HUT63857A - Process for producing grf-analogs - Google Patents

Description

A jelen találmány olyan peptidekre vonatkozik, amelyek emberekben és más állatokban, különösen emlósökban a hipofízis működését befolyásolják. Közelebbről, a jelen találmány tárgyát olyan peptidek képezik amelyek a hipofízis növekedési hormon felszabadítását segítik elő. A jelen találmány szerinti peptidek in vivő hatásosak, a plazmában stabilabbak és egyes találmány szerinti peptidek vizes környezetben, semleges pH-η is stabilabbak a természetes GRF szekvenciáknál .

Fiziológusok régen felismerték, hogy a hipotalamusz szabályozza az adenohipofízis kiválasztó funkcióját, mégpedig oly módon, hogy speciális anyagokat termel, amelyek serkentik vagy gátolják egyes hipofízishormonok kiválasztását. 1982-ben humán hasnyálmirigy daganatok extraktumaiból humán hasnyálmirigy (daganat) felszabadító faktort (hpGRF) különítettek el, ezt megtisztították, jellemezték, szintetikusan előállították és megvizsgálták, és úgy találták, hogy elősegíti a hipofízis növekedési hormon (GH) felszabadítását [Guillemin, R. és. munkatársai, Science 218, 585-585 (1982)]. Azóta más fajokból, így patkányból, sertésből, juhból , szarvasmarhából, kecskéből és az emberből származó megfelelő hipotalamusz GH felszabadító faktorokat is jellemezték és előállították.

A humán hipotalamusz GRF (hGRF) szerkezetét azonosnak találták a hpGRF-ével, amelynek felépítése a következő: HTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GlnGln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2.

A patkány GRF (rGRF) esetében azt találták, hogy a 8-as

-3helyzetben Ser maradékot tartalmaz, és szerkezete a következő: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-IleLeu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-AsnArg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-AsnOH (1d. például a 4,595,676 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

A szarvasmarha GRF (bGRF) szerkezetét a következőnek találták: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-ValArg-Leu-NH2.

A sertés GRF a 28-helyzetben Ser maradékot tartalmaz.

Beszámoltak arról, hogy a természetes GRF szekvenciák a vérplazma enzimjei hatására gyorsan inaktiválódnak. A gyors lebomlás magába foglalja a peptid 2-3 kötésének egy IV típusú dipeptidilpeptidáz (DPP-IV), korábban dipeptidilaminopeptidáz-IV-nek is nevezett [Frohman, L. A. és munkatársai, J. Clin. Invest. 7 8 , 906-913 ( 1986)] enzim általi hasítását .

A GRF metabolikus stabilitásának és a GRF peptideknek a dipeptidilpeptidáz általi hasítás ellen való védelmére különféle módszereket javasoltak, többek között Félix és munkatársai [Synthesis and biological activity of növel linear and cyclic GRF analogs (Új lineáris és gyűrűs GRF analógok szintézise és biológiai hatása), a Peptides. Chemistry and Biology, Proc. lOth Am. Peptide Symposium kidaványban, Szerk. G. R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, The Netherland, 465-467.oldal, 1988], akik szerint az 1-helyzetben desNI^-Tyr-t és/vagy a 2-helyzetben D-Ala-t • ·

-4tartalmazó GRF analógok N-terminálisának az enzimatikus lebontással szembeni stabilitása növekedett. Ezt az információt aztán Frohman és munkatársai is megerősítették humán növekedési hormont felszabadító hormon plazmában, dipeptidilpeptidáz-IV és tripszinszerű enzimmel végzett lebontásával [J. Clin. Invest. 83 . 1533-1540 (1989)]. Emellett az utóbbi csoport megmutatta, hogy az N-terminális tirozinmaradék N-acetilezése és N-metilezése vagy a GRF-ben egy D-Tyr-l-es szubsztitúció teljesen meggátolja a 2-3 helyzet közötti hasítást. Az 1-helyzetü tirozin alfa-metilezése azonban csak részlegesen blokkolta a DPP-IV általi lebontást.

Murphy, W. A. és Coy, D. H. [Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, (Növekedési hormont felszabadító faktor hosszú ideig ható, alkilezett analógjai) Peptide Research 1_, 36-41 ( 1988 )] olyan

GRF-analógokat írnak le, amelyek az N-terminális aminosav N-alkilezésének vagy N-aralkilezésének következményeként, amely reakció során a peptidláncon belüli lizinek oldalláncában levő csoportok N-alkilezödése is végbemehet, az enzimatikus lebontással szemben fokozottan rezisztensek.

A természetes GRF szekvenciák Gly-t tartalmaznak a 15ös helyzetben. Az ebben a helyzetben Alá vagy Leu maradékokat tartalmazó analógok megnövekedett GH felszabadító potenciállal rendelkeznek (ld. például a 4,649,131 és 4,734,399 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, valamint Ling, N. és munkatársai, Quo Vadis?, Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege,

Francé, 309-322.oldal). A Gly-15 valinnal vagy alfa-amino-

• · · · izovajsavval való helyettesítése is fokozza a GRF-analógok potenciáját [Félix és munkatársai, Synthesis and biological activity of növel growth hormon releasing factor analogs (Új növekedési hormont felszabadító faktor analógok szintézise és biológiai hatása), Peptides, 1986, Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York, 481-484 (1987)].

A. M. Félix olyan programról számol be, amelynek keretében fokozott és/vagy nyújtott biolgiai hatású analógokat állítanak elő, leírja többek között az Ala^ hGRF(1-29)NH₂ és desNI^-Tyrl , D-Ala² , Ala^ hGRF( 1-29 )NH₂ előállítását és vizsgálatát [ld. például a 4,649,131 és 4,734,399 számú amerikai egyesült állmokbeli szabadalmi leírásokat, valamint A. N. Félix, E. P. Heimer, T. F. Mowles, H. Bisenbeis, P. Leung, T. J. Lambros, M. Ahmad, C. T. Wang & Paul Brazeau: Synthesis and biological activity of növel growth hormon releasing factor analogs, Peptides 1986. 481-484.oldal ( 1987 ); Félix A. M., Wang, C. T., Heimer, E. Fournier, A. Bolin, D. Ahmad, M. Lambros, T. Mowles, T. és Miller, L.: Synthesis and biological activity of növel linear and cyclic GRF analogs, Peptides. Chemistry and Biology, Proceedings of the lOth American Peptide Symposium, szerk. G. R. Marshall, Escom Science Publishers, Leiden, The Netrherlands (1988), 465-467 oldal; D. Pétidére, H. Lapierre, G. Pelletier, P. Dubreuil, P. Gaudreau, T. Mowles, A. Félix and P. Brazeau: Effect of a potent analóg of humán growth hormon-releasing factor (hGRF) on growth hormon (GH) release and milk production of dairy cows (A humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) egy hatékony analógjának hatása a növekedési hormon (GH) felszabadulására és a tejtermelésre • · · · · • ·

-6tejelo tehenekben). Meeting Abstract P223, 82nd Meeting American Dairy Sci. Assn, Columbia, MO, June 21-24 (1987)].

Egy olyan GRF-analógot, amely ugyanabban a molekulában nyolc más módosítás mellett Ser^-t tartalmaz, Tou és munkatársai írtak le [Amphiphilic Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs: peptide design and biological activity in vivő (Amfifil növekedési hormont felszabadító faktor (GRF) analógok: peptid tervezés és in vivő biológiai hatás). Biochem. Biophys. Rés. Commun. 139, 763-770 (1986)]. Ez az analóg juhban 165%-os aktivitást mutat in vivő a bGRF(l44)NH2^-höz viszonyítva.

A 4,734,399 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan GRF-analógokat ismertetnek, amelyek a 2-helyzetben Alá, N-metil-D-ala vagy D-Ala és a 15-helyzetben Alá, Leu, Val, Ile, Nle, Nval vagy béta-Ala maradékokat tartalmaznak. Lásd a 4,649,131 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást is.

A 0 188 214 számon nyilvánosságra hozott, 86100127.9 számú európai szabadalmi bejelentésben Coy és Murphy olyan GRF-analógokat ír le, amelyek a 2-helyzetben Leu vagy Phe maradékot tartalmaznak, és olyan GRF-peptideket, amelyekben a 2-helyzetben különféle L- vagy D-konfigurációjú nem-természetes aminosavak vannak.

Coy és munkatársai nagyon alacsony biológiai hatású, Sar“ vagy Pro^ maradékot tartalmazó GRF-analógokat ismertetnek [Strategies in the design of synthetic agonists and antagonists of growth hormone-releasing factor (Szintetikus növekedési hormont felszabadító faktor agonisták és antagonisták tervezésének stratégiái), Peptides, vol 7, Suppl.

49-52 (1986)].

Ling és munkatársai [Growth hormone-releasing factor analogs with potent antagonistic activity (Potenciálisan agonista hatású növekedési hormont felszabadó faktor analógok), Peptides. Chemistry and Biology. Proceedings of the lOth American Peptide Symposium, szerk. G. R. Marshall, Escom Science Publishers, Leiden, The Netherlands (1988), 484-486.oldal] egy sor olyan GRF-analógot írnak le, amely a 2-helyzetben Arg vagy különféle D-aminosav maradékot tartalmaz. Ezek mindegyike gyengébb hatású, mint az eredeti hormon, és közülük néhány antagonista hatást mutat.

Egy korábbi találmány olyan szintetikus GRF polipeptideket bocsát rendelkezésre, amelyek a rendszerint a polipeptid 8- és 28-helyzetében levő aminosavak helyett Ser maradékot tartalmaznak, a Ser gátolja vizes közegben a kémiai lebomlást (deamidálódást). Lásd az 1989. január 27-én tett 07/303,518 sorozatszámú és az 1989. március 15-én tett, 07/323,955 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést, valamint A, R. Friedman, A. K. Ichhpurani, D. M, Brown, R. M. Hillman, L. F. Krabil, R. A. Martin, H. A. Zurcher-Neely és D. M. Guido cikkét [The Degradation of Growth Hormoné Releasing Factor Analogs in Neutral Aqueous Solution is Related to Deamidation of Asparagine Residues. Replacement of Asparagine Residues By Serine Stabilizes (A növekedési hormont felszabadító faktor analógok semleges vizes közegben való lebomlása az aszparaginmaradék deamidálódásával kapcsolatos. Az aszparaginmaradék szerinnel való helyettesítése stabilizáló hatású). Int. J. Peptide Protein Rés., 37, 14-20 (1991)].

