SK282235B6 - Lieková kombinácia na transfekciu a expresiu exogénov in vivo alebo ex vivo - Google Patents
Lieková kombinácia na transfekciu a expresiu exogénov in vivo alebo ex vivo Download PDFInfo
- Publication number
- SK282235B6 SK282235B6 SK1108-97A SK110897A SK282235B6 SK 282235 B6 SK282235 B6 SK 282235B6 SK 110897 A SK110897 A SK 110897A SK 282235 B6 SK282235 B6 SK 282235B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- combination according
- adenovirus
- recombinant
- gene
- adenoviruses
- Prior art date
Links
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 160
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 135
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 37
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 15
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 6
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 5
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 5
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 5
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 5
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 5
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 5
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims description 4
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 108700022375 Human herpesvirus 1 VP23 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 81
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 11
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 3
- 102100035888 Caveolin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 101000715467 Homo sapiens Caveolin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101150067954 B15R gene Proteins 0.000 description 2
- 101150067964 BcRF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000701168 Murine adenovirus 1 Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150039910 UL18 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150044134 US28 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- -1 alpha-ΙΑΤ Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 102220582667 Astrocytic phosphoprotein PEA-15_E18R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101150039990 B13R gene Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100422644 Caenorhabditis elegans syx-5 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100232885 Cowpox virus (strain Brighton Red) CPXV209 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 101900102284 Human herpesvirus 1 ICP47 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101100007739 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) crmA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102100028748 Transportin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001125929 Trisopterus luscus Species 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100004091 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B15R gene Proteins 0.000 description 1
- 101100340726 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR197 gene Proteins 0.000 description 1
- 101900286835 Vaccinia virus Soluble interferon alpha/beta receptor B18 Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 101150067246 crmA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 101150025873 dbp6 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000052 myelotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002556 myelotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Je opísaná lieková kombinácia aspoň jedného imunosupresného činidla a aspoň jedného rekombinantného defektného adenovírusu, ktorého genóm obsahuje prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu terapeutický gén a druhú rekombinantnú DNA obsahujúcu imunoprotekčný gén na následné, prerušované a/alebo časovo súčasné použitie vhodné na exogénovú transfekciu in vivo a/alebo ex-vivo.ŕ
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka oblasti génovej terapie a najmä použitia adenovírusov na expresiu zainteresovaného terapeutického génu. Vynález sa týka najmä nového spôsobu liečenia patologických stavov genetického pôvodu založeného na kombinovanom použití dvoch typov terapeutických činidiel.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v korekcii nedostatočnosti alebo anomálie (mutácia, aberentná expresia, atď) zavedením genetickej informácie do bunky alebo orgánu vykazujúcich uvedenú nedostatočnosť alebo anomáliu. Táto genetická informácia môže byť zavedená buď in vitro alebo ex vivo do bunky extrahovanej z orgánu, pričom modifikovaná bunka je potom znovu zavedená do organizmu, alebo priamo in vivo do príslušného tkaniva. V tomto druhom prípade existujú rôzne fyzikálne transfekčné techniky, medzi ktoré taktiež patrí použitie vírusu vo funkcii vektora. V tomto ohľade sa testovali rôzne vírusy s cieľom stanoviť ich schopnosť infikovať niektoré bunkové populácie. Ide najmä o retrovírusy (RSV, HMS, MMS, atď), vírus HSV, adenoasociované vírusy a adenovírusy.
Z týchto vírusov najmä adenovírusy majú niektoré zaujímavé vlastnosti na použitie v génovej terapii. Majú dosť široké hostiteľské spektrum, sú schopné infikovať kviescentné bunky a neintegrujú sa do genómu infikovanej bunky. Adenovírusy sú vírusy s lineárnou dvojreťazcovou DNA veľkosti asi 36 kb. Ich genóm obsahuje najmä obrátenú repetičnú sekvenciu (ITR) na ich konci, cnkapsidačnú sekvenciu, rané gény a pozdné gény (pozri obr. 1). Hlavnými ranými génmi sú gény El (Ela a Elb), E2, E3 a E4. Hlavnými neskoršími génmi sú gény Ll až L5.
Vzhľadom na uvedené vlastnosti adenovírusov sa tieto vírusy už použili na prenos génov. S týmto cieľom sa pripravili rôzne vektory odvodené od adenovírusov zahŕňajúce rôzne gény (beta-gal, OTC, alfa-ΙΑΤ, cytokíny, atď.). V každej z týchto konštrukcií sa adenovírus modifikoval takým spôsobom, aby bol neschopný replikácie v infikovanej bunke. Takto sú konštrukciami opísanými v rámci doterajšieho stavu techniky adenovírusy s deléciami oblastí El (Ela a/alebo Elb) a prípadne oblastí E3, pričom v úrovni týchto delécií je vložená sekvencia heterológnej DNA (Levrero a kol.: Gene 101, 195 (1991); Gosh-Choudhury a kol.: Gene 50,161 (1986)).
Avšak ako je to pri všetkých známych vírusoch, podanie divého adenovírusu (Poutes a kol.: J. Virol. 65, 1450 (1991)) alebo defektného rekombinantného vírusu neschopného replikácie (Yang a kol.: PNAS 4407 (1994)) indukuje výraznú imunitnú odozvu.
Hlavnou zásadou imunitného systému je integrita indivídua či vlastná integrita. Podľa tejto zásady imunitného systému dochádza k eliminácii infekčných činidiel a k odmietaniu implantovaných štepov a nádorov bez toho, aby sa tieto mocné obranné mechanizmy organizmu obrátili proti vlastnému organizmu a indukovali v ňom autoimunitné choroby. Tento stav neodozvy na vlastné antigény, v rámci ktorej sú eliminované len cudzie antigény, je definovaný ako stav fyziologickej tolerancie. Na elimináciu cudzích činidiel rozvíja imunitný systém dva typy mechanizmov. V rámci prvého z týchto mechanizmov produkuje pomocou lymfocytov B špecifické protilátky, pričom sa v tomto prípade hovorí o humorálnej imunite. Tieto protilátky viažu antigén a buď ho inaktivujú alebo ho vylúčia z organizmu. Druhý obranný mechanizmus sa týka bunkovej imunity a využíva lymfocyty T a z týchto cytotoxínové lymfocyty nesúce špecifický receptor uvažovaného antigénu. Rozpoznanie antigénu receptorom T vyžaduje, aby sa tento exprimoval v kombinácii s proteínmi kódovanými génmi hlavného histokompatibilného komplexu (CMH) triedy I a triedy II.
V dôsledku toho táto imunitná odozva rozvinutá proti infikovaným bunkám predstavuje hlavnú prekážku s použitím vírusových vektorov v génovej terapii, keďže 1) indukujúc deštrukciu infikovaných buniek obmedzuje dobu expresie terapeutického génu a teda aj terapeutický účinok, 2) indukuje paralelene výraznú zápalovú odozvu a 3) spôsobuje rýchlu elimináciu infikovaných buniek po opakovaných injekciách. Je samozrejmé, že rozsah tejto imunitnej odozvy voči infikovaným bunkám sa mení podľa charakteru orgánu, ktorý sa podrobil injekcii a v závislosti od použitého spôsobu podania. Takto je expresia beta-galaktozidázy kódovaná rekombinantným adenovírusom dodaným do svalu imunokompetentných myší, znížená na minimálnu úroveň 40 dní po injekcii (Kass-Eisler a kol.: PNAS 90, 11498 (1993)). Rovnako je expresia génov transfekovaných adenovírusom do pečene výrazne znížená v priebehu 10 dní nasledujúcich po injekcii (Yang a kol.: Immunity 1, 433 - 442 (1994)) a expresia faktoru IX preneseného adenovírusom do hepatocytov hemofilných psov vymizne 100 dní po injekcii (Kay a kol.: PNAS 91,2353 (1994)).
V rámci perspektívneho využitia vektorov odvodených od adenovírusov v génovom inžinierstve sa javí ako nevyhnutné regulovať imunitnú odozvu rozvinutú proti bunkám infikovaných uvedenými adenovírusmi.
Z uvedeného vyplýva, že uvedenie imunitného systému do činnosti vyžaduje z jeho strany predovšetkým rozpoznanie prvkov, ktoré sú organizmu cudzie (nevlastné alebo vlastné avšak modifikované), akými sú vektory odvodené od adenovírusov, ktoré musia byť v normálnom čase zničené. V priebehu posledných rokov sa vyvinuli imunointervenčné stratégie, ktorých cieľom bolo vytvoriť “permisívne” imunitné prostredie, čiže indukovať stav tolerancie voči vopred definovaným cudzím antigénom.
A presne na tejto úrovni pôsobí vynález. Vynález smeruje k zabráneniu rýchlej eliminácie adenovírusov z infikovaných buniek a teda k predlíženiu in vivo expresie terapeutického génu, ktoré tieto bunky nesú.
V nedávnej dobe prihlasovateľ preukázal, že ko-expresia niektorých génov v infikovaných bunkách je schopná indukovať imunoprotekčný účinok a spôsobiť tak, že vektory a/alebo infikované bunky unikajú pôsobeniu imunitného systému. Používané sú najmä adenovírusy, v ktorých je expresia zainteresovaného terapeutického génu spojená s expresiou imunoprotekčného génu (FR n° 94 12346). Môže ísť najmä o gén, ktorého produkt pôsobí na činnosť hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) alebo na účinnosť cytokínov a umožňuje tak výrazne znížiť alebo dokonca potlačiť akúkoľvek imunitnú odozvu voči uvedenému vektoru alebo voči infikovaným bunkám. Takto dochádza aspoň k čiastočnej inhibícii expresie proteínov MHC alebo prezentácie antigénov, čo má za následok výhodu spočívajúcu v značnom obmedzení imunitnej reakcie na prítomnosť vektora alebo infikovaných buniek a teda v predĺžení terapeutického účinku.
