SK283138B6 - Spôsob prípravy amino-deoxy-di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny - Google Patents

Spôsob prípravy amino-deoxy-di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny Download PDF

Info

Publication number
SK283138B6
SK283138B6 SK1450-95A SK145095A SK283138B6 SK 283138 B6 SK283138 B6 SK 283138B6 SK 145095 A SK145095 A SK 145095A SK 283138 B6 SK283138 B6 SK 283138B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
amino
deoxy
acetyl
acceptor
oligosaccharide
Prior art date
Application number
SK1450-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK145095A3 (en
Inventor
Kurt G. I. Nilsson
Original Assignee
Procur Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Procur Ab filed Critical Procur Ab
Publication of SK145095A3 publication Critical patent/SK145095A3/sk
Publication of SK283138B6 publication Critical patent/SK283138B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Uvedený spôsob sa týka syntézy amino-disacharidu, amino-oligosacharidu alebo príslušných derivátov zahŕňajúcich reakciu monosacharidu, disacharidu, oligosacharidu, glykozidu alebo ich derivátu s amino-deoxy-sacharidom alebo jeho derivátom za katalýzy glykozidázou, a izolácie aminosacharidu priamo zo zmesi produktov alebo po ďalšej chemickej/enzymatickej modifikácii.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález opisuje spôsob prípravy amino-deoxy-di- alebo oliigosacharidovej zlúčeniny, ktorá je buď fragmentom alebo analógom uhľovodíku.
Doterajší stav techniky
Bolo zistené, že oligosacharidická časť glykokonjugátov (obzvlášť glykolipidov a glykoproteínov) má rad dôležitých funkcií in vivo (Biology of Carbohydrates, vol. 2, Ginsburg et al., Wiley, New York, 1984; The Glycoconjugates, vol. I-V, Academic Press, New York; S. Hakomori, Ann. Rev. Biochem., vol. 50, pp. 733-64; Feizi, Náture, pp. 314, 1985; S. Hakomori, Chemistry and Physics of Lipids, vol. 42, pp. 209-233). Medzi iným bolo zistené, že:
uhľovodíkové štruktúry sú dôležité z hľadiska stability, aktivity, lokalizácie, imunogenity a degradácie glykoproteínov;
- uhľovodíky naviazané na bunkový povrch pôsobia ako receptory pre patogény, proteíny, hormóny, toxíny a počas medzibunkových interakcií;
- uhľovodíky sú dôležité z hľadiska onkogenézie, boli objavené konkrétne oligosacharidy pôsobiace ako antigénne determinanty súvisiace s rakovinou;
- k plnej biologickej aktivite (napr. receptorovej) bežne postačuje len malá sekvencia (di- alebo trisacharid) uhľovodíkovej časti glykokonjugátu.
V súčasnosti univerzity aj priemyselný výskum intenzívne pracujú na rozvoji využitia biologicky aktívnych oligosacharidov v rôznych oblastiach, ako sú napr.
- nová diagnostika a reagencie na určovanie antigénov krvných skupín;
- vysoko špecifické materiály pre afmitnú chromatografiu;
bunkové špecifické aglutinačné reagencie;
- cielené liečivá;
- monoklonálne protilátky, reagencie špecifické, napr. pre nádorové procesy;
- terapie;
- vývoj nových typov terapeutických činidiel (ako alternatív k antibiotikám) fungujúcich na základe inhibicie väzby baktérie alebo vírusu na bunkový povrch vplyvom špecifických oligosacharidov;
- stimulácia rastu rastlín a ochrana pred patogénmi.
Okrem uvedených oblastí je možné očakávať rozvoj trhu čistých chemikálií s biologicky aktívnymi uhľovodíkmi.
Aminosacharidy, v ktorých je sacharidická -OH skupina nahradená skupinou -NH2, majú v niektorých prípadoch vyššiu (alebo modifikovanú) biologickú aktivitu v porovnaní so zodpovedajúcimi hydroxyl- alebo N-acetylamino-deoxy-sacharidmi, napr. pri väzbe na selektíny dôležité pre iniciáciu zápalových procesov (väzba leukocytov na epiteliálne bunky v krvných cievach). Možnosť využívať tieto sacharidy terapeuticky, napr. pri akútnych alebo chronických zápalových stavoch (t. j. reperfúzia, zranenie a septický šok) sa skúma. Významnou súčasťou týchto aj ďalších výskumov je selektívna syntéza di- a oligosacharidov poskytujúca dostatočné množstvá produktu. Predkladaný vynález opisuje nový spôsob syntézy amino-sacharidov.
Amino-deoxy-di-, tri- alebo vyššie oligosacharidy obsahujúce jednu alebo viac amino-NH2 skupín sú predmetom záujmu v rade oblastí: potravinárskej, poľnohospodárskej, farmaceutickej aj z pohľadu diagnostického využitia uhľovodíkov, pretože modifikujú metabolizmus látok a/alebo zvyšujú biologické účinky prirodzených látok.
Uhľovodíková časť glykokonjugátov zahŕňa asi desať rôznych mnonosacharidov: D-glukózu (Glc), D-galaktózu (Gal), N-acetyl-D-glukózoamín (GlcNAc), kyselinu N-acetylneuramínovú (Neu5Ac), D-mannózu (Man), L
-fukózu (Fuc), N-acetyl-D-galaktózamín (GalNAc), xylózu (Xyl) a arabinózu (Ara) (skratky v zátvorkách vyhovujú IUPAC-IUB's skrátene terminológii monosacharidov, J. Biol. Chem. (1982), vol. 257, pp. 3347-3354, kde je možné tiež nájsť nomenklatúru používanú v tomto texte na označovanie oligosacharidických sekvencii). Počet možných štruktúr je takmer nekonečne veľký, pretože je možné meniť anomérne konfigurácie aj polohy O-glykozidických väzieb.
Súčasné postupy organickej syntézy týchto oligosacharidov extenzívne využívajú chémiu ochranných skupín s mnohými syntetickými stupňami a drahými katalyzátormi (pozri Binkley: Modern Carbohydrate Chemistry, Marcel Dekker, New York, 1988, a odkazy). Tieto komplikované reakčné schémy vedú k nízkym výťažkom a zahŕňajú nepriaznivé postupy obzvlášť pri nutnosti práce s väčším množstvom.
Selektívna chemická syntéza uhľovodíkov obsahujúcich NH2 skupiny vyžaduje pokročilé postupy chémie ochranných skupín s mnohými syntetickými stupňami (pozri Binkley: Modem Carbohydrate Chemistry, Marcel Dekker, New York, 1988, a odkazy). Efektívne postupy syntéz týchto uhľovodíkov sú preto veľmi potrebné.
Predkladaný vynález poskytuje výrazne zjednodušený spôsob syntézy derivatizovaných alebo nemodifikovaných di-, tri- a vyšších oligosacharidov obsahujúcich aspoň jednu -NHj (amino) skupinu. Uhľovodíkové aminoderiváty, ku ktorým podľa doterajších postupov viedli niekoľkostupňové syntézy, jc možné podľa predkladaného vynálezu pripraviť v jedinom reakčnom stupni a s absolútnou stereošpecifitou.
Enzýmy, ako prírodné katalyzátory majú veľa príťažlivých znakov, ako je vysoká stereo-, regio- a substrátová selektivita a vysoká katalytická aktivita v miernych reakčných podmienkach. Dnes sú preto vkladané veľké nádeje práve do využitia enzýmov na selektívne syntézy oligosacharidov vo veľkom, zahrnujúce málo reakčných stupňov a teda efektívnejšie ako tradičné postupy organickej syntézy.
Na syntézu je možné využiť hydrolázu (glykozidázu, EC 3.2) a glykozyltransferázu (EC 2.4) (glykozidázu: pozri Nisizawa et al, „The Carbohydrates, Chemistry and Biochemistry“, 2nd Ed., vol. IIA, pp. 242-290, Academic Press, New York, 1970). V syntézach sú často využívané glykozidázy na reverznú hydrolýzu (rovnovážna reakcia) alebo transglykozylácie (kinetická reakcia) (pozri napr. K. G. I. Nilsson, Carbohydr. Res. (1987), vol. 167, pp.95-103; Trends in Biochcmistry (1988), vol. 6, pp. 256-264).
EH
Reverzná hydrolýza: DOH + HOA * DOA + HjO
ROH HOA
Transglykozyiácia: DOR+EH * Fn ·> DOA + EH
.....\
DOH + EH (DOH je donor sacharidu, DOR je donor glykozidicky H_ alebo π. viazaného aglykónu (-R), HOA je akceptor sacharidu a EH je enzým).
Transferázy využívajú ako donor relatívne drahý nukleotidický cukor (napr. UDP-Gal, CMP-Sia, UDP-GalNAc, GDP-Fuc, atď.). Naproti tomu glykozidáz je dostatok a je možné ich často použiť priamo bez purifikácie.
Syntetický postup podľa predkladaného vynálezu zahrnuje aspoň jeden syntetický stupeň, ktorý využíva glykozidázu (EC 3.2) na katalyzovanie rovnovážnej alebo transglykozylačnej reakcie medzi akceptorom, čo je mono-, di-, tri- alebo vyšší oligosacharid, modifikovaný alebo nemodi fíkovaný, obsahujúci aspoň jednu amino-deoxy-skupinu (-C(NH2)- a donorom glykozylu, čo je monosacharid, disacharid, oligosacharid alebo glykozid alebo príslušný derivát. Produkt tohto stupňa je použitý- na ďalší reakčný stupeň a/alebo je izolovaný z reakčnej zmesi.
Týmto spôsobom je možné podľa predkladaného vynálezu vykonať stereošpecificky syntézu di-, tri- alebo vyšších amino-deoxy-oligosacharidov alebo ich derivátov, ktoré je možné priamo, alebo po ďalšom syntetickom stupni použiť na rôzne aplikácie, napr. na farmaceutické, lekárske a diagnostické štúdie, na terapeutické ciele alebo diagnostiku, ako prísady kozmetických prípravkov alebo v potravinárstve, na modifikáciu separačných materiálov, afinitnú chromatografiu, na modifikácie aminokyselín, peptidov, proteínov, mastných kyselín, lipidov, enzýmov alebo rekombinantných proteínov.
