SK49093A3

SK49093A3 - Stabilized active analogues of factors releasing of growth hormone

Info

Publication number: SK49093A3
Application number: SK49093A
Authority: SK
Inventors: Alan R Friedman
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1991-11-13
Publication date: 1993-10-06
Also published as: NO931745L; RU2119800C1; WO1992008481A1; HU9301385D0; CZ85393A3; NO931745D0; AU9055191A; EP0565536A1; FI932185A0; AU655791B2; FI932185A; HUT63857A; JPH06502650A; CA2092906A1

Description

Vynález sa týka peptidov ovplyvňujúcich činnosť podmozgovej žľazy u ľudí a iných živočíchov, predovšetkým cicavcov. Menovite je tento vynález zameraný na peptidy, ktoré podporujú uvoľňovanie rastového hormónu hypofýzou. Peptidy podľa tohoto vynálezu sú účinné in vivo, stabilnejšie v plazme a vybrané peptidy sú stabilnejšie i vo vodnom prostredí pri neutrálnom pH než prirodzené reťazce týchto látok.

Doterajší stav techniky

Fyziológovia vedeli už dávno, že hypotalamus kontroluje činnosť adenohypofýzy tak, že produkuje zvláštne látky, ktoré povzbudzujú aleho inhibujú vylučovanie rôznych hormónov. V roku 1982 boli izolované z ľudských tumorov podžalúdkovej žľazy (pankreasu) ľudské pankreatické (rakovinové) faktory (hpGRF). Boli vyčistené, charakterizované, syntetizované a zistilo sa, že podporujú uvoľňovanie rastového hormónu (GH) hypofýzou. [Guillemin R., a kol.: Science 218, 585-585 (1982)]. Od toho času boli tiež charakterizované a syntetizované zodpovedajúce hypota1 am ické faktory uvoľňujúce GH (GRF) z iných druhov, vrátane krýs, ošípaných, oviec, hovädzieho dobytka a kôz aj ľudí.

Bolo zistené, že ľudský hypotha 1 ainický GRF (hGRF) má rovnaké zloženie ako phGRF, a to: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-S e r-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH?.

Krysí GRF (rGRF) má, ako bolo zistené, skupinu Ser v polohe 8 a vzorec: H-Hi s-A 1 a-Asp-A 1 a-11e-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-A rg-Ar g - 1.1 e - L e u-G l y -G 1 n- L. e u -Ty r - A 1 a - A r g - Ly s - L e u - L e u - H i s - G 1 u -I1e-Met-Asn-Arg-G1n-G1n-G i v-G1u-Arg-Asn-Gln-Glu-G 1 u-G 1 n-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH (viď napríklad US patent ú,595,676).

Bolo zistené, že hovädzí GRF (bGRl) má vzorec Il-Tyr-Ala2

Asρ-Α 1 a-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-G1y-G1n-LeuSer-A 1 a-Arg-Ľys-Leu-Ľeu-GIn-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-GlyG1 u-Arg-Asn-G ln-G lu-Gln-Gly-Ala-Lys-Va 1 -Arg-I.eu-NH2 .

Bravčový GRF má skupinu Ser v polohe 28.

Bolo oznámené, že prírodné reťazce GRF sú rýchlo dezaktivované enzýmami krvnej plazmy. Rýchly rozpad je vyvolaný prerušením väzby 2-3 peptidu d ipeptidy1peptidázou, typ IV (DRP-IV), ktorá bola skôr tiež označovaná ako dipeptidylaminopeptidáza-IV. [Frohman, L.A. aj.: J. Clin. Invest. 78, 906/913 (1986)].

Bola študovaná metabolická stabilita GRF a rôzne metódy ochrany GRF peptidov proti účinku dipeptidylpeptidázy, medzi inými Felixom a kol.: Syntéza a biologická aktivita nových lineárnych a cyklických analógov GRF, v Peptides. Chemistry and Biology, Proc.lOth Am. Peptide Symposium, Ed . G.R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, str. 465-467 (1988), ktorí oznámili, že GRF analógy, substituované dezNH2-Tyr v polohe 1 a/alebo D-Ala v polohe 2 majú zvýšenú stabilitu N-koncových skupín voči enzymatickej degradácii. Táto informácia bola nedávno potvrdená Frohmanom a kol.: Dipeptidylpeptidáza-IV a trypsínu podobná enzymatická degradácia hormónu uvoľňujúceho ľudský rastový hormón v plazme. J. Clin. Invest. 83, 1533-1540 (1989). Okrem toho naposledy menovaná skupina ukázala, že N-acetylácia a N-metylácia N-koncovej skupiny tyrozínu alebo substitúcia D-Tyr-1 v GRF úplne inhibujú hydrolýzu v polohe 2-3. Na druhej strane, a 1 fa-mety1 á c i a Tyr-1 iba čiastočne bránila degradácii DPP-IV.

Murphy, W.A. a Coy D.H. Dlhodobo účinné alkylované analógy faktora uvoľňujúceho rastový hormón, Peptide Research .1. , 36-41, ( 1988)., popisujú analógy GRF, ktoré ukazujú zvýšenú odolnosť voči enzymatickej degradácii ako dôsledok N-alkylácie postranných skupín lyzínov v peptidovom reťazci.

Reťazce prirodzeného GRF majú Gly zvyšok v polohe 15. Je známe, že analógy s Ala alebo Leu v polohe 1.5 majú zvýšenú schopnosť uvoľňovať GH [viď napríklad US patenty 4,649,131 a 4,734,399 ako i I.ing N. a kol.: Quo vadíš Symposium, Sanofi Group, 29-30. máj 1985, Toulouse-Labege (str. 309-322)]. Sub3 stitúcie Gly-15 Val alebo a 1 fa-aminoizomas1ovou kyselinou rovnako zvyšovali účinnosť GRF analógov [Felix a kol.: Syntéza a biologická účinnosť nových analógov faktora uvoľňujúceho rastový hormón, v Peptides 1986, Walter de Gruyter and Co., Berlin-New York, str. 481-484 (1987)].

A. M. Felix informoval o pláne syntetizovať analógy so zvýšenou a/alebo predĺženou biologickou účinnosťou, vrátane prípravy a testovania A1a¹⁵h-GRF(1-29)NH2 a dezNH2-Tyr¹, D-Ala², A 1 a ¹⁵hGRF(1-29)NH2 [viď napríklad US patenty A,649,131 a 4,734,399 ako i A. M. Felix, E. P. Heimer, T. F. Mowles, H. Bisenbeis, P. Leung, T. J. Lambros, M. Ahmad, C. T. Wang a Paul Brazeau: Syntéza a biologická účinnosť nových analógov faktora uvoľňujúceho rastový hormón, v Peptides 1986; Walter de Gruyter and Co., Berlin-New Yokr, str. 481-484 (1987); Felix A.M., Wang C.T., Heimer E., Fournier A., Bolin D., Ahmad M., Lambros T., Mowles T. a Miller L.: Syntéza a biologická aktivita nových 1ineárnych a cyklických analógov GRF, v Peptides; Chemistry and Biology, Proc.lOth Am. Peptide Sympózium, Ed. G.R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, str. 465-467 (1988); D. Peticlerc, H. Lapierre, G. Pelletier, P. Dubreuil, P. Graudreau, T. Mowles, A. Felix a P. Brazeau:

ŕ

Účinok aktívnych analógov ľudského faktora uvoľňujúceho rastový hormón (hGRF) na uvoľňovanie rastového hormónu (GH) a produkciu mlieka u dojníc; Meeting Abstract P223, 82nd Meeting American Dairy Sci. Assn., Columbia, MO, 21-24 júna (1987)].

Analóg GRF, modifikovaný Ser², ako i ďalších osem iných modifikácií tej istej molekuly, je opísaný Touom a kol.: Amfifilné analógy faktora uvoľňujúceho rastový hormón (GRF): štruktúra peptidov a biologická aktivita in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 139. 763-770 (1986). Tento analóg má 165Y, aktivitu in vivo pri ovciach v porovnaní s hGRF (1-4 4) NH2 .

US patent 4,734,399 popisuje GRF analógy, ktoré majú Ala, N-metv1-D-Ala alebo D-Ala v polohe 2 a Ala, Leu, Val, íle, Nie, N val alebo f.i-Ala v pulohu 15 (viď tiež U S patent 4,649,131).

Európska patentová prihláška (Coy a Murphv, číslo publikácie 0 180 214, Application Number 86100127.9) popisuje ahalogy GRF s Leu alebo Phe v polohe 2 spolu s GRF peptidmi, ktoré sú v polohe 2 substituované rôznymi aminokyselinami prirodzene sa nevyskytujúcimi s L alebo D-koriŕ i gurác iou .

Analógy GRF s veľmi nízkou biologickou aktivitou, ktoré majú Sar² alebo Pro², popisuje Coy a kol.: Stratégia návrhu syntetických analógov a antagoni s tov faktora uvoľňujúceho rastový hormón,' Peptides, Vol. 7, Suppl. 49-52 (1986).

Ling a kol.: Analógy faktora uvoľňujúceho rastový hormón so silnou antagonistickou aktivitou, v Peptides, Chemistry and Biology, Proc.lOth Am. Peptide Symposium; Ed. G.R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leideri, str. 484-486 ( 1988) informovali o rade GRF analógov

Arg alebo rôznymi

(viď US	pat.	prihláška
januára	1989	a poradové
Rovnako	A.R.	Fri edman,
Hi11man,	L.F.	Krabi11, R

substituovaných buď D-aminokyse1inami v polohe 2. Všetky sú menej účinné ako základný hormón a niektoré z nich vykazovali antagonistickú aktivitu .

Predchádzajúci vynález predstavuje syntetické GRF polypeptidy, ktoré majú zvyšok Ser na mieste aminokyselín, normálne nachádzaných v polohe 8 a 28 polypeptidov, ako prostriedok inhibujúci chemický rozklad (deamináciu) vo vodnom prostredí prihláška poradové číslo 07-303,518, podaná 27.

:íslo 07-323,955 z 15. marca 1989). A.K. Ichhpurani, D.M. Brown, R.M. i. Martin, H.A. Zurcher-Neely a D.M. Guido: Degradácia analógov faktora uvoľňujúceho rastový hormón v neutrálnom vodnom roztoku sa vysvetľuje deamináciou asparagínových zvyškov. Náhrada asparagínových skupín serínom stabilizuje. Int. J. Peptide Protein Res. 37, 14-20 (1991).

Predchádzajúci vynález popisuje syntetické GRF polypeptidy, ktoré majú substituovaný zvyšok namiesto aminokyseliny v polohe R3 cysteovej kyseliny (Cya) a/alebo R 25 (viď US pat.

prihláška poradové číslo 07-150,301, podaná 29. januára 1988 a poradové číslo 89-00245 z 27. januára 1989).

29-am.inokysel inový analóg hGRF hol navrhnutý G. Velicebim a kol..· Proc. Natl. Aca. Sci. USA, Vol. 83, 5397-5399 ( 1986), ktorý' má prvých šesť aminokyselín pri. a mínovom konci rovnakých a líši sa od prirodzeného peptidu 13 aminokyselinami, v zvyšku reťazca vrátane zabudovania Ser skupiny v polohe 8. Amidová forma a forma voľnej kyseliny analóga majú vzorec: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-G1 n-Leu-A1 a-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-G 1n-G1 u-Leu-Leu-A la-Arg-NH2/ /OH. Keď bola overovaná ich schopnosť stimulovať uvoľňovanie rastového hormónu GH v primárnych kultúrach buniek krysích predných hypofýz, amidový analóg bol l,57x silnejší ako hGRF(1-40)OH, zatiaľ čo voľná kyslá forma mala. len 1/6 účinnosti v rovnakom pokuse.

Vale a kol. (US pat. prihláška poradové číslo 053,233, podaná 22. mája 1907, popisuje 31-zvyškové analógy hGRF, ktoré využívajú skupinu v polohe 31 s postranným funkcionalizovaným reťazcom, ktorý môže byť spojený so zvláštnym proteínom. 31-zvyškové hGRF analógy môžu tiež mať substitúcie iných skupín, ktoré sa objavujú v prirodzenom reťazci GRF, ako Asn alebo Ser v polohe 8, Phe v polohe 10 alebo Ala v polohe 15. Asn alebo Ser môžu byť v polohe 28.

Je známe, že za určitých okolností sú v prítomnosti vody deamidované Asn skupiny po 1ypeptidov. Avšak nie je jasné, čo ovplyvňuje rýchlosti deamidácie. Napríklad v polypeptide trypsínu sú deamidované len niektoré Asn skupiny s čiastočnou sekvenciou Asn-Ser, zatiaľ čo iné deamidované nie sú [viď Kossiakoff A.A.: Science 240, 191-194 (1988)].

Európska patentová prihláška číslo 86308337.4, Číslo publikácie 0 220 958, popisuje triedu zlúčenín, ktoré majú vzorec H-X-Pro-Peptid, v ktorých X je zvyšok prirodzene sa vyskytujúcej aminokyseliny, Pro znamená prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu prolín a Peptid je reťazec zvyškov aminokyselín definovaný biologicky aktívnym peptidom alebo proteínom. Príklady H-X-Pro-Peptidov zahŕňajú Met-Pro (faktor uvoľňujúci rastový hormón), ktorý môže byť chemicky prevedený na GRF.

Analógy peptidov, ktoré nie sú GRF a sú rozšírené na Nkonci, určené pre rôzne účely, boli tiež popísané. Napríklad M.A. Tallon a kol. [Biochem. 26,777-7774 (1987)] synteticky pripravili, analógy alfa-reprodukčného faktora kvasiniek rozšírené na N konci s Ala, Glu-Ala, Ala-Glu-Ala alebo Glu-Ala-Glu-Ala. Tieto peptidy sa používali pri štúdiu vzťahov m e d z i. š t r u k t ú r o u a a k t i v i. t o u .

D. Andreu a kol. [20 th Eur. Peptide Symp. Tubingen, NSR, 4-9. septembra (1980), Symposium Abstracts, s. 33] syntetizovali celu sekvenciu 64 aminokyselín prekurzorovej formy analóga cekropinu A spolu s mnohými kratšími peptidmi, odpovedajúcimi predpokladaným reakčným rnedziproduktom. Medzi nimi bol úplný reťazec cekropinu rozšírený o A1a-Pro-Gly-Pro na N-konci. Bol použitý na dôkaz,: že sa rozširujúca časť naozaj štiepi čisteným enzymatickým preparátom podobným dipeptidylpeptidáze, získaným z kokónov priadky cekrópia [viď tiež H. Boman aj.: J. Biol. Chem. 264, 5832-5860 (1989)].

G. Kreil a kol. [Eur. J. Biochem., 111, 49-58 (1980)] informjú, že melittín, hlavná zložka včelieho jedu, je odvodený z pro-me 1 i tt. í nu . Reťazec pro-me1 ittínu sa skladá zo šiestich X-Pro a piatich X-Ala opakovaných dipeptidických skupín. Výsledky prezentované Kreilom a kol.

prekurzora na produkt môže prebiehať enzýmom typu naznačujú, že konverzia postupným štiepením didipeptidylpeptidázy IV, peptidových jednotiek prítomným v extraktoch z jedových žliaz.

C. Mollay a kol. [Eur. J. Biochem., 160. 31-35 (1986)]: Caerulein a xenopsín sú dva peptidy nájdené v kožných sekrétoch Xenopus laevis. Prvý má sekvenciu Phe-A1a-Asp-G1 y a druhý Ser-Ala-Glu-Ala na rozšírení N-koncovej skupiny ich odpovedajúcich prekurzorov. DipeptidyIpeptidáza typu IV, izolovaná z výlučkov žabej kože, má špecifitu požadovanú pre štiepenie týchto N-koncových predĺžení, čo vedie ku konečným produktom.

D. Julius a kol. [Celí, 32, 839-852 (1983)]: Alfa-bunky Saccharomyces cerevisiae vylučujú ako kopulačný feromón alfa-faktor peptid s 13 aminokyselinami. Nekopú 1 ujúci mutanti i

alfa- buniek, ktoré nemajú dipeptidylpeptidázu viazanú na membrány, neprodukujú normálny alfa-faktor, ale vylučujú rad nedokonale pripravených foriem so štruktúrami G 1 u-A 1a-G 1 u-A1 a -alfa-faktor alebo Asp-Ala-Glu-Ala-alfa-faktor, ktoré majú výrazne zníženú biologickú aktivitu. Ukázalo sa, že dipeptidylpept.idáza viazaná na membrány je nevyhnutná pre normálne spracovanie prekurzora a 1 f a - f a kt o ra a že táto reakcia môže obmedzovať r ý c h 1 o s k v a s i n i e k .

zrenia alfa-ťaktora v normálnych alfa-bunkách

C.L. Choy a kol. [Eur. J. Biochem., 160, 267-272 (1986)]: Prekurzor proteínu, zabraňujúci zmrznutiu novofoundlandskej zimnej plat.esy, obsahuje štyri opakované sekvencie X-Pro a sedem X-Ala na koncovej N-s.kupine. Aj keď reakcie prekurzora neboli študované, autori uvažujú, že k modifikácii prekurzora by mohlo dochádzať v plazme účinkom enzýmu podobného dipeptidy1peptidáze, ktorý by postupne odbúraval dipeptidové jednotky predlžujúcej časti a uvoľňova1.proteín zabraňujúci m r z n u t i u .

Až po prioritnom dátume základnej Suhr a kol. informovali o izolácii a dĺžky klonu cDNA kódujúceho.myší GRF.

zrelý myší GRF je peptid so 42 aminokyse1inovými skupinami a voľným karboxylovým koncom. Tento peptid má valínovú skupin v polohe 2. Tá ho odlišuje od GRF iných druhov, ktoré majú všetky Ala v polohe 2 [viď Mol. Endocrino1ogy, 3, 1693-1700 (1969)].

Na základe úvah iných autorov boli prípravné analógy GRF so substitúciou Leu¹⁹ (menovite Thr² A1 a ¹⁵Leu¹⁹Leu²⁷-bGRF-(1-29)NH2, tri f 1uóracetátová soľ, zlúčenina č.3; Leu ¹⁹Leu²⁷hGRF -(1-29)NH2 trifluóracetátová soľ; Thr²Leu¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2 testovaní uvoľňovania rastového buniek krysej prednej hypofýzy patentovej prihlášky charakterizácii celej Predpokladalo sa, že [menovite trifluóracetátová soľ). Pri hormónu in vitro pri použití boli Leu¹⁹ analógy

Thr ² A1.a ^{1 5}Leu ^{1 9}Leu^{2 7}- bGRF(1-29)NH2, zlúčenina fluóracetát. Leu¹⁹Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2,

Thr² Leu¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2 Leu²⁷ bGRF(1-29)NH2] významne Ala¹⁹ analógy. Pri skúšaní.

tri f 1uóracetát číslo 3, tr i trifluóracetát aj tri f luóracetát. Ala¹⁵Leu¹⁹menej aktívne než zodpovedajúce in vivo na rastúcich hrvoľoch v dávke 10 pmol/kg nebolo množstvo GH uvoľnené Leu¹⁹ analógmi počas 2-h od i nové h o sledovali ia významne odlišné (p > 0,05) od zlúčenín s Ala¹⁹. Pri sledovaní stability v hovädzej plazme boli zlúčeniny s Leu¹⁹ stabilnejšie ako Ala¹⁹ analógy.

poloha .19 v oblasti, ktorá je vretenová m e m b r á n e

Mol. Biol.

V molekule GRF je v p r o s t r e d í podobnému a G r o n e n b o r n A . H . : J .

[ C 1 o r e G.M. , Martin S.R. .191 . 553-561 ( 1986) ] . Nie je m o 1 e k u 1 á ch GRF je š t r u k t ú r n a kupiny v alebo či je to receptor dotykového zvyšku [Sato K., Hotta M.,

Kagegama J., Cziang T. C., Hu H. Y., Biochein. Biophys. Res. Commun. 149 Schiffer M. a Edmundson A.B.: Biophys. J stitúcia D - A 1 a ^{1 9} za Ala schopnosť uvoľňovať GH pokuse s bunkami krysej hypofýzy.

v N1 e ²⁷rGRF(1-29)NH2 znížila účinnosť na stave buniek hovädzej hypofýzy a v Nle²⁷rGRF(l-29)NIl2 znížila účinnosť na stave buniek krysej hypofýzy [Riviér J.

Dong M.H. a Ling N.: (2) 531-537 (1987);

7, 121 (1967)]. Sub¹⁹ v hGRF(1-29)NH2 znížila štandardnú in vitro na 6 % analóga s L-Ala¹⁹ pri Tá istá substitúcia 10 % štandardu v sútotožná substitúcia 30 % štandardu v súSecond International

Symposium on Vasointestinal Peptide and Related Peptides, Cap

Naopak analóg GRF so Ser¹⁹ bol v pokuse so štandardným uvoľňovaním bunkami krysej hypofýzy [Velicebi G., Patthi S. a Kaiser T.E.: Štruktúra a biologická aktivita analógov faktora uvoľňujúceho rastový hormón, ktoré majú potenci oná 1 n e amfifilné vretenové karboxylové konce. Proc. Na 1.1. Aca. Sci d'Agde, Francúzsko (1985)]. rovnako účinný ako hGRF(l-AO)

USA, Vol. 83,

5397-5399 (1986)].

? Getzoff uviedol, že v peptidovom modeli myohemerytrínu môžu Ala, íle, Ser a Thr substituovať Val bez straty viazania protilátok, ale peptid substituovaný Leu schopnosť [Getzoff E.D., Gysin H.M., Rodda Tainer J.A. a Lerner R.A.: Mechanizmus viazania protilátok na proteín. Science, 235, 1191-1196 (1987)].

WO 90/15821 (publikované 27. decembra 1990, teda po dátume priority predmetu tejto prihlášky) popisuje rôzne GRF peptidy, ktoré majú Thr, Val alebo íle skupiny namiesto zvyškov aminokyselín normálne existujúcich v polohe 2, Ala v polohe 19 v kombinácii s jednou z nasledujúcich aminokyselín: Ala, Val, Leu, íle alebo Glv v polohe 15. GRF peptid môže mať prípadne zvyšok Ser na mieste zvyšku aminokyseliny, ktorá normálne býva v polohách 8 a 28 polypeptidu.

Okrem toho môžu bvť prípadne GRF peptidv rozšírené na Nkonci aJkylmi C1-C5, benzvlom, H(Y-X)_n alebo H(Y-X)_m-(Y’-X‘)_p, kde Y a Y¹ su rovnaké alebo rôzne prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny, s výhodou Tyr alebo A sp, X a X¹ , rovnaké alebo má zníženú väzbovú S.J., Alexander H., rôzne, sú vybrané zo skupiny Thr, Se.r alebo Ala, s výhodou Thr alebo S e r, n je 1-10, m je 1-5, p je 1-5.

E.P. Heilmer . a kol. ( 121.h Am. Peptide Symposium, Cambridge, MA, 16-22. júna 1991 ), .abstrakt číslo 32 v sympoziálnom Program and Abst.ract oznámil, že Val² zvyšuje odolnosť mGRF voči štiepeniu dipeptidylpeptidázou IV. Bol zverejnený rad analógov hGRF s modifikáciami v polohe' 2, s dôrazom na Val². V sekcii posterov boli tiež.uvedené GRF analógy s G1 y² , íle² a Leu².