• ·· • ··· • · · · · · · • · · · · · • · · · · * «·····«··

-8«

Egy korábbi találmány tárgyát olyan szintetikus GRFanalógok képezik, amelyek az R3 és/vagy R25 aminosavmaradékok helyén ciszteinsavmaradékot (Cya) tartalmaznak (ld. az 1988. Január 29-én tett, 07/150,301 sorozatszámú és az 1989 január 27-én tett, 89/00245 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéseket.

G. Velicelebi és munkatásai [Proc. Natl. Acad. Sci USA

3, 5397-5399 (1986 )] olyan hGRF 29-aminosav-analógokat terveztek, amelyekben az aminoterminális első hat aminosavjának szekvenciája megmaradt és a szekvencia fennmaradó része 13 aminosavban, többek között a 8-helyzetben egy Ser maradék beépítésében különbözött a természetes peptidétől. Az analóg amid és szabad sav formájának szerkezete a következő : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-LeuLeu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-LeuAla-Arg-NH2/OH. Patkány adenohipofízissejtek primer tenyészetében a növekedési hormon (GH) kiválasztására gyakorolt serkentő hatást vizsgálták, az amid analóg 1,57-szer volt hatásosabb a hGRF(1-40)OH-nál, míg a szabad sav esetében 1/6-nyi hatást mértek ugyanilyen kísérletben.

Vale és munkatársai (az 1987. május 22-én tett, 053,233 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésükben) hGRF 31-maradék-analógokat írnak le, amelyekhez a 31-helyzetben az oldalláncban funkcióscsoportot tartalmazó maradékokat használtak, ezek a funkciós csoportok egy külön fehérjéhez kapcsolódhatnak. A hGRF 31-helyzetű analógjaiban a természetes GRF szekvencia más maradékai is helyettesítve lehetnek, így a 8-helyzetben Asn vagy Ser, a 10-helyzetben Phe vagy a 15-helyzetben Alá, a 28-helyzetben • · «

-9pedig Asn vagy Ser lehet jelen.

Polipeptidek Asn maradékairól azt írják, hogy bizonyos körülmények között, víz jelenlétében deamidálódnak. Azonban a deamidálódás mértékét irányító szabályok nem világosak. Például, a tripszin polipeptidben csak bizonyos, az Asn-Ser szerkezetben előforduló Asn maradékok deamidálódnak, míg mások nem [Kossiakoff, AA, Science 240, 191-194 (1988 )].

A 86308337.4 számú, a 0 220 958 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben egy sor H-X-ProPeptide általános képletű vegyületet írnak le, amelyekben X egy a természetben előforduló aminosav, Pro a természetben előforduló prolin aminosav és a Peptide egy biológiailag aktív peptid vagy fehérje szekvenciáját meghatározó aminosavmaradékok szekvenciája. A H-X-Prop-Pept ide vegyületek között található a Met-Pro-(növekedési hormont felszabadító factor), amely kémiai úton GRF-fé alakítható.

Nem-GRF peptidek N-terminálison meghosszabbított analógjait különféle célokra állították elő, például:

M. A. Tallon és munkatársai [Biochem., 26 , 7767-7774 (1987)] az élesztő alfa-emésztő faktor N-terminálison meghosszabbított analógjainak sorozatát szintetizálták, ahol a hosszabbító rész Alá, Glu-Ala, Ala-Glu-Ala vagy Glu-AlaGlu-Ala szerkezetű volt. Ezeket a peptideket a szerkezet és hatás összefüggését vizsgáló kísérletekhez használták.

D. Andreu és munkatársai [20th Eur. Peptide Symp. Tubingen, GFR, September 4-9, 1988, Symposium Abstracts,

33.oldal] cecropin A pekurzor formájának teljes, 64 aminosavból álló szekvenciáját előállították néhány rövidebb peptiddel együtt, amelyek feltehetően az előállítás közbenső * ·

-10termékei. Ezek között volt egy teljes cecropin szekvencia, amely Ala-Pro-Gly-Pro résszel volt megtoldva az N-terminálison, és ezzel azt mutatták ki, hogy a hozzáadott rész valóban lehasadt egy részlegesen tisztított dipeptidilpeptidáz-szerű enzimatikus készítménnyel való kezelés során, amely készítményt cecropia selyemszövólepke bábból állítottak elő. Lásd H. Bomannak és munkatársainak a J. Bioi. Chem. 264, 5852-5860 (1989) irodalmi helyen megjelent közleményét is.

G. Kreil és munkatársai [Eur. J. Biochem. 111, 49-58 (1980)] arról számolnak be, hogy a melittin, a háziméh mérgének fő komponense, promelittinből származik. A promelittin proszekvenciája 6 X-Pro és Öt X-Ala ismétlődő dipeptid-részből áll. Kreil és munkatársainak eredménye azt feltételezi, hogy a prekurzor-termék a dipeptid egységeknek a méregmirígyből készült extraktumban levő dipeptidilpeptidáz IV típusú enzimek hatására, lépésenként végbemenő lehasadásával alakul át termékké.

A cerulein és xenopszin a Xenopus laevis bőrváladékában található két peptid. Az előbbi szekvenciája az Nterminálison Phe-Ala-Asp-Gly, az utóbbié Ser-Ala-Glu-Ala résszel hosszabb a megfelelő prekurzorokban. Egy, béka bőrváladékból elkülönített IV típusú dipeptidilpeptidáz azzal a speciális tulajdonsággal rendelkezik, amely ezen Nterminálisnál kapcsolódó rész lehasífásához szükséges, és a folyamat az érett termékek képződéséhez vezet [C. Mollay és munkatársai, Eur. J. Biochem., 160, 31-35 (1986)].

Az alfa-faktort emésztő feromon egy 13 aminosavból álló peptid, amelyet a Saccharomyces cervisiae alfa-sejtek vá-

-11lasztanak ki. Nem-emésztő alfa-sejt mutánsok, amelyekből hiányzik a membránhoz kötött dipeptidilpeptidáz, nem termelnek normális alfa-faktort, de számos nem teljesen előállított formát szabadítanak fel Glu-Ala-Glu-Ala-alfa-faktor vagy Asp-Ala-Glu-Ala-alfa-faktor szerkezettel, amelyek jelentősen csökkent biológiai hatásúak. D. Julius és munkatársai [Cell, 3.2, 839-852 (1983 )] megmutatták, hogy a membránhoz kötött dipeptidilpeptidáz szükséges az alfa-faktor prekurzor előállításához, és ez a folyamat sebességmeghatározó lehet az alfa-faktor érése szempontjából a normál élesztó-alfa-sejtekben.

A Newfoundland téli lepényhalból származó fagyásellenes fehérjének proszekvenciája négy X-Pro és hét X-Ala ismétlődő szekvenciát tartalmaz az N-terminálison. Noha ennek a prekurzornak az előállítását nem vizsgálták, a szerzők, C. L. Choy és munkatársai [Eur. J. Biochem., 160, 267-272 (1986)] feltételezik, hogy egy ilyen átalakulás a szérumban egy dipeptidilpeptidáz-szerű enzim közreműködésével, a hosszabbító rész dipeptid-egységeinek szekvenciális lehasításával megy végbe, és ennek eredményeként szabadul fel az érett, fagyásellenes fehérje.

Az eredeti bejelentés elsőbbségi napját követően Suhr és munkatársai egér GRF-t kódoló teljes hosszúságú cDNA klón elkülönítéséről és jellemzéséről számolnak be. Az érett egér GRF-ről megjósolták, hogy 42 aminosavból álló peptid, szabad karboxiterminálissal. Ez a peptid a 2-helyzetben valinmaradékot tartalmaz, amellyel egyedülálló az összes más fajból elkülönített GRF-k között, mivel azok 2-es helyzetében Alá maradék van [Mól. Endocrinology 3., 1693-1700 (1989 )].

• ·

-12A mások által ajánlott megfontolások alapján Leu^ helyettesítéssel GRF analógokat, nevezetesen Thr^Ala^^Leu^⁹Leu2⁷-bGRF( 1-29jNHg-trifluor-acetát-sót, 3.számú vegyület;

Leu1⁹Leu2⁷-bGRF(1-29)NI^^-trifluor-acetát-sót; Thr^Leu·'⁹Leu³⁷bGRF( 1-29)NH2^-trifluor-acetát-sót; Ala^⁸Leu^⁹Leu2⁷bGRF(1-29)NH2~trifluor-acetát-sót] állítottak elő. Amikor ezeket in vitro egy növekedési hormont (GH) felszabadító kísérletben patkány adenohipofízis sejteket használva vizsgálták, a Leu·'·⁹ analógok [nevezetesen a Thr^Ala^^Leu·'⁹Leu^-bGRFf1-29)NH2^-trifluor-acetát-só, 3.számú vegyület;

Leu·'·⁹Leu2⁷bGRF( 1-29 )-NH2^-trifluor-acetát-só; Thr^Leu'·⁹Leu^⁷bGRF( 1-29 )NH2~trif luor-acetát-só ; és Ala-'-⁸Leu-'-⁹Leu2⁷bGRF( 1-29 )NH2^-trifluor-acetát-só ] a megfelelő Alá·'·⁹ analógoknál szignifikánsan kisebb aktivitást mutattak. Amikor in vivő növendékmarhákban 10 pmol/kg mennyiségben alkalmazva vizsgálták, a 2 óra alatt felszabadított GH mennyiségét illetően nem volt szignifikáns különbség (p>0,05) a Leu^⁹ és az Alá'·⁹ analógok között. Amikor a vegyületek marhaszérumban mutatott stabilitását tanulmányozták, a Leu·'·⁹ anyagok stabilabbak voltak az Ala^⁹ analógoknál.