Nasledujúca syntetická schéma zahrnuje kapacitu glykozidáz vytvárať stereošpccifické glykozidické väzby medzi donorom glykozylu (v schéme ozn. DR, kde D predstavuje prenesenú uhľovodíkovú časť) a akceptorom glykozylu (HOA) pri syntézach podľa predkladaného vynálezu:
DR+ HO-(amino)sacharid —> D-0-(amino-)sacharid-glykozidáza
Reakciu podľa predkladaného vynálezu je možné principiálne uskutočniť dvomi spôsobmi, buď rovnovážnou syntézou (R=H), alebo transglykozylačnou reakciou (R=F, alebo organická skupina; kinetický riadená reakcia). Tieto všeobecné typy reakcií sú odborníkom v danej oblasti dobre známe a ich uskutočnenie, rovnako ako voľba donora glykozylu a glykozidázy neobmedzuje rozsah vynálezu.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález sa týka spôsobu prípravy aminodeoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, ktorá je buď fragmentom alebo analógom uhľovodíka, alebo ho obsahuje ako uhľovodíkovú časť glykokonjugátu, ktorý zahrnuje (a) reakciu najmenej jedného donora obsahuhujúceho glykozid, ktorého aglykonóm je glykozidicky viazaný atóm fluóru alebo Ο-, N-, C- alebo S-glykozidicky viazaná alifatická alebo aromatická zlúčenina, (b) najmenej jedného akceptora obsahujúceho aminodeoxy mono-, di-, alebo oligosacharid, alebo jeho glykozid a (c) glykozidázy E.C. skupiny 3.2, katalyzujúcej tvorbu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, (d) pripadne izoláciu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny.
Uvedený donor a akceptor podľa vynálezu obsahujú jeden alebo niekoľko monosacharidov, sú zvolené zo skupiny obsahujúcej D-glukózu, D-mannózu, N-acetyl-neuramínovú kyselinu, N-acetyl-D-galaktózamín, N-acetyl-D-glukózoamín L-fukózu a ich analógy.
Glykozidom podľa vynálezu je glykozid, ktorého aglykonóm je glykozidicky viazaný atóm fluóru alebo Ο-, N-, C- alebo S-glykozidicky viazaná alifatická alebo aromatická zlúčenina.
Výhodne uvedenou glykozidázou je endo- alebo exoglykozidáza, ktorá je zvolená zo skupiny obsahujúcej galaktózidázu, mannozidázu, N-acetyl-hexózoaminidázu, N-acetyl-glukózoaminidázu, N-acetyl-galaktózoaminidázu, fukozidázu a sialidázu s H. alebo „.špecifitou.
Uhľovodíková časť uvedeného donora a akceptora obsahuje jednu alebo niekoľko zo zlúčenín D-galaktóza, D-mannóza, N-acetylneuramínová kyselina, N-acetyl-D-ga laktózoamín, N-acetyl-D-glukózoamín, L-fúkózu a ich analógy.
Glykozidáza podľa vynálezu je použitá in situ, alebo po čiastočnej či úplnej izolácii z prirodzeného biologického zdroja aje imobilizovaná precipitáciou, adsorpciou, enkapsuláciou, chelatáciou alebo kovalentnou väzbou na polymémy nosič alebo jeho derivát nerozpustný v protických i aprotických rozpúšťadlách.
Polymérnym nosičom podľa vynálezu je aktivovaný polysacharid, plast alebo sklo, ktoré nesú reaktívne skupiny vybrané zo skupín kyanatan, organický sulfonát, aldehyd, diazónium, epoxy, divinylsulfonát a triazín.
Polysacharidom podľa vynálezu je celulóza alebo agaróza a plastom je polyakrylamid, polyvinylalkohol alebo polystyrén.
Ďalšou podstatou vynálezu je spôsob prípravy aminodeoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, ktorá je buď fragmentom alebo analógom uhľovodíka alebo ho obsahuje ako uhľovodíkovú časť glykokonjugátu, ktorý zahrnuje reakciu (a) najmenej jedného mono-, di- alebo oligosacharidu, glykozidu alebo ich derivátu ako donora, (b) najmenej jedného akceptora obsahujúceho aminodeoxy mono-, di-, alebo oligosacharid, alebo jeho glykozid a (c) glykozidázy E.C. skupiny 3.2, katalyzujúce tvorbu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, a (d) izoláciu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu spočíva v reakcii monosacharidu, disacharidu, oligosacharidu, alebo ich derivátu s amino-deoxy-sacharidom alebo jeho derivátom v prítomnosti glykozidázy (EC 3.2) ako katalyzátora.
Ako príklad amino-deoxy-monosacharidu, ktorý je možné použiť ako akceptor je možné uviesť 2-amino-2-deoxy-galaktopyranozid, alebo 2-amino-2-deoxy-mannopyranozid (teda v nižšie uvedenej schéme R3, R4 a ÍU sú OH a R] je jedna zo skupín napr. pentenyl-, SEt-, -SPh, -OEtBr, -OEtSiMe3, -OAlyl, -OPh, -OCH2Ph, alebo -OR, kde R je napr. CH3(CH2)n; n je celé číslo výhodne v rozmedzí O až 12; kde R je napríklad aminokyselinový zostatok, peptidický zostatok alebo príslušný derivát):
NH, NH,
Ďalším príkladom amino-deoxy-monosacharidu je 2, 3, 4, 5, alebo 6 amino-monosacharid, ako je uvedené skôr, ktorý bol derivatizovaný v jednej z polôh 2, 3, 4, 5, alebo 6. Ako príklad je možné uviesť deriváty, v ktorých jedna alebo dve hydroxylové skupiny boli modifikované na alyloxy-(CH2=CH-CH2O-), benzyloxy-(PhCH20-), benzoyloxy-(PhCOO-), chlóracetyloxy-(ClCH2COO-), p-metoxybenzyloxy-(p-MeO-PhCH2O-), trityl-(Ph3CO-), trialkylsilyloxy-, tosyl-, mezyl-, fosfát, sulfát, karboxylát, estery ako RCOO-, kde R je CH3(CH2)n (n=l až 20), alebo pivaloyloxy-, alebo deriváty v ktorých dve vicinálne hydroxylové skupiny boli modifikované na napr. benzylidénacetal, izopropylidén ketal alebo ortoester, pivaloyl-, tetrahydropyranyl, (2-metoxyetoxy)metylizopropylidén ketal, cyklohexylidén ketal, benzylidén acetal, ortoester, -0N03, derivát sulfátu, fosfátu, karboxylátu, estery napr. typu -OC(O)R, ako sú acetyl-, butanoyl-, oktanoyl-, benzoyl-, pivaloyl-, atď. Ako akceptory podľa predkladaného vynálezu je možné tiež použiť uvedené štruktúry, podobne modifikované.
Pokiaľ sú použité modifikované amino-monosacharidy, riadi sa voľba typu modifikácie požiadavkami konkrétnej situácie. Odborná literatúra obsahuje rad všeobecných informácií o ochranných skupinách/modifikáciách uhľovodíkov a ich syntéze (napr. „Modem Carbohydrate Chemistry“, Binklcy, Marcel Dekker, 1988 vrátane odkazov; Paulsen, Chem. Soc. Rev., vol. 13, pp. 15-45). Nasleduje niekoľko príkladov kategórií akceptorov, ktoré je možné použiť podľa predkladaného vynálezu (tento výčet nie je v žiadnom smere obmedzujúci).
Podobne je možné použiť modifikované amino di-, trialebo vyššie oligosacharidy ako akceptory.
NH, NH,
NH, NH,
NH, NH,
V uvedených štruktúrach (I - XI) predstavuje R3 napr. alkyl, alyl, benzyl, chlórbenzyl, benzoyl prípadne iný typ chrániaci skupiny vhodné na špecifickú syntézu. R6 môže byť aromatická skupina, ako napr. Ph- alebo alkylová skupina (napr. propyl- alebo (CH3)3C-). V štruktúrach (XII - XVII) predstavuje R3 napr. acetyl, fenoxyacetyl, metoxy acetyl alebo chlórmetoxyacetyl. R6 môže byť aromatická skupina, ako napr. Ph- alebo alkylová skupina (napr. propyl- alebo (CH3)3C-). Pokiaľ je R2 napr. H, potom R1 je jedna z uvedených skupín a naopak, pokiaľ R1 predstavuje H. Podobne môže byť v uvedených príkladoch modifikovaná poloha 4 namiesto polôh 3 alebo 6 a tiež môže byť modifikovaná amino-deoxy skupinou poloha iná ako 2.
Ako ilustračný príklad (vynález v žiadnom smere neobmedzujúci) je možné uviesť reakciu, ktorá vychádza z 2-amino-2-deoxy-H-D-galaktopyranozidu ako akceptora, enzýmu H-galaktózidázy a donora glykozylu rafinózy, metyl H-D-galaktopyranozidu, GaldF (F=fluór) (alebo p-nitrofenyl) H-D-galaktopyranozidu (transglykozylačná reakcia) za vzniku H-glykozidicky viazaného 2-amino-2-deoxy-digalaktozylového derivátu typu
t. j. 2-NH2-2-deoxy-derivátu GalHl-3-GalH-R. Iný príklad, keď je ako akceptor použitý I, ako enzým H-galaktózoaminidáza a ako donor glykozylu GalNACH-OPh, GalNACHF alebo GalNACH-OPhNO2-p, vedie ku vzniku GalNAcHl-3GalH-R.
Produkty je možné použiť na ďalšie syntézy, napr. chemické syntézy vyšších oligosacharidov, odborná literatúra obsahuje rad informácií o použití čiastočne chránených uhľovodíkov (pozri Binkley a Paulsen, uvedené).