Podstata vynálezu

Predmetom tohoto vynálezu je polypeptid podporujúci uvoľňovanie rastového hormónu hypofýzou (GRF peptid), ktorý má Val alebo íle v polohe 19. GRF peptid podľa vynálezu bude mať Gly, Thr, Val alebo íle zvyšok namiesto zvyšku aminokyseliny, ktorý sa normálne nachádza v polohe 2 v kombinácii s jednou z nasledujúcich aminokyselín: Ala, Val, Leu, íle alebo Gly v polohe 15. Vo výhodnej alternatíve GRF peptid môže mať Ser zvyšok namiesto zvyšku aminokyseliny, ktorý sa normálne nachádza v polohách 8 a 28 polypeptidu. Naviac GRF peptidy podľa tohoto vynálezu môžu byť rozšírené na N-konci. alkylom C1-C5, benzylom (X-Y)-(X --Y)n, kde n je 0 až 20, s výhodou 0 až 10, X je akákoľvek prirodzene sa vyskytujúca aminokyselina, Y je alanín, serín, treonín alebo prolín a ak n = 0, potom Y je vybraný zo skupiny tvorenej alanínom, serinom alebo treonínom, X > je každá prirodzene sa vyskytujúca aminokyselina s výnimkou prolínu alebo hydroxypro1 ínu.

Peptidy podľa predloženého vynálezu sú účinné in vivo a sú omnoho odolnejšie voči štipeniu enzýmami krvnej plazmy než reťazce prírodných GRF. Naviac sú zlúčeniny substituované Ser⁸ a Ser²⁸ chránené proti d ea iri i dá c i i vo vodnom prostredí a sú chemicky omnoho stálejšie.

Termín GRF peptid, tak ako je užívaný v popise a nárokoch, znamená známy polypeptid, ktorý má dĺžku 27 až ó é zvyškov a ktorý spôsobuje uvoľňovanie rastového hormónu hypofýzou. Príkladmi GRF peptidov sú prirodzené alebo syntetické polypep10 tidy popísané v IJS patentoch 4,517,181, 4,518,586, 4,528,190, 4,563,352, 4,585,756, 4,595,676, 4,605,643, 4,610,976,

4,626,976, 4,628,043, 4,684,987, 4,843,064, a v US pat. prihláške poradové číslo 89/00245, podanej 27. januára 1989. Všetky sú sem zahrnuté týmto odkazom. Felix A.M., Wang C.T., Heimer E., Fourier A., Bol in D., Ahmad M., Lambros T., Mowles a biologická aktivita nových lineárnych GRF v Peptides. Chemistry and Biology,

T . a^- M i 1 1 e r L : S y n t é r a a cyklických a n a 1 ó g o v

Proc. lOth Am. ľeptide Syrnposium, Ed. G.R. Marshall, FSCOM ( 1988) ; Tou B.I)., Buonomo F.C., Della-Fera M.A., analógy faktora uvoľňujúceho rastový' a biologická aktivita in viSci, Publishers, Leiden, str·. 465-467 Kaempfe h.A., Vineyard

Ba i 1 e C.A . : hormón (GRF) skupina C-konc i

Amfifilné

Štruktúra peptidov vo. Biochern. Biophys. Res. Commun. 1Š9, 763-770 (1986). Termín GRF peptidy zahŕňa ich netoxické soli.

Nomenklatúra používaná pri definovaní GRF peptidov je podľa knihy Schroder a Lubke : Peptides, Academic Press (1965), pričom sa v súlade s konvenčnou reprezentáciou aminoobjavuje vľavo a karboxylová skupina na má zvyšok aminokyseliny izomérne formy,, uvádza sa L-forma pokiaľ nie je výslovne uvedené inak. Tento vynález uvádza analógy GRF peptidov, ktoré majú nasledujúce vzorce: R-Ri-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R-Ser-Tyr-Arg-Ri2-R13-Leu-Rl5-Gln-Leu-Ri8-Ri9-Arg-R2l-R22-Leu-Gln~R25-Ile-R27-R28-Argna N-konci vpravo. Ak

-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-R35-Gln-Glu-R38-R39-R4O-Arg-R42-Arg-Leu-Z kde R je H, C1-C5 alkyl alebo henzyl, s výhodou H,

Rl je Tyr alebo His, s výhodou Tyr,

R2 je Gly, Thr, Val alebo íle, s výhodou Val alebo íle,

R 3 je Asp, Glu alebo Cys , s výhodou Asp,

R8 je Asp alebo Ser, s výhodou Ser,

R12 je Lys, N-e-alkyl- alebo N-e-benzy 1-l.ys alebo Arg, s výhodou Lys; alebo N-e-alkyl- alebo N-e-benzy1-Lys v prípade, že R je C 1 - C 5 alkyl alebo b e; n z y 1 ,

R1 3 je Val alebo Íle, s výhodou Val,

K’is je Ala, V či l , Leu, I 1 t; alebo Gly, s výhodou Ala, Val, Leu alebo íle, najlepšie Ala,

Plb je Ser alebo Tyr, s výhodou Ser,

R19 je Val alebo íle, s výhodou Val,

R2i je Lys, N-e-alkyl- alebo N-e-benzy1-Lys alebo Arg, s výhodou Lys alebo N-e-alkyl alebo N-e-benzy1-Lys, ak R je

alkyl	alebo benzyl,
R 2 2	i^e	A 1 a	a 1 e b 0	Leu ,	s	výhodou	Leu,
R 2 5	je	Asp	alebo	Gl.u,	s	výhodo ,	Asp,
R 2 7	je	Met ,	íle	a 1 e bo'	Leu, s výhodou 1
R 2 8	je	Asn	alebo	Ser,	s	výhodou	Ser, ·
R 3 4	je	Ser	alebo	Arg,	s	výhodou	Arg ,
R 3 5	je	Asn	alebo	Ser ,	s	výhodou	Asn ,
R 3 8	je	Arg	alebo	Gin,	s	výhodou	Gin,
R 3 9	je	Gly	alebo	Arg,	s	výhodou	Gly,
Rá 0	je	A 1 a	alebo	Ser ,	s	výhodou	A1 a ,
R4 2	je	A1 a ,	Val	alebo	Phe, s výhodou 1

Z znamená karboxylový koniec zvyšku aminokyseliny na C-konci a je to skupina -COORa, -CRaO, -CONHNHRa, -CONRaRb alebo -CH2OR_a s Ε» a Rb, ktoré predstavujú Ci-Ce alkyl alebo vodík alebo ich biologicky aktívny fragment rozšírený od R na N-konci k akémukoľvek zvyšku v ktorejkoľvek polohe medzi 27 až 44 ako jej C koniec, prípadne ich Hse(laktón), HseOH alebo HseNRaRb a ich netoxické soli,

Ra je s výhodou vodík (H) , : Rb je s výhodou etyl.

Príkladmi Ci-Ce alkylov sú metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, oktyl a ich izomérne formy. Skratka iPr sa vzťahuje na isopropyl.

Skratka Bzl sa používa pre benzyl.

Niektorými z možných realizácií vynálezu sú GRF peptidy, v ktorých Ri 9 je Val alebo íle vrátane pept.idov Thr²Ala’ ⁹Val ¹⁹ Leu ²⁷bGRF(1- 29)NH2

Thr²Ala¹’i]el9Leu ²⁷bGRF(1- 29)NH2

Val ²Ala ¹ 5i le l ⁹ l.eu ^{2 7} bGRF (1-29 ) NH 2

1 e ² A 1 a ^{1 5} 11 e ^{1 9} Leu ^{2 7}bGRF(1-29)N H 2

Va 1 ²Λ 1 a ¹ ’Va1 ¹⁹Leu ^{2 7}bGRF(1-29 )NH2

T 1 e ² A 1 a ^{1 5} Va 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} bGRF ( l.-29)NH2

G 1 y ² A 1 a ^{1 5} V a 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} bG R F ( 1 - 2 9 ) N H 2

G I y ² Λ 1 a ¹I1 e ¹⁹ Leu ²⁷bGRF(1 -29)N H 2, s výhodou peptidy

Thr²Se r ⁸ A 1 a ¹⁵Va1^{1 9}Leu²⁷Ser²⁸Hse ³°bGRF(1-30)NH2

Thr² S e r ⁸ A 1 a ¹⁵Va 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{3 3} bGRF ( 1 - 3 3 ) NH 2:

Thr²Ser⁸ A 1 a ¹⁵Va 1 ^{1 9}Leu²⁷Ser²⁸ Hs e ³⁷bGRF(1-37)NH2

Thr²Ser⁸Ala^{1 5} Val ^{1 9}Leu ^{2 7} Ser ^{2 8}lls e ^{4 4} bGRF( 1-AA) NH 2:

Thr²Ser⁸Ala ¹⁵11 e ^{1 9}I.e u ^{2 7} Se r ^{2 8}Hs e ^{3 o}bGRF( 1-30) NH2:

Thr ² Ser ⁸ A1 a ^{1 5} 11 e ^{1 9}Leu ^{2 7}Ser ^{2 8}H s e ^{3 3}bGRF( 1-33 ) NH 2:

Thr²Ser⁸Ala¹⁵11 e ¹⁹Leu ^{2 7}S e r ^{2 8} Hs e ^{3 7} bGRF (1 - 37 ) NH2: alebo

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(l-AA)NH2;, ešte výhodnejšie Ile²Ser⁸Ala ^{1 8} Va 1 ^{1 9}1. e u ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{3 (,}bGRF ( 1-3O)NH2 Thr ² S e r ⁸ A1 a ^{1 5} Va 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ³ θ bGRF (1 -30 ) NIIEt II e²Ser⁸Ala^l5 Val ¹⁹Leu²⁷ S e r ²⁸Hse ³³bGRF(1-3 3)NH 2 Ile²Ser⁸Alaí⁸Val> ⁹ Leu ^{2 7} Se r ^{2 8} Hs e ^{3 3} bGRF (1 -3 3 ) NHL t Thr²Ser⁸AIa¹⁵ Val ¹⁹Leu²⁷ S er ²⁸Hse ³³bGRF(1-3 3)NHEt Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)NH2 Ile²Ser⁸A.la¹⁵Val^{1 9}Leu²⁷ Ser ²⁸Hse ⁴⁴bGRF(1-A A)NH2 Val²Ser ⁸ A1 a ¹⁵Va1¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(1-30)NH2 Val²Ser⁸Ala¹⁵Val^{1 9}Leu ²⁷S e r ²⁸Hse ³³bGRF(1-33)NH2 Val ²Ser⁸AlalSval 1⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)NH2 Val ²Ser⁸ATat ⁵ Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ⁴⁴bGRF(1-AA)NH2 Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile^{1 9}Leu ^{2 7} Se r ^{2 8}Ilse ³ °bGRF (1-30) NH2 Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu ²⁷Ser²⁸Hse ^{3 3}bGRF(1-3 3)NH2 Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH2 11 e ²Ser⁸A 1 a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷Se r ²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-AA)NH2 Val²Ser⁸Ala¹⁵ 11 e ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ObGRF(l-30)NH2 Va 1 ² S e r ⁸ A 1 a ¹⁵11 e ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{3 3} bGRF(1-3 3)NH 2 Val²Ser⁸Ala^I5Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)NH2 Va 1 ²Ser⁸ A 1 a ¹⁵11 e ^{1 9}Leu ²⁷ Ser ^{2 8} Hse ^{4 4}bGRF(1-AA)NH2 Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile' ⁹Leu^{2 7}Ser^{2 8} Hse ^{3 7} bGRF (1-37 )NHnPr alebo aleboichnetoxickésoli.

Najlepším GRF p f: p t i dom podľa tohoto vynálezu je Val ²Ser⁸Ala ’ ⁵ Val ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8}II s e ³ °bGRF (1 -30) NHEt.

Inou možnosťou realizácie tohoto vynálezu sú peptidy rozšírené na N-konci. Medzi nimi s vi napríklad N - a - ( T y r - A i a - P11 e - P r o - P h e - A 1 a ) T y r ¹ T h r ² S e r ⁸ A 1 a ^{1 5} ľ 1 e ^{1 9} L e u ^{2 7} S e r ^{2 8}-bGRF(1 -29)NH 2

N-rt- ( Leu - Pro-G 1 y - P r o-Ty r-A 1 a ) Ty r ¹ Thr-² S e r ⁸ A 1 a ^{1 3} V a 1 ^{1 9}Leu ^{2 7} Ser^{2 8}-bGRF(1-29)NH 2

Ν-α- ( A 1 a-Pro-Gly-Pro-Tyr-Ser) 2 Ty r ¹ V a 1 ² S e: r ⁸ Ala ^{1 5}11 e ^{1 9} Leu ^{2 7}Ser ²⁸-lise ^{3 2}bGRF( 1-32 ) NH 2

N-a-(Leu-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala)Tyr^lIle²Ser⁸Ala¹⁵ Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸-bGRF(l-29)NH2

N-a-(His-Ala-Tyr-Pro-Tyr-Ala)Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸-bGRF(1-29)NH2

Ν-α - ( G1 u-Pro-Phe-A 1 a-Tyr-Pro-Hi s-A1 a )Tyr ¹11 e ²Ser ⁸ A1 a'^{1 5} Va 1 ^{1 9}/

-Leu ²⁷ Ser ²⁸bGRF(1-29)NH2

N-a-(His-Pro-His-Pro-His-Ala-Tyr-Ala)Tyr¹Thr²Ser⁸Ala¹⁵.Val¹⁹-Leu ²⁷Ser ²⁸bGRF(1-37)NH2

N-a-(Tyr-Ala-Gly-Pro-Leu-I^,ro-Phe-Ala)Tyr^lIle²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹- L e u ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{3 2} bG R F (1 - 3 2 ) N H 2

N-a-(Val-Pro-Arg-Pro-Phe-Pr'o-Tyr-Ala)Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹-Leu ²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NHEt

Ν-α - (Arg-Pro-Tyr-Al a-Ile-Pro-Phe-Ala)Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹-Leu ^{2 7}Ser ^{2 8}Hse ³°-bGRF(1-30)NHEt

N-a-ÍTyr-AlajATyr'Val²Ser⁸Ala¹⁵ Va 1¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁴ bGRF(1-3A) -NHCII3

N-a-(Ile-Pro-Glu-Ala-Tyr-Ala)Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸-bGRF(1-37 )NH2

Ďalšou realizáciou tohto vynálezu sú ľubovoľné zhora uvedené modifikácie, v ktorých Asp v polohe 3 a/alebo 25 je nahradené Cya, s výhodou v polohe 3.

Zlúčeniny s Val¹⁹ a íle¹⁹ podľa tohoto vynálezu sú rovnako účinné (a niekedy aj účinnejšie) pri uvoľňovaní GH in vitro (bunky krysej hypofýzy) ako ich odpovedajúce náprotivky s Ala¹⁹ (Tabuľka I a Obrázok 1). Sú však stabilnejšie voči proteolýze pri inkubácii v hovädzej plazme. Dôkazy o zvýšenej m e t a b o i c k e j stabilite zlúčenín p o d ľ či tohoto vynálezu [v porovnaní s prirodzeným GRF reťazcom predstavovaným Leu²⁷bGRF( 1-29) N1Í2 ] sú uvedené v Tabuľke II, kde sú zhrnuté údaje o stabilite in vitro. Zlúčeniny podľa tohoto vynálezu sú aktívnejšie in vivo v dávke .10 pmol/kg ako Leu¹⁹ analógy, viď Obrázok 2 a spravidla uvoľňujú viac rastového hormónu so stabilnejším účinkom než Ala¹⁹ a Leu¹⁹ analógy pri skúškach na kastrovaných býkoch pri dávke 30 pinol/kg’ (Tabuľka III). Na obrázkoch 1 a 2 (zlúčeniny boli použité vo f o r· m e tri f 1uóracetá14 ku 2 (P r i tových. solí) T2 znamená Thr.², Alal5 znamená Ala¹⁵, 1,27 znamená Leu²⁷, Ĺ .19 znamená Leu’⁹, V19 znamená Val¹⁹ a 1.119 znamená íle¹⁹.

Zvýšená účinnosť z 1 ú č r: n í n podľa tohoto vynálezu, v ktorých R je Val alebo Íle, je doložená v Tabuľke III a na ObrázNapríklad odborník pozná z relatívnej účinnosti in vivo dávke 10 pmol/kg, Obrázok 2), že tri f 1uóracetát

Thr²Ser⁸A1 a ¹⁵Va1¹⁹Leu²⁷Se r ²⁸bGRF(1-29)NH2. a trif1uóracetát Thr²Ser⁸A1a ¹⁵11 e ¹⁹ Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2 rovnako ako Val¹⁹a íle¹⁹ zlúčeniny (v dávke: 30 pmol/kg, Tabuľka III) sú bioaktívnejšie než prirodzený GRF.

Pre účely komerčnej produkcie sa dáva prednosť karboxylovému koncu tvorenému homoserínom, laktónom alebo amidom homoserínu, prípadne sekundárnemu či terciárnemu Ci-Ce (s výhodou C i -C 4) alkylamidu homoserínu.

Syntetické analógy GRF peptidov sa pripravia vhodnou metódou, vrátane metód popísaných v US patente 4,529,595 (stĺpec 2, riadok 35 až stĺpec 5, riadok 64) a v US patente 4,689,318 (stĺpec 2, riadok 23 až stĺpec 9, riadok 13), obidva sú sem zahrnuté týmto odkazom.

Postup A predstavuje jednu metódu pre prípravu analógov GRF peptidov podľa tohoto vynálezu.

POSTUP A

Peptidy sa syntetizujú technikou pevnej fázy v syntetizátore peptidov Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) pomocou syntetických cyklov dodaných tou istou firmou. Boe aminokyseliny a ostatné reagenty boli dodané Applied Biosystems a inými komerčnými dodávateľmi. Používal sa sekvenčný dvojitý kopulačný protokol na východiskovú p-mety1benzhydry1amino živicu na syntézu C- koncových amidov karboxylovej kyseliny. Na syntézu uživ a 1 a z o d p o v e: d a j ú c a P A M živí c či .

nín sú spájané pomocou vopred pripravených symetrických anhyd· ridov Boe aminokyselín.

P o u ž í v či j ú s čí n či s 1 t: d u j ú e e o e h r či n y b o č n é h o reťazca :

Λ r g, to s y 1

A s p , h e: n z y 1

C- koncových kyselín sa poAsparagín, glutamín a argi15

Cys , 4-metylbenzy1

G 1 u , b e n z y 1

Ser, benzyl.

Thr, benzyl

Tyr, 4-brómkarbobenzoxy

Lys, 4-chlórokarbobenzoxy.

Odstránenie ochrany Boe sa dosiahne tri f 1 uóroctovou kyseliriou (TFA) v mety 1 éneh 1 ori de . Pokiaľ sa majú získať Hse analógy, zabuduje sa pomocou pevnej fázy Met a potom sa modifikuje brómkyanidom po štiepení HF dobre známymi metódami. Štiepenie brómkyanidom mení Met na peptid s Hse laktónom na C-konci. Ten sa dá previesť na peptid s Hse amidom účinkom vhodného amínu v rozpúšťadle, ako je metanol alebo dimetylformamid. Analógy s Hse laktónom, IlseOH, HseNRaRb na C- konci sa dajú pripraviť metódami popísanými Kempom a kol. [BIOTECHNOLOGY, Vol 4, str. 565-568 (1986)]. Po skončení syntézy sú peptidy zbavené ochrany a oddelené od živice bezvodým fluorovodíkom obsahujúcim 10 X p-kresolu. Štiepenie skupín chrániacich bočné skupiny a peptidu od živice sa robí pri 0 °C alebo nižšie, s výhodou pri -20 °C počas 30 minút s nasledujúcimi 30 minútami pri 0 “C. Po odstránení HF sa peptid so živicou premyjú éterom a peptid sa extrahuje ľadovou kyselinou octovou a lyofilizuje sa. Pred čistení sa cysteín, obsiahnutý v surových peptidoch, okysličuje na odpovedajúcu kyselinu pomocou perkyseliny mravčej pri -10 až 10 °C, s výhodou pri 0 °C ako je popísané v Synthesis, Pierce (1984), str. 113].

S t e w a r d

Chemical kol [Solid Phase

Cumpany, Rockford,

Peptide

Illinois

Konverzia na Hse laktóny a Hse amidy na

C-konci bola popísaná vyššie.

Čistenie sa robí ioniovou výmennou chromat ograf iou na kationaktívnej kolóne Synchroprep S-300 (SynChrorn Inc. Linden, Indiana). Peptid sa nanáša s použitím tlmivého roztoku, 20 milimolárneho TRIS (pH 6,8) v 20X acetonitrile a vymýva s použitím gradientu 0-0,3 molárneho chloridu sodného v tom istom rozpúšťadle. Zlúčeniny sa ďalej č i s t: i a a zbavia solí kvapalnou chromatografiou s reverznou fázou na kolóne Vydac Ľ-18 (Separát i o n s Group, H e s p (i r i a , K a J i f o r n i a ) s použi t. í m g r a d i e n t o v

6 iý>

t;.·..

voda:acetónitri1, obidve fázy obsahujú 0.1 % TFA. Želané frakcie sa spoja a lyofilizujú. Získa sa žiadaný GRF peptid vo forme tr if 1 u órac e tátovej soli. Tri f 1uóra c e tat sa môže, pokial je to žiadúce, metódami iontovej výmeny previesť na ine soli.

Peptidy sa hydrolyzujú 24 hodín za vákua v plynnej fáze v prístroji Pico-Tag Work St.ation (Waters) s použitím konštantné vriacej HC1 (Pierce) v prítomnosti fenolu ako čistiacej látky pri 110 °C. Hydrolyzáty sa analyzujú na prístroji Beckman Amino Acid Analyzer, Model 6300. Zloženie peptidov sa vypočíta s použitím známej koncentrácie norleucínu ako vnútorného štandardu.

Hmotnostné spektrá sa získali pomocou prístroja Applied Biosystems Time of Flight Mass Spectrometer.

Príklady uskutočnenia vynálezu

ÍÝ·;. J /2 I·.·:·l·

Príklad 1

Príprava tri f 1uóraC etá tu Thr²A1 a ¹⁵Va1¹⁹Leu ²⁷bGRF(1-29)NH2, zlúčenina č . 1 .

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Val-Arg -Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I1e-Leu-Asn-Arg-NH2 (ako tri f 1uóracetát) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4,06(4), Thr

1,57(2), Ser 1,64(2), Glu 2,10(2), Ala 2,25(2), Val 2,00(2), íle 1,68(2), Leu 5,15(5), Tyr 1,88(2), Phe 0,94(1), Lys 2,00(2) , Arg 2,94(3) .

Príklad 2

Príprava tri f 1uóracetát u Thr²A la ¹⁵11 e ¹⁹Leu ^{2 7}bGRF(1-29)NH2, zlúčenina č.2 .

b’^{ )·

f.