Podstata vynálezu
Prihlasovateľ neočakávateľne preukázal, že je možné výrazné predĺženie terapeutického účinku vektora tým, že sa k nemu pridruží imunosupresor. Pritom eliminácia uvažovaného vektora a/alebo deštrukcia infikovaných buniek imunitným systémom je oneskorená o čas, ktorý je výrazne dlhší ako oneskorenie, ktoré by bolo možné očakávať pri súčte imunoprotekčných účinkov uvedeného vektora a imunosupresora. Výhodne lieková kombinácia, podľa vynálezu, indukuje „pseudo-nečinnosť“ imunitného systému, ktorá je priaznivá pre dlhodobú expresiu terapeutického génu.
V zmysle tohto vynálezu je imunosupresorom každá zlúčenina, ktorá je schopná inhibovať čiastočne alebo úplne aspoň jednu imunitnú signalizačnú cestu. Vo všeobecnosti sa imunosupresory používajú zvyčajne pri transplantáciách na predchádzanie odmietnutia cudzorodých štepov a pri liečení niektorých autoimunitných chorôb. Klasicky používanými látkami sú buď chemické imunosupresoiy, akými sú kortikosteroidy, azatioprin, cyklosporin, FK506, alebo biologické imunosupresory, akými sú polyklonálne alebo monoklonálne protilátky. Prvá kategória imunosupresorov a z nej najmä cyklosporin a FK506 inhibujú vo významnej miere produkciu cytokínov, ako napríklad produkciu interleukínu 2, ktoré zohrávajú podstatnú úlohu pri diferenciácii a proliferácii lymfocytných buniek. Bohužiaľ účinnosť tohto typu imunosupresora vyžaduje permanentné podávanie, ktoré je pri viac alebo menej dlhej dobe aplikácie v rozpore s ich toxicitou. Takto je azatioprin potenciálne myelotoxický, zatiaľčo cyklosporin je nefrotoxický a môže okrem toho spôsobiť hypertenziu alebo neurologické poruchy.
Pokiaľ ide o protilátky, ide o protilátky riadené proti lymfoidným bunkám imunitného systému. Prvou protilátkou použitou ako imunosupresor bola anti-CD3 riadená proti lymfocytom T. Jej cieľom je jeden z polypcptidových reťazcov molekukly CD3, ktorý tvorí receptor pre antigén buniek T. Z toho vyplýva funkčná inaktivácia buniek T CD3+ rozpoznaných protilátkou. V prípade problematiky, ktorá je tu predmetom záujmu, by podanie imunosupresora tohto typu spoločne s podaním rekombinantného adenovírusu obsahujúceho terapeutický gén bolo schopné blokovať imunitnú reakciu hostiteľa voči vírusovému vektoru a/alebo voči jeho produktom exprimovaným na povrchu infikovaných buniek. Na rovnakom princípe možno využiť protilátky anti-CD4, anti-CD2, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, antiICAM-1 aanti-LFA-1.
Prihlasovateľ teraz vyvinul nový spôsob obzvlášť účinného a výrazného omeškania alebo dokonca inhibície reakcie imunitného systému, pri ktorom nedochádza k problémom toxicity.
Presnejšie definované, vynález je odvodený od preukázania zvlášť výrazného synergického účinku spojeného s kombinovaným použitím rekombinantného adenovírusu, v ktorom je expresia zainteresovaného terapeutického génu spojená s expresiou imunoprotekčného génu, ktorý bol opísaný, a aspoň jedného imunosupresného činidla.
V prvom rade sa teda predmet vynálezu dotýka liekovej kombinácie aspoň jedného imunosupresného činidla a aspoň jedného rekombinantného adenovírusu, ktorého genóm obsahuje prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu terapeutický gén a druhú rekombinantnú DNA obsahujúcu imunoprotekčný gén, na následné, prerušované a/alebo časovo súčasné použitie vhodné na exogénovú transfekciu in vivo a/alebo ex vivo.
Ako už bolo uvedené, podstata vynálezu spočíva najmä v preukázaní synergického účinku medzi aktivitou imunosupresného činidla a účinkom imunoprotekčného génu exprimovaného na expresiu terapeutického génu.
Toto kombinované použitie umožňuje výrazne predĺžený terapeutický účinok a výhodne vyžaduje významne znížené dávky najmä imunosupresného činidla.
Ako bude uvedené ďalej, môžu byť obe zložky kombinovaného ošetrenia použité následne, prerušovane a/alebo časovo súčasne. Výhodne sa imunosupresné činidlo injikuje pred a po injekcii adenovírusu. Podľa tejto formy uskutočnenia vynálezu môže byť podanie imunosupresného činidla uskutočnené v časovom odstupe a výhodne môže byť pravidelne obnovované. V tomto Špecifickom prípade sú obe zložky kondiciované oddelene. V prípade súčasného podania môžu byť obe zložky zmiešané bezprostredne pred spoločným podaním alebo môžu byť naopak podané súčasne avšak oddelene. Najmä spôsoby podania oboch činidiel môžu byť odlišné.
V rámci vynálezu možno ako imunosupresné činidlo použiť každú zlúčeninu, ktorá je schopná inhibovať čiastočne alebo úplne aspoň jednu imunitnú signalizačnú cestu. Toto činidlo môže byť zvolené najmä z látok, akými sú cyklosporin, FK506, azatioprin, kortikosteroidy a každá mono- alebo polyklonálna protilátka. Ide výhodne o protilátky schopné inaktivovať imúnne molekuly alebo vyvolať deštrukciu imúnnych buniek nesúcich tieto molekuly. Ako protilátku možno použiť najmä protilátky anti-CD4, antiCD3, anti-CD2, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, anti-ICAM-1, anti-LFA-1. Môže taktiež isť aj o hybridné molekuly, akými sú CTLA41g, fuzny proteín medzi molekulou CTLA-4 (homológ k CD28) a imunoglobulínom. Miesto GlFc tejto molekuly viazanej s molekulou B7 sa ukazuje schopné inhibovať aktiváciu buniek T (D. J. Lenschow: Science 257, 789 (1992)). le samozrejmé, že rozsah vynálezu nie je nijako obmedzený na uvedené imunosupresory. Tieto imunosupresory môžu byť použité v izolovanej forme alebo v kombinácii.
Čo sa týka rekombinantnej DNA prítomnej v genóme adenovírusu použitého v rámci vynálezu, ide o fragmenty DNA obsahujúce uvažovaný gén (terapeutický alebo imunoprotekčný) a prípadne signály umožňujúce jeho expresiu konštruované in vitro a potom vložené do genómu adenovírusu. Rekombinantnými DNA použitými v rámci vynálezu môžu byť komplementárna DNA (DNAc), genómové DNA (DNAg) alebo hybridné konštrukcie pozostávajúce napríklad z DNAc, do ktorej boli vložené jeden alebo niekoľko intrónov. Môže taktiež ísť o syntetické sekvencie alebo semisyntetické sekvencie. Tieto DNA môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového a iného pôvodu. Výhodne sa používajú DNAc alebo DNAg.
Ako terapeutický gén použiteľný na konštrukciu vektorov, podľa vynálezu možno uviesť gén kódujúci produkt, ktorý má terapeutický účinok. Takto kódovaným produktom môže byť proteín, peptid, RNA a podobne.
Čo sa týka proteínového produktu, môže ísť o produkt homológny voči cieľovej bunke (t. j. produkt, ktoiý je v cieľovej bunke normálne exprimovaný v prípade, že táto bunka nevykazuje žiadnu patológiu). V tomto prípade umožňuje expresia proteínu napríklad liečiť nedostatočnú expresiu v bunke alebo expresiu neaktívneho alebo slabo aktívneho proteínu, spôsobenú nejakou modifikáciou, alebo ešte nadmernou expresiou uvedeného proteínu. Terapeutický gén môže takto kódovať bunkový proteín, ktorý má zvýšenú stabilitu, modifikovanú účinnosť a podobne. Proteínový produkt môže byť taktiež heterológny voči cieľovej bunke. V tomto prípade môže exprimovaný proteín napríklad dopĺňať alebo nahrádzať niektorú deficitnú aktivitu v bunke, čím robí bunku schopnú bojovať proti uvažovanej patológii alebo u nej stimuluje imunitnú odozvu.
Ako terapeutické proteínové produkty v zmysle vynálezu možno uviesť najmä enzýmy, krvné deriváty, hormóny, interleukíny, interferóny, TNF, atď. (FR 92 03120), rastové faktory, neurotransmitery alebo ich prekurzory alebo syn3
SK 282235 Β6 tézne enzýmy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofm, atď., apoliproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atď. (FR 93 05125), dystrofm alebo minidystrofln (FR 91 11947), proteín CFTR združený s mukoviscidózou, protinádorové supresné gény: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atď. (FR 93 04745), gény kódujúce faktory implikované pri koagulácii: faktory VII, VIII, IX, gény zasahujúce do reparácie DNA a podobne.
Ako už bolo uvedené, môže byť terapeutickým génom taktiež antimediátorový gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génu alebo transkripciu bunkových mRNA. Takéto sekvencie môžu byť napríklad prepísané v cieľovej bunke na RNA komplementárnu k bunkovým RNAm a blokovať tak ich transláciu na proteín technikou opísanou v patente EP 140 308. Antimediátory taktiež obsahujú sekvencie kódujúce ribozómy, ktoré sú schopné selektívne rozkladať cieľové RNA (EP 321 201).
Terapeutické gény môžu byť ľudského, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového a iného pôvodu. Tieto gény môžu byť získané ľubovoľnou známou technikou a najmä vytriedením bánk, chemickou syntézou alebo aj zmiešanými metódami zahŕňajúcimi chemickú alebo enzymatickú modifikáciu sekvencií získaných vytriedením bánk.
Imunosupresný gén použitý v rámci vynálezu môže byť rozličného typu. Ako už bolo vysvetlené, ide o gén, ktorého produkt pôsobí na aktivitu hlavného histokompatibilitného komplexu (MHC) alebo na aktivitu cytokínov. Výhodne ide o gén, ktorého produkt inhibuje aspoň čiastočne expresiu proteínov komplexu MHC alebo antigénovú prezentáciu. Ako výhodné príklady možno uviesť niektoré gény obsiahnuté v oblasti E3 adenovírusu, gén ICP47 vírusu herpes alebo gén UL18 cytomegalovírusu.
Oblasť E3 genómu adenovírusu obsahuje rôzne čítacie rámce, ktoré alternatívnym zvíjaním poskytujú rôzne proteíny. Z týchto proteínov je proteín gpl9k (alebo E3 - 19k) transmembránovým glykozylovaným proteínom lokalizovaným v membráne endoplazmového retikula (RE). Tento proteín obsahuje luminálnu doménu viažucu molekuly komplexu MHC-I a C-terminálny cytoplazmový koniec schopný viazať mikrotubuly (alebo tubulín), ktoré pôsobia pri zakotvení proteínu gpl9k v membráne ER. Proteín gpl9k je takto schopný zabrániť expresii molekúl MHC-I na povrchu buniek interakciou a sekvestráciou na úrovni ER. Avšak v neprítomnosti vírusovej replikácie je proteín gpl9k slabo exprimovaný adenovírusmi. Inak je expresia gpl9k taktiež prispôsobená k realizácii zvíjania. Zavedenie rekombinantnej DNA obsahujúcej sekvenciu (výhodne DNAc) kódujúcu gpl9k do vektora podľa vynálezu, umožňuje regulovať a optimalizovať expresiu uvedeného proteínu. Najmä použitie konštitutívnych promótorov a supresia ostatných čítacích rámcov umožňuje silne zvýšiť expresiu uvedeného proteínu a vymaniť sa zo závislosti od vírusovej replikácie a prítomnosti indukčných prvkov. To umožňuje obzvlášť výhodným spôsobom, značne znížiť lýzu použitím CTL infikovaných buniek a takto zvýšiť a predĺžiť in vivo produkciu terapeutického génu.
Ďalšie proteíny kódovanej oblasti E3 genómu adenovírusu, akými sú proteíny 10,4k a 14,5k, majú niektoré zaujímavé vlastnosti s ohľadom na ich zavedenie do vektorov podľa vynálezu.
Gén ICP47 vírusu herpes simplex tvorí ďalší imunoprotekčný gén, ktorý je obzvlášť zaujímavý na použitie v zmysle vynálezu. Bunky infikované vírusom herpes simplex sa vyznačujú odolnosťou proti lýze indukovanej CTL. Preukázalo sa, že táto rezistencia môže byť poskytnutá génom ICP47, ktorý je schopný obmedziť expresiu molekúl
MHC-1 na povrchu buniek. Inkorporácia génu ICP47 do rekombinantnej DNA, podľa vynálezu, umožňuje taktiež rekombinantným vírusom, podľa vynálezu, uniknúť imunitnému systému.
Gén UL18 cytomegalovírusu tvorí ďalší výhodný príklad imunoprotekčného génu podľa vynálezu. Produkt génu UL18 je schopný viazať beta2-mikroglobulín (Browne a kol.: Náture 347, 770 (1990)). beta2-Mikroglobulín je jedným z reťazcov molekúl MHC-I. Zabudovanie génu UL18 do rekombinantnej DNA, podľa vynálezu, tiež umožňuje znížiť počet funkčných buniek beta2-mikroglobulínu v bunkách infikovaných vírusmi, podľa vynálezu, a teda znížiť schopnosti týchto buniek produkovať kompletné a funkčné molekuly MHC-I. Tento typ konštrukcie teda umožňuje chrániť infikované bunky pred lýzou spôsobenou CTL.
Ako už bolo uvedené, je imunoprotekčným génom použitým v rámci vynálezu pri inom výhodnom spôsobe vykonania gén, ktorého produkt inhibuje aktivitu alebo signalizačné cesty cytokínov. Cytokíny tvoria skupinu vylučovaných proteínov, ktoré pôsobia ako signalizačné molekuly imunitného systému. Môžu priťahovať imunitné bunky, aktivovať ich, indukovať ich proliferáciu a dokonca pôsobiť priamo na infikované bunky tak, že ich zabíjajú.
Ako príklady génov, ktorých produkt pôsobí na aktivitu alebo signalizačné cesty cytokínov, možno uviesť gény zasahujúce do syntézy cytokínov alebo gény, ktorých produkt je schopný sekvestrovať cytokíny, antagonizovať ich aktivitu alebo interferovať s intracelulámymi signalizačnými cestami. Ako výhodné príklady takýchto génov možno uviesť najmä gén BCRF1 vírusu Epsteina a Barové, gény crmA a crmB vírusu cowpox, gény B15R a E18R vírusu kravských kiahní, gén US28 cytomegalovírusu a gény E3-14,7, E3-10,4 a E3-14,5 adenovírusu.
Gén B15R vírusu kravských kiahní kóduje rozpustný proteín schopný viazať interleukín-lbeta (sekrétovaná forma interleukínu-1) a takto brániť tomuto cytokínu viazať sa na jeho bunkové receptory. Interleukín-1 je v skutočnosti jeden z prvých cytokínov produkovaných ako odozva na antigénovú agresiu a zohráva veľmi dôležitú úlohu pri signalizácii imunitného systému na počiatku infekcie. Možnosť zabudovať gén B15R do vektora, podľa vynálezu, výhodne umožňuje redukovať aktivitu interleukínu-lbeta najmä pri aktivácii imunitných buniek a týmto spôsobom lokálne chrániť infikované bunky vírusom, podľa vynálezu, proti výraznej imunitnej odozve. Taktiež možno použiť homológne gény génu BI5R, akým je napríklad gén vírusu cowpox.
Rovnakým spôsobom gén B18R vírusu kravských kiahní kóduje proteín homológny s receptorom interleukínu-6. Tento gén alebo každý funkčný homológny gén je taktiež použiteľný vo vektoroch podľa vynálezu na inhibíciu väzby interleukínu-6 na jeho bunkový receptor a takto na lokálne zníženie imunitnej odozvy.
Rovnakým spôsobom môže byť použitý aj gén crmB vírusu cowpox. Tento gén kóduje v skutočnosti sekretovaný proteín schopný viazať TNF a konkurovať receptorom TNF na povrchu buniek. Tento gén teda umožňuje vo vírusoch podľa vynálezu lokálne znižovať koncentráciu aktívneho činidla TNF schopného ničiť infikované bunky. Taktiež môžu byť použité aj iné gény kódujúce proteíny schopné viazať TNF a inhibovať aspoň čiastočne jeho väzbu na jeho receptory.
Gén crmA vírusu cowpox kóduje proteín, ktorý má inhibičnú aktivitu proteáz typu serpínu, ktorý je schopný inhibovať syntézu interleukínu-lbeta. Tento gén môže byť teda použitý na lokálne zníženie koncentrácie interleukínu-1 a takto na obmedzenie rozvinutia imunitnej a zápalovej odozvy.
Gén BCRF1 vírusu Epsteina a Barrovej kóduje analóg interleukínu 10. Produktom tohto génu je cytokín schopný obmedziť imunitnú odozvu a zmeniť jej špecifičnosť mechanizmom indukcie proliferácie lymfocytov B.
Gén US28 cytomegalovírusu kóduje proteín homológny s receptorom zápalového proteínu makrofágov lalfe (ΜΙΡ-1-alfa). Tento proteín je teda schopný pôsobiť ako konkurenčné činidlo receptorov MIP a inhibovať tak lokálne aktivitu uvedeného zápalového proteínu.
Produkt génov E3-14.7, E3-10.4 a E3-14,5 adenovírusu je schopný blokovať prenos intracelulámeho signálu mediovaného niektorými cytokínmi. Keď sa cytokíny viažu na ich receptor na povrchu infikovanej bunky, dôjde k prenosu signálu do jadra indukujúceho bunkovú smrť alebo zastavenie proteínovej syntézy. To je najmä prípad nekrózneho faktoru nádorov. Inkorporácia génov E3-14,7, E3-10.4 a/alebo E3-14,5 do rekombinantnej DNA podľa vynálezu, s cieľom ich konštitučnej alebo regulovanej expresie umožňuje blokovať intracelulámu signalizáciu indukovanú faktorom TNF a takto chrániť bunky infikované rekombinantnými vírmi podľa vynálezu, pred toxickými účinkami uvedeného cytokínu.
Lokálna a prechodná inhibícia môže byť obzvlášť výhodná. Takáto inhibícia sa môže dosiahnuť najmä voľbou špecifických expresných signálov (napríklad cytokín-dependentné promótory), ako to bude opísané ďalej.
Je samozrejmé, že na konštrukciu vektorov, podľa vynálezu, možno použiť aj ďalšie homológne gény alebo gény, ktoré majú podobné funkčné vlastnosti. Takéto rôzne gény sa môžu získať každou už známou technikou a najmä vytriedením bánk, chemickou syntézou alebo aj zmiešanými metódami zahŕňajúcimi chemickú alebo enzymatickú modifikáciu sekvencii, získaných vytriedením bánk. Okrem toho sa môžu takéto gény použiť samostatne alebo v kombinácii či kombináciách.
Vloženie uvažovaných génov vo forme rekombinantných DNA podľa vynálezu, ponúka väčšiu pružnosť pri konštrukcii adenovírusov a umožňuje lepšiu reguláciu uvedených expresných génov.
Takto môžu byť rekombinantné DNA (a teda oba zainteresované gény) zabudované do adenovírusových vektorov, podľa vynálezu zostavené a usporiadané rôznymi spôsobmi.
Môžu byť najskôr vložené na rovnaké miesto genómu adenovírusu alebo na rôzne zvolené miesta tohto genómu. Rekombinantné DNA môžu byť najmä vložené aspoň čiastočne v úrovni oblastí El, E3 a/alebo E4 genómu adenovírusu tak, že nahrádzajú alebo dopĺňajú vírusové sekvencie.
Výhodne sa rekombinantná DNA vloží aspoň čiastočne v úrovni oblastí El, E3 alebo E4 genómu edenovírusu. V prípade, že sa vloží na dve rôzne miesta, potom sa uprednostňuje v rámci vynálezu použitie oblastí El a E3 alebo El a E4. Príklady v skutočnosti ukazujú, že táto organizácia umožňuje zvýšenú expresiu obidvoch génov, bez toho aby pritom dochádzalo k interferencii medzi týmito génmi. Výhodne sa rekombinantné DNA vložia tak, že nahrádzajú vírusové sekvencie.
Každá z týchto rekombinantných DNA potom môže obsahovať transkripčný promótor, pričom tieto promótory môžu byť rovnaké alebo odlišné. Táto konfigurácia umožňuje dosiahnuť vyššiu expresnú hladinu a ponúka lepšiu reguláciu expresie génov. V tomto prípade môžu byť oba gé ny vložené v rovnakej orientácii alebo v opačných orientáciách.
Rekombinantné DNA môžu taktiež tvoriť jednotnú transkripčnú entitu. V tejto konfigurácii sú obe rekombinantné DNA priľahlé a uložené takým spôsobom, že oba gény sú pod kontrolou jediného promótora a poskytujú jedinú premediátorovú RNA. Toto usporiadanie je výhodné, pretože umožňuje použitie jediného transkripčného promótora.
Konečne použitie rekombinantných DNA podľa vynálezu, umožňuje použitie transkripčných promótorov odlišného charakteru a najmä silných alebo slabých promótorov, regulovaných alebo konštitučných promótorov, tkanivovo špecifických alebo ubikvitámych promótorov a podobne.
Voľba expresných signálov a respektívna poloha rekombinantných DNA je obzvlášť dôležitá na dosiahnutie zvýšenej expresie terapeutického génu a výrazného imunoprotekčného účinku.
V rámci obzvlášť výhodného spôsobu uskutočnenia vynálezu sa používa defektný adenovírus, ktorý obsahuje prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu terapeutický gén a druhú rekombinantnú DNA obsahujúcu imunoprotekčný gén, pričom obe rekombinantné DNA sú vložené v úrovni oblasti El.
V rámci iného, obzvlášť výhodného spôsobu uskutočnenia vynálezu sa používa defektný adenovírus, ktorý obsahuje prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu terapeutický gén vložený v úrovni oblasti El a druhú rekombinantnú DNA obsahujúcu imunoprotekčný gén vložený v oblasti E3.
Ako už bolo uvedené, sú adenovírusy podľa vynálezu defektné vírusy, čo znamená, že sú neschopné replikovať sa autonómnym spôsobom v cieľovej bunke. Všeobecne je teda genóm defektného adenovírusu podľa vynálezu zbavený aspoň sekvencii nevyhnutných na replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti môžu byť buď odstránené (úplne alebo čiastočne) alebo môžu byť znefimkčnené alebo môžu byť nahradené inými sekvenciami a najmä terapeutickými génmi. Defektný charakter adenovírusov podľa vynálezu je dôležitým faktorom, pretože zaisťuje nerozširovanie sa vektorov podľa vynálezu po podaní.
V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu obsahujú adenovírusy, podľa vynálezu, sekvencie ITR a sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a majú deléciu celku alebo časti génu El.
Sekvencia obrátenej repetície (ITR) tvorí počiatok replikácie adenovírusu. Tieto sekvencie sú lokalizované na koncoch 3'a 5'vírusového genómu (pozri obr. 1), odkiaľ môžu byť ľahko izolované klasickými technikami molekulárnej biológie, ktoré sú pre technika v danom obore dobre známymi technikami. Nukleotidová sekvencia sekvencii ITR ľudských adenovírusov (najmä sérotypov Ad2 a Ad5) je opísaná v literatúre a to rovnako ako psích adenovírusov (najmä CAV1 a CAV2). Pokiaľ ide napríklad o adenovírus Ad5, zodpovedá ľavá sekvencia ITR oblasti obsahujúcej nukleotoidy 1 až 103 uvedeného genómu.
Enkapsidačná sekvencia (tiež označovaná ako sekvencia Psi) je nevyhnutná na enkapsiadáciu vírusovej DNA. Táto oblasť musí byť prítomná na to, aby umožnila prípravu defektných rekombinantných adenovírusov podľa vynálezu. Enkapsidačná sekvencia je lokalizovaná v genóme adenovírusu medzi ľavou ITR (5') a génom El (pozri obr. 1). Táto sekvencia môže byť izolovaná alebo umelo syntetizovaná klasickými technikami molekulárnej biológie. Nukleotidová sekvencia enkapsidačnej sekvencie ľudských adenovírusov (najmä sérotypov Ad2 a Ad5) je opísaná v literatúre, rovnako ako enkapsidačná sekvencia psích ade
SK 282235 Β6 novlrusov (najmä CAV1 a CAV2). Čo sa týka adenovírusu Ad5, zodpovedá enkapsidačná sekvencia oblasti obsahujúcej nukleotoidy 194 až 358 genómu.
Výhodnejšie obsahujú adenovírusy, podľa vynálezu, sekvencie ITR a sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a majú deléciu celku alebo časti génov El a E4.
V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu je genóm adenovírusu, podľa vynálezu, zbavený deléciami celku alebo časti génov El, E3 a E4 a výhodne aj celku alebo časti génov El, E3, L5 a E4.
Adenovírusy, podľa vynálezu, môžu byť pripravené z adenovírusov rôzneho pôvodu. V skutočnosti existujú rôzne typy adenovírusov, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trocha menia, avšak ktoré majú porovnateľnú genetickú organizáciu. Takto môžu byť inštrukcie opísané v prihláške vynálezu odborníkom ľahko použité pre ľubovoľný typ adenovírusov.
Adenovírusy podľa vynálezu môžu byť ľudského, zvieracieho alebo zmiešaného (ľudského a zvieracieho) pôvodu.
Pokiaľ ide o adenovírusy ľudského pôvodu, dáva sa prednosť použitiu adenovírusov zaradených do skupiny C. Z rôznych sérotypov ľudských adenovírusov sa v rámci vynálezu prednostne používajú adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5).
Ako už bolo uvedené, môžu byť adenovírusy podľa vynálezu taktiež zvieracieho pôvodu alebo môžu obsahovať sekvencie pochádzajúce z adenovírusov zvieracieho pôvodu. Prihlasovateľ v skutočnosti preukázal, že adenovírusy zvieracieho pôvodu sú schopné infikovať s vysokou účinnosťou ľudské bunky a že sú neschopné propagovať sa v ľudských bunkách, v ktorých boli testované (pozri prihláška FR 93 05954). Prihlasovateľ taktiež preukázal, že adenovírusy zvieracieho pôvodu nie sú nijako transkomplementované adenovírusmi ľudského pôvodu, čo eliminuje akékoľvek rekombinačné a propagačné riziko in vivo v prítomnosti ľudského adenovírusu, ktoré by inak mohlo viesť k tvorbe infekčných častíc. Použitie adenovírusu alebo oblasti adenovírusu zvieracieho pôvodu je teda obzvlášť výhodné vzhľadom na to, že je tak ešte viac znížené riziko spojené s použitím vírusu ako vektora v génovej terapii.
Adenovírusmi zvieracieho pôvodu použiteľnými v rámci vynálezu môžu byť adenovírusy psieho, bovínného, murínneho (napríklad: Mavl, Bcrad a kol.: Virology 75, 81 (1990)), ovčieho, prasačieho, vtáčieho alebo aj opičieho pôvodu (príklad: SAV). Z vtáčích adenovírusov možno uviesť najmä sérotypy 1 až 10 dostupné v ATCC, ako napríklad kmene Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR280), P7-A (ACTT VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-121 (ATCC VR-921), alebo aj kmene ATCC VR-831 až 835. Z bovínnych adenovírusov možno použiť rôzne známe sérotypy, a najmä sérotypy dostupné v ATCC (typy 1 až 8) pod odkazmi ATCC VR-313, 314, 639 - 649, 768 a 769. Taktiež možno uviesť murínne adenovírusy FL (ATCC VR-550) a E20380 (ATCC VR-528), ovčí adenovírus typu 5 (ATCC VR-1343 alebo typu 6 (ATCC VR-1340), prasačí adenovírus 5359 alebo opičie adenovírusy, a to najmä adenovírusy uvedené v ATCC pod číslami VR-591-594, 941943,195-203 a podobne.
Z adenovírusov zvieracieho pôvodu sa v rámci vynálezu výhodne používajú adenovírusy alebo oblasti adenovírusov psieho pôvodu a najmä všetky kmene adenovírusov CAV2 (kmeň Manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-80)). Psie adenovírusy sú predmetom mnohých štruktúrnych štúdií. V rámci doterajšieho stavu techniky (Spibey a kol.: J. Gen. Virol. 70,165 (1989)) sa takto opísali úplné reštrikčné mapy adenovírusov CAV1 a CAV2 a taktiež sa klonovali a sekvenovali gény El a E3, ako aj sekvencie ITR (pozri najmä Spibey a kol.: Vírus Res. 14, 241 (1989); Linné: Vírus Res. 23,119 (1992); WO 91/11525).
Defektné rekombinantné adenovírusy, podľa vynálezu, sa môžu pripraviť rôznymi spôsobmi.
Prvý z týchto spôsobov spočíva v transfekcii defektného rekombinantného vírusu pripraveného in vitro (buď ligáciou alebo vo forme plazmidu) do kompetentného bunkového radu, t. j. do radu nesúceho v trans všetky funkcie nevyhnutné na komplementáciu defektného vírusu. Tieto funkcie sú výhodne integrované do genómu bunky, čo umožňuje vyvarovať sa rizika rekombinácie a poskytuje bunkovému radu zvýšenú stabilitu.
Druhý prístup spočíva v ko-transfekcii do príslušného bunkového radu DNA defektného rekombinantného vírusu pripraveného in vitro (buď ligáciou alebo vo forme plazmidu) a DNA hclper vírusu. Podľa tejto metódy nie je nevyhnutné mať k dispozícii kompetentný bunkový rad schopný komplementovať všetky defektné funkcie rekombinantného adenovírusu. Časť týchto funkcií je v skutočnosti komplementovaná helper vírusom. Tento vírus musí byť sám o sebe defektný a bunkový rad nesie v trans funkcie nevyhnutné na jeho komplementáciu. Z bunkových radov použiteľných výhodne v rámci vynálezu pri tomto druhom prístupe možno uviesť najmä ľudský embryonálny renálny rad 293, bunky KB, bunky Hela, MDCK, GHK a podobne (pozri príklady).
Potom sa multiplikované vektory rekuperujú, purifikujú a amplifíkujú klasickými technikami molekulárnej biológie.
Podľa variantného uskutočnenia možno pripraviť in vitro, a to buď ligáciou alebo vo forme plazmidu, DNA defektného rekombinantného vírusu nesúcu príslušné delécie a obe rekombinantné DNA. Ako už bolo uvedené, vektory podľa vynálezu majú deléciu celku alebo časti niektorých vírusových génov, najmä génov El, E3, E4 a/alebo L5. Táto delécia môže zodpovedať akémukoľvek typu potlačenia pôsobiaceho na uvažovaný gén. Môže ísť najmä o potlačenie celku alebo časti kódujúcej oblastí uvedeného génu a/alebo celku alebo časti promočnej oblasti transkripcie uvedeného génu. Uvedená supresia sa vo všeobecnosti uskutoční na DNA defektného rekombinantného vírusu, napríklad digesciou pomocou reštrikčných enzýmov a potom ligáciou technikami molekulárnej biológie, ako aj technikami opísanými v príkladoch. Rekombinantné DNA potom možno vložiť do tejto DNA enzymatickým štiepením a potom ligáciou v úrovni selekovaných oblastí a v zvolenej orientácii.
Takto získaná DNA, ktorá teda nesie príslušné delécie a obe rekombinantné DNA, umožňuje priamo generovať defektný rekombinantný adenovírus nesúci uvedené delécie a rekombinantnú DNA. Tento prvý variant je obzvlášť vhodný na realizáciu rekombinantných adenovírusov, v ktorých sú gény usporiadané vo forme jedinej transkripčnej jednotky alebo pod kontrolou oddelených promótorov, ktoré sú však vložené na rovnaké miesto genómu.
Taktiež možno pripraviť rekombinantný vírus v dvoch etapách, umožňujúcich následné zavedenie oboch rekombinantných DNA. Takto sa DNA prvého rekombinantného vírusu nesúceho príslušné delécie (alebo časť uvedených delécií) a jednu z rekombinantných DNA konštruuje ligáciou alebo vo forme plazmidu. Táto DNA sa potom použije na generáciu prvého rekombinantného vírusu nesúceho uvedené delécie a jednu rekombinantnú DNA. DNA tohto prvého vírusu sa potom izoluje a ko-transfekuje s druhým plazmidom alebo DNA druhého defektného rekombinantného vírusu nesúceho druhú rekombinantnú DNA, prísluš
SK 282235 Β6 né delécie (časť neprítomná na prvom víruse) a oblasť umožňujúcu homológnu rekombináciu. Táto druhá etapa takto generuje defektný rekombinantný vírus nesúci obe rekombinantné DNA. Tento variant prípravy je obzvlášť vhodný na prípravu rekombinantných vírusov nesúcich obe rekombinantné DNA vložené do dvoch rôznych oblastí genómu adenovírusu.
Obe činidlá podľa vynálezu, t. j. imunosupresor a rekombinantný adenovírus môžu byť formulované tak, aby získané formulácie boli vhodné na topické, perorálne, parentálne, intranazálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, intraokuláme, transdermálne a ďalšie podanie.
Výhodne farmaceutická formulácia alebo farmaceutické formulácie obsahujú farmaceutický prijateľné nosiče vhodné na injikovateľnú formuláciu. Môže ísť najmä o roztoky solí (dihydrogénfosforečnan sodný, hydrogénfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý a podobne, alebo zmesi týchto solí), ktoré majú sterilný a izotonický charakter alebo o suché kompozície, ktoré po pridaní sterilnej vody alebo fyziologického roztoku poskytujú rekonštruované injikovateľné tekutiny.
Dávky imunosupresora a adenovírusu použité na injekciu môžu byť závislé na rôznych faktoroch, najmä na použitom spôsobe podania, na liečenej patológii, na géne, ktorý má byť exprimovaný alebo aj na požadovanom čase liečenia.
Vo všeobecnosti sa rekombinantné adenovírusy, podľa vynálezu, formulujú a podávajú vo forme dávok obsahujúcich medzi 104 a 1014 pfii/ml, výhodne medzi 106 a 1O10 pfu/ml. Výraz pfu (“plaque forming unit”) zodpovedá infekčnej potencii uvažovaného roztoku a je stanovený infikovaním príslušnej bunkovej kultúry a stanovením, zvyčajne po 5 dňoch, počtu pláží infikovaných buniek. Techniky stanovenia koncentrácie pfu vírusového roztoku sú veľmi dobre zdokumentované v literatúre. Pokiaľ ide o imunosupresory, menia sa ich dávky a injekčné podanie podľa ich charakteru. Nastavenie oboch týchto parametrov je v schopnostiach odborníka v danom odbore.
Lieková kombinácia podľa vynálezu sa môže použiť na liečenie alebo prevenciu mnohých patologických stavov. Podľa terapeutického génu vloženého do jedného adenovírusu môže byť uvedená kombinácia použitá na liečenie alebo prevenciu genetických chorôb (dystrofia, muskoviscidóza, atď.), neurodegeneratívnych chorôb (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, ALS, atď.), hyperproliferatívnych patológií (rakoviny, restenóza, atď.), patológií spojených s poruchami koagulácie alebo dyslipoproteinémiami, patológií spojených s vírusovými infekciami (hepatitídy, AIDS, atď.) a ďalších patologických stavov.
Predmetom vynálezu je taktiež každý spôsob terapeutického ošetrenia, pri ktorom sa použije nárokovaná lieková kombinácia.
V nasledujúcej časti popisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú len ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne definovaný formuláciou patentových nárokov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na pripojených výkresoch
Obr. 1 znázorňuje genetickú organizáciu adenovírusu Ad5. Úplná sekvencia adenovírusu Ad5 je k dispozícii na základe údajov zistených sekvenovaním a umožňuje od borníkovi selektovať alebo vytvoriť každé reštrikčné miesto a takto izolovať ľubovoľnú oblasť genómu.
Obr. 2 znázorňuje reštrikčnú mapu adenovírusu CAV2, kmeň Manhattan (podľa Spibey a kol., odkaz, ktorý už bol uvedený).
Obr. 3 znázorňuje vektor pAD5-gpl9k-beta-gal a
Obr. 4 znázorňuje konštrukciu adenovírusu Ad-gpl9kbeta-gal,deltaE 1 ,deltaE3.
Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii, ako preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, odstredenie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovom géle, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínu fenolom alebo sústavou tvorenou zmesou fenolu a chloroformu, precipitácia DNA v soľnom prostredí etanolom alebo izopropanolom, transformácia do Escherichia coli, atď., sú dostatočne známe a podrobne opísané v literatúre (Maniatis T a kol.: “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. a kol (ed.) “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, New York 1987).
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 sú komerčne dostupné (Bethesda Research Laboratories).
Na účel ligácie sa môžu fragmenty DNA separovať podľa veľkosti elektroforézou na agarózovom alebo akrylamidovom géle, extrahovať fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, precipitovať etanolom a potom inkubovať v prítomnosti DNA ligázy fägu T4 (Biolabs) podľa odporučenia dodávateľa.
Doplnenie prečnievajúcich 5' koncov sa môže uskutočniť Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I z E. coli (Biolabs) podľa špecifikácií dodávateľa. Deštrukcia prečnievajúcich 3' koncov sa uskutočňuje v prítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) použitej podľa odporučenia výrobcu. Deštrukcia prečnievajúcich 5'koncov sa uskutoční šetrným ošetrením nukleázou S1.
Riadená in vitro mutagenéza syntetickými oligodeoxynukleotidmi sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Taylorom a kol. (Nucleic Acids Res. 13, 8749 - 8764 (1985)), pričom sa používa súprava distribuovaná firmou Amersham.
Enzymatická amplifikácia fragmentu DNA technikou nazývanou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. a kol.: Science 230, 1350 - 1354 (1985); Mullis K. B. aFallonaF. A.: Meth. Enzým. 155, 335 - 350 (1987)) sa môže uskutočniť použitím činidla “DNA thermal cycler” (Perkín Elmer Cetus) podľa špecifikácií výrobcu.
Overenie nukleotidových sekvencii sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Sangerom a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467 (1977)), pričom sa používa súprava distribuovaná firmou Amersham.
Použité bunkové rady
V nasledovných príkladoch sa použijú alebo môžu byť použité nasledovné bunkové rady:
- Ľudský embryonálny renálny rad 239 (Graham a kol.: J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)). Tento rad obsahuje najmä vo forme integrovanej vo svojom genóme ľavú časť genómu ľudského adenovírusu Ad5 (12 %).
- Ľudský bunkový rad KB: pochádzajúci z ľudského epidermálneho karcinómu. Tento bunkový rad je dostupný v ATCC (referenčné číslo: CCL17), rovnako ako podmienky umožňujúce jeho kultiváciu.
- Ľudský bunkový rad Hela: pochádza z karcinómu ľudského epitelu. Tento rad je dostupný v ATCC (referenč
SK 282235 Β6 né číslo: CCL2), rovnako ako podmienky umožňujúce jeho kultiváciu.
- Psí bunkový rad MDCK: podmienky kultivácie buniek MDCK opísal najmä Macatney a kol.: Science 44, 9 (1988)).
- Bunkový rad gm DBP6 (Brough a kol.: Virology 190, 624 (1992)). Tento bunkový rad je tvorený bunkami Hela nesúcimi gén E2 adenovírusu pod kontrolou LTR z MMTV.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Konštrukcia defektných rekombinantných adenovírusov obsahujúcich terapeutický gén (gén LacZ z E. coli) pod kontrolou promótora LTR od RSV, pričom oba gény sú vložené v úrovni oblasti El.
Tieto adenovírusy sa konštruovali homológnou rekombináciou medzi plazmidom nesúcim ľavú časť adenovírusu Ad5, obe rekombinantné DNA a oblasť adenovírusu Ad5 (zodpovedajúcu proteínu IX) a DNA defektného adenovírusu nesúceho rôzne delécie
1. Konštrukcia vektora pAD5-gpl9k-beta-gal (obr. 3)
1.1. Konštrukcia plazmidu pGEM-gp 19k
Plazmid pAD5-gpl9k-beta-gal obsahuje sekvenciu DNA kódujúcu proteín gpl9k adenovírusu. Tento plazmid sa skonštruoval nasledovným spôsobom. Izoloval sa fragment Xbal genómu divého adenovírusu Ad5 obsahujúceho oblasť E3 a tento sa klonoval do zodpovedajúceho miesta plazmidu pGEM (Promega) s cieľom vytvoriť plazmid pGEM-E3. Fragment Hinfl obsahujúci kódujúcu sekvenciu proteínu gpl9k (nukleotidy 28628 až 29634 divého adenovírusu Ad5) sa potom izoloval z plazmidu pGEM-E3. Konce tohto fragmentu sa uvoľnia pôsobením Klenowovho fragmentu DNA polymerázy z E. coli (pozri všeobecné techniky molekulárnej biológie) a získaný fragment sa klonuje do miesta Smal plazmidu pGEMzf+ (Promega). Získaný plazmid sa označil ako pGEM-gp 19k (obr. 3).
1.2. Konštrukcia vektora pAD5-gpl9k-beta-gal
Tento príklad opisuje konštrukciu plazmidu obsahujúceho jednu alebo obe rekombinantné DNA obsahujúce ich vlastný promótor, ľavú časť genómu adenovírusu a suplementárnu časť (proteín pIX) umožňujúci homológnu rekombináciu. Tento vektor sa skonštruoval z plazmidu pAd.RSVbetaGal nasledovným spôsobom.
Plazmid pAd.RSVbetaGal obsahuje v orientácii 5' smerom k 3':
- fragment PvuII zodpovedajúci ľavému koncu adenovírusu Ad5 obsahujúci: sekvenciu ITR, počiatok replikácie, enkapsidačné signály a amplifikátor,
- gén kódujúci beta galaktozidázu pod kontrolou promótora RSV (vírus Rousovho sarkómu)
- drahý fragment genómu adenovírusu Ad5, ktorý umožňuje homológnu rekombináciu medzi plazmidom pAd.RSVbetaGal a adenovírusom dl324. Plazmid pAd.RSVbetaGal opísal Stradford-Perricaudet a kol.: (J. Clin. Invest. 90,626 (1992)).
Plazmid pAd.RSVbetaGal sa najskôr digeraje enzýmami Eagl a Clal. Táto digescia generuje prvý fragment nesúci najmä ľavú časť adenovírusu Ad5 a promótor LTR vírusu RSV. Paralelne sa vyreže enzýmami Eagl a Xbal plazmid pAd.RSVbetaGal. To poskytne druhý typ fragmentu nesúceho najmä promótor LTR vírusu RSV, gén LacZ a fragment genómu adenovírusu Ad5, ktorý umožní homológnu rekombináciu. Fragmenty Clal-Eagl a EaglXbal sa potom ligujú v prítomnosti fragmentu Xbal-Clal plazmidu pGEM-gpl9k (príklad 1.1) nesúceho kódujúcu sekvenciu gpl9k (pozri obr. 3). Takto získaný vektor označený ako pAD5-gpl9k-beta-Gal teda obsahuje:
- fragment PvUII zodpovedajúci ľavému koncu adenovírusu Ad 5 obsahujúcemu: sekvenciu ITR, počiatok replikácie a amplifikátor El A
-sekvenciu kódujúcu gpl9k pod kontrolou promótora vírusu RSV (vírus Rousovho sarkómu),
-gén kódujúci beta-galaktozidázu pod kontrolou promótora vírusu RSV (vírus Rousovho sarkómu) a
-druhý fragment genómu adenovírusu Ad5, ktorý umožňuje homológnu rekombináciu.
2. Konštrukcia rekombinantných adenovírasov
2.1. Konštrukcia rekombinantného adenovírusu s deléciou v oblasti El, nesúceho obe rekombinantné DNA vložené v rovnakej orientácii v úrovni oblasti El
Vektor pAD5-gpl9k-beta-gal sa linearizoval a kotransfekoval s deficitným adenovírusovým vektorom v géne El do buniek helper (rad 293) prinášajúcich v trans funkcie kódované oblasťami El (E1A aElB) adenovírusu.
Presnejšie definované, adenovírus Ad-gpl9k-betagaljdeltaEl sa získa homológnou rekombináciou in vivo medzi adenovírusom Ad-RSVbeta-gal (pozri StratfordPemcaudet, odkaz, ktoiý bol citovaný) a vektorom pAD5gpl9k-beta-gal podľa nasledovného protokolu: plazmid pAD5-gpl9k-beta-gal linearizovaný pomocou XmnI a adenovíras Ad-RSVbeta-gal linearizovaný enzýmom Clal sa kotransfekujú do bunkového radu 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého s cieľom umožniť homológnu rekombináciu. Takto vytvorené rekombinantné adenovírusy sa potom selektujú purifikáciou na doske. Po izolácii sa DNA rekombinantného adenovírusu amplifikuje v bunkovom rade 293, čo vedie k supematantu nad kultivačným prostredím obsahujúcemu nepurifikovaný rekombinantný defektný adenovírus, ktorý má koncentráciu asi 1O10 pfu/ml.
Vírusové častice sa vo všeobecnosti purifikujú odstredením na gradiente chloridu cézneho už známou technikou (pozri najmä Graham a kol.: Virology 52, 456 (1973)). Adenovíras Ad-gpl9k-beta-gal,deltaEl môže byť uchovávaný pri teplote -80 °C v 20 % glycerole.
2.2. Konštrukcia rekombinantného adenovírusu s deléciami v oblastiach El a E3, nesúceho obe rekombinantné DNA vložené v rovnakej orientácii v úrovni oblasti El (obr. 4)
Vektor pAD5-gpl9k-beta-gal sa linearizuje a kotransfekuje adenovírusovým vektorom deficitným v génoch El a E3 do buniek helper (rad 293) prinášajúcich v trans funkcie kódované oblasťami El (E1A a E1B) adenovírusu.
Presnejšie definované, adenovírus Ad-gpl9k-beta-gal, deltaEl, deltaE3 sa získa homológnou rekombináciou in vivo medzi mutantným adenovírusom Ad-dll324 (Thimmappaya a kol.: Celí 31, 543 (1981)) a vektorom pAD5-gpl9k-beta-gal podľa nasledovného protokolu: plazmid pAD5-gpl9k-beta-gal a adenovírus Ad-dll324 linearizovaný enzýmom Clal sa kotransfekujú do bunkového radu 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého s cieľom
SK 282235 Β6 ton Dickinson). Získané výsledky sú uvedené nasledujúcej tabuľke I.
Tabuľka I umožniť homológnu rekombináciu. Rekombinantné adenovírusy, ktoré sa takto získali sa potom selektujú purifikáciou na doske. Po izolácii sa rekombinantný adenovírus amplifikuje v bunkovom rade 293, čo vedie k supematantu nad kultivačným prostredím obsahujúcemu nepurifíkovaný rekombinantný defektný adenovírus, ktorý má koncentráciu asi 10lopfú/ml.
Vírusové častice sa vo všeobecnosti purifikujú odstredením v gradiente chloridu cézneho už známou technikou (pozri najmä Graham a kol.: Virology 52, 456 (1973)). Genóm rekombinantného adenovírusu sa potom overil analýzou southem blot. Adenovírus Ad-gpl9k-beta-gal,deltaEl,deltaE3 sa môže uchovávať pri teplote -80 °C v 20 % glycerole.
Príklad 2
Preukázanie imunoprotekčnej aktivity liekovej kombinácie podľa vynálezu.
dospelých myších samičiek DBA/2 sa náhodne rozdelí do šiestich skupín po desiatich myšiach a tieto myši sa ošetria podľa nasledovného injekčného protokolu:
-skupina la:
dostane intraokulámu injekciu 10 mg monoklonálnych protilátok anti-CD3 v dňoch -2, -1, 1, 2., 3, 4, a 5 a v deň 0 dostane intravenóznu injekciu 4.10’ pfú vírusu AdRSVbeta-gal (pozri Stratford-Perricaudet a kol, odkaz, ktorý už bol uvedený),
-skupina lb:
je ošetrená rovnakým spôsobom ako skupina la, pričom sa použije koncentrácia 4.109 pfú vírusu Ad-gpl9k-beta-gal (obr. 4),
-skupina 2a: dostane intraperitoneálnu injekciu 250 mg monoklonálnych protilátok anti-CD4 v dňoch -2, -1,1,4 a 7 a v deň 0 dostane intravenóznu injekciu 4.10® pfú vírusu Ad-RSVbeta-gal,
-skupina 2b:
je ošetrená rovnakým spôsobom ako skupina 2a, pričom sa použije vírusová koncentrácia 4.10’ pfú vírusu Adgpl9k-beta-gal,
-skupina 3a:
dostane intravenóznu injekciu 4.109 pfú Ad-beta-gal bez súčasného podania imunosupresora a
-skupina 3b:
dostane intravenóznu injekciu 4,109 pfú Ad-gpl9k-beta-gal bez súčasného podania imunosupresora.
V rôznych časoch sa vždy dve zvieratá z každej skupiny usmrtili, aby z nich bolo možné odobrať pečeň a slezinu.
2.1. Imunofluorescenčná analýza rozdelenia hlavných subpopulácií lymfocytov (CD3+, CD4+ a CD8+) vo vnútri splenocytov odobratých 15. deň po injekcii
Suspenzia izolovaných buniek sa pripraví z odobratých slezín. Vzorka týchto buniek sa analyzuje imunofluorescenčne pomocou špecifických protilátok pre každú lymfocytovú subpopuláciu. Odčítanie fluorescenčných buniek sa uskutočnilo použitím cytofluórometru (FACS Schan-Bec-
| Skupina 3a Ad-Bgal | Skupina 3b Ad-Bgalgp!9k | Skupina la anti CD3/ Ad-Bgal | Skupina 2a anti CD4/ Ad-Bgal | |||||
| % buniek exprimujúcich beta-gal na povrchu buniek | ||||||||
| CD3 | 20,4 | 17.5 | 20,6 | 21 | 5,4 | 6,1 | 12 | 10,3 |
| CD4 | 13,4 | 12,6 | 15,3 | 16,8 | 4,4 | 5,1 | 2,7 | 4,1 |
| CD8 | 5,5 | 5,5 | 6,1 | 6 | 20,2 | 23,0 | 7,9 | 6,7 |
Z tabuľky je zrejmý jednoznačný úbytok buniek CD3+, CD4+ a CD8+ u zvierat ošetrených protilátkou anti-CD3 a selektívny úbytok buniek CD4+ u zvierat ošetrených protilátkou anti-CD4.
2.2. Analýza cytotoxickej kapacity splenocytov odobratých 32. deň po injekcii a stimulovaných in vitro voči histokompatibilným cieľom exprimujúcim beta-gal
Druhá vzorka splenocytov izolovaných z ošetrených zvierat sa kultivovala in vitro počas 4 dní v prítomnosti buniek P815 exprimujúcich na ich povrchu beta-galaktozidázu. Po ukončení kultivácie sa vyhodnotila cytotoxická aktivita splenocytov voči cieľovému P815-beta-gal značenému rádioaktívnym izotopom Cr51. Cytotoxická aktivita vyjadrená percentuálnou eytolýzou sa stanovila konvenčným spôsobom v prítomnosti rôznych pomerov efektívnych buniek a cieľových buniek.
Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke II.
Tabuľka II
| Skupina | 2b | 3a |
| Ošetrenie | Anti-CDV Ad-Bgal-gpl9 | M-ígal |
| Pomer efektívnych a delových buniek | Cytolýza (%) | |
| 80/1 | 4 2 | 13 14 |
| 40/1 | 2 1 | 13 9 |
| 20/1 | 1 1 | 5 9 |
| 10/1 | 0 0 | 2 5 |
| 5/1 | 0 1 | 1 2 |
Splenocyty odobraté zvieratám, ktoré sa ošetrili protilátkou CD4, t. j. zvieratám skupiny 2b, vykazujú jednoznačnú neutralizáciu ich cytotoxickej kapacity.
2.3. Expresia aktivity beta-galaktozidázy v pečeni po 15 a 32 dňoch
Pečeň sa rozdelí na úseky a vyfarbí X-gal s cieľom zviditeľniť (vyvinúť) aktivity beta-galaktozidázy a eozínom s cieľom zviditeľniť histológiu rezu. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke III
SK 282235 Β6
Tabuľka III
| Počet buniek expriaujúcich figal | ||
| 15 | 32 | |
| Skupina 2a: lanti-cc4/Ad-Bgai) | 1 | 1 |
| Skúpia* 2b: (anti~CD4/Adgpl9Jr*-ígal) | 250 | 50 |
| Skupina 3a: [Äd-Bgal) | 3 | 0 |
| Skupina 3b: (AdgpL9k-figai) | 25 | 0 |
Z uvedených výsledkov vyplýva, že injekcia protilátky anti-CD4 združená s injekciou Adgpl9k-beta-gal indukuje výrazne prolongovanú expresiu uvažovaného génu. Takto možno pozorovať 30 dní po injekciách v prípade skupiny 2b významnú beta-galaktozidázovú aktivitu. Toto predĺženie, ktoré môže byť interpretované ako dôsledok javu tolerancie indukovaného podľa vynálezu, je výrazne väčší, než je predĺženie, ktoré by bolo možné očakávať v prípade jednoduchého súčtu účinkov imunosupresora anti-CD4 a rekombinantného adenovírusu Ad gpl9k-beta-gal.
Navyše sa po 30 dňoch v prípade skupiny 2b nepozorovala žiadna zápalová reakcia.
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Lieková kombinácia aspoň jedného imunosupresného činidla a aspoň jedného rekombinantného defektného adenovírusu, ktorého genóm obsahuje prvú rekombinantnú DNA obsahujúcu terapeutický gén a druhú rekombinantnú DNA obsahujúcu imunoprotekčný gén na následné, prerušované a/alebo časovo súčasné použitie na exogénovú transfekciu in vivo a/alebo ex-vivo.
- 2. Lieková kombinácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že imunosupresné činidlo sa výhodne zvolí z množiny zahŕňajúcej cyklosporín, FK506, azatioprín, kortikosteroidy a monoklonálne a polyklonálne protilátky.
- 3. Lieková kombinácia podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že ide o protilátky schopné inaktivovať imúnne molekuly alebo vyvolať deštrukciu buniek nesúcich tieto molekuly.
- 4. Lieková kombinácia podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že protilátka sa zvolí z množiny zahŕňajúcej anti-CD4, anti-CD2, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, anti-ICAM-1, anti-LFA-1 aCTLA4Ig.
- 5. Lieková kombinácia podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že terapeutický gén kóduje terapeutický proteín.
- 6. Lieková kombinácia podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúca sa tým, že terapeutický gén kóduje terapeutickú RNA.
- 7. Lieková kombinácia podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že imunoprotekčným génom je gén, ktorého produkt pôsobí na aktivitu hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) alebo na aktivitu cytokínov.
- 8. Lieková kombinácia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že imunoprotekčným génom je gén, ktorého produkt inhibuje aspoň čiastočne expresiu proteínov komplexu MHC alebo antigénovú prezentáciu.
- 9. Lieková kombinácia podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že imunoprotekčný gén je zvolený z množiny zahŕňajúcej gén gpl9k adenovírusu, gén ICP47 vírusu herpes a gén UL18 cytomegalovírusu.
- 10. Lieková kombinácia podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA genómu adenovírusu tvoria jedinú transkripčnú entitu.
- 11. Lieková kombinácia podľa niektorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA obsahujú každá svoj transkripčný promótor, pričom tieto promótory sú buď identické alebo odlišné.
- 12. Lieková kombinácia podľa nároku 11, v y z nečujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA sú vložené v rovnakej orientácii.
- 13. Lieková kombinácia podľa nároku 11, v y z n a čujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA sú vložené v opačnej orientácii.
- 14. Lieková kombinácia, podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA sú vložené na rovnaké miesto genómu adenovírusu, výhodne v úrovni oblastí El, E3 alebo E4.
- 15. Lieková kombinácia podľa nároku 14, v y z n a čujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA sú vložené v úrovni oblasti El.
- 16. Lieková kombinácia, podľa niektorého z nárokov 1 až 13, vyznačujúca sa tým, že obe rekombinantné DNA sú vložené na rôzne miesta genómu adenovírusu.
- 17. Lieková kombinácia podľa nároku 16, v y z n a čujúca sa tým, že jedna z rekombinantných DNA je vložená v úrovni oblasti El a druhá rekombinantná DNA je vložená v úrovni oblasti E3 alebo E4.
- 18. Lieková kombinácia, podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že adenovírusom je defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci sekvencie ITR a sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a nesúci deléciu celku alebo časti génov EI a E4.
- 19. Lieková kombinácia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že ide o adenovírus obsahujúci sekvencie ITR a sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu, a nesúci deléciu celku alebo časti génov El, E3 a E4.
- 20. Lieková kombinácia, podľa niektorého z nárokov 1 až 19, vyznačujúca sa tým, že ide o adenovírus, ktorého genóm je deléciou zbavený celku alebo časti génov El, E3, L5 a E4.
- 21. Lieková kombinácia, podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že rekombinantný adenovírus je ľudského, zvieracieho alebo zmiešaného pôvodu.
- 22. Lieková kombinácia podľa nároku 21, v y z n a čujúca sa tým, že rekombinantné adenovírusy ľudského pôvodu sú zvolené z adenovírusov zaradených do skupiny C, výhodne z rekombinantných adenovírusov typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5).
- 23. Lieková kombinácia podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že adenovírusy zvieracieho pôvodu sú zvolené z množiny zahŕňajúcej psie, hovädzie, myšie, ovčie, prasačie, vtáčie a opičie adenovírusy.
- 24. Lieková kombinácia, podľa niektorého z predošlých nárokov, vyznačujúca sa tým, že imunosupresné činidlo sa injikuje pred a po injekcii adenovírusu.
- 25. Lieková kombinácia, podľa niektorého z nárokov 1 až 23, vyznačujúca sa tým, že imunosupresné činidlo a rekombinantný adenovírus sa injikujú súčasne.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501662A FR2730411B1 (fr) | 1995-02-14 | 1995-02-14 | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
| PCT/FR1996/000218 WO1996025177A1 (fr) | 1995-02-14 | 1996-02-12 | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK110897A3 SK110897A3 (en) | 1998-01-14 |
| SK282235B6 true SK282235B6 (sk) | 2001-12-03 |
Family
ID=9476106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1108-97A SK282235B6 (sk) | 1995-02-14 | 1996-02-12 | Lieková kombinácia na transfekciu a expresiu exogénov in vivo alebo ex vivo |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030004091A1 (sk) |
| EP (1) | EP0809516B1 (sk) |
| JP (1) | JPH11500430A (sk) |
| KR (1) | KR100402540B1 (sk) |
| AT (1) | ATE204481T1 (sk) |
| AU (1) | AU717218B2 (sk) |
| BR (1) | BR9607310A (sk) |
| CA (1) | CA2211039C (sk) |
| CZ (1) | CZ258197A3 (sk) |
| DE (1) | DE69614668T2 (sk) |
| DK (1) | DK0809516T3 (sk) |
| ES (1) | ES2163612T3 (sk) |
| FI (1) | FI119176B (sk) |
| FR (1) | FR2730411B1 (sk) |
| GR (1) | GR3036438T3 (sk) |
| HU (1) | HU222991B1 (sk) |
| IL (1) | IL117116A0 (sk) |
| MX (1) | MX9706017A (sk) |
| NO (1) | NO320072B1 (sk) |
| PT (1) | PT809516E (sk) |
| SK (1) | SK282235B6 (sk) |
| WO (1) | WO1996025177A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA961161B (sk) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6451571B1 (en) | 1994-05-02 | 2002-09-17 | University Of Washington | Thymidine kinase mutants |
| AU4088697A (en) * | 1996-08-26 | 1998-03-19 | Chiron Corporation | Postinfection human immunodeficiency virus (hiv) vaccination therapy |
| EP1025242A1 (en) | 1997-10-30 | 2000-08-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | A method of inhibiting an immune response to a recombinant vector |
| EP1141314A2 (en) | 1998-12-31 | 2001-10-10 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| AU5470900A (en) * | 1999-06-08 | 2000-12-28 | Children's Hospital Of Philadelphia, The | Methods for preventing formation of inhibitory antibodies in the setting of genetherapy |
| FR2799472B1 (fr) | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| EP1294699B1 (en) | 2000-05-12 | 2016-04-13 | Genzyme Corporation | Modulators of tnf- alpha signalling |
| AU2002320314A1 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-21 | Chiron, Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US7569217B2 (en) * | 2001-09-24 | 2009-08-04 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus E1 and E4 regions |
| US20030211075A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-11-13 | Thorpe Philip E. | Combined compositions for tumor vasculature coagulation and treatment |
| DK1562571T3 (da) * | 2002-11-21 | 2011-12-05 | Genzyme Corp | Kombination af et diamidderivat og immunsuppressive midler til hæmning af transplantatafstødning |
| EP1567138B1 (en) * | 2002-11-21 | 2011-01-05 | Genzyme Corporation | Use of a diamide derivative for inhibiting chronic transplant rejection |
| JP2007520566A (ja) * | 2004-02-04 | 2007-07-26 | ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク | 自己免疫治療のための抗ｃｄ３及び抗原特異的免疫療法 |
| WO2008013918A2 (en) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Myelin Repair Foundation, Inc. | Cell cycle regulation and differentiation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994016065A1 (en) * | 1992-12-31 | 1994-07-21 | Exemplar Corporation | Producing cells for transplantation to reduce host rejection and resulting cells |
| WO1994016080A1 (en) * | 1993-01-08 | 1994-07-21 | Exemplar Corporation | An in vitro/in vivo method for identifying anti-neoplastic drugs |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5872154A (en) * | 1995-02-24 | 1999-02-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus |
-
1995
- 1995-02-14 FR FR9501662A patent/FR2730411B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-12 JP JP8524707A patent/JPH11500430A/ja not_active Ceased
- 1996-02-12 ES ES96903080T patent/ES2163612T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 EP EP96903080A patent/EP0809516B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 AT AT96903080T patent/ATE204481T1/de active
- 1996-02-12 CA CA2211039A patent/CA2211039C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-12 IL IL11711696A patent/IL117116A0/xx unknown
- 1996-02-12 CZ CZ972581A patent/CZ258197A3/cs unknown
- 1996-02-12 AU AU47238/96A patent/AU717218B2/en not_active Ceased
- 1996-02-12 DK DK96903080T patent/DK0809516T3/da active
- 1996-02-12 HU HU9800635A patent/HU222991B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 DE DE69614668T patent/DE69614668T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 US US08/894,246 patent/US20030004091A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-12 WO PCT/FR1996/000218 patent/WO1996025177A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-02-12 BR BR9607310A patent/BR9607310A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-12 SK SK1108-97A patent/SK282235B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 PT PT96903080T patent/PT809516E/pt unknown
- 1996-02-12 MX MX9706017A patent/MX9706017A/es unknown
- 1996-02-12 KR KR1019970705594A patent/KR100402540B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-13 ZA ZA961161A patent/ZA961161B/xx unknown
-
1997
- 1997-08-13 FI FI973323A patent/FI119176B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 NO NO19973724A patent/NO320072B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-23 GR GR20010400947T patent/GR3036438T3/el unknown
-
2004
- 2004-04-14 US US10/823,682 patent/US20040265276A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6669942B2 (en) | Defective adenoviruses including a therapeutic gene and an immunoprotectove gene | |
| JP6817979B2 (ja) | 腫瘍選択的ｅ１ａおよびｅ１ｂ変異体 | |
| ES2310924T3 (es) | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. | |
| EP2986311B1 (en) | Enhanced adoptive cell therapy | |
| RU2711371C2 (ru) | Аденовирус, содержащий альбумин-связывающий участок | |
| FI118011B (fi) | Menetelmä replikaatiokyvyn suhteen puutteellisen yhdistelmä-DNA-adenoviruksen tuottamiseksi | |
| KR101662574B1 (ko) | 유인원 ｅ 아데노바이러스 ｓａｄｖ-39, -25.2, -26, -30, -37, 및 -38 | |
| SK144795A3 (en) | Application of recombinant adenovirus of the animal origin for preparing of farmaceutical agent | |
| JP2020521471A (ja) | 導入遺伝子を保持する組換えアデノウイルス | |
| SK282235B6 (sk) | Lieková kombinácia na transfekciu a expresiu exogénov in vivo alebo ex vivo | |
| JP2020504767A (ja) | 武装した複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルス | |
| JPH11500736A (ja) | 遺伝子治療ベクターを投与するための方法及び組成物 | |
| WO1995014101A1 (fr) | Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers | |
| JP2010512760A (ja) | 組換えｋｈｐ５３遺伝子のアデノウイルス組換え体及びその調製方法と用途 | |
| US20210128653A1 (en) | Replication-enhanced oncolytic adenoviruses | |
| FR2729674A1 (fr) | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20150212 |