A GRF molekulában a 19-es maradék abban a tartományban van, amely membránszerű környezetben spirális [Clore, G. M., Martin, S. R. és Gronenborn, A. M., J. Mól. Bioi. 191, 5531 9 561 ( 1986)]. Nem ismeretes, hogy a GRF molekulában az Alá⁴· szerepe a szerkezetből adódik-e vagy az Alá⁹ egy receptorkapcsoló maradék [Sato, K., Hotta, M., Kagegama, J., Chiang, TC. , Hu, HY. , Dong,MH: and Lin, N., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 149(2) 531-537 (1987)]. Schiffer, M. és Edmundson,

A. B. [Biophys. J. 7., 121 (1967)] vizsgálatai szerint a

-139 * 99 « ···* « • * * ·« · · • · f ·» « · • < · · · 4 · · 4 hGRF(1-29)NH2~ben az Ala^⁹ D-Ala^^-cel való helyettesítése az in vitro St felszabadító potenciált patkány hipofízis sejttel végzett vizsgálatban az L-Ala^⁹-cel mértnek 6%-ára csökkentette. Az Nle²? rGRF(1-29)NH2^-ben ugyanez a helyettesítés egy marha hipofízis sejtet alkalmazó tesztrendszerben a hatásosságot a standarddal mért érték 10%-ára csökkentette. Nle²^ rGRF(1-29 )NH2^-ben ugyanez a helyettesítés patkány hipofízis sejtet alkalmazó tesztrendszerben a standard hatását 30-kal csökkentette. [Rivier, J. Second International Symposium on Vasointestinal Peptide and Related Peptides (Második nemzetközi szimpózium vazointesztinális és rokonszerkezetű peptidekröl) , Cap d’Agde Francé, Jun 1985]. A Ser·*·⁹ analógok a hGRF(l-40) pepiiddel teljesen azonos hatást mutattak patkány hipofízis sejt St felszabadító vizsgálatokban [Velicelebi, G., Patthi, S. and Kaiser, Τ. E., Design and biological activity of analogs of growth hormoné releasing factor with potential amphiphilic helical carboxy termini (Potenciálisan amfifil spirális karboxi-terminálissal rendelkező növekedési hormont felszabadító faktor analógok tervezése és biológiai hatása), Proc. Natl. Acd. Sci., 83, 5397-5399 (1986)].

Getzoff arról számolt be, hogy egy peptidben, amely a miohemeritrin epitopja, az Alá, Ile, Ser és Thr az antitestkötés csökkenése nélkül helyettesíthető valinnal, azonban a leucinnal helyettesített peptid kötőképessége kisebb mértékű [Getzoff, E. D., Gysin, Η. M·, Rodda, S. J., Alexander, H. Tainer, J. A. and Lerner, R. A., Mechanism of antibody binding to a protein (Antitest fehérjéhez való kötődésének mechanizmusa). Science, 235, 1191-1196 (1987)].

• ♦ 9 ««· 4 »* · »· · *

V · · 4 * W • · · · · ··«« ·«·> 4

A jelen bejelentés elsőbbségi napja után, 1990. december 27-én, a WO 90/15821 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben különféle GRF peptideket ismertetnek, amelyek a rendesen 2-es helyzetben található aminosavmaradék helyett Thr, Val vagy Ile maradékot, 19-helyzetben Alá maradékot tartalmaznak a 15-helyzetben Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly egyikével kombinációban. Adott esetben a GRF peptid a rendszerint a peptid 8-as és 28-as helyzetében levő aminosavmaradék helyett Ser maradékot tartalmazhat.

Emellett a GRF peptidek adott esetben az N-terminálison 1-5 szénatomos alkilcsoportal, benzilcsoporttal, H-(Y-X)_n vagy Η-(Y-X)_m(Y’-X’ )p általános képletű csoportokkal meghosszabbíthatók, a képletben Y és Y’ azonos vagy különböző és egy természetben előforduló aminosavat, előnyösen Tyr-t vagy Asp-t jelent; X és X’ azonos vagy különböző, és Thr, Ser vagy Alá, előnyösen Thr vagy Ser maradék; n értéke 1-10; m értéke 1-5; p értéke 1-5.

E. P. Heilmer és munkatársai (12th Am. Peptide Symposium, Cambridge, MA, June 16-22, 1991) a szimpózium Program and Abstract kiadványában a Ρ-32-es jelű kivonatban azt közük, hogy a Val⁶ az mGRF peptidet a dipeptidilpeptidaz IV hasításával szemben rezisztenssé teszi. Egy sor 2-helyzetben módosított hGRF analógot ismertetnek, amelyek közül a Val³ beépítésével kapottakat emelték ki. A pószterszekcióban a Gly³, Ile³ és Leu³ GRF-analógokat is bemutatták.

A jelen találmány olyan polipeptidekre vonatkozik, amelyek a hipofízis növekedési hormon (GRF peptid) felszabadítását elősegítik, és 19-helyzetben Val vagy Ile maradékot tartalmaznak. A GRF peptidekben a rendszerint 2-helyzet-15 ben található aminosavmaradék helyett Gly, Thr, Val vagy Ile maradék található a 15-helyzetben az Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly aminosavak egyikével kombinációban. Adott esetben a GRF peptid az általában a polipeptid 8-as és 28-as helyzetében található aminosavmaradék helyett Ser maradékot tartalmazhat. Emellett a jelen találmány szerinti GRF peptid adott esetben az N-terminálison 1-5 szénatomos alkilcsoporttal, benzilcsoporttal, (X-Y)-(X’-Y)_n általános képletű csoporttal hosszabbított is lehet, a képletben n értéke 0-20, előnyösen 0-10, X bármely, a természetben előforduló aminosav; Y alanin, szerin, treonin vagy prolin; és amikor n értéke 0, Y alanin, szerin vagy treonin; X’ bármely, a természetben előforduló aminosav, kivéve a prolint vagy hidroxi-prolint.

A jelen találmány szerinti peptidek in vivő hatásosak és a vérplazma enzimjei által okozott lebomlással szemben a

Q természetes GRF szekvenciáknál stabilabbak. Emellett a Ser° és Ser²^ helyettesítésű vegyületek védettek a vizes környezetben végbemenő deamidálódással szemben és kémiailag is stabilabbak.

A GRF PEPTID meghatározás a leírásban és az igénypontokban olyan ismert polipeptidet jelent, amely 27-44 közötti számú maradékból áll, és elősegíti a hipofízis növekedési hormon felszabadítását. A GRF PEPTIDEK jellemző példái a természetes vagy szintetikus polipeptidek, amelyekét az alábbi irodalmi helyeken ismertetnek:

4,517,181

4,518,586 ,

4,528,190

4,529,595 , 4,563,352

585,756

4,595,676,

4,605,643

4,610,976 , 4,626,523

628,043

4,689,318,

4,784,987,

4,843,064 számú amerikai egyesült • · államokbeli szabadalmi leírások és az 1989. január 27-én tett, 89/00245 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyekre ezúton utalunk; Félix, A., Wang, C. T., Heimer, E., Fournier, A., Bolin, D., Ahmed, M., Lambros, T., Mowles, T. and Miller, L., Synthesis and Biological Activity of Növel Linear and Cyclic GRF Analogs, in Peptides. Chemistry and Biology, Proc. lOth Am. Peptide Symposium, Ed. G. R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, The Netherlands, 465-467 (1988); Tou, J. S., Kaempfe, L. A., Vineyard, B. D., Buonomo, F. C., Della-Fera,

M. A. and Baile, C. A.Amphiphilic Growth Hormoné Releasing Factor Analogs. Peptid Design and Biological Activity in vivo , Biochem. Biophys. Rés. Commun. 13 9( 2 ) , 763-770 (1986); Coy, D. H., Murphy, W. A., Sueires-Di£ζ, J. Coy, E. J., Láncé, V. A., Structure Activity Studies on the Nterminal Region of Growth Hormoné Releasing Factor (A növekedési hormont felszabadító faktor N-terminálisa környezetének szerkezet-hatás vizsgálata), J. Med. Chem. 28, 181-185 (1985); Félix, A. M., Heimer E. P., Mowles, T.

F., Eisenbeis, H. Leung, P., Lambros, T. J., Ahmed, M. and Wang, C. T., Synthesis and Biological Activity of növel Growth Hormoné Releasing Factor Analogs, in Peptides 1986, Walter de Gruyter and Co., Berlin-New York, 481-484 (1987); Velicelebi, G., Patthi, S. and Kaiser E. T., Design and Biological Activity of Analogs of Growth Hormoné Releasing Factor with Potential Amphiphilic Helical Carboxil Termini, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85 , 5397-5399 (1986); Ling,

N. , Baird, A., Wehrenberg, W. Β., Munegumi, T. and Ueno, N:, Synthesis GRF Analogs as Competitive Antagonists of GRF

-17Therapeutic Agents Produced by Genetic Engineering, Quo Vadis Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, ToulouseLabege, Francé, 309-329; Murphy,W. A. and Coy, D. H., Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, Peptide Research, X, 36-41 (1988); J. C. Tou, L. A. Kampfe, B. D. Vineyard, F. C. Buonomo, M. A. Della-Fera and C. A. Baile: Amphiphilic Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs: peptide design and biological activity in vivő, Biochem. Biophys. Rés. Commun, 139, 763-770 (1986). A GRF PEPTID megnevezés magába foglalja a peptidek nemtoxikus sóit is.

A GRF PEPTIDEK meghatározásához a Schröder és Lübke által A peptidek című munkában (Academic Press, 1965) megadott nevezéktant használjuk, amely szerint, a szokásosnak is megfelelően az N-terminális aminocsoport a baloldalon, a C-terminális a jobboldalon helyezkedik el. Amikor az aminosavmaradék izomer formában létezhet, a szimbólum más, kifejezett utalás hiányában az aminosav L-formáját jelöli.