Pokiaľ je použitá „.galaktózidáza namiesto ,-galaktozidázy a pokiaľ je použitá laktóza, alebo napr. p-nitrofenyl-„-D-galaktopyranozid ako donor glykozylu, a ako akceptor 2-amino-2-deoxy-glukóza alebo jej derivát (pozri napr. XII až XVII), vedie reakcia k derivátom s „.glykozidickou väzbou Gal-GlcNHj alebo Gal-GlcNH2-R. Príklady čiastočne chránených Gal-GlcNH2 alebo Gal-GlcNH2-R derivátov, ktoré je možné použiť napr. na syntézu trisacharidových štruktúr Lewis-x alebo Lewis-a (alebo na syntézu ďaľších disacharidických derivátov) sú uvedené ďalej:
oh wt, hu λμπιπ
Navyše, pokiaľ je n-L-fukozidáza použitá s napríklad nitrofcnyl-H-L-fOukopyranozidom alebo FuCH-F ako donorom glykozylu, je možné predkladanými postupmi syntetizovať zodpovedajúce deriváty, napr. H-viazaných Fuc-GalNH2-R a H-viazaných Fuc-Glc-NH2-R, analogicky je možné pripraviť s N-acetyl-„.glukózoamínidázou alebo N-acetyl-,. -galaktózo-aminidázou „.viazané deriváty GlcNAc-Gal
-NH2 a G1cNAc-G1c-NH2 alebo GalAc-Gal-NH2 respektíve GalNAc-Glc-NH2, vychádzajúc z „.glykozidov GlcNAc, respektíve GalNAc, ako donorov glykozylu. Podobne je možné využiť H-sialidázu na katalýzu syntézy, napr. sialovanej 2-amino-2-deoxy-galaktózy (NeuSAcn-GalNHj) alebo derivátov 2-amino-2-deoxy-galaktózoamínu (derivátov Neu5ACH-GalNH2) vychádzajúc z nitrofenyl glykozidu kyseliny N-acetylneuramínovej, prípadne chráneného derivátu 2-amino-2-deoxy-galaktózy ako akceptora.
Pokiaľ je použitá endoglykozidáza, je možné postupmi predkladaného vynálezu pripraviť dlhšie oligosacharidické deriváty. Potom je donorom di-, tri-, alebo vyšší oligosacharid alebo glykozid, napr. nitrofenyl glykozid ktoréhokoľvek z uvedených sacharidov. Podobne ktorákoľvek R skupina akceptora môže byť sacharidickou jednotkou.
Uvedené reakcie je možné tiež uskutočňovať ako rovnovážne reakcie s monosacharidmi ako donormi glykozylu.
Benzylovú alebo alylovú skupinu (alebo ďalšie skupiny spomínané v súvislosti s uvedenými vzorcami) v uvedených produktoch je možné ľahko chemicky vymeniť za široké spektrum skupín a dosiahnuť selektívnu syntézu rôznych derivátov amino-deoxy-disacharidov (napr. 0fosfátov, O-sulfátov, atď.) alebo vyšších amino-deoxy-oligosacharidov v rámci predkladaného vynálezu.
Substráty reakcií sú volené s ohľadom na oligosacharid, ktorý má byť pripravený, sú často komerčne dostupné alebo syntetizovateľné organickými alebo enzymatickými syntetickými postupmi, a preto nie sú obmedzujúcim prvkom predkladaného vynálezu. Donorové substráty používané v predkladanom vynáleze zodpovedajú substrátom, ktoré boli použité v minulých transglykozylačných reakciách (pozri napr. články K. G. I. Nilsson, Carbohydr. Res. vol. 167 a Trends in Biochemistry vol. 6, ako bolo uvedené).
Ďalšími príkladmi akceptorov, ktoré je možné použiť v predkladanom vynáleze sú amino-deoxy di- alebo oligosacharidy (alebo ich glykozidy), ktorých uhľovodíková časť obsahuje jeden alebo viac z nasledujúcich monosacharidov: D-glukóza, D-galaktóza, D-mannóza, N-acetyl-neuramínová kyselina, N-acetyl-D-galaktózoamín, N-acetyl-D-glukózoamín a L-fukóza, alebo príslušné analógy. Ak je akceptorom glykozid, môže byť aglykónom glykozidicky viazaná (v H- alebo „. konfigurácii) alifatická alebo aromatická zlúčenina (napr. metyl, etyl, 2-brómetyl, (CH2)nCOOMe n>l, alyl alebo iné polymerizovateľné zlúčeniny, benzyl, pentenyl, trimetylsilyletyl, aminokyseliny a ich deriváty, peptidy a ich deriváty, nitrofenyl, atď.)
Iným typom veľmi zaujímavých aglykónov sú aminokyseliny (serín, treonín, hydroxyprolín, hydroxylyzin, asparagín, atď.), peptidy, lipidy a deriváty a analógy látok týchto troch uvedených skupín. Glykozidy aminokyselín a peptidov je možné chrániť na amino- alebo karboxylových skupinách bežnými ochrannými skupinami používanými v syntéze peptidov (FMOC, CBZ, BOC, atď.). Vychádzajúc z týchto aglykónových fragmentov alebo analógov je možné predkladanými syntetickými postupmi syntetizovať glykokonjugáty; pojmy ako „aglykóny“, „fragmenty“ a „analógy“ sú v tejto oblasti techniky dobre známe. Aglykónom môže byť amínová, nitrilová alebo amidická skupina alebo fluorogénna zlúčenina, aglykón môže obsahovať fosfátovú, sulfátovú alebo karboxylovú skupinu alebo ich derivát. Iným dôležitým typom amino-deoxy sacharidických derivátov sú zlúčeniny, kde je kyslíkový atóm cukrového kruhu (napr. kyslík na C-5 hexóz) nahradený sírou, dusíkom, atď. Príkladom takéhoto derivátu je moranolín, analóg glukózy, kde kyslík na C-5 je nahradený dusíkom. Podľa predkladaného vynálezu je možné syntetizovať oligosacharidické a nalógy, ktoré sú účinnými inhibítormi enzýmov alebo proteínov viažucich uhľovodíky.
Donorové substráty používané v predkladanom vynáleze zodpovedajú substrátom, ktoré boli použité v minulých cnzymatických transglykozylačných reakciách (pozri uvedené odkazy), a preto neobmedzujú rozsah vynálezu.
Príkladom donorov vhodných pre predkladaný vynález sú monosacharidické glykozidy a di- alebo oligosacharidy (alebo ich glykozidy), ktorých uhľovodíková časť obsahuje jeden alebo viac z nasledujúcich monosacharidov. D-galaktóza, D-glukóza, D-mannóza, N-acetyl-neuramínová kyselina, N-acetyl-D-galaktózoamín, N-acetyl-D-glukózoamin a L-fukóza. Príkladom vhodných donorov glykozylu sú nitrofcnyl H- alebo „.glykozidy uvedených monosacharidov, laktóza, dimannóza a rafinóza. Príkladom vhodných donorov pre endoglykozidázy sú nitrofenylové deriváty biologicky aktívnych uhľovodíkových sekvencií (napr. Galnl3GlcNAc„.OPhNO2-p), biologicky aktívne oligosacharidy alebo štruktúry typu Glc(n 1 -3Glc)nn 1 -3Glc (n> 1).
Koncentrácia donora glykozylu v reakčnej zmesi je volená s ohľadom na oligosacharid, ktorý má byť pripravený a tiež s ohľadom na vlastnosti enzýmu a preto nijak neobmedzuje rozsah vynálezu. V niektorých prípadoch je výhodné pridávať donor po malých kvantách, čo znižuje riziko, že donor by mohol fungovať tiež ako akceptor (pokiaľ ovšem tento stav nie je naopak žiaduci).
Výber enzýmov sa primárne riadi typom oligosacharidu, ktorý má byť pripravený. Enzýmy je možné používať in situ alebo po čiastočnej alebo plnej purifikácii z prírodných zdrojov. Enzýmy je možné použiť rozpustené alebo imobilizované na pevnom nosiči, napr. adsorpciou, enkapsuláciou, chelatáciou, precipitáciou alebo kovalentnou väzbou.
Príklady H- a „-glykozidáz vhodných na predkladané ciele sú D-mannozidázy, D-galaktózidázy, L-fukozidázy, N-acetyl-D-galaktózoaminidázy, sialidázy, hexózoaminidázy a ďalšie glykozidázy skupiny EC 3.2 (podľa Enzýmovej nomenklatúry, Academic Press, 1984). V postupoch predkladaného vynálezu je možné využiť endo- i exo-glykozidázy.
Stupeň čistoty použitého enzýmu nie jc kritický. Enzýmy je možné používať in situ alebo po čiastočnej alebo úplnej purifikácii z prírodných zdrojov. Tiež je možné použiť surový extrakt z organizmu alebo tkaniva. Enzýmy je možné tiež získať precipitáciou, napr. síranom amónnym. Enzýmy môžu byť prítomné v kryštalickej forme alebo uzatvorené v micelách. Biochemická literatúra obsahuje rad podrobných informácií týkajúcich sa purifikácie a izolácie glykozidáz. Enzýmy je možné pripraviť rekombinantnými technikami. Ak je to žiaduce, je možné výmenou jednej alebo niekoľkých aminokyselín z pôvodnej sekvencie optimalizovať vlastnosti enzýmu, napr. tepelnú stabilitu, katalytickú účinnosť a/alebo regioselektivitu.
Enzým je možné použiť rozpustený alebo imobilizovaný, napr. adsorpciou, enkapsuláciou, chelatáciou, precipitáciou alebo kovalentnou väzbou na pevnom nosiči, ako je napr. polymérna zlúčenina alebo jej derivát, nerozpustný v protických alebo aprotických rozpúšťadlách (Methods in Enzymology, vol. 44, Academic Press, 1976). Zvolená forma nie je z pohľadu predkladaných postupov kritická. Použitie rozpustnej formy enzýmu dáva možnosť jeho predbežnej chemickej modifikácie smerujúcej napr. ku zvýšeniu tepelnej stability alebo stability v organických rozpúšťadlách. Enzýmy imobilizované na nerozpustnom polyméri, ako je napr. agaróza, celulóza, hydroxyetylakrylát, sklo, silikagél, polyakrylamid, plasty na bázi polyakrylátov, atď., je možné ľahko oddeliť zo zmesi produktov a recyklovať. Ďalším prínosom imobilizovaných enzýmov je často zvýšená tepelná odolnosť a stabilita v organických rozpúšťadlách.
Produkty syntéz je možné použiť na ďalšie enzymatické syntézy s glykozidázami alebo glykozyltransferázami. Napríklad d-sialyltransferázu je možné použiť na katalýzu prípravy sialovaných derivátov Gal-GlcNAc a n-galaktózyltransferázu je možné použiť pri príprave oligosacharidických derivátov typu Gal-GlcNAc-Gal-R, ktoré môžu byť pripadne sialované a/alebo použité do ďalších chemických syntetických stupňov, a pod.
Pokiaľ je ako akccptor použitý modifikovaný 2-amino galaktózid alebo glukozid, riadi sa voľba aglykónu požiadavkami aplikácie produktu. Obzvlášť zaujímavými aglykónmi sú aminokyseliny (serín, treonín, hydroxyprolín, hydroxylyzín, asparagin, atď.), peptidy, lipidy a deriváty a analógy látok týchto troch uvedených skupín. Glykozidy aminokyselín a peptidov je možné chrániť na amino- alebo karboxylových skupinách bežnými ochrannými skupinami používanými v syntéze peptidov (FMOC, CBZ, BOC, atď.). Produkty reakcií vychádzajúcich z modifikovaných alkylglykozidov (napr. metyl-, oktyl-, dodecylglykozidy) ako akceptorov je možné použiť ako inhibítory na afinitne chromatografie a v aglutinačných testoch, pri terapiách vychádzajúcich z inhibície alebo pre cielené liečivá, ako štruktúrne jednotky na ďalšie enzymatické syntézy. Nitrofenylové glykozidy je možné redukovať na aminofenylglykozidy. Použiteľné sú aj glykozidy nesúce polymerovateľný aglykón, ako je napr. 2-hydroxyetylmetakrylát. Ako príklad N-glykozidicky viazaného aglykónu je možné uviesť NHCO(CH2)6NH2. Iným vhodným typom aglykónu, napr. pri syntéze glykolipidov (a ich analógov) na konverziu na ceramidy (a ich analógy), sú napr. aglykóny typu uvedeného v Magnusson et al, J. Org. Chem., 1990. V predkladaných postupoch je možné ďalej použiť tioglykozidy (napr. SEt alebo SPh) pri príprave produktov určených na ďalšie chemické syntézy. Voľbou ochrannej skupiny/derivátu, aglykónu, polohy derivatizovanej hydroxylovej skupiny je možné ovplyvniť výťažok a regioselektivitu predkladaných reakcií. Napríklad použitie jedného alebo niekoľkých hydrofóbnych aglykónov (napr. ρ-metoxy-benzyl-, benzyl- v porovnaní napr. s allylom) môže viesť k vyšším výťažkom pri rovnakej koncentrácii akceptora.
Voľba enzýmu sa riadi požadovanými vlastnosťami oligosacharidu, ktorý má byť pripravený. Enzým môže byť prítomný in situ (obzvlášť v prípade niektorých glykozidáz) alebo po čiastočnej či úplnej purifikácii z prírodného zdroja. Enzýmy je možné použiť rozpustené alebo imobilizované na pevnom nosiči, napr. adsorpciou, enkapsuláciou, chelatáciou, precipitáciou alebo kovalentnou väzbou. Súčasné použitie glykozidázy a glykozyltransferázy v rozpustenej forme alebo imobilizovanej na nosiči (prípadne v spoločne imobilizovanej forme) môže byť v podmienkach predkladaných postupov výhodné, pretože dochádza k uľahčeniu konverzie oligosacharidického intermediátu na produkt. Z tohto pohľadu prináša predkladaný vynález rad výhod oproti starším postupom: purifikácia medziproduktov nie je nevyhnutná, dochádza k minimálnej sekundárnej hydrolýze (vyššie výťažky) a trisacharidy aj vyššie oligosacharidy je možné pripravovať v minimálnom počte stupňov (niekedy v jednom). Uvedené rysy syntéz sú umožnené vysokou akceptorovou špecifitou väčšiny glykozyltransferáz: transferáza nereaguje s nevhodným izomérom.
Syntetické postupy predkladaného vynálezu je možné uskutočňovať v rozmanitých reakčných podmienkach z hľadiska pH, typu pufra, teploty a koncentrácie reakčných zložiek. Ako rozpúšťadlá je možné použiť napr. N,N-dimetylformamid, acetonitril, dimetylsulfoxid, dioxán, py ridín, metanol, etanol, etylénglykol, atď., v rôznych koncentráciách s vodou (do 99 % hmôt.). Navyše je možné reakciu uskutočňovať v dvojfázovej sústave: voda-organické rozpúšťadlo. Použitie akceptorových monosacharidov modifikovaných organickými skupinami uľahčuje izoláciu produktu v organickej fáze. Reakčné podmienky nie sú pre predkladané postupy kritické, ale primáme sa riadia vlastnosťami reakčných zložiek a praktickosťou postupu. Napríklad je vhodné uskutočňovať enzymatické reakcie pri laboratórnej teplote, v prípade vodného reakčného prostredia pri pH v rozmedzí 4 až 11. Rozpustnosť aminosacharidov vo vode rastie/klesá s rastom/poklesom pH a v niektorých prípadoch sa výhodne používa pH nižšie ako 8 a vyššie ako 4 na zvýšenie rozpustnosti akceptorového aminosacharidu.
Organické rozpúšťadlá niekedy znižujú vedľajšie hydrolytické reakcie. Z rovnakých dôvodov sa používajú dvojfázové systémy. Príkladom vhodných rozpúšťadiel sú tetrahydrofurán, acetonitril, DMF. Výber rozpúšťadiel a koncentrácia organického rozpúšťadla je v oblasti techniky dobre známa a neobmedzuje rozsah vynálezu. Použitie vysokých koncentrácií (do takmer 100 % hmôt, celkového objemu rozpúšťadla) môže byť obzvlášť výhodné v prípade použitia akceptorových derivátov s hydrofóbnymi skupinami, ktoré sú dobre rozpustné v organických rozpúšťadlách, t. j. akceptory modifikované esterovými skupinami (napr. acetyl-, benzoyl-, butanoyl-, pivaloyl-, oktanoyl-, atď.) a/alebo napríklad skupinami alyl-, benzyl-, trityl-, a pod. V takýchto prípadoch je možné docieliť relatívne vysokú koncentráciu akceptora v organickej fáze a tak znížiť vedľajšie hydrolytické reakcie vzhľadom na nízky obsah vody. Spôsob syntézy podľa predkladaného vynálezu umožňuje pracovať v organických rozpúšťadlách, napr. syntézy amino-deoxy trisacharidových derivátov a vyšších oligosacharidických derivátov katalyzovanej exoglykozidázami s využitím hydrofóbne chránených derivátov aminodeoxy di-, tri- alebo vyšších oligosacharidov, ktoré majú jednu alebo len niekoľko voľných hydroxylových skupín slúžiacich ako akceptory.
Zvýšeniu rozpustnosti/dostupnosti v organickom prostredí a uľahčeniu reakcie s donorom je možné pomôcť použitím napr. fenylborátu, ktorý vytvára komplex s vicinálnymi hydroxylovými skupinami sacharidov; vzniknutý komplex má vďaka prítomným fenylom vyššiu rozpustnosť v organických rozpúšťadlách.
Zmeny reakčnej teploty tiež ovplyvňujú výťažok produktu a stabilitu enzýmu a neobmedzujú rozsah vynálezu. Reakcie sa bežne uskutočňujú v rozmedzí teplôt 4 až 55 C, nižšie teploty a teploty pod 0 C sú tiež možné a tieto teploty uľahčuje práve použitie organických rozpúšťadiel. Vyššie teploty je možné použiť v prípade tepelne stabilných glykozidáz a substrátov, tiež v prípade enzýmov stabilizovaných proti tepelnej degradácii napr. vysokou koncentráciou substrátu (Johansson et al, Biotcchnol. Lett. (1986), vol. 8, pp. 421-424). Výhodou vyšších teplôt je napr. možnosť využitia vysokej koncentrácie substrátov, čo znižuje aktivitu vody a zvyšuje výťažok produktu. Ďalšou výhodou vyšších reakčných teplôt je zvýšenie aktivity enzýmu, čo vedie ku kratším reakčným časom. Dodatočnou výhodou je možnosť využitia glykozidov, (napr. metyl-, alebo etylglykozidov), ktoré podliehajú pri laboratórnej teplote pomalej hydrolýze, ako vhodných donorov glykozylu pri zvýšenej teplote (50 až 60 °C). Horná teplotná hranica je daná tepelnou stabilitou enzýmu v reakčnom prostredí. Pre niektoré transglykozylačné reakcie však vedie k vyšším výťažkom glykozidických produktov nižšia teplota.
Koncentrácia akceptora je ďalším parametrom, ktorý má vplyv na výťažok reakcií predkladaného vynálezu. Pre
SK 283138 Β6 rovnovážne aj transglykozylačné reakcie sú výhodné vysoké koncentrácie, pretože obmedzujú hydrolytické vedľajšie reakcie. Konkrétne koncentrácie závisia od rozpustnosti akceptora, používajú sa hodnoty v rozmedzí 0,05 až 7 mol x x ľ1. Vysoké koncentrácie donorov sú používané predovšetkým v rovnovážnych reakciách. Všeobecne je možné vysoké koncentrácie dosiahnuť postupom, ktorý zahŕňa zahrievanie reakčnej zmesi po niekoľko minút až na taeplotu varu, ochladenie zmesi na plánovanú reakčnú teplotu (obvykle 4 až 75 C podľa teplotného optima z hľadiska výťažku a tepelnej stability enzýmu/substrátu)) a pridanie enzýmu. Na zvýšenie rozpustnosti substrátu s hydrofóbnymi skupinami je možné pridať ďalšie rozpúšťadlá.
Postup reakcie je možné monitorovať pomocou TLC, HPLC alebo spektrofotometrickým meraním uvoľneného aglykónu (napr. p-nitrofenolu, 400 nm). Postrekom TLC doštičiek ninhydrínom je možné detegovať prítomnosť NH2-skupín. Po dosiahnutí požadovaného výťažku produktu je možné reakciu ukončiť denaturáciou enzýmu zmenou pH, zvýšením teploty a/alebo pridaním organického rozpúšťadla (etanolu). Obvykle postačí zahriatie reakčnej zmesi na 60 až 80 °C počas 3 až 5 min. (prípadne následné pridanie etanolu na koncentráciu 80 % hmôt.).
Na izoláciu produktu existujú rôzne postupy. Vhodná je precipitácia z vodnej fázy alebo organického rozpúšťadla (etanolu, metanolu, etylacetátu), najmä v prípadoch, kde bola jedna z reakčných zložiek použitá v nadbytku, alebo ak majú donor a akceptor v reakčnom prostredí odlišnú rozpustnosť. Po rovnovážne riadenej reakcii alebo po transglykozylácii a po napr. terminačnom zahriatí alebo zriedení reakčnej zmesi, ako bolo uvedené, je niekedy vhodné pridať ďalšiu glykozidázu s odlišnou regioselektivitou, než akú mala glykozidáza použitá na syntézu. Tento postup vedie k viac či menej selektívnej hydrolýze nežiaducich izomérov (napríklad 1-6 glykozidických väzieb), čo uľahčuje izoláciu žiadaného produktu.