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lvs-Va1-Leu-A 1 a-G 1 n-Leu-Ser-11e-Arg - Ľ y s - L e u - L e u - G 1 n - A s p - 1 1 e -1. e u - A s n - A r g e - NII2 (ako t r i f 1 u ó r a c e t á t) sa u s k u to č ň u j e postu p n e po d ľ a p o s t u pu A. V ý sled k y nokyselín, teoretické 1.98(2), Ser 1.64(2) ho d 11 o ty v z á t v o r k á c h: A s p

Glu 2.05(2), Ala 2.25(2),

I J e 2.84(3), Leu 5.07(5), Tyr 1.87(2),

Phe a n a 1 ý z y a m i 4.09(4), Thr Val 1.0(1), 0.94(2), Lys

1.97(2), Arg 2.94(3) .

P r í k 1 a d 3

Príprava trifluóracetátu Thr² A la ¹⁵Va1¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2, zlúčenia č.3.

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca H-Tyr-Thr-Asp-A la-11 e -Phe-Thr-Asn-Ser-TyΓ-Arg-Lys-Va1-Leu-A1 a-G 1n-Leu-Ser-Leu-Arg -Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I 1 e-I.eu-Asn-Argťž-NH 2 (ako trif luo r acetát) sa robí postupne podľa postupu A. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4.08(4), Thr 1.87(2), Ser 1.72(2), Glu 2.07(2), Ala 1.93(2), Val 1.04(1), íle 1.88(2), Leu 6.11(6), Tyr 1.90(2), Phe 0.93(1), Lys 2.03(2) , Arg 3.09(3) .

V

Príklad 4

Príprava tri f 1uóracetátu Val²Ala¹⁵Leu¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2>

zlúčenina č.4.

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca H-Tyr-Va1-Asp-A1 a-II e -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-A1 a-G 1n-Leu-Ser-Leu-Arg -Lys-l.eu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (ako trifluóracetát) sa robí postupne podľa postupu A. Hmotnostná spektrálna analýza (metódou Cf252 desorpcie plazmy) m/z pre (M+H)*: pozorované 3454,6, teória 3452,1. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4.01(4), Thr 0.93(1), Ser 00(2), Val 1.85(2), íle 1.88(2), Phe 0,94(1), Lys

1.68(2), Glu Leu 6.11(6), 3.11(3).

2.03(2) , Ala 2 Tyr 1.94(2),

1.97(2), Arg

P r í k 1 a d 5

Príprava t r i f 1uóracetátu I 1 e ² A 1 a ¹⁵ Leu ¹⁹Leu ²⁷hGRF(1-29)NH2, zlúčenina č.5.

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca Η-Tyr-11e-Asp-A 1 a-11 e -Ph e-Th r-As n-Ser-Tyr-Arg-Ly s-Va1-Leu-A 1 a-G 1n-Leu-Ser-Leu-Arg - Lys-Le u- Leu-G 1 n-As p-I1 e-Le u-A s n-Arg-NH 2 (ako trifluóracetát) sa robí postupne podľa postupu A. Hmotnostná spektrálna analýza (metódou Cf252 desorpcie plazmy) m/z pre (M+H)⁺: pozorované 3460.6, teória 3466.1. Výsledky analýzy a mi n okvs J í n, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4.02(4), Thr 0.94(1), Ser

1.67(2), Glu Leu 6.12(6), 3.13(3) .

2.05(2), Ala 2.00(2), Val 0.94(1), íle 1.83(2), Tyr 1.94(2), Phe 0.95(1), Lys 1.99(2), Arg

Príklad 6

Príprava t.r i f 1 uóracet.átu Va 1 ² A 1 a ^{1 5} 11 e ^{1 P 9 * * *} Leu ^{2 7} bGRF (1 -29 ) NH 2 , zlúčenina.c.6.

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca H-Tyr-Va1-Asp-A1a-11 e -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-1 T e-Arg. -Lys-Leu-Leu-G 1 n-Asp-11e-Leu-Asn-Arg-NH 2 (ako trifluóracetát) sa robí postupne podľa postupu A. Hmotno s tná spektrálna analýza (metódou Cf252 desorpcie plazmy) m/z pre (M+H)⁺: pozorované 3453.4, teória 3452.1. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4.03(4), Thr 0.94(1), Ser 2.03(2), Ala 2.01(2), Val 1.89(2), íle 2.85(3), Phe 0.95(1), Lys

1.69(2), Glu Leu 5.11(5), 3.08(3) .

1.99(2), Arg

Tyr 1.95(2),

Príklad 7

Príprava tri f 1uóracetátu 11 e ²A1 a ¹⁵11 e ¹⁹ Leu ²⁷bGRF(1-29)NH2, zlúčenina č.7.

Syntéza analógii GRF peptidu vzorca Η-Tyr-11 e-Asp-A 1 a -11 e -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg -Lys-Leu-Leu-G 1 n-Asp-Tle-Leu-Asn-Arg-NH2 (ako trifluóracetát) sa robí postupne podľa postupu A. Hmotnos.tná spektrálna analýza (metódou Cf252 desorpcie plazmy) m/z pre (M+H)*: pozorované 3469.7, teória 3466.1. Výs1edky ana1ýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4.03(4), Thr 0.94(1), Ser 2.06(2), Ala 2.04(2), Val 0.94(1), íle 3.78(4), Phe 0,95(1), Lvs

1.69(2), Glu Leu 5.11(5), 3.09(3).

Tyr 1.94(2),

1.98(2), Arg

Príklad

Príprava t.r i f 1 uórac etátu Val ² A 1 a ^{1 5} Va 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} bGRF( 1 - 29 ) N H 2 , zlúčenina č.8.

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca Η-Tyr-Va1-Asp-A1 a-11 e

-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-V a 1 - Leu-A 1 a-G 1n-Leu-Ser-Va1-Arg

- Ly s - Le u - I.e u-G 1 n -As p- I 1 e - l.e u - A s n - A r g - NH 2 (ako trifluóracetát) sa robí postupne podľa postupu A. Hmotnostná spektrálna analýza (metódou Cí^;252 desorpeie plazmy) m/z pre (M + II) ⁺ : pozorované 3440.6, teória 3430.1. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v 1.67(2), Glu Leu 5.09(5), 3.05(3).

0.93(1), Ser

Asp ,4,02(4), Thr 2.03(2), Ala 2.00(2), Val 2.78(3), íle 1.86(2), Tyr 1.92(2), Phe 1.04(1), Lys 1.98(2), Arg

P r í k 1

Príprava z 1 ú č e n i n a ad 9 t ri f 1uórac e tátu č . 9 .

Ile²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2,

Syntéza analóga GRF peptidu vzorca H-Tyr-11e-Asp-Ala-11 e -Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Val-Arg -Lys-I.eu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (ako trifluóracetát) sa robí postupne podľa postupu A. Hmotnostná spektrálna analýza (metódou Cf252 desorpeie plazmy) m/z pre (M+H)⁺: pozorované 3454.9 teória 3452.1. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Asp 4.02(4), Thr 0.93(1), Ser 1.69(2), Glu 2.04(2), Ala 2.06(2), Val 1.86(2), íle 2.84(3), Leu 5.10(5), Tyr 1.94(2), Phe 0.94(1), Lys 1.98(2), Arg 3.07(3).

S použitím postupnej syntézy podľa postupu A je možné tiež pripraviť nasledujúce peptidy:

I le²Ser-8AIa i 5val i ⁹ Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} Hs e ³ °bGRF (1 -30) NH2

II e ² S e r ⁸ A 1 a ^{1 5} Va 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{3 3} bGRF(1-33)NH 2

I le²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)NH2

Ile²Ser⁸Ala¹⁵ Val’⁹Leu ²⁷Ser²⁸ Hs e ⁴«bGRF(1-44)NH2

Va 1 ²Ser⁸Ala¹⁵ Va 1¹⁹Leu ^{2 7}Ser^{2 8}Hse ³ °bGRF(l-30)NH2

Va1²Ser⁸ A 1 a ¹⁵Va1 ^{1 9}Leu²⁷Ser²⁸Hse ³³bGRF(1-33)NH2

T le²Ser⁸Ala

Ile²Ser⁸Ala

T 1 e ²Ser ⁸A la J 1 e ² S e r ⁸ A 1 a Val ² S e r ⁸ A 1 a V a 1 ² S e r ⁸ Λ 1 a ⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH2 ⁵ Val ^{1 9}Leu ^{2 7}Ser ^{2 8}lis e ^{4 4} bGRF( 1-44 ) NH2 ⁵ Va 1 1 ⁹ I.e u ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{5 0} bGRF ( 1 -30 ) NH 2 ⁵ Va 1. ^{1 9}l.eu ^{2 7} Ser ^{2 8} Hs e ^{3 3}bGRF(1-33)NH2 ⁵ Va 1 ^{1 9} Le u^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{3 7}1»GRF( 1-37 ) NH 2 ⁹ V a 1 ^{1 9} Leu ^{2 7}Ser ² «lise ^{4 4} bGRF ( 1 -4 4 ) NII2 ⁵ I 1 e ^{1 9}Leu ^{2 7}Ser ^{2 8}Hse ³ <’ bGRF( 1 -30 ) N!1 2 ⁹1 I e ^{1 9}Leu ^{2 7}Ser^{2 8}Hse^{3 3}bGRF(1-33)NH2

0

Va 1 ² S e r ⁸ A1 a ^{1 5} 11 e ^{1 9} L e u ^{2 7} S e: r ^{2 8} Hs e ^{3 7} _bG R p (i - 3 7 ) N H 2

V a 1 ² S er ⁸ A 1 a ^{1 5} U e ^{1 9} Le u ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ^{4 4} bG R F ( 1 - 4 4 ) N H 2

Ile²Ser⁸Ala1⁵ Val ¹⁹ Leu ^{2 7} S e: r ^{2 8} Hs e ³ ObGRF (1-30) NH 2

Thr²Ser⁸Ala¹⁵ Val ¹⁹ Leu ²7Ser²⁸h_se3o_bGRF(i-30)NH₂

Thr² Ser⁸ Λ1 a ¹⁵Va 1 1 ⁹ Leu ²⁷Ser²8Hse ^{3 3}bGRF(1-33)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹⁵ V a 1¹⁹ L e u^{2 7} S e: r ^{2 8} H s e ^{3 7} bG R F (1 - 3 7 ) N H 2

Thr²Ser⁸A 1 a ¹⁵Va1 ^{1 9} Leu ^{2 7} S e: r ^{2 8} Hs e ^{4 4}bGRF (1-4 4 ) NH 2

Thr²Ser⁸ A1 a ¹⁵11 e ¹⁹ Leu²⁷Ser²⁸Hse ³°bGRF(1-30)NH2

Thr²Ser⁸Ala^{1 5} íle ¹⁹Leu²⁷s er ^{2 8} hs e ^{3 3}bGRF(1-33)NH 2

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile’⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(l-37)NH2

Thr²Ser⁸ A la ¹⁵11 e ¹⁹ Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹⁹ Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³°bGRF(1-30)NHEt Thr²Ser⁸Ala1⁵ Val ¹⁹ Leu ²⁷ Ser ²⁸Hse ³³bGRF(1-33)NHEt Ile²Ser⁸Ala¹⁵ Val ¹⁹ Leu ²⁷Ser²⁸Hse ³°bGRF(1-30)NHEt Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu ²⁷ Ser²⁸Hse ³³bGRF(1-33)NHEt Val²Ser⁸Ala^]5Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(l-37)NH-n-propyl.

POSTUP B

Vedľa prípravy GRF analógov technikou pevnej fázy môžu byť tieto analógy získané metódou rekombinantnej DNA podľa postupu popísaného pre Leu²⁷bGRF(1-44)OH (európska patentová prihláška 0212531) s následnými úpravami v segmente DNA kódujúcom v Leu²⁷bGRF(1-44)0H, kodóny pre Ala², Asn⁸, Gly¹⁵ a Asn²⁸ sú nahradené kodónmi: napríklad (ACT) Thr² alebo (ATT) íle² alebo (GTT) Val², (AGT) Ser⁸, (GCT) Ala¹⁵, (AGT) Ser²⁸.

Naviac pre GRF analógy obsahujúce Cya³ sa kodón GAT (Asp³) nahradí kodónom TGT pre: Cys³. Po vytvorení proteínu a reakcii s brómkyánom v mravčej kyseline, ako je popísané v hore uvedenej európskej patentovej prihláške, sa pridá k roztoku peroxid vodíka asi pri 0 °C na oxidáciu zvyšku Cys na Cya. Peptid sa potom čistí popísanými metódami.

Okrem toho sa pre GRF analógy, rozšírené na N-konci, pridajú DNA segmenty, kódujúce: rozšírenie: na N-konci, takto: (TATACT) pre Tyr-Thr, (TATACT)n pre (Tyr-Thr)n, (TATAGT) pre (Tyr-Ser)n alebo (TATAGTTATACT) pre Tyr-Ser-Tvr-Thr alebo (TATACTTATAGT) pre Tyr-Tlir-Tvr-Ser, (GATGCT) pre Asp-Ala at.ď.

Gén prekurzorovéhn proteínu sa vloží do expresného vektora E. coli. Po vytvorení proteínu sa uskutoční izolácia z materiálu a rozklad brómkyánom v mravčej kyseline tak, ako je popísané v zmienenej európskej patentovej prihláške. Kyselina mravčia sa odstráni za zníženého tlaku a surový polypeptid sa potom čistí popísanými metódami.

Zlúčeniny podľa tohoto vynálezu je možné pripraviť známou technológiou rekombinantnej DNA, pretože tieto peptidy sú zložené iba z pridzene sa vyskytujúcich aminokyselín. V tom je rozdiel voči známym analógom, ktoré obsahujú nekódované DNA skupiny, ako sú D-Ala a/alebo dezaminoTyr, a budú využívať pre akúkoľvek produkciu vo veľkom meradle nákladnú chemickú syntézu alebo kombináciu genetického inžinierstva s chemickými postupmi .

Rekombinantne východiskové mikroorganizmy používané v tomto vynáleze sa pripravia technikami rekombinantnej DNA, ktoré sú dobre známe odborníkom a sú popísané napríklad v T. Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] a v B. Perbal A [Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley, New York (1984)). Touto referenciou sú tieto knihy zahrnuté do popisu.

Analógy s IIse laktónom, HseOH, HseNRaRb na C-konci je možné pripraviť metódami popísanými Kempom a kol. [BIOTECHNOLOGY, Vol 4, str. 565-568 (1986)].

POSTUP C

Tento postup sa týka alkylovaných na dusíku.

GRF analógov podľa tohoto vynálezu, Peptidy sa pripravia buď chemickou alebo biochemickou metódou (postup A alebo B). N-akylácia sa potom dosiahne známymi metódami, napr. Murphy, W.A. a Coy D . H . [Dl h o d o b o ú činné či 1 k y 1 o v a n é a n či 1 ó g y faktora uvoľňujúceho rastový hormón, Peptide Research 1, 36-41 (1988)], V.

Sythyammorthy a kol. [ Red uk t í vna inetylácia neurotoxinu botulí11 u t y p ov A a B, Mol. Celí, B i o c h e m . 83, 65-72 ( 1988)].

Postupom C je možné tiež pripraviť nasledujúce peptidy:

N - e p s 1 l on - i P r^- - Ty r ¹ T h r ² S e r ^H N - e p s i 1 o n - j Pr- l.v s ^{1 2} ^{2 1} V a 1 ^{1 5} ] ] _e 1 9

2

Leu ²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2

N -eps i 1 on-i Pr-Tyr ¹Thr ² S er⁸ N-eps i 1 on-i Pr-Ly s ^{1 2}’^{2 1} A 1 a ^{1 5} Va 1¹⁹Leu²⁷bGRF(l-4O)NIÍ2

N-epsilon-Bzl-Tyr¹'ľhr²Ser⁸N-epsilon-Bzl-Lys¹²“²¹Val¹⁵Ile¹⁹ e ²⁷Ser ²⁸bGRF(1-32 ) NH2

N-epsilon-iPr-Tyr¹Ile²Ser⁸N-epsilon-.iPr-Lys^l2’²¹Ala¹⁵Val¹⁹Leu ²⁷bGRF(1-40)NH2

N-epsilon-Bzl-Tyr¹Val²Ser⁸N-epsilon-Bzl-Lys^{1 2} ^{2 1} Va 1 ^{1 5}Val¹⁹11 e ²⁷ S er ²⁸bGRF(1-32 ) NH2

Všetky syntetické GRF peptidy podľa tohoto vynálezu, vrátane peptidov pripravených v príkladoch, sa považujú za biologicky aktívne a užitočné na stimuláciu uvoľňovania GH hypofýzou .

Dávky medzi asi 10 nanogramami a asi 5 rnikrogramami týchto peptidov na kilogram telesnej hmotnosti sa považujú za zvlášť účinné na vyvolanie sekrécie GH. Stimulácia vylučovania GH týmito peptidmi by mala viesť k odpovedajúcemu zvýšeniu rastu u ľudí, dobytka a iných zvierat s normálnymi hladinami GH. Okrem toho by podávanie inalo zmeniť obsahu tuku v tele a upraviť iné metabolické, imunologické a vývojové procesy, ktoré závisia od GH. Napríklad tieto analógy môžu byť užitočné ako prostriedky stimulujúce anabolické procesy u človeka v stavoch podobných následkom popálenín. V inom príklade môžu byť tieto analógy podávané komerčným teplokrvným zvieratám, ako kurčatáin, morkám, ošípaným, kozám, dobytku a ovciam, a môžu byť využívané“ v rybárstve na chov rýb a iných chladnokrvných morských živočíchov, napr. morských korytnačiek a úhorov, a obojživelníkov na urýchlenie rastu a zvýšenie pomeru prot e í nov k tuku, získaného podávaním účinných dávok peptidov. Tieto analógy sa môžu používať na stimuláciu imunitných funkcií u ľudí a zvierat na liečenie cukrovky, vznikajúcej z abnormálnej produkcie rastového hormónu, či na zlepšenie hojenia kostí, rán a spálenín, alebo pri osteoporéze. Tiež je možné použiť tieto analógy na povzbudenie rastu vlasov.

Denné dávky medzi. 10 nanogramami/kg a asi. 50 mikrogramami/kg telesnej hmotnosti sa považujú za zvlášť účinne na zvýšenie. laktácie, rastu a stimulácie imunitných f u n k c i í .

Na podávanie ľuďom a zvieratá» by tieto syntetické peptidy mali mať čistotu aspoň asi 93 % a s výhodou aspoň 98 %.

Tieto syntetické peptidy alebo ich netoxické soli, kombinované s farmakologicky alebo veterinárne prijateľným nosičom do formy farmaceutického prípravku, s výhodou s predĺženým uvoľňovaním, sa podávajú zvieratám a ľuďom buď intravenózne, /

podkožné, cez kožu alebo nosovou sliznicou. Lekár ich môže použiť na stimuláciu uvoľňovania GH, pokiaľ liečený pacient takúto terapiu potrebuje. Vhodné dávkovanie bude závisieť od zdravotného stavu a dĺžky požadovanej liečby.

Takéto peptidy sa často podávajú vo forme nejedovatých solí, ako sú kyslé adičné soli alebo kovové komplexy, napr. so zinkom, železom a podobne (pre potreby aplikácie sú považované za soli). Ako adičné soli je možné menovať hydroch 1 orid, hydrobromid, síran, maleát, octan, citrari, benzoan, jantaran, jablčnan, askorbát, vínan atď. V prípade, že aktívna zložka sa má podať intravenózne v izotonickom fyziologickom roztoku, môžu sa použiť f os forečnanové alebo iné tlmivé roztoky.

Peptidy by sa mali podávať ľuďom pod lekárskym dohľadom a farmaceutické prípravky budú obvykle obsahovať peptid spolu s korí večným, tuhým alebo kvapalným farmaceutický prijateľným nosičom. Základná dávka obyčajne bude od asi 100 nanogramov do asi 50 mikrogramov peptidu na kilogram telesnej hmotnosti pacienta .

Aj keď vynález bol popísaný s ohľadom na formy, ktorým sa dáva prednosť, rozumie sa, že je možné uskutočniť rôzne zmeny a úpravy, ktoré sú zrejmé osobám zbehlým v obore, bez toho aby sa vybočilo z rozsahu jeho nárokov. Napríklad je možné vykonať modifikáciu peptidového reťazca vynechaním jedného alebo dvoch zvyškov od C-konca peptidu podľa súčasne známej experimentálnej praxe, čo vedie k peptidom, ktoré si zachovávajú značnú č a s ť b i o 1 o g i c k e j ú č i. n n osti. Preto t a k é t o r o z. s íi l'i u t o b o t o v y n á 1 e z u . O k r f: m C-koniec a/alebo \-k on iec peptidu s a v y s k y t u j ú c e z. v y š k y s u b s t. i t. u o v a ť z a i c 11 v š e o b e c n é ekvivalenty, ako je všeobecne známe v pept. idovej chémii. Tak je možné peptidy spadajú do toho je možné substituovať a / a 1 e b o j e m e ž n é p r i r o d z e n e »

napríklad vyrobiť iné analógy so zvýšenou odolnosťou voči proteolýze a pri. tom majúce aspoň podstatnú časť účinnosti polypeptidov podľa nároku, bez toho aby sa dostali z rozsahu vynálezu, ilustrovaného zlúženinami 1 až 15. Tiež známe substitúcie karboxylovej skupiny na C-konci, napr. nižšími alkylamidini, vedú k ekvivalentným molekulám.

Spôsob'mi, ktoré boli popísané vyššie, je^- možné vyrobiť GRF peptidy všeobecného vzorca

R’-R ¹-R’2-R 3-A 1 a-11 e-Phe-Thr-R«-Ser-Tyr-Arg-R' i 2-R i 3-Leu-R 15 -Gln-Leu-Ri8~Ri9-Arg-R'2i-R22-Leu-Gln-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln

-Gln-Gly-Glu-R34-R35-Gln-Glu-R3 8-R39-R4O-Arg-R.5 2- Arg-Leu-Z, výhodou 0-10 a X je priroY je alanín, serín, t r e o kde R'je (X-Y)-(X’-Y)„ s n 0-20, s dzene sa vyskytujúca aminokyselina, nín alebo prolín a ak n = 0, potom Y je vybraný zo skupiny tvorenej alanínom, serínom alebo treonínom, X' je ktorákoľvek prirodzene sa vyskytujúca aminokyselina s výnimkou prolínu alebo hydroxypro1 ínu,

Ri	je	Tyr	alebo His,
R ’	2 je	A1 a	, Gly, Thr,	, Val a 1ebo íle,
R3	je	Asp ,	Glu alebo	Cya ,
Rs	je	Asn	alebo Ser,

R' t 2 je Lys alebo Arg,

R 1 3	je	Val alebo	íle,
R1 5	je	Ala, Val,	Leu,	Íle alebo Gly,
R 1 8	je	Ser alebo	Tyr,
R 1 9	je	Val alebo	íle ,
R ’ 2 :	1 je	! Lys a 1ebo Arg,
R2 2	je	Ala alebo	Leu,
R2 5	je	Asp, Glu	alebo	Cya ,
R 2 7	je	Met, íle	ale bo	L e u ,
R 2 8	je	Asn alebo	Ser,
R 3 4	j e	Ser alebo	Arg ,
R 3 5	je	Asn ale b 0	S t: r ,
R 3 8	je	Arg alebo	Gin,
R 3 9	j e	G 1 y alebo	Arg ,
R 4 0	je	A 1 a a 1 e b 0	Ser ,
R í 2	j e	Ala, Val ,	alebo	ľ h e ,

Z znamená karboxylový koniec zvyšku aminokyseliny na Ckonci a je to skupina -COORa, ~CR_aO, -CONHNHRa, -CON(R_a)(Rb) alebo -CH2ORa s R_a a Rt>, ktoré znamenajú Ci-Ce alkyl alebo vodík, alebo ich biologicky aktívny fragment rozšírený od R na N-konci ku ktorémukoľvek zvyšku v ktorejkoľvek polhe medzi 27 až 44 ako jej C koniec, prípadne ich Hse ( laktón)’, HseOH alebo HseN(R_a)(Rbj a ich netoxické soli. Tieto modifikácie je možné pripraviť podľa súčasne známych experimentálnych postupov. Pretože si zachovávajú podstatnú časť biologickej aktivity pôvodného peptidu, sú tieto modifikácie považované za súčasť vyná1ezu.

Rozširujúca časť GRF peptidu podľa tohoto vynálezu má reťazec aminokyselín odpovedajúci vzorcu (X-Y)-(X'-Y)n, kde n predstavuje počet lineárne spojených X-Y skupín a toto číslo je od 0 do 20, s výhodou od Ó do 10 skupín,

X je vybrané zo skupiny tvorenej všetkými prirodzene sa vyskytujúcimi aminokyselinami,

Y je vybrané zo skupiny tvorenej prolínom, alanínom, serínom a treonínoin, a len v prípade, ak n = 0 je Y vybrané zo skupiny tvorenej alanínom, serínom alebo treonínoin a

X' je vybrané zo skupiny tvorenej ktoroukoľvek prirodzene sa vyskytujúcou aminokyselinou s. výnimkou prolínu alebo, hydroxypro1 ínu.

Podľa tohto vzorca v prípade, ak n=l, sú tu dve skupiny Y. Ďalej je možné mať až dvadsaťjeden Y skupín a dvadsať X'skupín v jednom prevedení. Jednotlivými zvyškami Y a X' môžu byť ľubovoľné aminokyseliny z príslušnej skupiny, z ktorej majú byť vybrané. To znamená, že jednotlivé zvyšky Y nemusia byť rovnaké v danom prevedení. Podobne aj v prevedenní vynálezu s viac než jednou X’ skupinou každou jednotlivou X' skupinou inôže byť ktorákoľvek aminokyselina s výnimkou prolínu a hydroxyprolínu, bez ohľadu na charakter iných zvyškov X'. Všetky jednotlivé Y a X zvyšky musia odpovedať pravidlám pre danú špec i ( i c k ú s ku pi n u a stačí , a by r ô z n e j ed n o11 i v é zvyšky v určených polohách odpovedali z. ho ra s ta n o ve riým pravidlám.

Tabuľka I

Účinok analógov bGRF n a vylučovanie in vit.ro krysieho GH z kultúr buniek krysej prednej hypofýzy*

Zlúč.	Názov	Koncentrácia	ana1óga	n M
číslo.	(ako trifluóracetát.)	0.01 0.1	1	10
		bez dávkovania GRF	1963« 1963«	1963«	1963«
		Leu ²⁷bGRF(1-29)NH2	3474®· ^d 75614	15172®	16506®
9	11 e ²A 1 a ¹⁵Va1¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	55988 120828	17230^f
7	11 e ²A 1 a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂	5162 f - 811006í	816980^f
8	Val²Ala 15 Val 1⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	4629® · f 11832í	8165788
6	Va1²A 1 a ¹⁵11 e 1⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	. 4141^d . c₁₀686^f	16370®	f
1	Thr²Ala * ⁵Va11⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	3852^d 9252®	16138®	f
2	Thr²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1- 29)NH2	2541«·b 6263®	^d13122^d
	Thr²Ala*⁵Leu ²⁷bGRF(1- 29)NH2	2 8 3 3 ^b · ® 5 8 31 ^c	13378^d
5	11e²Ala > ⁵Leu ¹⁹Leu ²⁷bGRF(1- 29)NH2	.......5835®	12298^d	17272^d
4	Val²Ala'⁵Leu>⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	.......3976b	9540®	16455®
3	Thr²A 1 a ¹⁵ Leu ¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	......... 2443«	• 4483^b	13012^b

* Množstvo rGH vylúčeného z kultúr buniek hypofýzy sa meralo rádioiinunotestom a je vyjadrené v ng na vzorku za 4 hodiny. Podmienky testu sú popísané v Frohman a kol.: Methods Enzymol. 124, 371 (1986).

a , b . c , d.e , f , e _v danom stĺpci sú výsledky odlišné od iných indexov na hladine významnosti p< 0.05.

Poznámka: Substitúcia Leu¹⁹ mala zhoršujúci účinok na schopnosť uvoľňovať GH, zatiaľ čo Val¹⁹ a Íle¹⁹ modifikácie viedli k analógom so zníženou účinnosťou. Leu²⁷bGRF(1-29)NH2 sa používal ako skúšobný štandard.

Tabuľka II

Stabilita GRF peptidov substituovaných v polohe 19 v plazme in vitro

Zlúčenina číslo	Názov (ako trifluóracetát)	11 / 2 [ h ]
	Leu²⁷bGRP(1-29)NH	0.6*
1	Thr²Ala >5 Val í ⁹Leu ²⁷bGRF(1-29)NH2	4.9®
2	Thr²Ala¹5Vall⁹ Leu ^{2 7}bGRF(1-29)NH 2	14.7«
	Thr²Ala¹ Mal ^{1 9}I.eu²⁷bGRF( 1 -29 ) NHž	6.6^b
3	Thr²Alaí M.eu¹⁹Le u ²⁷bGRF(1-29)NH2	12.3«

* Priemerní! hodnota troch nezávislých pokusov (každý sa robil trikrát).

7

9 a,b,c zlúčeniny s rôznymi indexmi sa významnosti p< 0.05.	líšia	na hladine
Tabuľka III .
Odozva sérového GH Ho 1 steinských kast.rátov na analógov s rôznymi substitúciami v polohách 2 a 19	inekcie GRF schémy

X ² A1 a ^{1 5} X ¹⁹Leu²⁷bGRF(1- 29)NH2

Riad. číslo	Zlúč. č í s 1 o	N á z o v * * ·' (ako t r i f 1u ó r a e e t á t	Podiel [%]	Max iraum [ng/ml ]
1		Voda	0^a	11.7^a
2	A	bGRF(1-44)NH2	83^b	73.2^a
3	B	Thr²Ala¹⁵ Leu ²⁷bGRF(1-29)NH	100^b	75.7^a
4	3	Thr²Ala¹⁵Leu ¹⁹Leu^{2 7}bGRF(1-29)NH2	• 100^b	83.5^a
5	4	Val ²Ala¹⁵Leu ¹⁹Leu^{2 7}bGRF(1-29)NH2	92^b	70.9^a
6	5	Ile²Ala¹⁵ Leu¹⁹Leu^{2 7}bGRF(1-29)NH2	92^b	42.8^a
7	1	ThHAla^{1 5} Val ^{1 9} Leu ^{2 7} bGRF (1-29) NH 2	₉₂b	79.6^a
8	8	Val ²Ala ¹ 5 v_al i ⁹Leu^{2 7}bGRF(l-29)NIl2	100^b	69.4^a
9	9	Ile²Ala¹⁵ Val 1⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	92^b	72.7^a
10	2	Thr²Ala¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂	92^b	60.7^a
11	6	Val ²Ala¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	92^b	78.7^a
12	7	Ile²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2	100^b	49.5^a
13		SEM	5	12.7f
14		P hodnota	0.0001	0.75

Prezentované údaje zahŕňajú iba zvieratá, ktoré reagovali na injekcie GRF * * GRF analógy sa podávali vo forme intravenóznych injekcií pmol GRF/kg 2 hodiny pre kŕmením * * * Heterogenita variácie (Hartleyov test F-max), hodnota P a jej index sú počítané z logaritmickej transformácie dát. a,b.c.d,e hodnoty s rôznymi indexami v stĺpci sú významne rozdielne (P< 0.05).

^f SEM pri podávaní GRF holo 12.7 ng/ml, zatiaľ čo SEM pri kontrole s vodou bolo 45.2 n g/k g ⁶ SEM pri podávaní GRF bolo 4 minúty, zatiaľ čo SEM pri k o 111 r o 1 e s vodou holo 14 minút.

16000-i

1400012000•ο ο

(-1 η

Ν \

Ο) c

10000Zlúčenina • Už7-bCRr(l-29)NH2_ □ T2A1SL27- bGRFÍl-2fl)NH2

O T2AlSU9L27-bCRfXl-29)NH2

M T2AJSV10L27-bGRF(l-29)NH2

X T2A1SI19UŽ7—bGRF(l—29)NH2

C Bazálny ___ •000 □

£ >

Ο +*

U) «

Ή ιη >>

•000 •000

2000-

o

r-rrrr

k.0«' »ΙΓΓ· Ί I I I I I ll| —^1- T¹»¹» o·' '

ANALOG, nM

Obrázok 1

Účinok analógov Thr ² A 1 a ^{1 5}Leu^{2 7}bGRF( 1-29 ) N1Í2 na uvoľňovanie rastového hormónu GH v kultúrach buniek krysej hypofýzy in vitro. Pokus sa robil podľa postupu Frohmana a Downsa: Methods Enzymol. 1.2A, 371-309 ( 1 986). Leu¹⁹ substancia mala zhubný účinok na schopnosť analógov GRF uvoľňovať GH, zatiaľ čo V a 1¹⁹ a 13 e ¹⁹ modifikácie viedli k analógom s buď zvýšenou alebo nezmenenou bi oakt.i vi tou in vitro v porovnaní s Thr²A 1 a ¹⁵ Leu ²⁷bGRF(1-29)NH2. b e u ^{2 7} bGRF ( 1 - 29 ) NH 2 slúžil ako pokusný štandard.

00-1

700050- 29 CD

C x

to >

o (-1 'OJ tn

302010-

Zlúčenina X bCRF(I-44)NH2 • T2AlSL27-bC!RF(l-20)NH2

O T2A15LH>L27-bGRrťl-28)NH2 □ T2AlSV19L27-bGRF(l-28)NH2

T2AlS118L27-bGRF(l-281WH2

—t* .o

T

Minutý

Obrázok 2

Priemerné koncentrácie sérového rastového hormónu GH pri Ho 1 steinských kastrátoch kŕmených otrubami po intravenóznej injekcii 10 pmol/kg GRF analógov, Pokus sa robil podľa popisu Moseley a kol.: J. Endocrinol. 117, 252-259 (1988). Hovädzí GRF(1-44)NH2 sa používal ako pokusný štandard.

Claims

GRF peptid s Val alebo íle na mieste zvyšku aminokyseliny normálne sa nachádzajúcej v polohe 19, Gly, Thr, Val alebo íle na mieste zvyšku aminokyseliny, ktorý sa normálne nachádza v polohe
2, a s jednou aminokyselinou vybranou zo skupiny obsahujúcej Ala, Val, Leu, íle alebo Gly v polohe 15 .

GRF peptid podľa nároku tým, že aminokyselina v

GRF peptid podľa nároku 1, -A1 a-11e-Phe-Thr-Re-Ser-Tyr

1, vyznačujúci sa polohe 2 je Thr, Val alebo íle.

všeobecného vzorca R-R1-R2-R

3Arg-Ri2~Rl3-Leu-Ri5-Gln-Leu-Ri8-Ri9-Arg-R2l-R22-Leu-Gln-R25-Ile-R27-R;>8-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-R35-Gln-Glu-R38-R39-R4O-Arg-R,i2-Arg-Leu-Z, kde

R je H, C 1 - C 5 alkyl alebo benzyl Ri je Tyr a 1ebo His , R 2 je Gly, Thr, Val alebo íle, R 3 je Asp, Glu alebo Cya , R 8 je Asn alebo Ser,

R12 je Lys alebo Arg alebo N-epsi 1on-a1ky1 alebo N-epsil on-benzy1-Lys v prípade, ak R je C1-C5 alkyl alebo benzyl,

Rt 3 je Val alebo íle, R 1 5 je Ala, Val, Leu, íle alebo Gly, R 1 8 je Ser alebo Tyr, R 1 9 je Val alebo íle, R2 1 je Lys alebo Arg alebo N-epsi 1on-a1ky1 alebo N-epsi- 1 on -benzy1- Lys v prípade, ak R je C1-C5 alkyl alebo benzyl R 2 2 je Ala alebo Leu, R25 je Asp, Glu , R 2 7 je M e t., íle ale b 0 L e u, R 2 8 je Asn a 1 e b 0 S e r , R i 4 j e S e r a 1 e b 0 Arg, R 3 5 je Asn alebo Ser, R 3 8 je Arg alebo Gin, R 3 9 je G 1 y a 1 e b o Arg,

- :π »

R 4 o je Ala alebo Ser,

R 4 2 je Ala, Víil alebo Phe a

Z znamená karboxylovú časť zvyšku aminokyseliny na C-konci a je to skupina -COORa , -CRaQ., -CONHNHRa , -CONRaRb alebo -CH2ORa, kde R_a a Rb sú Ci-Ce alkyl alebo vodík, alebo, ich biologicky aktívny fragment rozšírený od R na N-konci k zvyšku v ktorejkoľvek polohe medzi 27 až 44 ako jej'C kof niec, alebo Hse(laktón), HseOH alebo HseNRaRb, a/alebo ich netoxickésoli.

4. GRF peptid podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že R2 je Thr, Val alebo íle.

5. GRF peptid podľa nároku 4, vybraný zo skupiny obsahujúcej Thr2Ala¹⁵ Val ¹⁹ Leu ²⁷bGRF(1-29)NH2

Thr²Ala¹Sile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2

Val ²Ala¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2

Ile²Ala¹⁵I1 e ¹⁹ Leu²⁷bGRF(1-29)NH2

Val ²Ala¹⁵Val ¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2

Ile²Ala¹⁵ Val ¹⁹Leu ²⁷bGRF(1-2 9)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹5 Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(1-30)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹5 Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³°bGRF(1-30)NHEt

Thr²Ser⁸Ala¹⁸ Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH 2

Thr²Ser⁸Ala¹⁵ Val ¹⁹Leu ²⁷Ser²»Hse^{3 3}bGRF(1-33)NHEt

Thr²Ser⁸Ala¹⁸ Val ¹⁹Leu ²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH2

Thr²Ser⁸Ala*⁸ Val ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ⁴⁴bGRF(1-44)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹⁸11 e ¹⁹Leu^{2 7}Ser²⁸Hse ³°bGRF(1-30)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹ Sile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ^{3 3}bGRF(1-33)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹⁸Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(l-37)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹⁸Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(l-44)NH2

11 e ²Ser⁸ A1 a ¹⁸Va1¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(1-30)NH2

11 e ²Ser⁸ A la ¹⁸ Va1¹⁹Leu ²⁷Ser ^{2 8} Hs e ³⁰bGRF(1 -30)NHEt

11 e ² S e r ⁸ Λ 1 a ^{1 8} V a 1 ^{1 9} L e u ^{2 7} S e r ^{2 8}11 s e ^{3 3} bG R F ( 1 - 3 3 ) N H 2

I 1 e ² S e r ⁸ A 1 a ^{1 8} V a 1 ^{1 9} l, f; u ^{2 7} 3 e r ^{2 8} H s e ^{3 3} bG R F ( 1 - 3 3 ) N H E t.

I 1 e ²Ser ⁸ A 1 a ^{1 8} Va 1 ^{1 9} Le u ^{2 7} S er ^{2 8}Hs e ^{3 7} bGRF ( 1 - 37 ) N11 2 Γ1 e ² S e r ⁸ A 1 a ¹⁵ Va1 ¹⁹ Leu ^{2 7}Ser^{2 8} H s e ⁴⁴ bGRF(1-44)NH 2 Va 1 ²Ser⁸Ala ^{1 r,}Va 1 ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} H s e ³ °bGRI·'( 1-3O)N1Í2

3 2

Val ² Ser⁸ A la ^{1 5} Val ^{1 9}Leu ^{2 7} S er ^{2 8}Hse ^{3 3}bGRF(1-33)NH2

Va1²Ser⁸A 1 a ¹⁵Va1¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)N H 2

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val ^{1 9} Leu ^{2 7} S e r ^{2 8} lis e ^{4 4} bGRF (1-4 4 ) NH 2

11 e ²Ser ⁸ A1 a ^{1 5} 11 e ^{1 9}Leu^{2 7}Ser ^{2 8}Ilse ³ °bGRF(1 -30) NH 2

Ile²Ser⁸Ala^l5Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH2

11 e ²Ser⁸ A1 a ¹⁵11 el⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)NH₂

11 e ²Sef⁸ A 1 a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH2

Va1²Ser⁸A 1 a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷ Ser²⁸Hse³°bGRF(1-30)NH2

Va1²Ser⁸ A 1 a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH2

Va1²Ser⁸A1a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse ³⁷bGRF(1-37)NH2

Va1²Ser⁸ A 1 a ¹⁵11 e ¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NHnPr alebo Val. ²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(l-4 4)NH2 alebo ich netoxické soli.

6 . GRF p e p t i d podľa nároku 3, ’S t ý m , že R 1 5 j « Ala, Val 7 . GRF pept i d podľa nároku 6, t ý m , že R je H a R1 5 je 8 . GRF t ý peptid m , že podľa R1 je nároku Tyr. 7, 9 . GRF peptid podľa nároku 8, t ý m , že Re a R 2 8 sú Ser 10, . GRF peptid pod ľa nároku 6, * t ý m , že R2 je Val . 11 , . GRF t ý peptid m , že p 0 d ľ a R2 je n a r 0 k u íle. 6, .12 . . GRF t ý p e. p t i d m , že podľa nároku R 1 9 je V a 1. . 6, 13. GRF p e p t i d p 0 d ľ a n á r 0 k u 6,

t. ý in , že R i 9 je íle.

vyznaču júci sa Leu alebo íle.

vyznačujúci sa Ala.

vyznačujúci sa vyznačujúci sa vyznačujúci sa vyznačujúci sa v y z n a č u j ú c i sa vyznačuj ú c i s a

14. Spôsob stimulácie uvoľňovania rastového hormónu v zvierati vyznačujúci sa tým, že uvedenému zvieraťu sa podáva účinné množstvo GRF peptidu, ktorý má Val alebo íle v polohe 19, Thr, Val alebo íle zvyšok namiesto zvyšku aminokyseliny normálne sa nachádzajúcej v polohe 2, a jednu aminokyselinu vybranú zo skupiny obsahujúcej Ala,

Val, Lču, íle alebo Gly v polohe 15.

/

15. Spôsob stimulácie podľa nároku 14, vyznačujúci, s a t ý m , že GRF peptid má všeobecný vzorec

R-Ri-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Ri2-Ri3-Leu-Ri5-Gln-Leu-Ri8~Rl9-Arg-R2i-R22-Leu-Gln-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-R35-Gln-Glu-R38-R39-R4O-Arg-R42-Arg-Leu-Z, kde

R je H, C1-C5 alkyl alebo benzyl ,

Ri je Tyr alebo His, R2 je Gly, Thr , Val alebo íle R3 je Asp, Glu á 1ebo Cya , Re je Asn alebo Ser,

R12 je Lys alebo Arg alebo N-epsi 1on-alky1 alebo N-epsi1on-benzy1-Lys v prípade, ak R je C1-C5 alkyl alebo benzyl,

Rl3 je Val alebo íle,

R l 5 je Ala, Val, Leu, íle alebo Gly,

Rl8 je Ser alebo Tyr,

R1 9 je Val alebo íle,

R21 je Lys alebo Arg, alebo N-epsi 1on-a1ky1 alebo N-epsi1on-benzy1-Lys v prípade, ak R je C1-C5 alkyl alebo benzyl,

R2 2 je Ala alebo Leu, R2 5 je As p, Glu, R 2 7 je M e t , I 1 e alebo R 2 8 je A s n a 1 ebo Ser , R 3 4 je Ser a 1 e b 0 Arg , R 3 5 je Asn a 1 e 1) 0 Ser, R 3 8 je Arg a 1 e bo G 1 n , R39 je G 1 y a 1 e b 0 Arg , R 4 n je A 1 a a 1 ebo Ser·, R A 2 je Λ I a , V a 1 , a 1 e bo

Z znamená karboxylovú časť zvyšku aminokyseliny na C-konc i a je to skupina -COORa, - C R _a O , -CONHNHRa, -CONRaR t> alebo -CHzORa, kde R_a a Rb sú Ct-Ce alkyl alebo vodík, alebo ich biologicky aktívny fragment rozšírený od R na N-konci k zvyšku v ktorejkoľvek polohe medzi 27 až 44 ako jej Ckoniec, alebo Hse(laktón), HseOH alebo IlseN-R_aRb a/alebo ich netoxické soli.

16. Zmes na uvľňovanie rastového hormónu u zvieraťa, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo GRF peptidu všeobecného vzorca

R-Rl-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Si2-Rl3-Leu-Ri5 -Gln-Leu-Ri 8 - R 19-Arg-R2i-R22-Leu-Gln-R25-lle-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-R35-Gln-Glu-R38-R39-R4O-Arg-R42~Arg-Leu-Z, kde

R je H, C1-C5 alkyl alebo benzyl,

Ri je Tyr alebo Hi s , R2 je Gly, Thr, Val alebo íle R3 je A s p, G 1 u alebo Cya , Re je Asn a 1ebo Ser,

R 1 2 je Lys alebo Arg alebo N~epsilon-alkyl alebo N-eps i- lon-benzyl- Lys v prípade, ak R je C1-C5 alkyl alebo benzyl, R 1 3 je Val alebo íle, R 1 5 je Ala , Val , Leu, íle alebo Gly, R 1 8 je Ser alebo Tyr, R 1 9 je Val alebo íle, R 2 1 je I.ys alebo Arg, alebo N-epsilon-alkyl alebo N-eps i - 1on-benzy1- Lys v prípade, ak R je Ci-C5 alkyl a 1 ebo benzyl, R'2 2 je Ala alebo Leu, R2 5 je Asp , G 1 u , R2 7 je Met , íle a 1 e b 0 L e u , R2 8 je Asn alebo Ser, R3 4 je Ser a 1 e b 0 Arg , R 3 5 j e Asn a 1 e b 0 Ser, R 3 8 j e A r g a 1 e bo Gin, R 3 9 j e G ) y a 1 ebo Arg, R 4 0 j 0 Ala a 1 e 1 > 0 S e r ,

R 4 2 je Ala, Val ale: b o P h e , a

Z znamená karboxylovú časť zvyšku aminokyseliny na C-konci a je to skupina -COORa, -CR_aO, -CONHNHRa, -CONRaRb alebo -CH2OR_a, kde R_a a Rb sú Ci-^Ce alkyl alebo vodík, alebo ich biologicky aktívny fragment rozšírený od R na N-konci k zvyšku v ktorejkoľvek polohe medzi 27 až 44 ako jej Ckoniec, alebo Hse(laktón), HseOH alebo HseN-R_aRb a/alebo r / ich netoxické soli v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom.