SK30893A3 - Method of gaining of enzymes from proenzymes - Google Patents

Description

Oddelenie trypsínu z reakčného média by mohlo byť podstatne zjednodušené použitím imobi1izovaného enzýmu. Použitie imobi1izovaného trypsínu k aktivácii protrombínu bolo dosiaľ pokladané za nemožné. Pokusy ukazujú, že na rozdiel od rozpustného trypsínu nié je imobilizovaný trypsín pre aktiváciu protrombínu na trombín vhodný (Zubairov a Zinkevich (1976), Voprosy medicinskoj chimii 22(2), 187 -191).

Úlohou predloženého vynálezu je nájsť jednoduchý spôsob aktivácie faktorov zrážania krvi, ktorý vykazuje vysoký výťažok vztiahnuté na aktivovaný enzým, bez toho. aby bolo nutné vykonávať stupeli čistenia po aktivačnej reakcii.

Podstata vynálezu

Táto úloha je podľa vynálezu riešená spôsobom aktivácie faktorov zrážania krvi trypsínoin, ktorý spočíva v tom. že sa faktor zrážania krvi získa z frakcie, obsahujúcej protrombínový komplex, spracuje sa s trypsínom imobi1izovaným na nosiči nerozpustnom vo vode a imobilizovaný trypsín sa po aktivácii faktora zrážania krvi oddelí. Ako vo vode nerozpustný nosič sa používajú niektoré celulózy, dextrany, agarózy, akryláty alebo silikáty.

Spôsob je vhodný najmä pre aktiváciu faktorov zrážania krvi protrombínu, faktora IX alebo faktora X.

Výhodné uskutočnenie vynálezu spočíva vo vykonaní aktivácie protrombínu. faktora IX alebo faktora X pri hodnote pH 5,8 až 7.9, vodivosti 5 až 25 mS a teplote od 2 do 45 °C.

Spôsob podľa vynálezu je zvlášt dobrý pre získanie trombínu z protrombínu. Riadené spracovanie frakcie, obsahujúcej čistený protrombín. imobi1izovaným trypsínom zahrnuje rýchle a úplne oddelenie trypsínu po vopred stanovenej dobe ošetrenia. Produkt neobsahuje v podstate žiadne produkty. Prídavok bežných stabilizátorov, ako 50 % glycerínu, je tiež možné použit. Frakcie obsahujúce trombín, môžu byt bežným spôsobom spracované na farmaceutické prípravky.

Pre výrobu aktivovaného enzýmu z faktora zrážania krvi sa môže aktivovat buď prečistený faktor zrážania krvi alebo komplex faktorov zrážania krvi, pričom sa aktivovaný enzým v poslednom uvedenom prípade výhodne ďalej čistí- Trombín môže byt tiež získaný aktiváciou prečisteného protrombínu alebo komplexu protrombínu.

Ďalšia výhoda spočíva v tom. že súčasne s aktiváciou faktoru zrážania krvi výrazne klesá aktivita vírusu v prípade, že bol použitý východzí materiál, ktorý pochádzal z krvi darcov kontaminovanej vírusom.

To, že imobilizovaný trypsín pôsobí inaktiváciu vírusu vo frakciách, obsahujúcich krvný faktor, je prekvapujúce. Spracovanie imobi1izovanými neutrálnymi hydrolázami pre inaktiváciu rozmnožovania schopných f i 1trovateľných pôvodcov chorôb bolo známe jedine pre frakcie, obsahu júce iinunoglobul ín G (EP'Ä 0247998).

Samozrejme môžu byt v rámci spôsobu podľa vynálezu použité tiež ďalšie prídavné postupy pre inaktiváciu prípadne prítomných infekčných agensov. Napríklad je možné zvlhčený lyofi 1izovaný východzí materiál spracovať pomocou ohrevu parou.

Nasledujúcimi postupmi je vynález bližšie vysvetlený.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Imobilizácia trypsínu

1,2 g trypsínu typ III (Sigma, Artikel Nr. T 8263) sa naviaže na 350 ml (100 g prášku) CNBr-aktivovanej Sepliarosy 4B podľa pokynov výrobcu (fa Pharmacia). Imobilizuje sa viac než 90 % trypsinu2. Aktivácia protrombínu vo frakcii, obsahujúcej protrombínový komplex

Z 50 1 ľudskej na kryoprecipi tát chudej krvnej plazmy sa izoluje protrombínový komplex známym spôsobom podíľa Brummelhuisa, Methods of Plasma Fractionation (J. M. Curling vyd., Acad. Press 1980) adsorbciou na aniónovýinennú živicu. Koncentrácia soli frakcie, obsahujúcej protrombín sa zníži diafiltráciou na 150 mM NaCI a produkt sa suší vymrazením.

Pre prípadnú inaktiváciu obsiahnutých pôvodcov chorôb sa tieto frakcie podľa AT-B 385657 zahrievajú za prítomnosti vodnej pary 10 h na 60 °C a 1 h na 80 °C.

Získaný prášok sa rozpustí (koncentrácia proteínu 12 mg/ml) a imobi1izovanom na Sepharose. 150 miešania- Aktivita trombínu je 1980 165 j./mg proteínu.

na 25 j. protrombínu/m1 spracováva s 1 ml trypsínu, min pri 25 °C za pomalého j. na ml, špecifická aktivita

- -J 3. Ďalšie čistenie trombínu zo stupňa 2.

Vyrobí sa trombín podľa stupňa 2 a čistí sa prechodom cez stĺpec 45 ml S-Sepharosy (Pharmacia). Stĺpec sa ekvilibruje 25 mM Na3Citrátu o pH 6.2. Trombín (105000 j. v 25 mM Na3Citrátu) sa naviaže na S-Sepharose, premyje sa rovnakým pufrom a eluuje 150 ml 450 mM NaCl roztoku.

Výtažok. vztiahnuté na trombín, bol nad 94 špecifická aktivita činí 1735 j./mg proteínu. Tento trombín sa za prítomnosti 9 g/1 NaCl a 5 g/1 glycerínu suší vymrazením na stabilný preparát.

4. Aktivácia prečisteného protrombínu

Získanie parou spracovaného protrombínového komplexu z plazmy sa vykoná podľa 2.

Vedľa protrombínu obsahuje vírusinaktívny produkt ešte faktor IX a faktor X. Chromatografickým delením, na sulfátovanom Sephadexe G50 (Pharmacia) (Miletich a spol.. (1.980), Analyt. Biochim. 105, 304-310) sa oddelia faktory IX a X od protrombínu. Po aktivácii prečisteného protrombínu na trombín podľa 2. bola Špecifická aktivita 745 j./ing.

5. Ďalšie čistenie trombínu zo stupňa 4.

trombínu sa vyrobí podľa 4 a ďalej sa čistí cez

S-Sepharosy. Po prečistení má trombín špecifickú j./mg proteínu.

110000 j. stĺpec 45 ml aktivitu 3240

Claims (4)

1. Spôsob í (ÍAOprM'V' %J p r&VHjJj . vyznačujúci sa tým. že sa získa faktor zrážania krvi z frakcie, obsahujúcej protrombínový komplex, spracuje sa s trypsínom imobi1izovaným na nosiči nerozpustnom vo vode a imobilizovaný trypsín sa po aktivácii faktora zrážania krvi oddelí.

2. Spôsob podľa nároku 1.vyznačujúci sa tým. že sa ako faktor ,₄ zrážania krvi spracováva protrombín. faktor IX alebo faktor X.

' * \ ·' ,

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým. že sa aktivácia ' protrombínu. faktora IX alebo faktora X vykoná pri hodnote pH

5.8 až 7,9. vodivosti 5 až 25 mS a teplote 2 až 45 °C.

4. Použitie spôsobu podľa nároku 3 pre získanie trombínu z protrombínu.