Precipitácia, extrakcia z vodnej fázy organickým rozpúšťadlom a hydrolýza vedľajších produktov sú doplňujúcimi postupmi chromatografie (ionexová, gélová filtrácia, HPLC na napr. amino-silikagéli, silikagéli s reverznou fázou alebo na nových dionexových kolónach).
Nasleduje niekoľko príkladov ilustrujúcich (ale v žiadnom smere neobmedzujúcich) predkladaný vynález.
Príklady zlúčenín používaných v predkladanom vynáleze ako donory sacharidov (DR, kde D je prenesená glykozylová skupina) sú D-glukóza, D-mannóza, L-fukóza, D-galaktóza, xylóza, N-acetyl-D-glukózamín, N-acetyl-D-galaktózamín, kyselina N-acetyl-neuramínová, glykozidy týchto látok, disacharidy alebo oligosacharidy tvorené jedným alebo niekoľkými uvedenými monosacharidmi (napr. laktóza, rafinóza, chitobióza) a deriváty uvedených látok, napr. obsahujúcich jednu alebo niekoľko modifikovaných hydroxylových skupín na kruhu.
Reakciu podľa predkladaného vynálezu je možné zhrnúť rovnicou:
DR+HO-(amino-)sacharid —> D-O-(amin0-)sacharid glykozidáza, kde D je glykozidicky viazané na sacharidovú jednotku amino-sacharidu. Ako enzým je vhodná endo- alebo exoglykozidáza (skupina EC 3.2) a reakcia je uskutočňovaná ako transglykozylačná reakcia. Voliť je však možné aj rovnovážnu reakciu. Neobmedzujúcimi príkladmi vhodných exoglykozidáz sú H-galaktózidáza, „-galaktózidáza, π-Ν-acetyl-glukozaminidáza, „-N-acetyl-galaktózaminidáza, H-L-fukozidáza, H-sialidáza, h- alebo „-xylozidáza, H-mannozidáza alebo „-mannozidáza.
Voľba reakčných podmienok sa riadi typom reakcie; ďalej sú uvedené niektoré (neobmedzujúce) príklady: koncentrácia reakčných zložiek sa obvykle pohybuje v rozmedzí 0,05 až viac ako 1 mol x ľ1, podľa rozpustnosti zložiek, teplota je obvykle v rozmedzí 0 až 80 °C a reakčné prostredie tvorí obvykle pufrovaná voda s pH 4 až 9; pH a teplota sú obvykle volené podľa vlastností enzýmu, prípadne je možné do reakčnej zmesi pridať organické rozpúšťadlo (1 až 99 % hmôt, tetrahydrofuránu alebo acetonitrilu). Reakcia býva obvykle skončená v okamihu maximálneho výťažku amino-sacharidového produktu, produkt je izolovaný pomocou napr. jedného alebo niekoľkých chromatografických postupov (adsorpčná chromatografia na ionexovom nosiči, Sephadex alebo silikagél), extrakcia, precipitácia, kryštalizácia a/alebo filtračnými postupmi.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Ako neobmedzujúci príklad predkladaného vynálezu je možné uviesť výrobu tioetyl Ä-D-galaktopyranozyl-(6-bcnzyl-2-amino-2-deoxy)-I-D-glukopyranozidu reakciou nitrofenyl „-D-galaktopyranozidu s tioetyl (6-benzyl-2-amino-2-deoxy)-n-D-glukopyranozidom v napr. pufri octanu sodného, pri pH 5, katalyzovanú ^-galaktózidázou.
Produkt reakcie je možné použiť priamo napr. na biologické/medicínske aplikácie alebo ako syntetický medziprodukt na ďalšie syntézy vyšších oligosacharidov alebo iných derivátov.
Syntéza derivátov GalÄl-3GlcNH2, respektíve Gal„l-4GlcNH2 (zložky substancií Lewisových krvných skupín ako sú Lewis-a a Lewis-x sialované štruktúry): vychádza napríklad z derivatizovaného glykozidu glukózamínu, ako sú napríklad zlúčeniny vzorcov (XIII) alebo (XIV), ako akceptora, ktorý je rozpustený (1/1 obj/obj) v prostredí tetrahydrofurán/pufor octan sodný (pH 5,5; 0,05 mol x ľ1), ako donor je použitý Galn-OPhNÓ2O za katalýzy „-galaktózidázou. Produktom uvedenej syntézy sú zlúčeniny nižšie uvedených typov:
CH OCH.PP
OH NH,
OH octom'
Tieto štruktúry je možné použiť priamo na rôzne aplikácie alebo ako medziprodukty na ďalšie chemické alebo enzymatické syntézy. Galaktózylový zostatok je možné napr. modifikovať chemicky alebo enzymaticky (lipáza alebo galaktózoxidáza, nasledované chemickou modifikáciou) za vzniku glukózaminylového zostatku s jednou voľnou hydroxylovou skupinou, ktorú je možné ďalej modifikovať napr. fukozylovou skupinou.
Podobne s použitím akceptora nižšie uvedeného typu je možné pripraviť zodpovedajúci „-viazaný derivát 3-O-chráneného Gal-Glc-NH2.
H HO*—pl NH,
Po zavedení ochrannej skupiny na voľný hydroxyl a aminoskupinu produktu a deprotekcie polohy 3-0- je možné do molekuly zaviesť napríklad H-viazanú fukozylovú skupinu, čo vedie k modifikovanej Lewis-x štruktúre. Tú je možné ďalej napr. silalovať za vzniku napr. NeuAcd2-3Gal„l-4(Fucdl-3)GlcNR2-R. Analogicky je možné pripraviť regioizoméry ako je napr. Gal„l-3(Fucdl-4)GlcNR2R a analógy/deriváty štruktúr Lewis-a a Lewis-x a sialovaných Lewisových štruktúr.
Príklad 1
Príkladom aplikácie postupu predkladaného vynálezu (v žiadnom smere ho neobmedzujúcom) je syntéza Gal„l-3(6-O-Bn)GlcNH2„SEt, ktorá vychádza z tioetyl (6-0-benzyl-2-amino-2-deoxy-„-D-glukopyranozidu (skrátene (6-O-Bn)GlcN2„HSEt) ako akceptora a galaktózy alebo laktózy alebo galaktózidu, napr. nitrofenyl H-D-galaktopyranozidu ako donora glykozylu, katalyzovaná „-galaktozidázou z býčích semenníkov.
Predkladanú reakciu je možné uskutočňovať aj s „-galaktózidázou pochádzajúcou z iných zdrojov. Reakcia bola uskutočnená pri laboratórnej teplote s počiatočnou koncentráciou substrátu typicky v rozmedzí 0,06 až 0,3 mol x ľ1. Donor bol použitý v nadbytku nad akceptorom. Enzým bol použitý vo forme surového precipitátu so síranom amónnym, reakcia sa uskutočnila pri pH 5 v 0,05 mol x ľ1 pufra octanu sodného. Reakcia bola ukončená 5 minútovým zahriatím vo vriacom vodnom kúpeli. Produkt bol izolovaný napr. adjustáciou pH na 10,5 (znižuje prítomnosť nábojov na aminoskupinách), extrakciou vodnej fázy etylacetátom, následnou extrakciou butanolom, butanolová fáza bola odparená, zostatok rozpustený vo vode a nanesený na ionex (v tomto prípade rýchlo-tečúci ionex Pharmacia nesúci sulfopropylové skupiny). Frakcie obsahujúce produkt boli odparené, produkt vysušený a analyzovaný NMR.
Analogicky bol pripravený iný 6-0-substituovaný produkt ako 6-O-benzyl- a/alebo iný typ 1-substituovaného derivátu ako Ι-tiocthyl-, použitím iného počiatočného 6-0a/alebo 1-substituovaného akceptora ako (6-O-Bn)GlcNH2„SEt, ako je uvedené v opise.
Ďalším príkladom je syntéza Fucdl-4(6-O-Bn)GlcNH2„SEt vychádzajúca z tioetyl (6-O-benzyl-2-amino-2-deoxy)-„-D-glukopyranozidu (skrátene (6-O-Bn)GlcNH2jtSEt) ako akceptora a fukózy alebo fukopyranozidu, napr. nitrofenyl H-L-fukopyranozidu ako donora glykozylu za katalýzy H-fukozidázou z býčích obličiek.
Uvedená reakcia bola uskutočnená pri 0,1 mol x ľ1 koncentrácii substrátov a produkt izolovaný na ionexe (napr. nosič nesúci sulfopropylové skupiny) a extrakciou vodnej fázy vhodným organickým rozpúšťadlom, napr. butanolom alebo etylacetátom.
Dve látky pripravené uvedenými postupmi sú napríklad vhodnými inhibítormi/modifikátormi selektínuhľovodíkových interakcií in vivo, ako napr. pri rôznych zápalových pochodoch, akým je septický šok, reumatizmus a astma, ale pôsobia aj ako inhibítory/modifikátory regulácie in vivo syntézy IgE (napr. inhibície, modifikácie interakcií FceRII-CR, pozri napr. prehľadný článok v Náture (1993), vol. 366, pp. 41-48, a uvedené odkazy).
Jednou z výhod predkladaného postupu je priama syntéza amino-disacharidového alebo amino-oligosacharidového produktu a derivátov, a to, že nie je nutné robiť po reakcii katalyzovanej glykozidázou modifikáciu aminoskupiny. Ďalšou výhodou je, že čiastočne modifikovaný aminocukrový derivát je možné pripraviť stereošpecificky a v špecifických reakčných podmienkach. Produkty je možné použiť priamo na rôzne aplikácie, alebo ako syntetické intermediáty na ďalšie syntézy vyšších oligosacharidov alebo iných derivátov.
Príklad 2
Syntéza GalÄl-4(6-OBn)GlcNH2jISEt. Syntéza tejto zlúčeniny bola uskutočnená, ako je uvedené, ale za katalýzy enzýmom pochádzajúcim z iného zdroja, ktorý katalyzuje tvorbu „1-4 väzieb, napr. enzým pochádzajúci z kmeňa kvasiniek napr. Bullera singularis. V tomto prípade bola reakcia uskutočnená ako fermentácia vychádzajúca napríklad z laktózy ako donora glykozylu s intaktnými bunkami.
Analogicky bol pripravený iný 6-O-substituovaný produkt než 6-O-benzyl- a/alebo iný typ 1 -substituovaného derivátu ako 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 6-0a/alebo 1-substituovaného akceptora ako (6-O-Bn)GlcNH2„SEt, ako je uvedené v opise.