A jelen találmány tárgyát szintetikus GRF peptid analógok (GRF PEPTIDEK), amelyek az

R-R|-R2~R3-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-R^-R-^g-LeuR^^-Gln —Leu-R|g—Rjg—Arg—Rgi^-R22~Fjeu-Gln-R2g — 11 e—R2 7 — ^R28^— -ArgGln-Gln-Gly—Glu — Rg4^_Rgg—Gin —Glu — Rgg —Rgg-R^Q—Arg — R₄₂ ^—ArgLeu-Z általános képlettel jellemezhetők, a képletben R hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport, előnyösen hidrogénatom;

Rj Tyr vagy His, előnyösen Tyr;

R₂ Gly, Thr, Val vagy Ile, előnyösen Val vagy Ile;

R3 Asp, Glu vagy Cya, előnyösen Asp;

-18Rg Asn vagy Ser, előnyösen Ser;

Rj2 Lys, N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon-benzil-Lys vagy

Arg, előnyösen Lys: vagy N-epszilon-alkil- vagy Neszilon-benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R-^3 Val vagy Ile, előnyösen Val;

R|g Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly, előnyösen Alá, Val, Leu vagy Ile, előnyösebben Alá;

R|g Ser vagy Tyr, előnyösen Ser;

R19 Val vagy Ile, előnyösen Val;

R21 Lys, N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon-benzil-Lys vagy

Arg, előnyösen Lys vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon-benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R22	Alá	vagy	Leu,	előnyösen	Leu;
R25	Asp	vagy	Glu,	előnyösen	Asp;
R27	Met	, Ile	vagy	Leu, előnyösen Leu;
R28	Asn	vagy	Ser,	előnyösen	Ser;
R34	Ser	vagy	Arg ,	előnyösen	Arg ;
R35	Asn	vagy	Ser,	előnyösen	Asn;
R38	Arg	vagy	Gin,	előnyösen	Gin;
R39	Gly	vagy	Arg,	előnyösen	Gly;
R40	Alá	vagy	Ser,	előnyösen	Alá;
R42	Alá	, Val	vagy	Phe, előnyösen Val;

Z a C-terminál is aminosav karboxi-részét, a -COOR_a,

-CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoportot jelenti, amelyben R_a és R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag hatásos fragmentumaik, amelyek az N-19 terminálistól kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhetnek; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R^) alakja és/vagy a fentiek nemtoxikus sói képezik.

R_a előnyösen hidrogénatom.

R^j előnyösen etilcsoport.

Az 1-8 szénatomos alkilcsoportra példaként a metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, oktilcsoportot és izomer formáikat említhetjük.

Az iPr izopropilcsoportot jelent.

A Bzl benzilcsoportot jelöl.

A találmány egyik foganatosítási módja szerinti GRF peptidek azok, amelyekben R-^g Val vagy lle, többek között az alábbi peptidek:

Thr²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Thr²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Val²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Ile²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Val²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Ile²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Gly²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

Gly²Alal5Val^⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂, előnyösen az alábbiak:

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH2, Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH2,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH2, Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF( 1-44)NH2,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH2, Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH2, Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂, vagy

Thr²Ser⁸Ala⁴ ^Ile^{4 9}Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF( 1-44 )NH₂; előnyösebben

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂ ,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NHEt,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂ ,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NHEt,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NHEt,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂ ,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-3 3)NH₂ ,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-3 7)NH₂ ,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Val²Ser⁸Ala⁴^Ile⁴⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH-n-propil vagy ezek nemtoxikus sói.

A jelen találmány szerinti legelőnyösebb GRF peptid az Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NHEt.

A találmány szerinti vegyületek egy másik csoportját az N-terminálison meghosszabbított peptidek képezik, például a következők:

N-alf a-(Tyr-Ala-Phe-Pro-Phe-Ala)-Tyr^Thr²Ser⁸Ala^^Ile⁴⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2; N-alfa-(Leu-Pro-Gly-Pro-Tyr-Ala)-21Tyr¹Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2; N-alfa-(AlaPro-Gly-Pro-Tyr-Ser) g-Tyi^Val^er^Ala^Ile^Leu^Ser^Hse^bGRF (1-32 )NH₂ ; N-alfa-(Leu-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala)-Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2; N-alfa-(His-Ala-TyrPrö-Tyr-Ala)-Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2; N-alfa-(His-Ala-Tyr-Pro-Tyr-Ala)-Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹³Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2; N-alfa-(Glu-Pro-Phe-Ala-Tyr-ProHis-Ala)-Tyr¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(1-29)NH2; Nalfa- (His-Pro-His-Pro-His-Ala-Tyr-Ala) -Ty r¹ Thr² Ser ⁸ Alá^{1 3}Val¹⁹Leu^{2 7}Ser²⁸bGRF(1-37)NH2; N-alfa-(Tyr-Ala-Gly-Pro-LeuPro-Phe-Ala)2~Tyr^Ile²Ser⁸Ala¹³Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³²bGRF(132)NH2; N-alfa-(Val-Pro-Arg-Pro-Phe-Pro-Tyr-Ser)-Tyr¹Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NHEt; N-alfa-(ArgPro-Tyr-Ala-Ile-Pro-Phe-Ala) -Tyr¹Ile²Ser⁸Alá^{1 3}Val^{1 9}Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NHEt; N-alfa-(Tyr-Ala)4-Tyr¹Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁴bGRF(1-34)NHCH3; N-alfa-(Ile-ProGlu-Ala-Tyr-Ala)-Tyr¹Ile²Ser⁸Alá¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸bGRF(137 )NH₂.

A találmány szerinti vegyületek egy még további csoportjába azok a már fentebb említett vegyületek tartoznak, amelyekben a 3- és/vagy 25-helyzetü, előnyösen a 3-helyzetü Asp helyett Cya található.

A találmány szerinti Val¹⁹ és Ile¹⁹ vegyületeknek az in vitro (patkány hipofízis sejtek) GH felszabadító hatása a megfelelő Alá¹⁹ vegyületekével azonos vagy annál jobb (I.Táblázat és l.ábra). Szarvasmarha plazmában történő inkubálás esetén a proteolízissel szemben stabilabbak. A találmány szerinti vegyületek megnövekedett metabolikus η n stabilitását (természetes GRF szekvencia és Leu^ bGRF(l-2229)NH2 vegyület összehasonlító vizsgálata eredményeként) a

II.Táblázatban bemutatott in vitro stabilitási adatok bizonyítják. A találmány szerinti vegyületek in vivő 10 pmol/kg koncentrációban hatásosabbak, mint a Leu^ analógok (2.ábra) és általában több növekedési hormont szabadítanak fel és hosszabb ideig hatnak, mint az Alá³⁹ és Leu³⁹ analógok, amikor növendékmarhákban 30 pmol/kg dózisban vizsgáljuk (III.Táblázat). Az 1. és 2.ábrán (a vegyületeket trifluorecetsavas só formájában vizsgálva) T2 Thr²-t, A15 Ala^^-t, L27 Leu²⁷-et, L19 Leu¹⁹-et, V19 Val¹⁹-et és 119 Ile¹⁹-et jelent.

A találmány szerinti olyan vegyületek megnövekedett in vivő hatását, amelyekben R³⁹ Val vagy Ile, a III.Táblázat és 2.ábra mutatja. Például, a szakember a relatív in vivő hatásadatokból látja (10 pmol/kg, 2. ábra)', hogy a Thr²Ala^^ Val1⁹Leu²⁷bGRF(1-29jNHg-trifluor-acetát-só és hasonlóan (30 pmol/kg dózisban, III.Táblázat) a Val^⁹ és Ile^·⁹ vegyületek biológiailag aktívabbak, mint a természetes GRF.

Az ipari előállítás céljára a karboxi-terminális maradék előnyösen homoszerin, homoszerin-lakton, homoszerinamid vagy a homoszerin 1-8 szénatomos alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos alkil-szekunder vagy tercier amidja.

A szintetikus GRF peptid analógokat megfelelő módszerekkel, például a 4,529,595 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (a 2.oszlop 35.sorától az 5.oszlop 64.soráig terjedő részben) és a 4,689,318 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (a 2.oszlop 23. sorától a 9.oszlop 13.soráig terjedő részben) ismertetett eljárásokkal állíthatjuk elő.

-23Az A) eljárás a találmány szerinti GRF peptid analógok szintézisére alkalmas módszer.

A) eljárás

A peptideket szilárd-fázisú módszerrel, Applied Biosystems 430A típusú peptidszintetizátorral (Applied Biosystems, Foster City, California) és az Applied Biosystems által rendelkezésre bocsátott szintézisciklusok felhasználásával állítjuk elő. A Boc-aminosavakat és más reagenseket az Applied Biosystems cégtől és más kereskedelmi forrásokból szereztük be. A C-terminális karboxamidok előállítására kétszeres kapcsolást előíró szekvenciális Boc-aminosavas módszert és p-metil-benzhidril-amin-gyanta kiindulási anyagot alkalmazunk. A C-terminális savak előállításához a megfelelő PAM-gyantákat használjuk. Az aszparagint, glutamint és arginint hidroxi-benzotriazol-észterek formájában kapcsoljuk. Minden más aminosavat az előre elkészített szimmetrikus Boc-aminosavanhidrid alakjában kapcsolunk.

Az oldalláncokat a következő csoportokkal védjük:

Arg, tozil

Asp, benzil

Cys, 4-metil-benzil,

Glu, benzil Ser, benzil Thr, benzil

Tyr, 4-bróm-karbobenzil-oxi

Lys, 2-klór-karbobenzil-oxi.

A Boc védőcsoport eltávolítására trifluor-ecetsavat használunk metilén-kloridban. Amikor Hse-t tartalmazó analógok előállítása kívánatos, Met maradékot kell szilárdfá-

zisú szintézissel beépíteni, amelyet aztán bróm-ciánnal módosítunk hidrogén-fluoridos hasítás után, a szakterületen jól ismert módszerekkel. Ez a bróm-ciános hasítás a Met maradékot C-terminális Hse-lakton-peptiddé alakítja. Ezt aztán a megfelelő aminnal oldósz&rben, például metanolban vagy dimetil-formamidban a Hse-amid-peptiddé alakíthatjuk. [A C-terminális Hse(lakton), HseOH és HseN(R_a)(R^) analógok a Kempe és munkatársai által a BIO/TECHNOLOGY 4, 565-568 (1986) irodalmi helyen leírt módszerrel állíthatók elő.] A szintézis befejezése után a peptidekről a védöcsoportokat eltávolítjuk, és 10% p-krezolt tartalmazó vízmentes hidrogén-f luoriddal a peptidet a gyantáról lehasítjuk. Az oldalláncok védőcsoportjainak és a peptidnek a gyantáról való lehasítását O’C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten, előnyösen -20’C-on végezzük 30 perces, majd O’C-on további 30 perces reakcióidőt alkalmazva. A hidrogén-fluorid eltávolítása után a peptid/gyanta keveréket dietil-éterel mossuk, és a peptidet jégecettel extraháljuk, majd 1 ifolizáljuk. Tisztítás előtt a nyers, ciszteintartalmú peptideket perhangyasavval a megfelelő ciszteinsavat tartalmazó vegyületté oxidáljuk -10 és +10’C közötti hőmérsékleten, előnyösen O’C-on, ahogy azt Stewart és munkatársai a Solid Phase Peptide Synthesis című munkában (113.oldal, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984) leírták. A C-terminális Hse-laktonokká és Hse-amidokká történő átalakítást a fenti módon végezzük.

A tisztításhoz ioncserélő kromatográfiás eljárást alkalmazunk, amelyhez Synchroprep S-300 (SynChrom Inc. Linden, Indiana) kationcserélő oszlopot használunk. A peptidet 20 millimólos, 20%-os acetonitriles trisz puffer-25ben (pH 6,8) visszük az oszlopra, és a fenti oldószerben készült 0 és 0,3 mól között gradiensen változó töménységű nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. A vegyületeket Vydac C-18 (Separations Group, Hesperia, California) fordított fázisú oszlopon tisztítjuk tovább és sómentesítjük, eluálószerként víz és acetonitril gradiens elegyét használjuk, minden fázis 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmaz. A megfelelő frakciókat bepároljuk és 1 iofi1izáljuk, így a kívánt GRF PEPTID-et trifluor-ecetsavas sója formájában kapjuk. A trifluoracetát-sót kívánt esetben más megfelelő sóvá alakíthatjuk a jól ismert ioncserélős módszerek alkalmazásával.

A peptideket vákuumban gőzfázisban, Pico-Tag Work Station (Waters) készülékben 110°C-on 24 órán át hidrolizáljuk állandó forráspontú hidrogén-klorid (Pierce) felhasználásával, fenol jelenlétében. A hidrolizátumokat Beckman aminosav-analizátorban (Model 6300) vizsgáljuk. A peptidtartalom kiszámításához ismert koncentrációjú norleucin belső standardot alkalmazunk.

A tömegspektrumokat Applied Biosystems Time of Flight Mass Spectrometer készülékben vettük fel.

1példa

Thr^Ala¹5Val¹^Leu²^-bGRF(1-29)NH2~trifluor-acetát-só (1.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Val-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 képletű GRF analóg peptidet az A) eljárásban leírt módon, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Az aminosav-analízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójelben szerepelnek): Asp 4,06 (4); Thr

1,57 (2);	Ser	1,64 (2)	; Glu	2,10	(2); Alá	2,25	(2); Val	2,0
(2); Ile	1,68	(2); Leu	5,15	(5) ;	Tyr 1,88	(2) ;	Phe 0,94	(1);
Lys 2,00	(2) ;	Arg 2,94	(3).

2.példa

Thr²Alal5];i_e19Leu²⁷-bGRF( 1-29) NHg-trifluor-acetát-só (2.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arge-NH2 képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Az aminosav-analízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójelben szerepelnek): Asp 4,09 (4); Thr 1,98

(2); Ser	1,64	(2); Glu	2,05	(2); Alá 2,25	(2); Val	1,0 (1);
Ile 2,84	(3);	Leu 5,07	(5);	Tyr 1,87 (2);	Phe 0,92	(1)5 Lys
1,97 (2);	Arg	2,94 (3) .

3.példa

Thr^Ala¹^Leul^Leu^⁷-bGRF(1-29)NHo-trifluor-acetát-só (3.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Az aminosav-analízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójelben szerepelnek): Asp 4,08 (4); Thr 1,87

(2); Ser	1,72	(2); Glu	2,07	(2); Alá 1,93 (2); Val 1,04	(i);
Ile 1,88	(2) ;	Leu 6,11	(6);	Tyr 1,90 (2); Phe 0,93 (1);	Lys
2,03 (2);	Arg	3,09 (3).
4.példa
Val2Ala15	Leu19	Leu27-bGRF(1-	29) NHo-trifluor-acetát-só

-27(4.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NHg képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Tömegspektrum (Cf-252 plazma deszorpciós módszer) m/z az [M+H]⁺-ra: mért: 3454,6; számított: 3452,1. Az aminosavanalízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójelben szerepelnek): Asp 4,01 (4); Thr 0,93 (1); Ser 1,68 (2); Glu 2,03 (2); Alá 2,00 (2); Val 1,85 (2); He 1,88 (2);

Leu 6,11 (6); Tyr 1,94 (2); Phe 0,94 (1); Lys 1,97 (2); Arg

3,11 (3) .

. példa

Ile²Ala^^Leu^^Leu²^-bGRF( 1-29 )NHo~trifluor-acetát-só (5.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Tömegspektrum (Cf-252 plazma deszorpciós módszer) m/z az [M+H]⁺-ra: mért: 3468,6; számított: 3466,1. Az aminosavanalízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójel-

ben szerepelnek):	Asp 4,02	(4) ; Thr 0,94	(1);	Ser 1,67	(2);
Glu 2,05	(2);	Alá	2,00 (2);	Val 0,94 (1);	He	2,83 (3);	Leu
6,12 (6);	Tyr	1,92	(2); Phe	0,95 (1); Lys	1,99	(2 ) ; Arg	3,13

(3) .

6.példa

Val^Ala^^Ile-l-^Leu^^-bGRFt 1-29 )NH2-trifluor-acetát-só (6.számú vegyület) előállítása

-28A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Tömegspektrum (Cf-252 plazma deszorpciós módszer) m/z az [M+H]⁺-ra: mért: 3453,4; számított: 3452,1. Az aminosavanalízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójelben szerepelnek): Asp 4,03 (4); Thr 0,94 (1); Ser

1,69 (2); Glu 2,03 (2); Alá 2,01 (2); Val 1,89 (2); Ile 2,85 (3); Leu 5,11 (5); Tyr 1,95 (2); Phe 0,95 (1); Lys 1,99 (2); Arg 3,08 (3).

7.példa

Ile²Ala^X^Ile¹⁹Leu²⁷-bGRF(l-29)NH2~trifluor-acetát-só (7.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Tömegspektrum (Cf-252 plazma deszorpciós módszer) m/z az [M+H]⁺-ra: mért: 3469,7; számított: 3466,1. Az aminosavanalízis eredménye a következő (az elméleti értékek zárójelben szerepelnek): Asp 4,03 (4); Thr 0,94 (1); Ser 1,69 (2); Glu 2,06 (2); Alá 2,04 (2); Val 0,94 (1); Ile 3,78 (4); Leu 5,12 (5); Tyr 1,94 (2); Phe 0,95 (1); Lys 1,98 (2); Arg 3,09 (3) .

8.példa

Val²Ala^X^Val^X^Leu²⁷-bGRF(l-29)NH2-trifluor-acetát-só (8.számú vegyület) előállítása

H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys♦ ♦· ·♦ · ·

-29Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Val-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 képletű GRF-analőg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Tömegspektrum (Cf-252 plazma deszorpciós módszer) m/z az [M+H]⁺-ra: mért: 3440,6; számított: 3438,1. Az aminosav-

analí z i s	eredménye a	következő	( az	elméleti értékek
zárójelben	szerepelnek):	Asp 4,02	(4);	Thr	0,93 (1);	Ser
1,67 (2);	Glu 2,03 (2);	Alá 2,00 (2)	; Val	2,78	(3); Ile	1,86
(2 ) ; Leu 5	,09 (5); Tyr 1	,92 (2); Phe	1,04	(i);	Lys 1,98	(2);

Arg 3,05 (3).

9.példa

Ile²Ala^^Val^⁹Leu²⁷-bGRF( 1-29 )NH2~trifluor-acetát-só (9.számú vegyület) előállítása

A H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Val-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptidet az A) eljárás szerint, lépésenként, trifluor-acetát-só formájában állítjuk elő. Tömegspektrum (Cf-252 plazma deszorpciós módszer) m/z az [M+H]⁺-ra: mért: 3454,9; számított: 3452,1. Az aminosav-

analízis	eredménye a	következő	(az	elméleti	értékek z	áró-
jelben szerepelnek):	Asp 4,02	(4);	Thr	0,93	(1); Ser	1,69
(2); Glu	2,04 (2); Alá	2,06 (2);	Val	1,86	(2);	Ile 2,84	(3);
Leu 5,10	( 5); Tyr 1,94	(2); Phe	0,94	(1);	Lys	1,98 (2);	Arg

3,07 (3).

Az A) eljárásban leírt módon, lépésenként az alábbi peptideket is előállíthatjuk:

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF( l-30)NH2 , Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH2,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂, ·· ·· • *

-30Ile²Ser⁸Ala⁴^Val^⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33 )NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH2, Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH2

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH2, Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH2;

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NHEt,

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NHEt,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NHEt, Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NHEt, Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH-n-propil.

