJ

ŽIVICI—USKUTOČŇUJÚCEJ VÝMENU ANIÓNOV

Kolóna o rozmeroch 1 x 10 cm naplnená gélom Merck Fractogel-TMAE sa premyla so 4 objemami kolóny s 1N NaCl a ekvilibrovala s 5 mM Tris-tlmivého roztoku, pH 8,8. Po ekvilibrácii kolóny, 50 ml 3,0 % (3 g/lOOml) nepurifikovaného hemoglobínového lyzátu (~85% HbAo) v 5mM Tris, pripraveného ako bolo opísané v Príklade 1, pH 8,8, bol tento lyzát. aplikovaný na kolónu pri 0,78 ml/min (1 cm/min). Toto obdobne viedlo k prípadnému predávkovaniu kolóny. Výluh sa zhromaždil. Kolóna sa potom premyla s 2 objemami kolóny s 5 mM Tris-tlmivého roztoku, pH 8,8 a tento výluh bol zmiešaný s výluhom zozbieraným počas plnenia kolóny. Kolóna sa potom premyla s 1 N NaCl tak, aby sa odstránili zachytené proteíny a tento výluh sa vyleje do odpadu. Kolóna sa regenerovala s použitím 3 objemov kolóny 0,5 N HC1 a 4 objemov kolóny 1 M NaOH. Hemoglobínový výluh z ionomeničovej živice, uskutočňujúcej výmenu aniónov bol analyzovaný na analytickej anióny vymieňajúcej ionomeničovej kolóne, pri použití gradientu pH ako je nižšie detailnejšie opísané v Príklade 11, a stanovilo sa približne 95 - 96 % HbAo, ako je uvedené na Obr. 3, s výťažkom 73 % HbAo z množstva aplikovaného na kolónu.

PRÍKLAD 4 - VYTESŇOVACIA CHROMATOGRAFIA NA IONOMENIČOVEJ

ŽIVICI—USKUTOČŇUJÚCEJ VÝMENU KATIÓNOV

Kolóna o rozmeroch 1 x 10 cm naplnená s Perseptive Poros HS-50 sa premyla so 4 objemami kolóny s IN NaCl a ekvilibrovala s 5 mM Tris-tlmivým roztokom, pH 7,5. Po na ionomeniči ekvilibrácii kolóny sa g/100 ml), na v 5mM Tris, v Príkladoch 2 nakoniec viedlo kolónu aplikovalo 120 ml 2,0 % (2 aniónov purifikovaného ~95% HbAo, pripraveného ako bolo opísané pH 7,5, a 3, rýchlosťou 0,78 ml/min (1 cm/min). Toto k podstatnému presýteniu kolóny, do rozsahu približne 5-násobne vyššiemu, ako odporúča výrobca. Výluh sa zozbieral. Kolóna sa potom premyla s 2 objemami kolóny 5 mM Tris-tlmivého roztoku, pH 7,5 a tento výluh bol zmiešaný s výluhom zozbieraným počas plnenia. Kolóna sa potom premyla s 1 N NaCI tak, aby sa odstránili zachytené proteíny a tento výluh sa vyleje do odpadu. Kolóna sa regenerovala s použitím 3 objemov kolóny 0,5N HCI a 4 objemov kolóny 1 M NaOH. Hemoglobínový výluh z ionomeničovej živice, uskutočňujúcej výmenu aniónov, sa analyzoval na analytickej, anióny vymieňajúcej ionomeničovej kolóne, pri použití pH gradientu a stanovilo sa > 99 % HbAo, ako je ilustrované na Obr. 4, s výťažkom približne 90 % HbAo, z množstva aplikovaného na kolónu.

PRÍKLAD 5

Sledoval sa vplyv vodivosti na vytesňovaciu chromatografiu na ionomeničovej aniónov (prvý stupeň).

Účinnosť vytesňovacej júcej miere závislá na iónovej živici, uskutočňujúcej výmenu chromatografie je v rozhodusile tlmivého roztoku ako aj vzorky, čo sa stanovilo vodivosťou. Experiment, ktorý je zhr nutý dole v Tabuľke 2 sa uskutočnil tak, že nepurifikovaný lyzát z Príkladu 1 sa aplikoval na ionomeničovú živicu , uskutočňujúcu výmenu aniónov Poros HQ-50 z PerSeptive Biosystems Inc. Výluh z kolóny sa analyzoval pomocou analytickéj anióny vymieňajúcej ionomeničovej chromatografie. Frakcie, získané počas procesu č. 1, boli všetky bez stanoviteľného množstva kyslých kontaminantov, zatiaľ čo dokonca už prvá frakcia z procesu 2 bola kontaminovaná s kyslými nečistotami.

CM

TABUĎKA

Odstrán, kyslých kontamin.	100%	o\° O
Rýchlosť prietoku cm/min		H	H
'S, 44
> 0
-H U		ω	to
g N rH 0 H		Tri	Tri
«J Q		T—1	r-1
C Ό X rd		x	x
0 /1		o	o
x; -		r-1	rd
			in
		cm	CO
CO
g		o o	CN
		co	CO
w		•	•
£X		CO	CO
XI		o	00
K		♦	·♦
H		m	CM
ita ia 1
o c g «s (U \	o	o
CbC tD (0 <—1 g	o CM	o CM
« &
ω
d
44			(N
0
CU

PRÍKLAD 6 - VÝŤAŽOK AKO FUNKCIA NÁLOŽE PROTEÍNU.

Presýtením kolóny sa dosiahne väčší výťažok purifikovaného HbAo. Experimenty opísané nižšie v Tabuľke 3 ukazujú veľmi veľké presýtenie na 10 ml kolóne katiónovej ionomeničovej živice Poros HS-50, ktorá zaručuje, že všetky väzobné miesta sú obsadené kontaminantmi, čo dovoľuje väčší výťažok purifikovaného HbAo. Presýtenie kolóny v prvom experimente bolo 13,5 krát väčšie ako odporúča výrobca (308 mg proteínov/ml). V druhom experimente to bolo približne 5-krát väčšie ako odporúča výrobca. Väčšie presýtenie vedie k výzmamnému zlepšeniu výťažku množstva získaného HbAo z kolóny.

TABUĽKA 3

Nálož (mg proteínov	THb	PH	mS	Kolóna (L x D)	Tlmivý roztok	Rýchlosť prietoku cm/min	Bez alkalic kontamin.
ml
308	3,1	7,5	0,5	9,5x1	Tris	0,6	100 % 88 % výťažok
216	2,9	7,4	0,6	9,5x1	Tris	0,6	100 %

% výťažok

PRÍKLAD 7 - POROVNANIE MEDZI MALÝMI A VEĽKÝMI KOLÓNAMI

Proces vytesňovacej chromatografie podľa tohto vynálezu môže byť použitý na veľkých a malých kolónach. Pri použití aniónovej ionomeničovej živice Poros HQ-50, s využitím 15 1 kolóny a následne katiónovej ionomeničovej živice HS-50, s využitím 10 1 kolóny sa vykonalo porovnanie s 10 ml kolónami. Plniaci roztok do kolóny obsahujúcej HQ-50

- 25 bol pripravený ako je opísané v Príklade 1. Výluh z HQ-50 kolóny bol plnený do HS-50 kolóny. Tabuľka 4 ilustruje podmienky a výsledky použitia Poros HQ-50 kolón. Tabuľka 5 ilustruje výsledky použitia POROS HS-50 kolón. Výsledky poukazujú, že obidva stupne procesu na komerčné využitie môžu byť. rozšírené do objemu, prinajmenšom 10-15 litrových kolón.

TABUĽKA

% odstrán. kyslej ších kontamin.	100%	<A° O O rH
• · C
Rýchl priet cm/mi	rH	rH
	CQ	CQ
•H XJ
e n rH O H M	Tri	Tri L
		in
05 Q C	rH
Ό N rH	X	X
0 J	o	O
	H	H
'XJ
co
0
> en	m	m
•h g	•	•
Ό	o	o
O
>
	σ>	CO
m	•	•
&	CO	CO
£)	eo	r-
K	»
H	m
>N rH
o s	o	O
H \	rH	o
'te íd S E	CM	CM
t vo ené		Cn tí
žs ln	UJ	CM
0 Ch c ω	rH	m
S G

Š 'J D CQ

c '05 · β Ll XJ -H	o\°	o\o
4J Ή	o	o
W Ό 05	o	o
Ό 05 XJ 0 (Q C	rH	rH
'05 O o\o N tí
• · c
chl iet /mi	ID	eo
P E « Oí u	O	o
>1,X
> 0	ω	ω
•H -P
E N
rH 0 H	H	H
		O
·***	rH	m
05 Q
C	x	X
Ό X rH	ĽD	m
0 J w —	cn	en
xj
CQ
0	in	Tf
>
h cn	o	o
Ό E
0
> ·
	in
K
04	C'	r-
Λ	rH	r-
K
H	Γ0	n
>N rH
OJ:	00	v<
'05 tí)	o	in
S E	m	(N
O Ό		bi
> c	Cn
žst lne	M·	r-
o Q,	CN	rH
C 05
S c

- 27 PRÍKLAD 8 - ANALÝZA NEPURIFIKOVANÉHO HEMOGLOBíNOVÉHO LYZÁTU A PURIFIKOVANÉHO HEMOGLOBÍNU POMOCOU IZOELEKTRICKEJ FOKUSÁCIE (IEF)

Analýza izoelektrickou fokusáciou (IEF) bola uskutočnená s použitím agarózového typu gélu s pH gradientom vytvorenom s použitím komerčne dostupných amfolytov. Amfolyty boli použité tak, že 90 % z nich bolo v rozsahu pH 5-8 a 10 % bolo v rozsahu pH

3,5-10 .

Finálna koncentrácia agarózy v géli bola 1,25 % a finálna koncentrácia prítomných amfolytov bola okolo 2 %. Kvôli zámeru určenia čistoty vzoriek, na gély sa aplikoval nadbytok vzorky (1 mg proteínu bol nanesený na 1 dráhu). Elektoforéza sa uskutočnila pri malom prúde, aby sa zabezpečil pohyb proteínov v elektrickom poli v rovnakom rovnom pruhu. Po dosiahnutí ustáleného stavu, napätie a prúd sa zvýšili na krátky čas, aby sa dosiahlo ďalšie zaostrenie pruhu. Po elektoroforéze boli proteíny v agarózovom géli fixované roztokom kyseliny trichlóroctovej a sulfosalycilovej. Po fixačnom kroku, sa gél zafarbil s Coomassie modrou, aby sa zviditeľnili pruhy proteínov.

Kvôli detekcii bol gél vysušený a na detekciu sa potom použil laserový denzitometer na rozlíšenie dráh získaných elektrofokusáciou zo vzoriek obsahujúcich nepurifikovaný hemoglobínový lyzát a purifikovaný hemoglobín. Obrázok 5 ilustruje porovnanie medzi IEF nepurifikovaného hemoglobinového lyzátu, pripraveného ako je opísané v Príklade 1, a purifikovaného HbAo pripraveného podľa tohto vynálezu. Purifikácia hemoglobinového roztoku sa uskutočnila za použitia Poros HQ-50 kolóny tak, ako je opísané v Príklade 2 a následne Poros HS-50 kolóny tak, ako je opísané v Príklade 4.

PRÍKLAD 9 - IMUNO-ANALÝZA NEPURIFIKOVANÉHO HEMOGLOBíNOVÉHO

LYZÁTU A PURIFIKOVANÉHO HEMOGLOBÍNU.

Na analýzu množstva rozličných kontaminantov v nepurifikovanom hemoglobinovom lyzáte z Príkladu 1 a v purifikovanom hemoglobíne, pripraveného podľa metódy vynálezu, sa použila imuno-farbiaca technika. Po elektrofokusácii proteínov na agarózovom géli, proteíny boli premiestnené na nitrocelulózový papier s použitím kapilárnej blotačnej techniky. Zvyšné volné väzobné miesta na papieri boli blokované inkubáciou blotu v roztoku hydrolyzovanej želatíny z rýb. Po inkubácii bol blot premytý s tris-upraveným fyziologickým roztokom (TBS) potom inkubovaný s primárnou protilátkou. (Primárna protilátka je protilátka, voči ktorej má bytí vzorka testovaná, napr. proti-ľudskému sérovému albumínu (anti-HSA) by mala byť použitá na testovanie HSA v hemoglobinových roztokoch). Po tejto inkubácii, bol blot premytý s TBS a potom inkubovaný so sekundárnou protilátkou, konjugovanou na enzýmový marker (napr. chrenová peroxidáza), ktorá je protilátkou proti primárnej protilátke. Po inkubácii so sekundárnou protilátkou bol blot znova premytý s TBS a potom sa pridal substrát pre enzýmový marker. Farebná zrazenina sa objaví tam, kde sa sekundárna protilátka naviazala na primárnu protilátku, ktorá je naviazaná na jeho antigén, a takto indikuje množstvo a polohu antigénu voči primárnemu antigénu na IEF géli.

Výsledky sú uvedené dole v Tabuľke 7, na ktorej ++++++ naznačuje silný signál, + naznačuje sotva zachytitel'ný signál a označuje, že žiaden signál nebolo možné zaznamenať.

TABUĽKA 6

POUŽITÉ PROTILÁTKY	NEPURIFIKOVANÝ Hb LYZÁT	HEMOGLOBÍN
Ľudský sérový albumín	+ + + + + + + + + + +	+ a
Erytrocyty ( Er )	+ + + + + + +
Membrány Er	+ + + + +	-
Ľudská plazma	+ + + + + + + + + + +	+ c
CO2 anhydráza I	+ + +	-
Spektrín	+ + + +	-
Glykoforín	+ +	-

a. Ľudský sérový albumín bol použitý ako štandarda pre imunobloty, jeho stanovená koncentrácia v purifikovanom HbAo bola < 5 pg/mg Hb ( < 50 ppm ).

b. Krížovými reakciami s protilátkami erytrocytov bol zistený kontaminant v stopovom množstve s pi ~ 5,2. Iní autori tiež uvádzajú podobný proteín v ich roztokoch purifikovaného Hb - pozri Christensen a spol., od. cit.

c. Protilátkami voči ľudskému sérovému albumínu prítomnými v anti-ľudskej plazme sa zisťovala prítomnosť ľudského sérového albumínu v purifikovanom HbAo.

PRÍKLAD 10 - ĽUDSKÝ SÉROVÝ ALBUMÍN - IMUNO DETEKCIA (HSA-ID)

Na kvantitatívne stanovenie ľudského sérového albumínu v roztoku hemoglobínu bola použitá chromatografická metóda. Metóda využívala kovalentne viazanú protilátku ( anti -HSA ) na matricu v kolóne. Keď sa vzorka aplikovala na kolónu, všetko okrem antigénu protilátky, prešlo cez kolónu v priebehu plniaceho a vymývacieho kroku. Pri použití elučného tlmivého roztoku, viazaný antigén (HSA) sa uvoľnil z kolóny a plocha tohto vrcholu sa používala na kvantitatívne stanovenie antigénu prítomného vo vzorke.

Imunodetekčná* (ID) testovacia súprava bola od firmy PerSeptive Biosystems. Prietoková rýchlostí na stanovenie bola 2 ml/min. Náboju podobná kolóna (1,6 mmD x 26 mmL) bola ekvilibrovaná s plniacim 10 mM fosfátovým tlmivým roztokom + 300 mM NaCI, pH 7,2 ) a potom sa aplikovalo 50 1 vzorky. Plniaci tlmivý roztok sa použil na premývanie kolóny po dobu 0,25 minúty a potom sa použil elučný tlmivý roztok (po dobu

3,5 minúty) tak, aby sa vylúhoval viazaný HSA z kolóny. Výluh bol monitorovaný Beckmanovým diódovým detektorom pri

220 nm a 414 nm. Kolóna bola potom reekvilibrovaná s plniacim tlmivým roztokom pre ďalšiu metódy stanovené množstvo aplikáciu. Pri použití tejto ľudského sérového albumínu nachádzajúce sa v purifikovanom hemoglobíne nebolo vyššie ako 0,0005 % hmotnosti, v prepočte na hemoglobín.

* ochranná známka

PRÍKLAD 11 - ANALYTICKÁ IONOMENIČOVÁ CHROMATOGRAFIA

Chromatografická metóda, ktorá sa použila na analýzu čistoty hemoglobínu v produktoch uvedených v príklade 2 a 4 bola nasledovná. Stanovenie sa zakladalo na metóde uverejnenej Huismanom & Dozym ^⁴\kde sa vzorka aplikovala na anióny vymieňajúcu ionomeničovú kolónu pri vysokom pH ( pH 8,5 ), takže všetky proteíny sa naviazali na kolónu a potom sa využil pH gradient od pH 8,5 po pH 6,5, aby sa postupne vylúhovali proteíny z kolóny. Použitím tejto chromatografickej metódy sa môžu separovať veľmi podobné proteíny (napr. rôzne varianty hemoglobínu). Na stanovenie sa použila 4,6 mm x 100 mm analytická anióny vymieňajúca ionomeničovú kolóna z PerSeptive Biosystemu. Použité tlmivé roztoky boli A) 25 mM Tris + 25 mM Bis-tris, pH 8,5 a B)25 mM Tris +25 mM Bis-tris, pH 6,5. Stanovenie sa uskutočňovalo pri rýchlosti prietoku 5 ml/min. Po tom, ako bola kolóna ekvilibrovaná s tlmivým roztokom B, 10 1 vzorky (koncentr.

mg THb/ml) sa aplikovalo na kolónu, na ktorú sa začalo pôsobiť gradientom (100 % tlmivého roztoku A ku 100 % tlmivému roztoku B na 25 objemových jednotiek kolóny). Výluh sa monitoroval UV detekciou pri 280 nm, za účelom identifikácie proteínových vrcholov. Obrázok 3 ilustruje chromatografický profil anióny vymieňajúcej ionomeničovej purifikácie hemoglobínu (produkt z príkladu 2) a obrázok 4 ilustruje purifikáciu HbAo (produkt z príkladu 4), keď boli analyzované touto metódou.

Táto metóda je štandardným stanovením na zistenie čistoty hemoglobinových roztokov. Purifikovaný HbAo v tomto vynáleze bol zbavený všetkých kontaminantov pozorovaných u hemoglobínu zbaveného stromy. Malý susediaci vrchol, predchádzajúci vrcholu HbAo sa príležitostne vyskytoval a bol pripisovaný oxidovanej forme HbAo (MetHbAo). Čistota produktu v tomto vynáleze je bežne vyššia než 99,5 % pri tejto analytickej metóde.

PRÍKLAD 12 - ODSTRÁNENIE VÍRUSOV

Proces v predkladanom vynáleze bol testovaný pre jeho schopnosť odstrániť vírusy z nepurifikovaného hemoglobínu.

Ku vzorkám pripraveného nepurifikovaného lyzátu, ako bolo opísané v Príklade 1 a ku vzorkám čiastočne purifikovaného roztoku hemoglobínu vytekajúceho z aniónovej kolóny, napr. produkt z Príkladu 2a 3, sa použil test, ktorý kvantifikuje nasledovné, pridané vírusy v aktívnej forme:

Poliovírus typ 1

Human Immunodeficiency (HIV) /vírus spôsobujúci AIDS/

Bovine Diarrhea Virus (ktorý je modelom pre ľudský vírus hepatitídy ) /hovädzí vírus vyvolávajúci hnačky/

Herpes simplex Virus typ 1 (HSV-1).

Alikvotné časti výluhu z príslušných kolón boli pridané k testovaciemu bunkovému systému. V prípade poliovírusu, herpesového vírusu a hovädzieho diarhea vírusu, prítomné aktívne vírusy reagujú s testovacími bunkami a vytvárajú V prípade k médiám plaky. Použili sa bežne známe HIV, alikvotné časti výluhov z tkanivových stanovilo zmenou kultúr. Množstvo sa štandardné kolón sa metódy. pridali vírusov prítomných rastu bunkových línií. Tieto zmeny sú známe ako TCID^q (infekcia 50% tkanivových kultúr). Tieto výsledky sú uvedené v Tabuľke 7 ďalej.

LOG REDUKCIE VÍRUSOV DOSIAHNUTÝ V PRIEBEHU CHROMATOGRAFIE

X ω h p n O4 S w H pH cn t* H cn M cn 04 p Pi Pi M H K P>	RNA	0 tí	Bunky Vero	r~f E tí H-l Cb o H X m in	<3 pfu/ml	k£) Λ	rH E tí IM 04 \O 0 rH X 0 CM	rH E tí IM O4 m O rH x rH	>3
M P Pi 1-1 es O H « Q	i	O tí	G H cn w >4 44 tí tí CQ	r-1 E tí IM Q, ΙΛ O rH X Γ' H	rH E tí <M O4 O CN V	M* Λ	rH E tí <M 04 ΙΛ O rH x CO CM	1—< E tí <M 04 0 rH X rH CM	rH Λ
HUMAN IMMUNO- DEFICIENCY — -- - - !		.0 tí	1 H S >, 44 C tí· ra	ΙΛ ° e H ^E X S Q M* H • U H Η	tí) S 0 tn Q n U H m v	in Λ	O tí) H X 2 Q CM H • U m H	rH E Q <n Q M U L· n O rH x <0 LO	m Λ
POLIOVIRUS TYPE 1 1 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________i		0) •rl a	O P Φ > >4 x tí G m	r4 e tí <M 04 f* o H x H	rH E \ tí <M Q4 W 0 H x in CO	rH V	rH E G IM 04 r- O rH x rH m	rH E tí <M 04 VO 0 rH x in r-	rH V
VÍRUS	♦g G Φ U	'^4 G Φ rH 03 X) O	e 'Φ M ω r*, ω Ή Q (Ú > O M n φ . H	>N O i—1 '05 tí '05 > O tí Ό •H α c	tí! tí rH ť £ . 0 tí Ό •H tí	Φ •H u tí Ό· Φ tí m 0 tí)	>N O t—1 '05 G '05 > 0 G Ό H 4J 05 X	tí! tí rH £ £ O c Ό •H 4J 05 W	Φ -H u 44 tí Ό Φ M tn 0 P

- 3 3 -Tieto výsledky poukazujú na malú redukciu množstva poliovírusu pri použití krokov buď výmeny aniónov alebo katiónov vytesňovacou ionomeničovou chromatografiou, uvedenou v tomto vynáleze, avšak poukazuje na výraznú redukciu vírusov po aplikácii vírusov na kolónu v prípade HIV, HSV bovine diarrhea a po následnej, anióny vymieňajúcej ionomeničovej chromatografii a v menšej miere po následnej, katióny vymieňajúcej ionomeničovej chromatografii. Tento nález bol úplne neočakávaný, avšak predstavuje významnú výhodu použitia tohto vynálezu.

PRÍKLAD 13 - ANALÝZA ČISTOTY POMOCOU IZOELEKTRICKEJ FOKUSÁCIE A WESTERN BLOTU

Pre pokusy, týkajúce sa izoelektrickej fokusácie (IEF) sa použila technika podľa Saravisa a Zamchecka.

Zariadenie na prípravu IEF gélov sa naplnili agarózou (finálna koncentrácia 1 %) a gradient pH sa vytvoril pomocou amfolytov (Pharmacia Biotech ľne., Piscatawaz, N.J.) tak, že 90 % bolo v rozpätí pH 5 - 8 a 10 % v rozpätí pH 3,5 - 10. Zvyčajne 10 1 z roztokov hemoglobínu o obsahu 100 mg/ml sa nanieslo na IEF gél. Po fokusácii proteínov, gél sa fixoval s 10 % kyselinou trichlóroctovou (TCA), vysušil a farbil s Coomassie modrou [3]. Obvykle sa nanáša 1 mg celkových proteínov na jednu dráhu.

Izoelektrická fókusačná analýza (IEF) bola použitá na porovnanie čistoty SFH s štyrmi (4) rozličnými šaržami HbAo purifikovaného podľa tohto vynálezu. Nanieslo sa 50 g alebo 1 mg celkového Hb na jednu dráhu. Výsledky sú ilustrované na Obr. 6. Dráha 20 predstavuje hemoglobín neobsahujúci stromu, ak bolo nanesených 50 g celkového Hb a dráhy 22, 24, 26 a 28 predstavujú šarže purifikovaného Hb podľa tohto vynálezu pri rovnakom nanesení vzoriek. Dráha 30 predstavuje 1 mg celkove naneseného SFH a dráhy 32, 34, 36 a 38 predstavujú šarže purifikovaného Hb podľa tohto vynálezu pri rovnakom nanesení vzoriek. 50 g celkove nanesenej vzorky ukázalo, že purifikovaný HbAo a SFH majú podobnú čistotu. Avšak, ak sa nanieslo 1 mg celkového Hb/dráhu, množstvo proteínov červených krviniek, buď plazmatických alebo membránových proteínov bolo pozorovaných v dráhe SFH, pričom tieto proteíny neboli zistené v dráhe purifikovaného HbAo. Veľmi slabý pruh proteínu o pi približne 5,2 sa zistil v dráhe purifikovaného HbAo, pravdepodobne z fragmentov globínového reťazca. Pruhy nad pruhom HbAo v dráhach, na ktoré sa aplikovalo 50 g vzorky sa vyskytujú kvôli prítomnosti viac kladne nabitých druhov MetHb, ktoré vznikajú počas elektrofokusácie.

Po ukončení izoelektrickej fokusácie sa pokračovalo technikou Westernovej blotačnej analýzy, ktorej princípom je farebná reakcia v prítomnosti protilátky (imuno-farebná reakcia), aby sa ďalej vyšetrila čistota produktu uvádzaného v tomto vynáleze. Takto, proteíny z IEF gélu boli za použitia kapilárneho blotingu prenesené na nitrocelulózový papier. Zostávajúce voľné miesta na nitrocelulózovom papieri boli blokované inkubáciou blotu s hydrolyzovanou želatínou rýb (Hipure Liquid Gelatin, Norland Products Inc., New Brunswick, N.J.). Potom sa blot inkuboval s králičou protilátkou proti ľudskej plazme (Dáko Corp., Šanta Barbara, CA, šarža #010) (protilátky boli zriedené 1 : 500 v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku). Po inkubácii cez noc, sa blot premyl s Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom (TBS) obsahujúcim 1% želatínu z rýb a potom bol inkubovaný s kozou-protikráličou IgG-chrenovou peroxidázou (HRP) (zriedenou 1 : 1000 v TBS).

Po jednohodinovej inkubácii, blot sa opáč premyl s TBS obsahujúcom 1 % želatínu z rýb. Komplex antigén-protilátka-HRP sa vizualizoval s 4-chlór-l-naftolom (30 mg/20 ml metanolu) a peroxidom vodíka (50 1 v 100 ml TBS) . Prítomnosť, antigénov, špeciálne plazmatických proteínov indikovali tmavopurpurové pruhy zrazeniny.

Vzorky hemoglobínu zbaveného stromy v duplikátoch, Hb podľa vynálezu, IEF Hb podľa vynálezu, purifikovaný Hb z Walter Reed Army Inštitúte (WRAIR) (purifikovaný spôsobom opísaným v predtým spomenutej práci Winslow a spol.) a purifikovaný Hb zo Sigma Corporation (ako je opísané v ich bežnom katalógu diagnostických činidiel, ako Hemoglobín Ao, kód H 0267) boli podrobené fokusácii na IEF géli. Jedna polovina gélu bola zafarbená s Coomassie-modrou a druhá bola preblotovaná na nitrocelulózový papier. Potom sa blot zafarbil, aby bolo možné vizualizovať komplex ľudská plazma - protilátka proti ľudskej plazme.

Výsledky sú uvedené na Obr. 7. Na tomto Obrázku, na dráhe 40 je znázornený hemoglobín zbavený stromy, zafarbený Coomassie-modrou a na dráhach 42, 44 a 46 sú znázornené príslušné dráhy HbAo podľa tohto vynálezu, Hb z WRAIR H od Sigmy. Na dráhe 48 je znázornený test Western blot - protilátka proti ľudskej plazme hemoglobínu, zbaveného stromy a dráhy 50, 52 a 54 reprezentujú príslušné dráhy HbAo podľa vynálezu, Hb z WRAIR a Hb od Sigmy.

Významné množstvá plazmatických proteínov boli zistené vo vzorkách SFH. Na druhej strane v dráhe produktu podľa vynálezu sa zistili len veľmi nepatrné stopy ľudského sérového albumínu (HSA). V produkte podľa vynálezu neboli zistené d'aľšie plazmatické proteíny. Nezistili sa detekovateľné hladiny HSA v HbAo z WRAIR, avšak potvrdila sa prítomnosť veľkého počtu ďalších plazmatických proteínov nad a pod pruhmi reprezentujúcimi HbAo. Štandarda HbAo od Sigmy obsahuje veľký počet plazmatických kontaminantov zahrňujúcich významné koncentrácie HSA.

PRÍKLAD 14 - AKÚTNA HYPOVOLEMICKÁ ŠTÚDIA U POTKANOV PRI VEDOMÍ

Produkt tohto vynálezu bol testovaný na vazopresorickú aktivitu.

Potkany kmeňa Sprague-Dawley, náhodne rozdelené do 6 skupín (n=6), mohli sa 4 dni aklimatizovať a v tom čase sa im zaviedla permanentná kanyla podľa techniky Tabata a Changa^). Náležíte kanylovaným zvieratám sa intravenózne aplikoval heparín v dávke 150 IU/kg. Jedna arteriálna kanyla bola napojená na Strathamov tlakový transduktor na meranie tlaku krvi a frekvencie srdca. Tieto parametre boli priebežne zaznamenávané na Grassovom polygrafický záznamníku. Po dosiahnutí ustáleného stavu, ktorý dokumentuje základná línia záznamu sa vyvolal letálny hemoragický šok podľa metódy Wiggersa, pri ktorom sa odstránilo 67 % celkového objemu krvi cez inú arteriálnu kanylu pri rýchlosti 0,5ml/min, v dvoch stupňoch. Okamžite po vyvolaní šoku, každému potkanovi sa aplikoval testovaný materiál rýchlosťou 0,5 ml/min., t.j. homologizovaná krv, HbAo podľa vynálezu (HbAo), alebo krížovozosieťovaný HbAo podľa vynálezu pri ktorom sa HbAo nechal zreagovať s o-rafinózovým činidlom, spôsobujúcim sieťovanie ako bolo opísané v uverejnenej U.S. patentovej prihláške 08/231 945 podanej 21. apríla 1994 (objem x 3) . Priemerný arteriálny tlak (MAP) a frekvencia srdca boli zaznamenávané až do 30 min. po ukončení infúzie. Každý potkan sa umiestnil do separátnej klietky a po dobu 14 dní bola monitorovaná jeho váha, hematokrit a prežitie.

Výsledky sú znázornené graficky na obrázku 8, kde MAP je vynesený oproti času.

Tieto údaje ilustrujú, že produkt podľa tohto vynálezu je vysoko purifikovaná forma hemoglobínu Ao, ktorá je rovnako účinná ako celá krv pri obnove priemerného arteriálneho tlaku po hemoragickom šoku u modelového potkana pri vedomí. Neboli pozorované žiadne rozdiely pri obnove arteriálneho tlaku a vo frekvencii srdca v skupine potkanov, ktorým bola aplikovaná celá krv a HbAo.

PRÍKLAD 15 - HEMODYNAMICKÉ ÚČINKY U POTKANOV PO IZOVOLEMICKEJ VÝMENNEJ TRANSFÚZII

HbAo v tomto vynáleze bol testovaný, aby sa vyhodnotili hemodynamické účinky pri izovolemickej výmennej transfúzií u potkanov pri vedomí.

Do externej iliakálnej vény a artérie potkanov sa zaviedla kanyla cez femorálnu oblasť, pozri Keipert a Chang^⁸). Po 24 hodinách oddychového obdobia, zvieratá, ktoré boli pri vedomí sa podrobili kontinuálnym 50 % izovolemickým výmenným transfúziám. Počas výmennej transfúzie bol objem krvi odstránenej cez iliakálnu artériu nahradený testovaným roztokom cez iliakálnu žilu rýchlosťou 0,5 ml/min pomocou konštantnej prietokovej infúznej pumpy. Tlak krvi a frekvencia srdca sa monitorovala nepretržite: (1) 30 min. pred výmenou, (2) v priebehu a (3) 2-3 hodiny po výmene. Priemerný arteriálny tlak a frekvencia srdca boli vypočítané

-.37 zo záznamov krvného tlaku.

Jedna skupina potkanov (4 v jednej skupine) dostala transfúziu ľudského sérového albumínu, HSA. V ďalšej skupine potkanov (6 potkanov v skupine) sa použil roztok hemoglobínu, neobsahujúci stromu (SFH) ako testovací roztok. V ďalšej skupine potkanov (8 potkanov v skupine) bol testovaným roztokom produkt vynálezu.

Výsledky sú prezentované graficky na obr. 9 a 9a.

Pri všetkých testovaných roztokoch sa priemerný tlak krvi zvýšil o 10-20 mm Hg v priebehu výmennej transfúzie. U kontrolného albumínového roztoku sa priemerný arteriálny tlak znížil o 15 mm Hg pod východiskovú úroveň pri monitorovaní počas oddychu po výmennej procedúre a zotrval na zníženej úrovni počas celej monitorovacej fázy po výmene približne 2,5 hodiny. (Obrázok 9). Tieto pozorovania sú v zhode s predchádzajúcimi publikovanými pozorovaniami ( p \ Keiperta a Changa.^v '

U hemoglobínu zbaveného stromy priemerný arteriálny tlak krvi klesol späť na pôvodnú úroveň na konci výmennej periódy, ale zvýšil sa v priebehu monitorovacej fázy po výmene maximálne o 15 mm Hg nad východziu úroveň 30-40 minút po výmene (Obrázok 9a).

Naopak u HbAo z tohto vynálezu sa priemerný arteriálny tlak krvi počas výmenný vrátil na pôvodnú úroveň a zvýšil sa po výmene nie viac ako o 5 mm Hg a tak zachoval MAP v normálnom rozsahu.

Výsledky tejto štúdie ukazujú, že HbAo vo vynáleze je zbavený účinnej vazoaktivity spojenej s výmennou transfúziou s hemoglobínom zbaveným stromy.

PRÍKLAD 16 - IN VITRO STANOVENIE POMOCOU TKANÍVÝCH KULTÚR

ZA ÚČELOM MERANIA OXIDATÍVNEHO POŠKODENIA V ENDOTELIÁLNYCH BUNKÁCH PREDTÝM VYSTAVENÝCH HEMOGLOBÍNOVÝM PRÍPRAVKOM

HbAo tohto vynálezu bol testovaný na schopnosť či môže vyvolať oxidatívne poškodenie kultúry endoteliálnych buniek. Detekcia vyplavenej laktátdehydrogenázy do média je .-38 markerom pre poškodenie buniek a cytotoxicitu.

Endoteliálne bunky z torakálnej aorty ošípanej sa kultivovali, pokým kultúra bola konfluentná, opakované pasážovanie buniek sa uskutočňovalo v pomere 1:3. Pre pokus sa použili bunky z pasáže 7, rastúce v rámci pasáže nie viac ako 48 hodín. Poškodenie buniek sa stanovilo meraním množstva uvoľnenej laktátdehydrogenázy z buniek do média Predtým ako boli hemoglobínové roztoky pridané, odstránilo sa médium a bunky boli dvakrát premyté s fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom. Bunky boli inkubované s hemoglobínom (2 50 M herne) v kompletnom EGM médiu po dobu 6 alebo 24 hodín pri teplote 37°C (n=4-6). Bunky inkubované v kompletnom EGM médiu bez pridanej testovanej látky tvorili negatívnu kontrolu. Na konci inkubácie 50 1 média bolo odobraných z každej jamky a stanovila sa aktivita laktátdehydrogenázy pomocou laktátdehydrogenázového testu (Sigma). Aktivita laktátdehydrogenázy v každej jamke bola porovnávaná s aktivitou enzýmu, ktorý sa uvoľnil z buniek po pridaní 2 % Tritonu X-100 (celkové uvoľnenie LDH) vyjadrené ako percento celkového uvoľnenia enzýmu.

Po 6 hodinách inkubácie sa pozorovalo signifikantne zvýšené uvoľnenie laktát dehydrogenázy za prítomnosti hemoglobínu zbaveného stromy SFH (74,4 4,2 %, p<0,005) . Podobné, ale menšie zvýšenie sa pozorovalo u purifikovaného hemoglobínu z Walter Reed Army Inštitúte of Research. Nebolo pozorované žiadne zvýšenie u HbAo tohto vynálezu (39,8 2,3 %) pri porovnaní s kontrolou (37,5 2,2 %). Uvoľňovanie laktátdehydrogenázy bolo aj naďalej zvýšené po 24 hodinách inkubácie za prítomnosti hemoglobínu (99,6 3,5 %), zatiaľ čo u HbAo podľa tohto vynálezu (41,6 4,6 %) sa nepozorovali žiadne zmeny v porovnaní s kontrolou (34,1 2,6 %).

Inkubácia tkanivových kultúr endoteliálnych buniek s HbAo , ktorý bol pripravený metódami opísanými v tomto vynáleze, nevyvolával uvoľnenie laktátdehydrogenázovej aktivity, ktorá je markerom pre poškodenie bunky. Preto cytotoxický účinok na kultivované endoteliálne bunky nie je vnútornou vlastnosťou hemoglobínových roztokov a purifikácia HbAo odstráňuje cytotoxické komponenty, ktoré sú prítomné u hemoglobínu neobsahujúceho stromu.

PRÍKLAD 17 - ODSTRÁNENIE PROKOAGULAČNEJ AKTIVYTY

Produkt tohoto vynálezu bol testovaný na obsah látok, ktoré potencujú koaguláciu krvi. Použila sa metóda , / Q \ podlá Biesselsa a spol.' ’

Morčatá boli anestezovane Hyponormom a silikónová kanyla bola zavedená do artérie carotis. Po zavedení kanyly sa odobralo 30 % objemu krvi (vypočítané ako 2 % telesnej hmotnosti) a nahradené ekvivalentným objemom testovaného roztoku. Infúzia 1 % ľudského albumínu rýchlosťou 2,5 ml za hodinu mala uchovať prístup ku kanyle. Začiatok albumínovej infúzie bol považovaný za začiatok experimentu. Fibrino peptid A (FPA), ktorý je známy, že sa tvorí z fibrinogénu pri koagulácii krvi bol meraný pred a po infúzii Faktoru Xa (8-9 mikrogramov/kg) v dávke, ktorá samotná nevyvoláva koaguláciu. Vzorky krvi sa zbierali do antikoagulačnej zmesi heparínu (1000 U/ml), Trasylolu (1000 U/ml) a citranu sodného (3,8 %), oddelili a plazma sa uskladnila na ľade.

Vzorky plazmy sa spracovali podľa metódy Leessmana, 1980 LO) na stanovenie FPA a vytvorený FPA sa stanovoval RIA metódou predtým publikovanou Gerritsom^¹¹^ . Plazmatické proteíny sa vyzrážali ekvivalentným objemom 40 % PEG 6000 vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom. Roztoky supernatantu sa zahrievali vo vriacom vodnom kúpeli, centrifugované a uskladnené na stanovenie. Výsledky sú ilustrované dole v tabuľke 8.

TABUĽKA 8

Testovaná vzorka	Opis	AUOio*
SFH	Rýchle,prechodné zvýšenie FPA z 1,4 ng/ml na 13,8 +/- 3 ng/ml v priebehu prvých 10 minút, ktoré po 40 minútach kleslo na východiskové hodnoty.	87,6 +/- 12
HSA	Zvýšenie FPA z východiskovej hodnoty 1.4 ng/ml na maximum 5,5 +/- 1.5 ng/ml.	45,7 +/- 8,2
HbAo	Zvýšenie PFA z východiskovej hodnoty 1,4 ng/ml na maximum 5,0 +/- 1,2 ng/ml	31,8 +/- 2,9

* Oblasť pod krivkou v počiatočných 10 minútach po aplikácii Faktoru Xa.

Výsledky ukazujú, prokoagulačnú neobsahujúcim aktivita je že produkt aktivitu stromu.

založená tohoto pri

Uvažuj e vo väčšej vynálezu nemá porovnaní s sa, že takáto miere na esenciálnu hemoglobínom prokoagulačná kontaminácii testovaných roztokov lipidmi a fosfolipidmi.

PRÍKLAD 18 -

- KVANTIFIKÁCIA KONTAMINÁCIE ĽUDSKÉHO SÉROVÉHO ALBUMÍNU POMOCOU ELISA TECHNÍK

Množstvo sérových proteínových kontaminantov u purifikovaného hemoglobínového produktu podľa tohoto vynálezu sa stanovilo a porovnávalo s inými dostupnými hemoglobinovými produktami pomocou viacvrstvovej (sendvičovej) ELISA techniky. V tomto príklade sa použili všeobecné postupy a techniky viacvrstvovej ELISA techniky podľa Butlera,J.E. (12).

Dynatech 96 jamkových, 1 mm 4 mikrotiter platne sa potiahli s pevnou fázou kozieho séra absorbovaného na králičiu protilátku s protilátkami proti l'udskénu séru (Dáko Corporation, Šanta Barbara, CA, šarža # 072), zriedenou v pomere 1 : 40 v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku. Po 2 hodinovej inkubácii pri 37 °C, sa platne premyli s Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom (TBS) a zbývajúce voľné miesta na platni boli blokované inkubáciou s hydrolýzovanou želatínou rýb (Hipure Liquid Gelatin, Norland

Products Inc., New Brunswick, N.J.). Po 1 hodinovej inkubácii sa platne premyli s TBS a testované zložky sa pridali pri použití dvojnásobného postupného riedenia. Po 1 hodinovej inkubácii sa platne znovu premyli s TBS a inkubovali s pevnou fázou králičieho séra potiahnutého kozími protilátkami proti ľudskému séru, IgG frakciou (Accurate

Chemical and

Scientific Corporation, Westbury obsahujúca 1 % želatínu rýb riedenú

N. Y., šarža #HO36),

1:1000 v TBS. Po 1 hodinovej inkubácii sa platne premyli s TBS a potom inkubovali s afinitnou chromatografiou purifikovanou králičou, protikozou protilátkou, IgG frakciou (konjugovaná chrenová peroxidáza HRP) (BioRad šarža #75312) riedenou 1:250 v TBS. Po 2 hodinovej inkubácii sa platne premyli s

TBS. Komplex antigén-protilátka-HRP sa vizualizoval pomocou o-fenyldiamín-dichloridu (ODP - 26 mg/15 ml kyseliny citrónovej, pH 5,0). Bledo žlté zafarbenie indikuje prítomnosť. antigénu, obzvlášť sérových proteínov. Ich absorbancia bola odčítaná pomocou prístroja Molecular Devices

Thermomax Microplate reader, pri 490 nm.

Vzorky normálneho ľudského séra v duplikátoch (Dimension Laboratories Inc., Mississauga, Ontario, šarža # 30317), purifikovaný hemoglobín HbAo zo Sigma Corporation (H-0267), purifikovaný HbAo z Walter Reed Army Inštitúte of Research (WRAIR) (šarža #92092) a purifikovaný HbAo z tohoto vynálezu sa testovali. Výsledky sú sumarizované v tabuľke 9. Je zrejmé, že produkt tohto vynálezu obsahuje nie viac ako 0,0004 % sérových proteínov, zatiaľ čo iné testované vzorky sú v tomto ohľade aspoň o jeden rád vyššie.

TABUĽKA 9

VZORKA	OBSAH SÉROVÝCH PROTEÍNOV (hmot.% v prepočte na Hb)	SÉROVÉ PROTEÍNY V PREPOČTE MILIGRAM NA ml ROZTOKU
HbAo z tohoto vynálezu (Roztok s celkovým obsahom 8% Hb)	0,0004 %	0,000328 mg/ml
WRAIR HbAo	0,0039 %	0,00263 mg/ml

(Roztok s celkovým obsahom 6,7 % Hb)

SIGMA HbAo (Roztok s celkovým obsahom 1,1 % Hb)

0,0029 %

0,000328 mg/ml

Vo všetkých vykonaných stanoveniach jediným detegovaným proteínom v produkte podl'a tohto vynálezu bol ľudský sérový albumín. Sérové proteíny, ktoré sa našli v iných konkurenčných produktoch, zdá sa, že sú heterogénnou zmesou zahrňujúcou HSA a ďaľšie sérové proteíny.

LITERATÚRA

1. HESS a spol., Systemic & Pulmonary Hypertension After Resuscitacion with Cell-Free Hemoglobín 1993 .

2. Chang a spol., Effect of single Replacement. . . ,

BIOMAT, Art Cells and Immob. Biotech, 20(2-4), pp. 503-510, (1992).

3. Simori a spol., Reaction of Human Endothelial Cells to bovine Hemoglobín Solutions and Tumor Necrosis Factor,

4. Huisman a spol., Studies on the Heterogeneity of of Hemoglobins. IX - The Use of Tris-Hcl Buffers in the Anión -Exchange Chromatography of Hemoglobins,

	J. Chromatoq., 19, 160-169,	(1965).
5 .	Savavis a Zamcheck
6 .	Tabata a Chang, Artificial	Organs,	6	213	-214
	(1982) .
7 .	Wigger,C.J., Physiology of	Shock,	New	York,	The

Common Fund, pp 138-139 (1950).

8 .	Keipert a Chang, Effects of	partial	. , Vox.
	Šanci 53. 7-14 (1987) .
9 .	Biessels a spol., Annual	Report of	the Karí

Landsteiner Foundation, 1991.

10.	Leeksma a spol.,	Blood 67	: 650-654, 1986
11.	Gerrits a spol.,	Thromb.	Res 5: 197. 1974.
12'.	Buttler, J.E.,	ELISA	and other Solid	Phase
	Immunoassays,	edited	by D.M.Kemeny	and
	S.J.Challacombe,	John Wiley and Sons Ltd, 1988, pp

1-180

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob separácie a preselekcie hemoglobínu z takého nepurifikovaného roztoku, ktorý tiež obsahuje kontaminujúce proteínové substancie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje v prvom chromatografickom stupni, naplnenie chromatografickej kolóny nepurifikovaným roztokom a podrobenie ho chromatografii jednak za podmienok aniónovej výmeny, pri ktorej komponenty nepurifikovaného roztoku viac kyslého charakteru, skôr ako povedzme preselektovaný hemoglobín, majú preferenčnú väzbovú afinitu, alebo za podmienok katiónovej výmeny pri ktorej komponenty i

   nepurifikovaného roztoku viac zásadité než preselektovaný hemoglobín, majú vyššiu preferenčnú väzbovú afinitu;

   pokračovanie plnenia nepurifikovaného roztoku v prvom chromatografickom stupni až pokiaľ kolóna je skoro úplne saturovaná s hemoglobinovými druhmi a komponentami vyššej afinity;

   ďalšie pokračovanie plnenia kolóny nepurifikovaným roztokom pri prvom chromatografickom stupni, aby sa vyvolalo presýtenie kolóny a následne vytesnenie hemoglobinových druhov z nej ;

   v druhom chromatografickom stupni naplnemie chromatografickej kolóny výluhom z prvého stupňa, ktorý obsahuje hemoglobínové druhy a podrobenie ich chromatografii za uvedených podmienok aniónovej výmeny alebo katiónovej výmeny, ktorá nebola vybraná pre prvý stupeň;

   pokračovanie plnenia uvedeného výluhu v druhom chromatografickom stupni až pokiaľ kolóna je skoro úplne saturovaná hemoglobínovými druhmi a komponentami s vyššou afinitou ako bolo uvedené pri podmienkach druhého stupňa,ďalšie pokračovanie ! plnenia uvedeného výluhu v druhom chromatografickom stupni, aby sa vyvolalo presýtenie a následne vytesnenie hemoglobíniových druhov z nej.
2. 2. Spôsob podľa patentového nároku 1, vyznačujúci sa tým, že prvý stupeň je ionomeničová chromatografia uskutočňujúca výmenu aniónov a druhý stupeň ionomeničová chromatografia uskutočňujúca výmenu katiónov.
3. 3. Spôsob podľa patentového nároku 2, vyznačujúci sa tým, že vopred vybraný druh hemoglobínu je normálny dospelý ľudský hemoglobín HbAo.
4. 4. Spôsob podľa patentového nároku 3, vyznačujúci sa tým, že prvý stupeň procesu výmeny aniónov sa uskutočňuje pri pH 5 až 9 pri použití plniaceho roztoku o nízkej vodivosti, menej než 3 mS.
5. 5. Spôsob podľa patentového nároku 4, vyznačujúci sa tým, že prvý stupeň spôsobu výmeny aniónov sa uskutočňuje pri pH 6,5 až 8,5 za použitia plniaceho roztoku s vodivosťou menej než 1 mS .
6. 6. Spôsob podľa patentového nároku 4, vyznačujúci sa tým, že plniaci roztok sa plní do kolóny rýchlosťou nie väčšou ako 10 cm za minútu.
7. 7. Spôsob podľa patentového nároku 6, vyznačujúci sa tým, že plniaci roztok má koncentráciu v rozsahu 0,1 až 20 %.
8. 8. Spôsob podľa patentového nároku 4, vyznačujúci sa tým, že druhý stupeň, katióny vymieňajúca chromatografia sa uskutočňuje pri pH 6,5 až 8,5 pri použití plniaceho roztoku o vodivosti menej než 3 mS.
9. 9. Spôsob podľa patentového nároku 8, vyznačujúci sa tým, že druhý stupeň, katióny vymieňajúca chromatografia sa uskutočňuje pri pH 7 až 7,5 za použitia plniaceho roztoku o vodivosti menej než 1 mS.
10. 10. Spôsob podľa patentového nároku 8, vyznačujúci sa tým, že plniaci roztok sa plní v druhom stupni na katióny vymieňajúcu kolónu rýchlosťou nie väčšou ako.10 cm za minútu.
11. 11. Spôsob podľa patentového nároku 8, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia plniaceho roztoku pre druhý stupeň katióny vymieňajúcej kolóny je od 2 až 6 %.
12. 12. Vodný roztok dospelého ľudského hemoglobínu HbAo, vhodný pre použitie ako krvná náhrada, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako rozpustenú látku 99,5 % HbAo a je zbavený detekovateľných aktívnych lipidmi opúzdrených vírusov ako sa stanovilo štandardnými testami.
13. 13. Vysoko purifikovaný hemoglobínový produkt, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vodný roztok ľudského hemoglobínu zbaveného všetkých proteínov z bunkových membrán erytrocytov ako sa stanovilo pomocou izoelektrickej fokusácie a imunoblotových analýz, s obsahom ľudského sérového albumínu v koncentrácii menej než 5 g na 100 mg hemoglobínu.
14. 14. Vysoko purifikovaný hemoglobínový roztok, použiteľný ako kyslíkový nosič resuscitačnej tekutiny, vyznačujúci sa tým, že má dostatočne vysokú čistotu, takže po aplikácii cicavcom, ako náhrada za 50 % normálne cirkulujúceho objemu krvi uvedených cicavcov, nevyvolal signifikantnú vazopresorickú reakciu u týchto cicavcov.
15. 15. Purifikovaný dospelý hemoglobín HbAo, v podstate nekontaminovaný inými proteínovými látkami vyznačujúci sa tým, že obsahuje ľudský sérový proteín nie viac ako 0,0005 hmotnostných % v prepočte na celkovú hmotnosť HbAo.
16. 16. Purifikovaný dospelý hemoglobín HbAo podľa patentového nároku 15, vyznačujúci sa tým, že je okrem toho zbavený detekovateľného množstva aktívnych lipidmi opúzdrených vírusov.