Príklad 3
Syntéza Gal„l-3GlcNH2nSEt a Gal„l-3GalNH2jISEt. Reakcia bola uskutočnená v podmienkach uvedených v príklade 1, s rovnakým enzýmom, len namiesto GlcNH2nSEt bol v druhom prípade ako akceptor použitý GalNH2lISEt. V tomto prípade na izoláciu neboli vhodné extrakčné postupy a po ionexovej chromatografii nasledovala napr. precipitácia alebo ďalšie chromatografické delenie.
Príklad 4
Syntéza Gal„l-4G!cNH2„SEt. Pri tejto reakcii bol použitý rovnaký akceptor a izolačný postup ako v príklade 3. Reakcia bola katalyzovaná enzýmom vedúcim k tvorbe 1-4 väzieb (ako v príklade 2). Pokiaľ je použitý rovnaký mikroorganizmus ako v príklade 2, je možné reakciu uskutočniť v rovnakých podmienkach fermentácie ako v príklade 2.
Príklad 5
Syntéza GalJ-3 (6-OAll)GlcNH2„SEt. Táto zlúčenina a iné 6-substituované deriváty a iné 1-substituované deriváty je možné pripraviť postupom uvedeným v príklade 1, len namiesto 6-O-benzyl-aminosacharidu je nutné použiť ako akceptor 6-O-alyl- alebo iný príslušne substituovaný derivát a/alebo iný typ 1-substituovaného derivátu, ako je uvedené v opise.
Príklad 6
Syntéza Gal„l-4(6-OAll)GlcNH2„SEt. Táto zlúčenina a iné 6-substituované deriváty a iné 1-substituované deriváty je možné pripraviť postupom uvedeným v príklade 2, za katalýzy „-galaktózidázou vedúcej k 1-4 väzbám, ale namiesto 6-O-benzyl-aminosacharidu je nutné použiť ako akceptor 6-O-alyl- alebo iný príslušne substituovaný derivát a/alebo iný typ 1-substituovaného derivátu, ako je uvedené v opise.
Príklad 7
Syntéza Gal,. 1-3 (4-OBn)GlcNH2nSEt. Syntéza tejto zlúčeniny aj inak 4-substituovaných derivátov a iných 1-substituovaných derivátov bola uskutočnená, ako je uvedené v príklade 1, ale s enzýmom katalyzujúcim tvorbu 1-3 väzieb, namiesto 6-O-benzyl-aminosacharidu bol ako akceptor použitý 4-O-benzyl- alebo iný príslušný 4-substituovaný derivát a/alebo 1-substituovaný derivát, ako je uvedené v opise.
Príklad 8
Syntéza Gal, 1-4 (3-OBn)GlcNH2,SEt. Syntéza tejto zlúčeniny aj inak 3-substituovaných derivátov bola uskutočnená tak, ako je uvedené v príklade 2, za katalýzy ,-galaktózidázou vedúcej ku vzniku 1 -4 väzieb, namiesto 6-O-benzyl-aminosacharidu bol ako akceptor použitý 3-0-benzyl- alebo iný príslušný 3-substituovaný derivát.
Príklad 9
Syntéza FucHl-4(6-OBn)GlcNH2xSEt. Syntéza bola uskutočnená pri laboratórnej teplote s počiatočnou koncentráciou substrátov typicky v rozmedzí 0,06 až 0,1 mol x ľ1. Enzým bol použitý vo forme surového precipitátu so síranom amónnym, reakcia bola uskutočnená pri pH 5 v 0,05 mol x ľ1 pufra octanu sodného. Reakcia bola ukončená 5 minútovým zahriatím vo vriacom vodnom kúpeli. Produkt bol izolovaný napr. adjustáciou pH na 10,5 (znižuje prítomnosť nábojov na aminoskupinách), extrakciou vodnej fázy etylacetátom, následnou extrakciou butanolom, butanolová fáza bola odparená, zostatok rozpustený vo vode a nanesený na ionex (v tomto prípadč rýchlo-tečúci ionex Pharmacia nesúci sulfopropylové skupiny). Frakcie obsahujúce produkt boli odparené, produkt vysušený a analyzovaný NMR.
Analogicky bol pripravený iný 6-O-substítuovaný produkt ako 6-O-benzyl- a/alebo iný typ 1 -substituovaného derivátu ako 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 6-Oa/alebo 1-substituovaného akceptora ako (3-O-Bn)GlcNH2jISEt, ako je uvedené v opise.
Príklad 10
Syntéza FucHl-3(6-OBn)GlcNH2xSEt. Syntéza tejto zlúčeniny bola uskutočnená, ako je uvedené, ale za katalýzy enzýmom pochádzajúcim z iného zdroja, ktorý katalyzuje tvorbu Hl-3 väzieb.
Analogicky bol pripravený iný 6-O-substituovaný produkt ako 6-O-benzyl- a/alebo iný typ 1-substituovaného derivátu ako 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 6-0a/alebo 1-substituovaného akceptora ako (6-O-Bn)GlcNH,,SEt.
Príklad 11
Syntéza FucHl-3(4-OBn)GlcNH2xSEt. Syntéza tejto zlúčeniny bola uskutočnená, ako je uvedené, ale s použitím (4-OBn)GlcNH2„SEt ako akceptora. Analogicky bol pripravený iný 4-O-substituovaný produkt než 4-0-benzyl- a/alebo iný typ 1-substituovaného derivátu než 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 4-0- a/alebo 1-substituovaného akceptora ako (4-O-Bn)GlcNH2,SEt.
Príklad 12
Syntéza FucHl-4(3-OBn)GlcNH2ltSEt. Syntéza tejto zlúčeniny bola uskutočnená, ako je uvedené, ale s použitím enzýmu katalyzujúceho vznik Hl-4 väzieb a s (3-OBn)GlcNH2jISEt ako akceptorom. Analogicky bol pripravený iný 3-O-substituovaný produkt ako 3-O-benzyla/alebo iný typ 1-substituovaného derivátu ako 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 3-0- a/alebo 1-substituovaného akceptora než (3-O-Bn)GlcNH2,SEt.
Príklad 13
Syntéza zlúčenín typu GlcNAcJ-3(6-OBn)GlcNH2,SEt, GlcNA^W/ô-OBnjGlcNH^Ek GlcNAcJ-4(3-OBn)GlcNH,,SEt, GlcNAcJ-3(4-OBn)GlcNH2xSEt, GlcNAc* 1-3(6-OBn)GalNH2,SEt, GlcNAc,l-4(6-OBn)Gal NH,,SEt, GlcNAc, 1 -4(3-OBn)GalNH2,SEt, GlcNAc, I -3(4-OBn)GalNH2xSEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise, je možné pripraviť za katalýzy N-acetyl-B-D-glukózaminidázou vedúcou k žiadanému typu väzieb a s použitím príslušného akceptora zo zlúčenín (6-O-BnjGlcNH2,SEt, (3-O-Bn)Glc-NH2,SEt, (4-O-Bn)GlcNH2„SEt, (6-O-Bn)GalNH2*SEt, (3-O-Bn)GalNH2„SEt, (4-O-Bn)GalNH2,SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise. Ako donor glykozylu je možné použiť GlcNAc, alebo jej glykozid ako napr. F-„-glykozid alebo nitrofenyl-,glykozid.
Príklad 14
Syntéza zlúčenín typu GalNAc,l-3(6OBn)GlcNH2,SEt, GalNAc,l-4(6-OBn)GlcNH2,SEt, GalNAc*l-4(3-OBn)GlcNH2,SEt, GalNAcJ-3(4-OBn)GlcNH2,SEt, GalNAcJ-3(6-OBn)GalNH2,SEt, GalNAc, 1 -4(6-OBn)GalNH2,SEt, GalNAc,l-4(3-OBn)GalNH2,SEt, GalNAc*l-3(4-OBn)GalNH2*SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise, je možné pripraviť za katalýzy N-acetyl-p-D-galaktózaminidázou alebo inou ,-hexózaminidázou vedúcou k žiadanému typu väzieb a s použitím príslušného akceptora zo zlúčenín (ô-O-Bn)GlcNH2,SEt, (3-O-Bn)Glc NH2xSEt, (4-O-Bn)GlcNH2„SEt, (6-O-Bn)GalNH2,SEt, (3-O-Bn)Gal NH2,SEt, (4-O-Bn)Gal NH2,SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise. Ako donor glykozylu je možné použiť GlcNAc, alebo jej glykozid ako napr. F-,-glykozid alebo nitrofenyl-,-glyko-zid.
Príklad 15
Syntéza zlúčenín typu GalNAcHl-3('6-OBn)GlcNH2,SEt, GalNAcHl-4(6-OBn)GlcNH2nSEt, GalNAcHl-4(3-OBn)GlcNH2lSEt, GalNAcHl-3(4-OBn)GlcNH2xSEt, GalNAcHl-3(6-OBn)GalNH2„S Et, GalNAcH 1 -4(6-OBn)GalNH2„S Et, GalNAcH 1 -4(3-OBn)GalNH2,SEt, GalNAcHl -3(4-OBn)GalNH2,SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise, je možné pripraviť za katalýzy N-acetyl-H-D-galaktózaminidázou alebo inou Hhexózaminidázou vedúcou k žiadanému typu väzieb a s použitím príslušného akceptora zo zlúčenín (6-O-Bn)GlcNH2*SEt, (3-O-Bn)Glc NH2*SEt, (4-O-Bn)GlcNH,,SEt, (6-O-Bn)GalNH2nSEt, (3-0-Bn)GalNH,,SEt, (4-O-Bn)GalNH2,SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise. Ako donor glykozylu je možné použiť GlcNAc, alebo jej glykozid ako napr. F-,-glykozid alebo nitrofenyl-„-glykozid.
Príklad 16
Syntéza zlúčenín typu ManHl-3(6-OBn)GlcNH2,SEt, ManHl-4(6-OBn)GlcNH2*SEt, ManHl-4(3-OBn)GlcNH2„SEt, ManHl-3(4-OBn)GlcNH2*SEt, Mannl-3(6-OBn)GalNH2ltSEt, Manjjl-áíó-OBnjGalNHjj/SEt, ManH14(3OBn)GalNH2*SEt, ManHl-3(4-OBn)GalNH2,SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise, je možné pripraviť za katalýzy H-D-manozidázou vedúcou k žiadanému typu väzieb a s použitím príslušného akceptora zo zlúčenín (6-O-Bn)GlcNI fySEt, (3-O-Bn)Glc-NH2ltSEt, (1-O-Bn)Glc NľfySEt. (6-O-Bn)GalNH2nSEt, (3-O-Bn)GalNH21tSEt, (4-O-Bn)GlcNH2„SEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise. Ako donor glykozylu je možné použiť manózu, alebo jej glykozid ako napr. F-„-glykozid alebo nitrofenyl-K-glykozid.
Príklad 17
Syntéza zlúčenín typu Glcxl-3(6-OBn)GlcNH2jtSEt, Glc„l-4(6-OBn)GlcNH2jtSEt, GlcJ-4(3-OBn)GlcNH2lSEt, Glcnl-3(4-OBn)GlcNH2xSEt, Glcxl-3(6-OBn)GalNH21ISEt, Glcxl-4(6-OBn)GalNH2xSEt, Ο10π1-4(3-ΟΒη)Οα1ΝΗ2π8Εζ Glcxl-3(4-OBn)Gal NH2rSEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise, je možné pripraviť za katalýzy „-D-glukozidázou vedúcou k žiadanému typu väzieb a s použitím príslušného akceptora zo zlúčenín (6-O-Bn)GlcNH2ltSEt, (3-O-Bn)GlcNH2ltSEt, (4-O-Bn)GlcNH2lSEt, (6-O-Bn)GalNH2xSEt, (3-O-Bn)GalNH2„SEt, (4-O-Bn)GalNH2xSEt, aj iných amino-sacharidov uvedeného typu substituovaných v polohách 1, 3, 4 alebo 6 iným typom skupín vrátane sacharidov uvedených v opise. Ako donor glykozylu je možné použiť glukózu, alebo jej glykozid ako napr. F-Ä-glykozid alebo nitrofenyl-,glykozid.
V príkladoch 13, 14, 15, 16 a 17 boli použité rovnaké izolačné postupy ako v príklade 1.
Ďalšie iné sacharidy, ako uvedené, je možné pripraviť použitím iných glykozidáz vrátane H- alebo „-xy-lozidáz, H-sialidáz a endoglykozidáz, a iných donorov glykozylu, ako boli uvedené v opise.
Nasleduje niekoľko príkladov syntéz podľa predkladaného vynálezu amino-deoxy trisacharidov a vyšších sacharidov s využitím glykozyltransferáz (uvedené príklady v žiadnom smere neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu). Glykozyltransferázy je možné použiť vo viac či menej izolovanom stave, môžu byť prirodzeného pôvodu alebo pripravené rekombinantnými postupmi. Donory glykozylov pre glykozyltransferázy môžu byť nukleotidické cukry alebo modifikované nukleotidické cukry, alebo iný typ donoru glykozylu reagujúci s glykozyl-transferázou. Glykozyltransferázy môžu katalyzovať prenos modifikovaných a neprirodzených glykozylových jednotiek aj di-, tri- aj vyšších oligosacharidov na akceptory. Túto ich vlastnosť je možné tiež využiť v postupoch predkladaného vynálezu.
Donory glykozylu pre glykozyltransferázy je možné pripravovať oddelene dopredu, alebo in situ v reakčnej nádobe (s využitím napr. multi-enzýmového systému), čo tiež neobmedzuje rozsah vynálezu. Tiež glykozidázovú reakciu je možné uskutočniť oddelene alebo spolu s glykozyltransferázovou reakciou v jednej reakčnej nádobe, čo tiež neobmedzuje rozsah vynálezu. Oba enzýmy, glykozidázu aj glykozyltransferázu je možné použiť v rozpustenej forme, alebo v imobilizovanej forme na nosiči, ako už bolo uvedené.
Príklad 18
Syntéza Neu.AcH2-3GalIl-3GlcNHÄSEt Galjl-3GlcNH2jtSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor „-G-galaktózidu v reakcii katalyzovanej d2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.4) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc. Analogicky bol pripravený iný 1-substituovaný derivát než 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 1-substituovaného akceptora ako GlcNHjjSEt, ako je uvedené v opise.
Príklad 19
Syntéza NeuAcH2-3Gay-IGlcNlfySEt. G41-1 GlcNH2xSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor „-G-galaktózidu v reakcii katalyzovanej H2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.5) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc. Analogicky bol pripravený iný 1-substituovaný derivát než 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 1-substituovaného akceptora ako GlcNH2xSEt, ako je uvedené v opise.
Príklad 20
Syntéza NeuAcH2-3Galxl-4(6-OBn)GlcNH2KSEt. Galxl-4(6-OBn)GlcNH2„SEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor ,-G-galaktózidu v reakcii katalyzovanej H2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.5) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc. Analogicky bol pripravený iný 6- a/alebo 1-substituovaný derivát ako 6-O-benzyl a 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 6- a/alebo 1-substituovaného akceptora ako 6-O-benzyl-GlcNH2lSEt, ako je uvedené v opise.
Príklad 21
Syntéza NeuAcH2-3Galxl-3(4-OBn)GlcNH2XSEtNH2HSEt. GalÄl-3(4-OBn)GlcNH2lSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor „-G-galaktózidu v reakcii katalyzovanej H2-3-sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.4) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc. Analogicky bol pripravený iný 4a/alebo 1-substituovaný derivát než 4-O-benzyl a 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 4- a/alebo 1-substituovaného akceptora ako 4-O-benzyl-GlcNH2xSEt, ako je uvedené v opise.
Príklad 22
Syntéza NeuAc1I2-3Galxl-4(3-OBn)GlcNH2xSEt. GalJ-4(3-OBn)GlcNH2)lSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor „-G-galaktózidu v reakcii katalyzovanej H2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.5) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc. Analogicky bol pripravený iný 3a/alebo 1-substituovaný derivát než 3-O-benzyl a 1-tioetyl-, použitím iného počiatočného 3- a/alebo 1-substituovaného akceptora ako 3-O-benzyl-GlcNH2nSet, ako je uvedené v opise.
Príklad 23
Syntéza NeuAcHS-ÓGal^l^GlcNH^Et GaU-4GlcNH2xSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor ,-G-gaiaktózidu v reakcii katalyzovanej H2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.1) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc.
Príklad 24
Syntéza GalHl-SGa^l^GlcNH^Et Gal^MGlcNH^SEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor v reakcii katalyzovanej H2-3-D-galaktózyltransferázou (napr. EC 2.4.1.151) s vhodným donorom glykozylu, napr. UDP-Gal.
Príklad 25
Syntéza GalHl-4(pjcHl-3)GlcNH2„SEt. Gal„l4GlcNH2rSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor v reakcii katalyzovanej Hl-3
-fukozyltransferázou (napr. EC 2.4.1.152 alebo 65) s vhodným donorom glykozylu, napr. GDP-Fuc.
Príklad 26
Syntéza Fuciil-ZGalJ-ÚGIcNH^SEt. Gal„l-4GlcNH2.ISEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor v reakcii katalyzovanej Hl-2fukozyltransferázou (napr. EC 2.4.1.69) s vhodným donorom glykozylu, napr. GDP-Fuc.
Príklad 27
Syntéza FuCul-lGaUlJGIcNH^Et. GaUl-3GlcNH2lSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor v reakcii katalyzovanej Hl-2-fukozyltransferázou (napr. EC 2.4.1.69) s vhodným donorom glykozylu, napr. GDP-Fuc.
Príklad 28
Syntéza NeuAc^GaÁl-SGalNH^Et Gal„l-3GalNH2lSEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor v reakcii katalyzovanej H2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.4) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMP-NeuAc.
Príklad 29
Syntéza NeuAcn2-3Gal, 1 -3(NeuAcd2-6)GalNH2„SEt. NcuÄCHŽ-SGalJ-SGalNH^SEt bol pripravený uvedeným postupom a použitý priamo alebo po izolácii ako akceptor v reakcii katalyzovanej H2-3sialyltransferázou (napr. EC 2.4.99.7) s vhodným donorom glykozylu, napr. CMPNeuAc.
V uvedených príkladoch 23 až 29 boli analogicky pripravené iné 1-substituované deriváty ako Ι-tioetyl-, použitím iných počiatočných 1-substituovaných akceptorov ako GlcNH2jISEt, ako je uvedené v opise.
Produkty uvedených syntéz je možné izolovať precipitáciou z vody v prípade, že akceptorové molekuly nesú hydrofóbne skupiny. Ďalej je možné použiť extrakciu produktu zo surovej zmesi pevných látok napr. metanolom. Tieto postupy, precipitácia a extrakcia, doplňujú chromatografiu. Na izoláciu je možné použiť aj kombinácie uvedených postupov.
Dá sa predpokladať, že odborník v oblasti nájde aj ďalšie možné varianty a modifikácie uvedených postupov, aj tieto možnosti patria do rámca predkladaného vynálezu.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob prípravy amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, ktorá je buď fragmentom alebo analógom uhľovodíka alebo ho obsahuje ako uhľovodíkovú časť glykokonjugátu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje reakciu (a) najmenej jedného donora obsahujúceho glykozid, ktorého aglykonóm je glykozidicky viazaný atóm fluóru alebo Ο-, N-, C- alebo S-glykozidicky viazaná alifatická alebo aromatická zlúčenina, (b) najmenej jedného akceptora obsahujúceho amino-deoxy mono-, di-, alebo oligosacharid, alebo jeho glykozid a (c) glykozidázy E.C. skupiny 3.2, katalyzujúce tvorbu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, (d) prípadne izoláciu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený donor a akceptor obsahuje jeden alebo niekoľko monosacharidov zvolených zo skupiny obsahujú cej D-glukózu, D-mannózu, N-acetyl-neuramínovú kyselinu, N-acetyl-D-galaktózamín, N-acetyl-D-glukózamín, L-fukózu a ich analógy.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený glykozid v bode (b) je glykozid, ktorého aglykónom je glykozidicky viazaný atóm fluóru alebo Ο-, N-, C- alebo S-glykozidicky viazaná alifatická alebo aromatická zlúčenina.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená glykozidáza je endo- alebo exoglykozidáza.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená glykozidáza je zvolená zo skupiny obsahujúcej galaktózidázu, mannozidázu, N-acetyl-hexózaminidázu, N-acetyl-glukózaminidázu, N-acetyl-galaktozaminidázu, fúkozidázu a sialidázu s H- alebo ^-špecifitou.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uhľovodíková časť uvedeného donora a akceptora obsahuje jednu alebo niekoľko zo zlúčenín D-galaktóza, D-mannóza, N-acetylneuramínová kyselina, N-acetyl-D-galaktózamín, N-acetyl-D-glukózamín, L-fukóza a ich analógy.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená glykozidáza je použitá in situ, alebo po čiastočnej či úplnej izolácii z prirodzeného biologického zdroja.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená glykozidáza je imobilizovaná precipitáciou, adsorpciou, enkapsuláciou, chelatáciou alebo kovalentnou väzbou na polymémy nosič alebo jeho derivát nerozpustný v protických i aprotických rozpúšťadlách.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedený polymémy nosič je aktivovaný polysacharid, plast alebo sklo, ktoré nesú reaktívne skupiny vybrané zo skupín kyanatan, organický sulfonát, aldehyd, diazónium, epoxy, divinylsulfonát a triazín.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený polysacharid je celulóza alebo agaróza a uvedený plast je polyakrylamid, polyvinylalkohol alebo polystyrén.
  11. 11. Spôsob prípravy amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny, ktorá je buď fragmentom alebo analógom uhľovodíka alebo ho obsahuje ako uhľovodíkovú časť glykokonjugátu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:
    (1) reakciu (a) najmenej jedného mono-, di- alebo oligosacharidu, glykozidu alebo ich deriváty ako donora, (b) najmenej jedného akceptora obsahujúceho amino-deoxy mono-, di-, alebo oligosacharid, alebo jeho glykozid a (c) glykozidázy E.C. skupiny 3.2, katalyzujúcej tvorbu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny a (d) izoláciu uvedenej amino-deoxy di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny.
SK1450-95A 1993-05-14 1994-05-17 Spôsob prípravy amino-deoxy-di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny SK283138B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9301677A SE9301677L (sv) 1993-05-14 1993-05-14 Syntesmetod
PCT/SE1994/000461 WO1994029477A1 (en) 1993-05-14 1994-05-17 Method for the synthesis of amino-deoxy-disaccharides and amino-deoxy-oligosaccharides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK145095A3 SK145095A3 (en) 1996-06-05
SK283138B6 true SK283138B6 (sk) 2003-03-04

Family

ID=20389953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1450-95A SK283138B6 (sk) 1993-05-14 1994-05-17 Spôsob prípravy amino-deoxy-di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5856143A (sk)
EP (1) EP0698114B1 (sk)
JP (1) JP3723208B2 (sk)
AT (1) ATE229078T1 (sk)
CZ (1) CZ294859B6 (sk)
DE (1) DE69431839T2 (sk)
SE (1) SE9301677L (sk)
SK (1) SK283138B6 (sk)
WO (1) WO1994029477A1 (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9301270D0 (sv) 1993-04-19 1993-04-17 Biosensor
SE9400034D0 (sv) 1994-01-06 1994-01-06 Glycorex Ab Laktosaminderivat
US5716812A (en) * 1995-12-12 1998-02-10 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
US6284494B1 (en) 1995-12-12 2001-09-04 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides using mutant glycosidase enzymes
US6169077B1 (en) 1996-01-30 2001-01-02 Glycotech Corp. Sialyl-Lewisa and sialyl-Lewisx epitope analogues
WO1997028174A1 (en) * 1996-01-30 1997-08-07 Novartis Ag SIALYL-LEWISa AND SIALYL-LEWISx EPITOPE ANALOGUES
US7014049B2 (en) 1996-12-23 2006-03-21 Glycorex Transplantation Ab Device for bio-affinity material
DE19812156A1 (de) * 1998-03-20 1999-09-30 Forschungszentrum Juelich Gmbh Nucleotidaktivierte Di- und Oligosaccharide sowie Verfahren zu deren Herstellung II
DE19812162A1 (de) * 1998-03-20 1999-09-30 Forschungszentrum Juelich Gmbh Nucleotidaktivierte Di- und Oligosaccharide sowie Verfahren zu deren Herstellung I
AU2136201A (en) * 1999-12-10 2001-06-18 National Research Council Of Canada Method for the synthesis of sialylated oligosaccharide donors
US20030096281A1 (en) * 2001-09-14 2003-05-22 Ganesh Venkataraman Methods of making glycomolecules with enhanced activities and uses thereof
ES2397850T3 (es) 2005-09-02 2013-03-11 Glycomimetics, Inc. Inhibidores de pan-selectina heterobifuncionales
US8895510B2 (en) 2008-04-08 2014-11-25 Glycomimetics, Inc. Pan-selectin inhibitor with enhanced pharmacokinetic activity
WO2011127322A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Momenta Pharmaceuticals, Inc. High mannose glycans
WO2012037034A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 Glycomimetics, Inc. E-selectin antagonists
CN103782168B (zh) 2011-03-12 2016-03-16 动量制药公司 在糖蛋白产品中包含n-乙酰己糖胺的n-聚醣
KR102055958B1 (ko) 2011-12-22 2019-12-13 글리코미메틱스, 인크. E-셀렉틴 길항제 화합물, 조성물, 및 이용 방법
WO2013181575A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to denosumab
AU2013355238B2 (en) 2012-12-07 2017-12-14 Glycomimetics, Inc. Compounds, compositions and methods using E-selectin antagonists for mobilization of hematopoietic cells
US10450361B2 (en) 2013-03-15 2019-10-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to CTLA4-Fc fusion proteins
US10464996B2 (en) 2013-05-13 2019-11-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of neurodegeneration
WO2015057622A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Sialylated glycoproteins
EP3569609A1 (en) 2014-12-03 2019-11-20 GlycoMimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of e-selectins and cxcr4 chemokine receptors
JP2019502727A (ja) 2016-01-22 2019-01-31 グリコミメティクス， インコーポレイテッド Ｐａ−ｉｌおよび／またはｐａ−ｉｉｌレクチンの糖模倣体阻害剤
WO2017151708A1 (en) 2016-03-02 2017-09-08 Glycomimetics, Inc. Methods for the treatment and/or prevention of cardiovescular disease by inhibition of e-selectin
EP3497131B1 (en) 2016-08-08 2022-03-09 GlycoMimetics, Inc. Combination of t-cell checkpoint inhibitors with inhibitors of e-selectin or cxcr4, or with heterobifunctional inhibitors of both e-selectin and cxcr4.
KR102653723B1 (ko) 2016-10-07 2024-04-01 글리코미메틱스, 인크. 매우 강력한 다량체성 e-셀렉틴 길항물질
CA3054605A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Glycomimetics, Inc. Galactopyranosyl-cyclohexyl derivatives as e-selectin antagonists
EP3717013A1 (en) 2017-11-30 2020-10-07 GlycoMimetics, Inc. Methods of mobilizing marrow infiltrating lymphocytes and uses thereof
CN111566117A (zh) 2017-12-29 2020-08-21 糖模拟物有限公司 E-选择蛋白和半乳凝素-3的异双功能抑制剂
KR20200128025A (ko) 2018-03-05 2020-11-11 글리코미메틱스, 인크. 급성 골수성 백혈병 및 관련 병태의 치료 방법
WO2020139962A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Glycomimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of e-selectin and galectin-3

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4415665A (en) * 1980-12-12 1983-11-15 Pharmacia Fine Chemicals Ab Method of covalently binding biologically active organic substances to polymeric substances
SE451849B (sv) * 1985-12-11 1987-11-02 Svenska Sockerfabriks Ab Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter
ZA881430B (sk) * 1988-03-02 1988-10-28
SE466403B (sv) * 1988-03-24 1992-02-10 Kurt G I Nilsson Saett att syntetisera oligosackarider
SE466521B (sv) * 1988-10-03 1992-02-24 Kurt G I Nilsson Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa
SE465516B (sv) * 1989-08-18 1991-09-23 Kurt G I Nilsson Saett att framstaella en oligosackaridfoerening varvid glykosidas fraan en mollusk anvaendes
JPH04353521A (ja) * 1991-05-30 1992-12-08 Toray Dow Corning Silicone Co Ltd オルガノポリシルセスキオキサンおよびその製造方法
CA2110797C (en) * 1991-06-10 2001-02-20 Andre P. Venot Modified sialyl lewis x compounds
SE9102292L (sv) * 1991-08-06 1993-02-07 Kurt G I Nilsson Enzymatisk metod
US5326867A (en) * 1992-07-16 1994-07-05 Bristol-Myers Squibb Company Pradimic acids, amides, and pradimicin derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
SK145095A3 (en) 1996-06-05
DE69431839D1 (de) 2003-01-16
JP2002502223A (ja) 2002-01-22
SE9301677D0 (sv) 1993-05-14
EP0698114A1 (en) 1996-02-28
SE9301677L (sv) 1994-11-18
CZ294859B6 (cs) 2005-04-13
DE69431839T2 (de) 2003-04-10
US5856143A (en) 1999-01-05
JP3723208B2 (ja) 2005-12-07
ATE229078T1 (de) 2002-12-15
EP0698114B1 (en) 2002-12-04
WO1994029477A1 (en) 1994-12-22
CZ301895A3 (en) 1996-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283138B6 (sk) Spôsob prípravy amino-deoxy-di- alebo oligosacharidovej zlúčeniny
US4918009A (en) Method of controlling the regioselectivity of glycosidic bonds
US5246840A (en) Method for synthesis of oligosaccharides
EP0577580A2 (en) Synthesis of sialoconjugates
CA2312843A1 (en) Enzymatic synthesis of gangliosides
CA2126213A1 (en) A method for obtaining glycosyltransferases
EP0598051B1 (en) Enzymatic method for synthesis of carbohydrates
US5372937A (en) Process for producing an oligosaccharide compound by using glycosidases from a mollusc
Zeng et al. Convenient enzymatic synthesis of a p-nitrophenyl oligosaccharide series of sialyl N-acetyllactosamine, sialyl Lex and relevant compounds
US6653109B1 (en) Method of producing derivatives of lactosamine
US6183994B1 (en) N-containing saccharides and method for the synthesis of N-containing saccharides from amino-deoxy-disaccharides and amino-deoxy-oligosaccharides
US5936075A (en) Amino-deoxy-disaccharides and amino-deoxy-oligosaccharides
EP0517766B1 (en) Biochemical process to produce oligosaccharides
EP1034294B1 (en) Enzymatic synthesis of gangliosides
Thiem et al. Glycoscience: Synthesis of Oligosaccharides and Glycoconjugates