B) eljárás

A GRF-analógokat a szilárdfázisú eljárások mellett rekombináns DNS módszerrel is megkaphatjuk, például 0212531 számú európai szabadalmi bejelentésben a Leu -31- • 4 ·· · ·*4· · • 4 · 4 ·· ♦ * · · ·· « • · 4 4·· •44 · «44 ·· bGRF(l-44)OH peptidre leírt eljárással, amelynél a DNS bGRF(1-44)OH-t kódoló szegmensében az Alá², Asn⁸, Gly·*·⁸ és Asn²⁸ kodonokat például (ACT)Thr² vagy (ATT)Ile² vagy (GTT)Val², (AGT)Ser⁸, (GCT)Ala¹⁵, (AGT)Ser²⁸ kodonokkal helyettesítjük.

Emellett a Cya tartalmú GRF-analógok esetében a GATÍAsp²) kodont a TGT (Cys²) kodonra cseréljük. A fehérje kifejezése és a hangyasavas bróm-ciános hasítás után, ahogy az a fenti európai szabadalmi bejelentésben le van írva, a Cys maradékok Cya maradékokká való oxidálására az oldathoz kb. O’C-on hidrogén-peroxidot adunk. A peptidet aztán a leírt módszerek segítségével tisztítjuk.

Az N-terminálison hosszabbított GRF-analógok előállításához az N-terminálishoz hozzáadjuk a DNS-nek a hoszszabbítást kódoló szegmensét, amelyek a következők: (TATACT) a Tyr-Thr, (TATACT)_n a (Tyr-Thr)_n vagy (TATAGT) a Tyr-Ser, (TATAGT)_n a (Tyr-Ser)_n, vagy (TATAGTTATACT) a Tyr-Ser-TyrThr vagy (TATACTTATAGT) a Tyr-Thr-Tyr-Ser, (GATGCT) az AspAla kódolására. A prekurzor fehérje génjét egy E. coli expreszsziós vektorba építjük be. A fehérje kifejezése után a befogadó testeket elkülönítjük, és hangyasavban brómciánnal hasítjuk, ahogy azt az európai szabadalmi bejelentésben leírják, majd a hangyasavat csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A nyers peptidet aztán a leírt módszerekkel tisztítjuk.

A jelen találmány szerinti vegyületek ismert DNS rekombináns technikával való előállítása azért lehetséges, mert az oltalmi körbe tartozó peptidek valójában a természetben előforduló aminosavakból vannak felépítve. Ezzel • · ·

-32ellentétben az olyan ismert analógok, amelyek nem-DNS-sel kódolt komponenseket, például D-Ala-t és/vagy dezamino-Tyr-t tartalmaznak, a nagy mennyiségben való előállításhoz költséges kémiai szintézist vagy génsebészeti és kémiai eljárás kombinációját igénylik.

A jelen találmány szerint használt rekombináns gazda mikroorganizmust a szakember által jól ismert rekombináns DNS technikával állítjuk elő, például T. Maniatis és munkatársai (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), valamint B. Perbal (A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, 1984) által leírt módszerrel, amelyekre ezúton utalunk.

A C-terminálison Hse(lakton), HseOH és HseN(R_a)() csoportokat tartalmazó analógokat a Kempe és munkatársai által a BIO/TECHNOLOGY, 4, 565-568 (1986) irodalmi helyen ismerteti módszerekkel állíthatjuk elő.

C) eljárás

Ez az eljárás a jelen találmány szerinti N-alkilezett GRF-analógok előállítására szolgál. A peptideket vagy kémiai vagy biotechnológiai eljárásokkal [A) eljárás vagy B) eljárás] kapjuk. Az N-alkilezést aztán ismert reakciókkal, például Murphy, W. A. és Coy, D. H. [Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, Peptide Research, 1, 36-41 (1988)], illetve V. Sythyamoorthy és munkatársai [Reductive methylation of botulinum neurotoxin types A and B (A és B típusú botulinum neurotoxin reduktív metilezése), Mól. Cell. Biochem. 83, 65-72 (1988)] módszerével valósítjuk meg.

A C) eljárás alkalmazásával az alábbi peptideket is • ·4 • · · · · · • · · · ·· · Λ «·»· «

-33előállίthatjuk:

N-epszilon-iPr-Tyr^Thr²Ser⁸N-epszilon-iPr-Lys^²,21y_a^15_

Ile¹⁹ Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l-29)NH2, N-epszilon-iPr-Tyr^Thr²Ser⁸N-epszilon-iPr-Lys·'·² ’²-'-Ala^^Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-40)NH2,

N-epszilon-Bzl-Tyr^Thr²Ser⁸N-epszilon-Bzl-Lys·^² ’²^Val^^Ile¹⁹Ile²⁷Ser²⁸bGRF(1-32)NH2, N-epszilon-iPr-Tyr-’'Ile²Ser⁸N-epszilon-iPr-Lys^² ’²^Ala^^Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-40)NH2,

N-epszilon-Bzl-TyrlVal²Ser⁸N-epszilon-Bzl-Lysl²’²^Val^®Val¹⁹Ile²⁷Ser²⁸bGRF(1-32)NH₂.

A jelen találmány szerinti összes szintetikus GRF peptidet, beleértve a példákban előállítottakat, biológiailag hatásosnak tartjuk, és alkalmasnak a GH hipofízis általi felszabadításának serkentésére.

A találmány szerinti peptidek kb. 10 nanogramm és kb. 5 mikrogramm peptid/kilogramm testtömeg közötti dózisai különösen hatásosan idéznek elő GH-kiválasztást.

A GH kiválasztás ilyen peptidek által történő serkentése fokozott növekedéssel jár emberekben, szarvasmarhákban és más, normál GH-szintű állatokban. Ezen felül, az ilyen peptid adagolása megváltoztatja a test zsírtartalmát és más, GH-függő metabolikus, immunológiai és fejlődési folyamatokat is módosít. Ezek az analógok például hasznosak lehetnek emberekben az anabolikus folyamatok serkentésére, például égési sebek gyógyítása esetén. Másik példaként azt említhetjük, hogy ezek az analógok a kereskedelmi méretekben tenyésztett melegvérű állatoknak, így csirkéknek, pulykáknak, sertéseknek, kecskéknek, teheneknek és juhoknak is

-34adagolhatók, valamint a mezőgazdaságban halak tenyésztésére vagy más hidegvérű tengeri állatok, például tengeri teknősök, angolnák és kétéltűek növekedésének gyorsítására és a súlygyarapodáson belül a fehérje és zsír arányának növelésére használhatók, amennyiben hatásos mennyiségben kerülnek alkalmazásra. Ezek az analógok használhatók lehetnek emberben és állatban az immunfunkciók serkentésére, a növekedési hormonnal kapcsolatos abnormalitások okozta cukorbetegség kezelésére vagy csont, seb vagy égés gyógyulásának elősegítésére vagy oszteoporózis javítására. Ezek az analógok hajnövekedés fokozására is alkalmazhatók.

A napi 10 nanogramm/kg és kb. 50 mikrogramm/kg testtömeg közötti dózisok különösen hatásosak a tejtermelés, növekedés és az immunfunkciók serkentése szempontjából.

Embereknek és állatoknak való beadáshoz ezeknek a szintetikus peptideknek legalább kb. 93%-os, és előnyösen legalább 98%-os tisztaságúaknak kell lenniök.

A találmány szerinti szintetikus peptidek vagy nemtoxikus sóik gyógyászatilag vagy állatgyógyászatilag elfogadható hordozókat tartalmazó gyógyászati készítmények, előnyösen nyújtott hatóanyagleadású készítmények formájában adagolhatok állatoknak, többek között embereknek intravénás, szubkután, intramuszkuláris, perkután, például intranazális úton. A készítményt az orvos a GH felszabadlulás serkentésére alkalmazhatja olyan egyedek esetében, akik ilyen gyógyászati kezelést igényelnek. A szükséges dózis a speciális kezelendő állapottól, annak súlyosságától és a kívánt kezelés időtartamától függ.

Az ilyen peptideket gyakran nemtoxikus sóik, például • ·«

-35savaddíciós sóik vagy fémekkel, például cinkkel, vassal vagy hasonlókkal alkotott komplexeik formájában (amelyeket a jelen találmány céljai szempontjából sóknak tekintünk) adagoljuk. A savaddiciós sókra példaként a hidrokloridőt, hidrobromidot, szulfátot, foszfátot, maleátot, acetátot, citrátot, benzoátot, szukcinátot, malátot, aszkorbátot, tartarátot és hasonlókat említhetjük. A hatóanyagok intravénás adagolása izotóniás sóoldatban, foszfát puffer oldatokban vagy hasonlókban történik.

A peptideket embereknek orvos irányítása mellett adagoljuk, és a gyógyászati készítmények általában a peptidet valamely szokásos szilárd vagy folyékony, gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazza. A parenterális dózis kb. 100 nanogramm és kb. 50 mikrogramm/testtömeg között van.

Noha a találmányt az előnyös kiviteli alakokra tekintettel írjuk le, természetes, hogy a szakember számára ezen a területen nyilvánvaló módosítások és változtatások tehetők anélkül, hogy a találmánynak a csatolt igénypontok által meghatározott körétől eltávolodnánk. Például, a peptidláncban végzett módosításokkal, különösen a peptid C-terminálisánál egy vagy két kezdő maradéknak a napjainkban ismert kísérleti technikákkal való kiiktatásával olyan peptideket hozunk létre, amelyek a pepiidnek a biológiai hatás szempontjából nagyon lényeges részét megtartják, így az ilyen peptideket a találmány körébe tartozóknak tekintjük. Emellett a C-terminálisnál és/vagy az N-terminálisnál a peptidet meghosszabbíthatjuk és/vagy általánosan ekvivalens maradékokkal helyettesíthetjük a természetben megtalálható • ·

-36maradékokat, ahogy az a peptidkémiában jól ismert, további analógokat hozhatunk létre, amelyek például és így a proteolízissel szemben ellenállóbbak, és az igényelt polipeptidnek legalább egy, a hatás szempontjából lényeges részét tartalmazzák, anélkül, hogy a találmány körétől eltérnénk (1-15.számú vegyületek). A C-terminálisnál a karboxicsoporton végrehajtott ismert helyettesítések, például egy kevés szénatomos alkil-amid előállítása szintén ekvivalens molekulákat eredményez.

Ugyanilyen módon, az

R’-R’g-Rg-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-R’12^-R13^^eu_ R|5-Gln-Leu-R|g-R|g-Arg-R’ 21^—R22 ^— ^^J®'J^-^^^^—R25 ^— ^^’®^—R27^—R28~ Arg-Gln—Gin — Gly—Glu —R34 — Rgg-Gln —Glu-Rgg —Rgg-R^Q-Arg —R42 -Arg-Leu-Z általános képlettel jellemezhető GRF PEPTIDEK, a képletben

R’ (X-Y)-(X’-Y)_n általános képletű csoport, amelyben n értéke 0-20, előnyösen 0-10,

X bármely, a természetben előforduló aminosav,

Y alanin, szerin, treonin vagy prolin; és amikor n értéke 0, Y alanin, szerin vagy treonin;

X’ bármely, a természetben előforduló aminosav, a prolin és hidroxi-prolin kivételével;

R1	Tyr vagy His;
R’ 2	Alá, Gly, Thr, Val vagy Ile;
r3	Asp, Glu vagy Cya;
r 8	Asn vagy Ser;
R’ 12	Lys vagy Arg;
R13	Val vagy Ile;
R15	Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly;

« 4»

R18	Ser	vagy	Tyr;
R19	Val	vagy	Ile;
R,21	Lys	vagy	Arg ;
R22	Alá	vagy	Leu;
R25	Asp	, Glu	vagy	Cya;
R27	Met	, Ile	vagy	Leu;
R28	Asn	vagy	Ser;
R34	Ser	vagy	Arg;
R35	Asn	vagy	Ser;
R38	Arg	vagy	Gin;
R39	Gly	vagy	Arg;
R40	Alá	vagy	Ser;
R42	Alá	, Val	vagy	Phe; és

Z a C-terminális aminosav karboxi-részét, a -COOR„,

-CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoportot jelenti, amelyben R_a és R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag hatásos fragmentumaik, amelyek az Nterminálison az R-től kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhetnek; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R_b) alakja és/vagy a fentiek nemtoxikus sói előállíthatok az ismert kísérleti gyakorlat felhasználásával, és így olyan peptideket kapunk, amelyek a peptidnek a biológiai hatása szempontjából nagyon lényeges részét megtartják, és az ilyen peptideket szintén a jelen találmány további tárgyának tekintjük.

A jelen találmány szerinti GRF peptid R> hosszabító részének aminosavszekvenciája az (X-Y)-(X’-Y) általános képlettel jellemezhető, amelyben • ♦ ·4 ϊ ***· · • « · · r ♦ • · 9 * ·* · ♦ 1«·· «

-38η a szekvenciálisán kapcsolt X’-Y csoportok számát jelöli, értéke 0 és 20, előnyösen 0 és 10 közötti;

X bármely, a természetben előforduló aminosav lehet;

Y prolin, alanin, szerin vagy treonin, kivéve, ha n értéke 0, mert akkor Y alanint, szerint vagy treonint jelent;

X’ bármely, a természetben előforduló aminosav, kivéve a prolint és hidroxi-prolint.

A képletnek megfelelően, amikor n = 1, két Y maradék van jelen. Lehetséges, hogy egyetlen molekula 21 Y maradékot és 20 X’ maradékot tartalmaz. Az Y és X’ külön-külön a meghatározásában szereplő csoportok bármelyikét jelentheti. Azaz, az egyes Y maradékoknak nem kell egy molekulábn belül azonosnak lenniök. Hasonlóképpen, az egynél több X’ maradékot tartalmazó molekulában minden egyes jelenlevő X’ maradék a prolin és hidroxi-prolin kivételével bármelyik aminosavmaradék lehet, függetlenül attól, hogy a többi X’ mit jelent. Minden egyes Y és X’ maradéknak az adott speciális csoportra vonatkozó szabályoknak meg kell felelnie, és mindannak, ami ahhoz szükséges, hogy az egyes speciális helyzetekben levő különféle maradékok a fentebb ismertett szabályoknak eleget tegyenek.

I.Táblázat bGRF-analógok hatása patkány GH felszabadulására patkány adenohipofízis sejttenyészetben in vitro*

A vegyület Az analóg koncentrációja(nm) száma neve(trifluor-acetát-só) 0,01 0,1 1 10

	alapvonal**	1963*	1963“	1963*	1963*
	Leu27-bGRF(l-29)NH2	3474c-d	756 ld	15172e	16506c
9	Ile2Ala15Val19Leu27-bGRF(l-29)NH2	5598«	12082«	17230f
7	Ile2Ala15Ile,9Leu27-bGRF(l-29)NH2	5162f’8	11006f,«	16980f
8	VaI2Ala15Val,9Leu27-bGRF(l-29)NH2	4629*^	11832f,«	16578f
6	Val2Ala,5Ilel9Leu27-bGRF(l-29)NH2	4141d-c	10686f	16370*,Γ
1	Thi^Ala15 Val l9Leu27-bGRF( 1 -29)NH2	3852d	9252c	16138e,f
2	Thr2AIa15lle19Leu27-bGRF(l -29)NH2	2541*,b	6263c,d	13122d
	Thr2Ala15Leu27-bGRF(l-29)NH2	2833b,c	5831c	13378d
5	IIe2Ala15Leu19Leu27-bGRF(l-29)NH2		5835c	12298d	I7272d
4	Val2Ala,5LeuI9Leu27-bGRF(l-29)NH2		3976b	9540°	16455c
3	Thr2Alal5Leu19Leu27-bGRF(l-29)NH2		2443*	4483b	130I2b

* A hipofízis sejttenyészetben felszabadult rGH mennyiségét radio-immunassay-vel mértük, és ng/méróhely/4óra értékként fejeztük ki, ahogy azt Frohman és munkatársai a Methods Enzymol. 124, 371 (1986) irodalmi helyen leírták.

** Analóg hozzáadása nélkül.

a,b,c,d,e,f,g ggy oszlopon belül a különböző felsó indexszel ellátott középértékek p < 0,05-nél eltérőek.

Megjegyzés: A Leu-^θ helyettesítés károsan hat az analalóg GH-f elszabadító poptenciál jára; míg a Val^⁹ és Ile^* ·· ♦

-40módosítás megnövekedett vagy változatlan in vitro hatású analógokat eredményez, addig a Leu^-θ helyettesítés következtében az analóg aktivitása csökkent. A meghatározáshoz standardként Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂ vegyületet használtunk.

II.Táblázat

19-helyzetben helyettesített GRF-ek in vitro plazmastabilitása

A vegyület

A vegyület neve ti/₂(ó^ra) száma (trifluor-acetát-só formájában)

	Leu27 bGRF(l-29)NH2	0.6*
	Thr2,Ala15,Leu27,bGRF(l-29)NH2	4.90
3	Thr2,Ala15,Leu19,Leu27,bGRF(l-29)NH2	14.7*
1	Thf2,AJa15,Va]19,Leu27 )bGRF(l-29)NH2	6.6b
1 2	Thr2,Ala15,Ile19,Leu27,bGRF(l-29)NH2	12.3*

* Három független kísérlet átlaga (mindegyik háromszoros ismétlésben végezve).

a,b,^c ^z _eitérö felső indexű vegyületek p < 0,05-nél statisztitkusan különböznek.

• ·· ·*·· · • 9 • · · « ·

III.Táblázat

-41Takarmánnyal táplált Holstein növendékmarhák szérum GH válasza az X2,Alal5,Y19,Leu27bGRF(1-29)NHg templátban a 2-es és 19-es helyzetekben különféle helyettesítőket tartalmazó GRF analógok intravénás beadására

Vegyület	Nincs	St	Az St	Terület	A B
(TFA-só	válasz	csúcs	csúcs	(egység)	%-ában
formá-	(%)	magas-	ideje 0-1	1-2	0-2 kifejezve
jában )		sága	(perc)	(óra)

(ng/ml)

—	0“	11.7“	22abc	0.51*	0.50*	1.00*	44	28
A	83b	73.2*	12*	1.73b	0.56*	2.29b	100	64
B	ioob	75.7*	18,bc	2.56°	1.04^	3.60°	157	100
3	100b	83.5*	17abc	2.436°	0.77ab	3.205°	140	89
4	92b	70.9*	216°	2.165°	0 9iabc	3.O700	134	85
5	92b	42.8*	15,bc	1.43b	0.95ab	2.38b	104	66
1	92b	79.6*	19*80	2.75	1.35041®	4.10°	179	114
8	100b	69.4*	15ab	2.306°	1.48^	3.7700	165	105
9	92b	72.7*	2200	2.285°	1.96c	4.25c	186	118
2	92b	60.7*	226°	2.04^	| j^bcde	3.23°	141	90
6	92b	78.7*	20abc	2.63^	1.74de	4.37°	191	121
7	100b	49.5*	24°	1.566°	1.36^°	2.91^	127	81
SEM	5	12.7f	4	0.33	0.23	0.48
P	0.0001	0.75	0.32	0.0001	0.0001	0.0001

• ·

-42A vizsgált vegyületek:

--- víz

A bGRF(1-44)NH₂

B Thr2,Alal5,Leu27,bGRF(1-29)NH₂

3. Thr2,Alal 5,Leül 9,Leu27bGRF(1-29)NH₂

4. Val2,Alal5,Leül 9,Leül7bGRF(1-29)NH₂

5. Ile2,Alal5,Leul9,Leu27bGRF(l-29)NH₂

1. Thr2,Alal5,Val19,Leu27bGRF(1-29)NH₂

8. Val2,Alal5,Val19,Leu27bGRF(1-29)NH₂

9. Ile2,Alal5,Vall9,Leu27bGRF(l-29)NH₂

2. Thr2,Alal5,Ile19,Leu27bGRF(1-29)NH₂

6. Val2,Alal5,Ilel9,Leu27bGRF(1-29)NH₂

7. Ile2,Alal5,Ilel9,Leu27bGRF(1-29)NH₂ £

Az itt közölt adatok a B analízis adatai, amely csak a GRF injektálására választ adó növendékmarhákat veszi f igyelembe.

** Az anyagokat iv injekció formájában, 30 pmol GRF/kg mennyiségben adagoltuk etetés előtt 2 órával.

*** a variáció heterogenitása (Hartley-féle F-max teszt), ez a P-érték és felső index a lóg transzformációs adatokon alapul.

abcde _egy oszlopban levő eltérő felső indexű értékek különbözőek (P <0,05).

I A SEM a GRF-fel való kezeléskor 12,7 ng/ml, azonban a SEM a vizes kontrollok esetében 45,2 ng/ml.

% A SEM a GRF-fel való kezeléskor 4 perc; azonban a SEM a vizes kontrollok esetében 14 perc .

* ·

-431.ábra

ΙβΟΟβη

14000Patkány növekedési hormon ng/méröhely/

00004 óra

120001001400·2000-

Analóg (nM)

Thr²,Alal®,Leu²⁷-bGRF(1-29)NH2 analógok hatása a növekedési hormon (GH) felszabadulására patkány hipofízis sejttenyészetben in vitro. A meghatározást Frohman és Downs eljárásának megfelelően [Methods Enzymol. 124, 371-389 ( 1986)] végeztük. Figyelemreméltó, hogy a Leu·'·⁹ helyettesítés káros hatással van az analóg GH-felszabadító potenciájára, míg a Val^·⁹ és Ile·'·⁹ módosítások megnövekedett vagy változatlan in vitro bioaktivitású analógokat eredményeztek a Thr²,Ala^®, Leu²⁷-bGRF(1-29)NH2 vegyületet véve alapul. A meghatározás-

2.ábra

Idő (perc )

Átlagos növekedési hormon (GH ) koncentrációk takarmánnyal táplált Holstein növendékmarhák szérumában 10 pmol/kg GRF analóg intravénás injektálása után. A meghatározást Moseley és munkatársai által leírt módon [J. Endocrinol. 117, 252

259 (1988)] végeztük. Standardként szarvasmarha GRF(1-44)NH2 peptidet használtunk.

Claims (6)

1. Szabadalmi igénypontok:

   1. GRF PEPTIDEK, amelyek a normális esetben a 19-helyzetben található aminosavmaradék helyén Val-t vagy Ile-t, a normális esetben a 2-helyzetben található aminosavmaradék helyett Gly-t, Thr-t, Val-t vagy Ile-t, és a 15-helyzetben Ala, Val, Leu, Ile vagy Gly valamelyikét tartalmazzák.
2. 2. Az 1.igénypont szerinti GRF PEPTIDEK, amelyekben a 2helyzetu aminosav Thr, Val vagy Ile.
3. 3. Az 1.igénypont szerinti,

   R-R|-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-Rj2~^R13^-Leu_ R-£g— Gin—Leu—g —^R19~ Arg—^21^{- R}22 ~beu—Gin-R£ g — I le—R2 γ — R28^—árg — Gln-Gln—Gly — GIU-R34 — Rgg —Gin—Glu —R^g-R^g — R4Q-Arg — R42^_Arg — Leu-Z általános képlettel jellemezhető GRF PEPTIDEK, a képletben

   R hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzil- csoport; ^R1 Tyr vagy His; r₂ Gly, Thr, Val vagy Ile; ^r3 Asp, Glu vagy Cya; ^Rg Asn vagy Ser; ^R12 Lys vagy Arg, vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon- benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy

   benzilcsoport;

   ^r13 Val vagy Ile; ^R15 Ala, Val, Leu , Ile vagy Gly; ^r18 Ser vagy Tyr; ^R19 Val vagy Ile; ^R21 Lys vagy Arg, vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon- benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport

   • * · · · • · vagy benzilcsoport;

   • · • ·

   ^R22 Alá vagy Leu; ^R25 Asp vagy Glu; r₂₇ Met, He vagy Leu; ^R28 Asn vagy Ser; ^R34 Ser vagy Arg; ^R35 Asn vagy Ser; ^R38 Arg vagy Gin; ^R39 Gly vagy Arg; ^R40 Alá vagy Ser; ^R42 Alá, Val vagy Phe;

   Z a C-terminális aminosav karboxi-részét, a -COOR_a,

   -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R^) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoportot jelenti, amelyben R_a és R^ 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

   vagy biológiailag hatásos fragmentumaik, amelyek az Nterminálistól kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhetnek; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R^) alakja és/vagy a fentiek nemtoxikus sói .
4. 4. A 3.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben R₂ Thr, Val vagy lle.
5. 5. A 4.igénypont szerinti GRÁF PEPTIDEK közül a következők: Thr²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

   Thr²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

   Val²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

   Ile²Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

   Val²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

   Ile²Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂,

   -47Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)ΝΗ₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NHEt,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-37)NHEt,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-37)NH₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(l-44)NH₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NH₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

   Thr²Ser⁸Ala¹⁸Ile⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂;

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NHEt,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NHEt,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(l-37)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala⁸Val⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁹bGRF(1-30)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

   Ile²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(l-44)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(1-30)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala^Ile⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂,

   Val²Ser⁸Ala¹⁵Ile¹⁹Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH-n-propil vagy • · β ezek nemtoxikus sói.
6. 6. A 3.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben

   Alá, Val, Leu vagy Ile.

   7. A 6.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben R hidrogénatom és R 15 ^Ala* 8. A 7.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben ^R1 Tyr. 9. A 8.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben Rg és R23 Ser. 10. A 6.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben r₂ Val. 11. A 6.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben r₂

   Ile.

   12. A 6.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben R|g Val.

   13. A 6.igénypont szerinti olyan GRF PEPTIDEK, amelyekben R|g Ile.

   14. Eljárás növekedési hormon felszabadulásának serkentésére állatokban, azzal jellemezve, hogy a fenti állatnak olyan GRF PEPTID hatásos mennyiségét adjuk be, amely 19-helyzetben Val-t vagy Ile-t, a normális esetben 2-helyzetben található aminosavmaradék helyett Thr, Val vagy Ile maradékot, és a 15-helyzetben Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly egyikét tártálHISZZΆ *

   15. A 14.igénypont szerinti eljárás, amelyben a GRF PEPTID egy R-R|-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-Ri2^-Ri3^_Leu“ R^g-Gln-Leu-Rjg-R^g-Arg-R23^-R22^_^^eu-®^ⁿ~^R25^-^^^e-R27^-R28^-^^r^ Gln-Gln—Gly—Glu—Rg^-Rgg—Gln-Glu-Rgg—Rgg-R^Q—Arg-R42^—ArgLeu-Z általános képlettel jellemezhető vegyület, a képletben • · ϊ

   R hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport ;

   R| Tyr vagy His;

   R₂ Gly, Thr, Val vagy Ile;

   Rg Asp, Glu vagy Cya;

   Rg Asn vagy Ser;

   R₄₂ Lys vagy Arg, vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilonbenzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

   ^R13 Val vagy Ile;

   Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly;

   R^g Ser vagy Tyr;

   ^R19 Val vagy Ile;

   R₂i Lys vagy Arg, vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilonbenzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

   Rgg Alá vagy Leu;

   R₂5 Asp vagy Glu;

   R₂y Met, Ile vagy Leu;

   R₂g Asn vagy Ser;

   R₃₄ Ser vagy Arg;

   R35 Asn vagy Ser;

   Rgg Arg vagy Gin;

   Rgg Gly vagy Arg;

   R₄₀ Alá vagy Ser;

   R42 Alá, Val vagy Phe; és

   Z a C-terminális aminosav karboxi-részét, a -COOR_a,

   -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoportot jelenti, amelyben R_a és R_b 1-8

   -50szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

   vagy biológiailag hatásos fragmentuma, amely az Nterminálistól kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhet; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(Rfc) alakja és/vagy a fentiek nemtoxikus sója.

   16. Készítmény növekedési hormon felszabadításának ser- kentésére állatban, azzal jellemezve, hogy egy

   R-R2-R2^-R3^-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-R^2^_R13^-i^|eu-R^5Gln-Leu-R^g-R^g-Arg-R2i~R92~^x,eu-Gln-R25-Ile-R27-R28^-ArgGln-Gin—Gly—Glu—Rg4 — R3 5 ^—Gin—Glu—Rgg—Rg g—R4q — Arg—R₄ 2 ^— Arg —

   Leu-Z általános képlettel jellemezhető GRF PEPTID, a képletben

   R hidrogénatom, csoport; 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzil- ^R1 Tyr vagy His; r₂ Gly, Thr, Val vagy Ile; ^r3 Asp, Glu vagy Cya; Rg Asn vagy Ser; ^r12 Lys vagy Arg, vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon- benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport; ^R13 Val vagy Ile; ^R15 Alá, Val, Leu vagy Ile; ^R18 Ser vagy Tyr; ^R19 Val vagy Ile; ^R21 Lys vagy Arg, vagy N-epszilon-alkil- vagy N-epszilon- benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport

   vagy benzilcsoport;

   R22 Alá vagy Leu;

   • * ♦ · · · • · » * · f -51«

   ^r25 Asp vagy Glu; ^r27 Met, Ile vagy Leu; ^r28 Asn vagy Ser; ^R34 Ser vagy Arg; ^R35 Asn vagy Ser; ^R38 Arg vagy Gin; ^R39 Gly vagy Arg; ^R40 Ala vagy Ser; ^R42 Ala, Val vagy Phe;

   Ζ a C-terminális aminosav karboxi-részét, a -COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoportot jelenti, amelyben R_a és R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

   vagy biológiailag hatásos fragmentumaik, amelyek az Nterminálistól kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhetnek; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R_b) alakjának és/vagy a fentiek nemtoxikus sójának hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazza.