KR19980702199A - 생체내 외인성 형질감염 및 발현용으로 유용한 의약 배합물 - Google Patents
생체내 외인성 형질감염 및 발현용으로 유용한 의약 배합물 Download PDFInfo
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Abstract
생체내 및/또는 생체외 외인성 형질감염에 연속적, 간헐적 및/또는 동시 사용을 위한, 치료 유전자를 함유하는 제 1 재조합 DNA 및 면역보호 유전자를 함유하는 제 2 재조합 DNA를 포함하는 게놈을 갖는 적어도 하나의 재조합 아데노바이러스 및 적어도 하나의 면역억제제의 의약 배합물.
Description
유전자 치료는 감염된 세포 또는 기관에 유전자 정보를 도입시킴으로써 결손 또는 비정상(돌연변이, 이상 발현 등)을 교정하는 것으로 이루어진다. 이러한 유전자 정보는 시험관 내 또는 생체 외에서 기관으로부터 제거된 세포로 도입될 수 있고, 이어서 변형된 세포는 기관 또는 생체 내 적당한 조직중으로 직접 재도입된다. 두 번째의 경우, 다양하고 상이한 물리적 기술이 벡터로서 바이러스의 사용을 포함한 형질감염을 위해 존재한다. 이점에 있어서, 다양하고 상이한 바이러스가 특정 세포군을 형질감염시키는 능력을 위해 시험되어 왔다. 특히, 이러한 바이러스에는 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS, 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스가 포함된다.
이러한 바이러스 중, 아데노바이러스는 유전자 치료에서 사용되기에 유리한 특성을 나타낸다. 아데노바이러스는 휴지기 세포를 감염시킬 수 있고 감염된 세포의 게놈으로 통합되지 않는 다소 광범위한 숙주 스펙트럼을 가진다. 아데노바이러스는 약 36 kb 크기의 선형 이본쇄 DNA를 함유한 바이러스이다. 이러한 게놈은 특히, 말단에서 역 반복 서열(ITR), 캡시드화 서열, 초기 유전자 및 말기 유전자(도 1 참조)를 포함한다. 주요 초기 유전자는 유전자 E1(E1a 및 E1b), E2, E3 및 E4이다. 주요 말기 유전자는 유전자 L1 내지 L5이다.
전술한 아데노바이러스 특성에서, 이러한 바이러스는 이미 생체내 유전자 형질감염을 위해 사용되었다. 이러한 이유로 해서, 상이한 아데노바이러스-유도 벡터는 제조되어 다양하고 상이한 유전자(β-gal, OTC, α-IAT, 사이토카인, 등)와 통합된다. 이러한 각각의 작제물에서, 아데노바이러스는 감염된 세포에서 복제할 수 있는 방법으로 변형된다. 따라서, 종래 기술에서 설명된 작제물은 E1(E1a 및 E1b) 및 이들의 자리에 삽입된 이종 DNA 서열로 결실된 E3 영역으로부터의 아데노바이러스이다[참조 문헌 : Levreto et al., Gene 101(1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50(1986) 161].
그러나, 모든 공지된 바이러스의 경우에서와 같이, 야생형 바이러스[참조 문헌 : Route et al., J, Virol. 65 (1991) 1450] 또는 복제에 결함이 있는 재조합 바이러스[참조 문헌 : Yang et al., PNAS (1994) 4407]의 투여가 실질적인 면역 반응을 유도한다.
면역 시스템의 주요 목적은 각각의 보전 또는“자가”보전이다. 그러나, 그것은 감염체의 제거 및 이식과 종양의 거부를 이끌고, 유기체의 이러한 강력한 방어 메카니즘은 대항하고 자가면역 질환을 일으킨다. 이러한 비-반응의 상태는 외부 항원이 제거되었을 때,“자가”항원으로 여기고 생리학적 내성의 상태로서 규정된다. 외부 요인을 제거하기 위해, 면역 시스템은 2가지 유형의 메카니즘을 개발한다. 첫번째는 B 림프구(사람의 면역 용어)에 의한 특정 항체의 생산이다. 이러한 항체는 항원을 고정시키고 불활성화시키거나 유기체로부터 제거한다. 두번째 방어 메카니즘은 세포성 면역을 포함하고 문제의 항체를 위한 특이적 수용체를 나르는 이러한 세포독성 T 림프구중 T 림프구를 사용한다. T 수용체에 의한 항체의 재인식은 주요 조직적합성 복합체 또는 Ⅰ 및 Ⅱ류 MHC의 유전자를 통해 암호화된 단백질과 연관되어 나중에 발현되는 것이 필요하다.
결과적으로, 감염된 세포에 대해 개발된 이 면역 반응은 (ⅰ) 감염된 세포의 파괴를 유도함으로써 치료 유전자가 발현되는 동안 기간 및 치료 효과를 제한하고, (ⅱ) 병행하여, 실질적인 염증 반응을 유도하며, (ⅲ) 반복된 주입 후 감염된 세포의 빠른 제거을 가져오기 때문에, 유전자 치료에서 바이러스 벡터의 사용에 대한 주요 장애를 구성한다. 감염된 세포에 대한 본 면역 반응의 크기는 주입을 유지하는 기관의 성질 및 사용되는 주사 방법에 따라 변화한다. 따라서, 면역컴피턴트 마우스의 근육내로 투여된 재조합 아데노바이러스에 의해 암호화된 β-갈락톡시다아제의 발현은 주입 후 40일에 최소 수준으로 감소한다[참조 문헌 : Kass-Eisler et al., PNAS 90 (1993) 11498]. 동일한 방법으로, 아데노바이러스를 사용하여 간에 형질감염된 유전자의 발현은 주입 후 10일에 매우 감소하고[참조문헌: Yang Y et al., 1994 immunity 1443-442] 아데노바이러스를 사용하여 혈우병에 걸린 개의 간세포로 형질감염된 Ⅳ인자의 발현은 주입 100일 후에 없어졌다[참조문헌: Kay et al., PNAS 91 (1994) 2353].
유전자 치료를 목적으로 아데노바이러스로부터 유도된 벡터의 이용 관점에서, 그 자체 또는 감염된 세포에 대해 개발된 면역 반응을 제어하기 위해 필요한 것 같다.
전술한 것으로부터, 면역 시스템의 활성화는 우선 통상적으로 파괴되는 아데노바이러스로부터 유도된 벡터 같은 유기체(비-자기 또는 변화된 자기)에 대해 이종인 요소의 시스템에 의한 재인식이 필요하다. 최근에는, 면역조정 전략이“허용성”면역 환경을 창조하는 것, 즉 예비규정된 외부 항체에 관한 내성의 상태를 유도하는 것으로 개발되어 왔다.
본 발명은 유전자 치료 및 특히 해당 치료 유전자를 발현시키기 위한 아데노바이러스의 사용에 관한 것이다. 더 특히, 본 발명은 2가지 유형의 치료제의 병행된 사용에 기초한 유전자 기원의 병리 치료를 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
도 1 : Ad5 아데노바이러스의 유전적 구성. Ad5의 완전한 서열은 데이터베이스에서 용이하고 당분야의 전문가가 제한 부위를 선택하거나 생성하고 이어서 게놈의 일부 영역을 분리하는 것을 가능하게 한다.
도 2 : CAV2 아데노바이러스의 맨하탄 균주의 제한도(상기에 언급된 Spibey 등에 따라서).
도 3 : 벡터 pAD5-gp19k-βgal의 작제.
도 4 : 아데노바이러스 Ad-gp19k-βgal, △E1, △E3의 작제.
일반적인 분자 생물학적 기술
플라스미드 DNA의 예비 추출, 칼슘 클로라이드 구배에서의 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로오즈 또는 아크릴아미드 겔에서의 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 페놀 또는 페놀/클로로포름으로의 단백질 추출, 에탄올 또는 이소프로판올로의 식염수 매질에서의 DNA 침전, E. coli 등으로의 형질전환 등과 같이 분자 생물학에 통상적으로 사용되는 방법이 당분야 전문가들에게 잘 알려져 있고 참고문헌에 충분히 기재되어 있다 [Maniatis T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, 1987].
pBR322와 pUC 유형의 플라스미드, 및 M13 시리즈의 파지는 시판용으로 수득된다 (Bethesda Research Laboratories).
연결을 위하여, DNA 단편은 아가로오즈 또는 아크릴아미드 겔에서의 전기영동에 의해 이들의 크기에 따라서 분리되고, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출되며, 에탄올로 침전되고, 이어서 공급자의 권장에 따라서 파지 T4 DNA 리가아제(Biolabs)의 존재하에 배양될 수 있다.
돌출 5' 말단을 공급자의 설명서에 따라서 E. coli DNA 폴리머라아제 I(Biolabs)의 클레나우 단편을 사용하여 채울 수 있다. 돌출 3' 말단을 제조자의 추천에 따라서 사용되는 파지 T4 DNA 폴리머라아제(Biolabs)의 존재하에 파괴한다. 돌출 5' 말단을 S1 뉴클레아제로 조심스럽게 처리함으로써 파괴한다.
시험관내에서 합성 올리고디옥시뉴클레오티드를 사용한 부위-지향 돌연변이 유발은 Taylor 등에 의해 개발된 방법을 사용하고 [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] Amersham에 의해 공급된 키트를 사용하여 수행할 수 있다.
PCR[polymerase-catalyzed chain reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]이라는 기술에 의한 DNA 단편의 효소적 증폭은 제조자의 설명서에 따라서 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 Amersham에 의해 공급된 키트를 사용하여 Sanger 등에 의해서 개발된 방법에 의해 입증할 수 있다. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].
사용된 세포주
하기의 실시예에서, 하기의 세포주를 사용했거나 사용할 수 있다.
- 사람 배 신장 세포주 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). 이러한 세포주는 특히 이의 게놈에 통합된, 사람 아데노바이러스 Ad5 게놈의 좌측 부분(12%)을 함유한다.
- 사람 상피 암종으로부터 유도된 KB 사람 세포주. 이러한 세포주는 이것을 배양하기 위한 조건에 따라 ATCC(ref. CCL17)로부터 수득할 수 있다.
- 사람 상피 암종으로부터 유도된 헬라 사람 세포주. 이러한 세포주는 이것을 배양하기 위한 조건에 따라 ATCC(ref. CCL2)로부터 수득할 수 있다.
- MDCK 개 세포주. MDCK 세포를 배양하기 위한 조건은 특히 Macatney 등에 의해 Science 44 (1988) 9에 기재되어 있다.
- gm DBP6 세포주 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). 이러한 세포주는 MMTV의 LTR의 조절하에 아데노바이러스 E2 유전자를 운반하는 헬라 세포로 이루어져 있다.
이 수준에서 본 발명이 개입하는 것이 정확하다. 본 발명은 감염된 세포로부터 아데노바이러스의 빠른 제거를 방지하는 쪽으로 지향되어 왔고 따라서 연속적 방식으로 나르는 치료 유전자의 생체내 발현에서 연장되는 쪽으로 지향되어 왔다.
최근에, 본 출원인은 감염된 세포에서 특정 유전자의 동시-발현이 면역보호 효과를 유도할 수 있고 따라서 벡터 및/또는 감염된 세포가 면역 시스템을 피할 수 있게 한다는 것을 나타냈다. 특히, 본 출원인은 치료적 중요성의 유전자의 발현인 개발된 아데노바이러스는 면역보호 유전자와 결합될 수 있다(프랑스 제 94 12346 호). 특히, 본 유전자는 생성물이 주요 조직적합성 복합체(HMC) 또는 사이토카인의 활성에 영향을 미치는 유전자이고, 억제하지 않으면, 벡터 또는 감염된 세포에 대한 임의의 면역 반응을 상당히 감소하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 생성물은 적어도 부분적으로 HMC 단백질의 발현 및 항체의 표현을 부분적으로 억제하고 유리하게는 벡터 또는 감염된 세포에 대한 면역 반응의 중요한 감소, 따라서 연장된 치료 효과를 초래한다.
뜻밖에, 본 출원인은 이러한 벡터의 치료 효과가 면역억제제와 결합함으로써 주목할반하게 연장될 수 있다는 것을 증명하였다. 면역 시스템에 의한 해당 벡터의 제거 및/또는 감염된 세포의 파괴는 벡터 및 면역억제제의 면역보호 효과의 단순한 병렬에 의해 기대되는 것보다 훨씬 큰 기간에 의해 시간이 늦추어 지는 것이 발견되었다. 유리하게는, 본 발명의 제목인 의약 조성물은 면역 시스템의“슈도-무력(pseudo-inertia)”의 현상을 유도하고, 이 현상은 장기간의 치료 유전자에서 발현을 선호한다.
본 발명의 의미내에서, 면역억제제는 전체적으로 또는 부분적으로 적어도 하나의 면역 시그널링 경로를 억제할 수 있는 임의의 화합물을 나타낸다. 일반적으로는, 면역억제제는 동종이식 거부를 방지하기 위해서 이식에서 및 특정 자가면역 질환의 치료에서 통상적으로 사용되고 있다. 시판되고 있는 제품은 코티코스테로이드, 아자티오프린, 사이클로스포린 또는 FK506 같은 화학적 면역억제제, 또는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 같은 생물학적 면역억제제가 있다. 면역억제제의 첫번째 카테고리 및 이러한 사이클로스포린 및 FK506 중, 특히 분화 및 림프구성 세포의 증식에서 중요한 역할을 하는 인터류킨 2 같은 사이토카인의 생성에 상당한 억제 효과를 방출한다. 불행하게도, 이러한 유형의 면역억제제가 효과적이기 위해서는 연속적으로 투여되어야 하고, 무언가 이들의 독성의 문제에 조만간 들어가야 한다. 따라서, 사이클로스포린이 신독성이고 또한 고혈압 또는 신경성 장애를 일으킬 수 있는 반면에 아자티오프린은 잠재적으로 척수독성이다.
특히, 항체에 관해서는, 이들은 면역 시스템의 림프구에 대한 항체이다. 면역억제제로서 사용된 첫번째 항체는 T 림프구에 대한 항-CD3이다. 이의 표적은 T 세포 항원을 위한 수용체를 형성하는 CD3 분자의 폴리펩타이드 사슬의 하나이다. 이어서 항체에 의해 인식되는 CD3+ T 세포의 기능성 불활성화가 이어진다. 본 경우에서 당해의 문제에 관해서는, 치료 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스의 것과 함께 이러한 유형의 면역억제제의 투여는 바이러스성 벡터 및/또는 감염된 세포의 표면에 관한 숙주의 면역 반응을 차단하는 위치일 수 있다. 항-CD4, -CD2, CD-8, CD28, -B7, -ICAM-1 및 -LFA-1 항체가 동일한 원리로 사용될 수 있다.
본 출원인은 현재 기타 독성 문제를 일으킴없이 면역 시스템의 반응을 억제하지 않고, 특히 실질적으로 지연에 효과적인 치료의 신규한 방법을 개발해 왔다.
더 특히, 본 발명은 재조합 아데노바이러스의 조합된 사용과 결합된 상당히 상승적 효과의 표시에서부터 치료적 중요성의 유전자의 발현이 앞서 전술한 것과 같은, 및 적어도 하나의 면역억제제가 면역보호 유전자의 것과 결합되는 것으로 연속된다.
따라서 본 발명은 초기에 적어도 하나의 면역억제제 및 치료 유전자를 함유한 제 1 재조합 DNA와 면역억제 유전자를 함유한 제 2 재조합 DNA를 포함하는 게놈의 적어도 하나의 재조합 아데노바이러스의 의약 배합물, 연속적이기 위해, 시간 동안 중간 및/또는 동시적 사용이 생체내 및/또는 생체외에서 외인성 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
앞서 지적한 바와 같이, 본 발명은 특히 면역억제제의 활성과 치료 유전자의 발현에서 발현된 면역보호성 유전자의 효과 사이의 상승적 효과의 증거에 기준한다.
이러한 조합된 사용은 뚜렷하게 연장된 치료 효과를 성취할 수 있고 특히 면역억제제의 함량에 관해 상당히 감소된 용량을 필요로 하는 것이 가능하다.
하기에 설명한 바와 같이, 본 발명의 조합된 치료의 두 가지 성분은 시간에 걸쳐 연속적으로, 단속적으로 및/또는 동시에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 면역억제제는 아데노바이러스의 주입 전후에 주입된다. 본 발명을 이행하는 방법에 따라, 면역억제제의 투여는 시간에 걸쳐 일정할 수 있고, 더 바람직하게는 규칙적으로 반복될 수 있다. 특정 경우에는, 두 성분이 분리되어 포장된다. 투여가 동시에 일어날 경우에, 함께 투여되기 전에 필요한 만큼 혼합될 수 있고, 반면에 동시지만 분리되어 투여될 수도 있다. 특히, 투여되는 두 제제의 경로가 상이할 수 있다.
본 발명에 따라, 임의의 화합물은 면역억제제로서 사용될 수 있는 적어도 하나의 면역 시그널링 경로에서 전체적으로 또는 부분적으로 억제될 수 있다. 본 화합물은 특히, 사이클로스포린, FK506, 아자티오프린, 코티코스테로이드 및 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로부터 선택될 수 있다. 용도는 바람직하게는 면역 분자를 불활성하게 할 수 있거나 이러한 분자를 나르는 면역 세포의 파괴를 유도하는 항체로부터 제조된다. 특히, 항-CD4, -CD3, -CD2, CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1 및 -LFA1 항체는 항체로서 사용될 수 있다. 또한, CTLA-4 분자 (CD28과 상동)와 면역글로불린 간의 융합 단백질인 CTLA4Ig와 같은 하이브리드 분자가 만들어져 사용될 수 있다. 이 분자의 G1Fc 부위는 B7 분자에 결합함으로써, T 세포의 활성을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: D. J; Lenschow; Science,257, 789, 1992]. 본 발명의 범위가 상기에서 열거된 면역억제물질에만 제한되지 않는다는 것은 자명하다. 이러한 면역억제물질은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스의 게놈에 존재하는 재조합 DNA는, 고려중인 유전자(치료 또는 면역예방적) 및 적절한 위치에, 발현될 수 있는 시그널을 포함하는 DNA 단편으로서, 이는 시험관내에서 작제되며, 그리고 나서, 아데노바이러스의 게놈에 삽입된다. 본 발명의 범위내에서 사용되는 재조합 DNA는 상보적 DNA (cDNA), 게놈 DNA (gDNA), 또는 예를 들면, 하나 이상의 인트론이 삽입된 cDNA로 이루어진 하이브리드 작제물이다. 이들 DNA는 인간, 동물, 식물, 세균, 바이러스 등의 기원을 가진다. cDNA 또는 gDNA로 만들어져서 특히 유리하게 사용된다.
치료 효과를 지닌 생성물을 암호화하는 임의의 유전자는, 본 발명의 벡터를 작제하기 위해 사용될 수 있는 치료 유전자로 언급될 수 있다. 이렇게 암호화된 생성물은 단백질, 펩타이드, RNA 등이다.
단백질 생성물은 표적 세포에 관하여 상동일 수 있다(즉, 표적세포가 어떠한 병상(病狀)도 보이지 않을때, 표적세포 내에서 정상적으로 발현되는 생성물일 수 있다). 이러한 경우에, 단백질의 발현은, 예를 들면 세포내의 불충분한 발현 또는, 변형에 기인한 불활성 또는 약활성 단백질의 발현을 보충하거나, 심지어는 상기 단백질의 과다발현까지도 가능케한다. 치료 유전자는 또한, 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질 돌연변이체를 암호화할 수도 있다. 또한, 단백질 생성물은 표적세포에 관해 이형일 수도 있다. 이러한 경우에, 발현되는 단백질은, 예를 들면 세포내에 부족한 활성을 보충하거나 제공할 수 있어서 병상에 저항하거나 면역 반응을 자극하는 것을 허용케한다.
보다 상세히 언급될 수 있는 본 발명의 의미내에서, 그러한 치료 단백질 생성물은 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, TNF, 등 (FR 9203120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이를 합성하기 위한 이의 전구체 또는 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀, 등; 전지질단백질: ApoAI, ApoAIV, ApoE, 등 (FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (FR 9111947), 뮤코비시도시스 결합된 CFTR 단백질, 종양-억압 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, 등 (FR 93 04745), 응고 관련 인자를 암호화하는 유전자: VII, VIII 및 IX 인자, DNA 복구에 개재하는 유전자, 등이다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 치료 유전자는 또한, 표적세포에서의 발현이 유전자 발현 또는 세포 mRNA 전사를 조절할 수 있는 안티센스 유전자이거나 서열일 수도 있다. 상기 서열은, 예를 들면, 표적세포내에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사됨으로써 특허 140 308에 기술된 방법에 따라 mRNA의 단백질로의 해독을 차단시킬 수 있다. 안티센스 서열은 또한, 표적 RNA를 선별적으로 파괴할 수 있는 리보자임을 암호화하는 서열을 포함한다.
치료 유전자는 인간, 동물, 식물, 세균, 바이러스 등의 기원이다. 그들은 당업자에게 공지된 임의의 기술, 특히, 라이브러리 스크린에 의해, 화학 합성에 의해 또는 라이브러리 스크린으로 얻어지는 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 범위내에서 사용되는 면역보호 유전자는 상이한 유형일 수 있다. 전술한 바와 같이, 이는, 주 조직적합성 복합체 (MHC)의 활성 또는 사이토카인의 활성에 작용하는 생성물을 암호화하는 유전자이다. 바람직하게, 이는 MHC 단백질의 발현 또는 항원 제시를 적어도 부분적으로 억제하는 생성물을 암호화하는 유전자이다. 바람직한 예로서, 상기는 아데노바이러스 E3 영역에 함유된 임의 유전자, 허피스 바이러스 ICP47 유전자 또는 사이토메갈로바이러스 UL18 유전자로 만들어질 수 있다.
아데노바이러스 게놈의 E3 영역은, 선택적 스플라이싱에 의한 상이한 판독 프레임을 가지므로, 상이한 단백질을 만들 수 있다. 이들 중에서, Gp19k (또는 E3-19k) 단백질은 소포체 (ER) 막에 위치하는 트랜스멤브레인 당단백질이다. 이 단백질은 MHC-1 분자에 결합할 수 있는 루미날 도메인 및 마이크로튜블 (또는 튜블린)에 결합할 수 있는 C-말단 세포질 끝을 포함하는데, 후자는 gp19 단백질을 ER 막내에 장착하도록 하는 효과를 가진다. 이렇게 해서, Gp19k는 MHC-I 분자와 상호작용하여 이들을 ER내에 가둬둠으로써 세포 표면에서의 이들 분자의 발현을 억제할 수 있다. 그러나, gp19k 단백질은 바이러스 복제 부재하에서 아데노바이러스에 의해 약하게 발현된다. 더우기, gp19k의 발현은 스플라이싱에도 좌우된다. gp19k를 암호화하는 서열 (바람직하게는 cDNA)을 함유한 재조합 DNA를 본 발명 벡터안으로 도입함으로써, 상기 단백질의 발현을 조절하고 최적으로 할 수 있다. 특히, 항상적인(constitutive) 프로모터를 이용하고 다른 판독 프레임을 억제함으로써, 이 단백질의 발현량을 크게 증가시킬 수 있고, 바이러스 복제 및 유도 요소의 존재에 상관없이 자유롭게 발현시킬 수 있다. 이는, 특히 유리하게도 CTL에 의한 감염 세포의 용해를 상당량 감소시켜서 치료 유전자의 생체내 생성을 증가 및 연장시킬 수 있다.
아데노바이러스 게놈의 E3 영역에 의해 암호화되는 다른 단백질로서, 10.4k 및 14.5k 단백질은 이들 유전자를 본 발명 벡터내로 통합하는데 관하여 유인시키는 일정 성질을 나타낸다.
허피스 심플렉스 바이러스의 ICP47 유전자는, 본 발명의 의미내에서 특히 바람직한 또 다른 면역보호 유전자를 나타낸다. 허피스 심플렉스 바이러스에 의해 감염된 세포는 CTL에 의해 유도되는 용해에 내성을 나타낸다. 이는, 세포 표면에서 MHC-1 분자의 발현을 감소시킬 수 있는 ICP47 유전자가 이러한 내성을 제공할 수 있는 것으로 드러났다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 DNA로의 ICP47 유전자의 통합은 본 발명의 재조합 바이러스가 면역 시스템을 피할 수 있도록 할 수 있다.
사이토메갈로바이러스의 UL18 유전자는 본 발명에 따른 면역보호 유전자의 또 다른 바람직한 예를 나타낸다. UL18 유전자의 생성물은 β2-마이크로글로불린에 결합할 수 있다[참고문헌; Brown et al. Nature 347 (1990) 770]. β2-마이크로글로불린은 MHC-I 분자의 체인 중 하나이다. 이리하여, 본 발명에 따른 재조합 DNA로의 UL18의 통합은, 본 발명의 바이러스에 의해 감염된 세포내의 기능적 β2-마이크로글로불린 분자의 수를 감소시킬 수 있으며, 따라서 완전하고 기능적인 MHC-I 분자를 생성하는 이들 세포의 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이런 유형의 작제물은 감염된 세포가 CTLs에 의한 용해로부터 보호받을 수 있도록 가능케한다.
상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명의 범위내에서 사용되는 면역예방 유전자는, 또 다른 바람직한 구체예에서, 사이토카인의 활성 또는 이의 시그널링 경로를 억제하는 생성물을 암호화하는 유전자이다. 사이토카인은 면역 시스템을 위한 시그널 분자로서 작용하는 분비 단백질의 한 계열이다. 그들은 면역 시스템 세포를 끌어당기며, 그들을 활성화하고 그들이 증식하도록 유도시킬 수 있으며, 심지어는 감염된 세포에 직접 작용하여 감염된 세포를 죽일 수도 있다.
사이토카인의 활성 또는 시그널링 경로에 영향을 미치는 생성물을 암호화하는 유전자 중에서, 상기는 사이토카인의 합성에 관여된 유전자이거나 또는 사이토카인을 가둬두거나 그들의 활성에 반대로 작용하거나 또는 세포내 시그널링 경로를 간섭하는 생성물을 암호화하는 유전자일 수 있다. 지적될 수 있는 바람직한 예로서, 특히, 엡스테인 바르 바이러스의 BCRF1 유전자, 카우팍스 바이러스의 crmA 및 crmB 유전자, 백시니아 바이러스의 B15R 및 B18R 유전자, 사이토메갈로바이러스의 US28 유전자, 및 아데노바이러스의 E3-14.7, E3-10.4 및 E3-14.5 유전자를 들 수 있다.
백시니아 바이러스의 B15R 유전자는 인터류킨-1β (인터류킨-1의 분비형)에 결합할 수 있는 용해성 단백질을 암호화함으로써, 이러한 사이토카인이 세포 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 이리하여, 인터류킨-1은 항원 공격에 대한 반응으로 생성된 제 1 사이토카인 중의 하나로서, 감염 개시부에서의 면역 시스템 시그널링에 중대한 역할을 수행한다. 본 발명에 따른 벡터로의 B15R 유전자의 통합의 용이성은, 특히 면역 세포의 활성화에 작용하는 IL-1β의 활성을 편리하게 감소시킬 수 있으며 따라서, 본 발명의 바이러스로 감염된 세포를 중대한 면역 반응으로부터 국부적 보호를 받도록 제공한다. B15R 유전자와 상동인 유전자, 예를 들면 카우팍스 바이러스의 유전자도 또한 사용될 수 있다.
동일한 방식으로, 백시니아 바이러스의 B18R 유전자도 인터류킨-6에 대한 수용체와 상동인 단백질을 암호화한다. 이러한 유전자 또는 임의의 기능적 상동체는, 인터류킨-6과 이의 세포 수용체와의 결합을 방해하여 국부적으로 면역 반응을 감소시키기 위하여 본 발명의 벡터내에 사용될 수도 있다.
카우팍스 바이러스의 crmB 유전자 또한, 유사한 방식으로 편리하게 사용될 수 있다. 이리하여, 이들 유전자는, 세포 표면의 TNF와 결합하며 TNF 수용체와 경쟁할 수 있는 분비 단백질을 암호화한다. 따라서, 이 유전자는 본 발명의 바이러스내에서, 감염된 세포를 파괴할 수 있는 활성 TNF의 농도를 국부적으로 감소시킬 수 있다. 또한, TNF와 결합할 수 있고 TNF와 수용체와의 결합을 적어도 부분적으로 방해할 수 있는 단백질을 암호화하는 다른 유전자가 사용될 수도 있다.
카우팍스 바이러스의 crmA 유전자는, 설핀 유형의 단백질분해효소-억제 활성을 가지며 인터류킨-1β의 합성을 방해할 수 있는 단백질을 암호화한다. 이리하여, 이 유전자는, 인터류킨-1의 농도를 국부적으로 감소시켜 면역 및 염증 반응의 전개를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
엡스테인 바르 바이러스의 BCRF1 유전자는 인터류킨 10의 동족체를 암호화한다. 이 유전자의 생성물은, 면역 반응을 감소시킬 수 있으며 B 림프구의 유도 증식동안 특이성을 바꿀 수 있는 사이토카인이다.
사이토메갈로바이러스의 US28 유전자는 마크로파아지 염증성 단백질 1α (MIP-1α)의 수용체와 상동인 단백질을 암호화한다. 이리하여, 이 단백질은 MIP 수용체와 경쟁할 수 있어서 이의 활성을 국부적으로 방해할 수 있다.
아데노바이러스의 E3-147, E3-10.4 및 E3-14.5 유전자의 생성물은 일정 사이토카인에 의해 중재되는 세포내 시그널의 전달을 방해할 수 있다. 사이토카인이 감염세포 표면의 수용체에 결합할때, 시그널은 세포의 죽음을 유도하거나 단백질 합성을 중단하기 위해 핵으로 전달된다. 이는 종양 괴사 인자 (TNF)의 특별한 경우에 해당한다. 연속적으로 또는 조절된 방식으로 발현시킬 목적으로 본 발명에 따른 재조합 DNA로 E3-147, E3-10.4 및 E3-14.5 유전자의 통합은, TNF에 의해 유도된 세포내 시그널링이 차단됨을 가능케하여 본 발명에 따른 바이러스로 감염된 세포를 상기의 사이토카인의 독성 효과로부터 보호받도록 할 수 있다.
국부적이고 일시적인 방해는 특히 이로울 수 있다. 이런 방해는 특히, 하기에서 나타내는 바와 같이 특정 발현 시그널(예를 들면, 사이토카인-의존성 프로모터)의 선택에 의해 얻어질 수 있다.
상동적이거나 유사한 기능적 특성을 가진 또 다른 유전자가 본 발명에 따른 벡터를 작제하는데 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 이들 상이한 유전자는 당업자에게 공지된 임의의 기술, 특히, 라이브러리 스크린에 의해, 화학 합성에 의해 또는 라이브러리 스크린으로 얻어지는 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합 방법에 의해 얻어질 수 있다. 더욱이, 이들 상이한 유전자는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 형태내에 고려중인 유전자의 삽입은 아데노바이러스의 작제에 있어서 더 큰 유연성을 제공하며 상기 유전자의 발현이 좀 더 효과적으로 조절되도록 가능케한다.
따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터 내로 통합되는 재조합 DNA (및 따라서, 두 개의 관련 유전자)는 상이한 방식으로 구성될 수 있다.
이들은, 무엇보다도, 아데노바이러스 내의 동일 영역 또는 상이한 선별 영역 내로 삽입될 수 있다. 특히, 바이러스의 서열을 대체 또는 보충하기 위하여, 재조합 DNA가, 적어도 부분적으로 아데노바이러스 게놈의 E1, E3 및/또는 E4 영역 내로 삽입될 수 있다.
바람직하게는, 재조합 DNA는, 적어도 부분적으로 아데노바이러스 게놈의 E1, E3 또는 E4 영역 내에 삽입될 수 있다. 이들이 상이한 두 영역 내로 삽입될 때, 본 발명의 범위 내에서 E1 및 E3 또는 E1 및 E4 영역을 이용할 선택이 주어진다. 따라서, 실시예에서 입증하는 바와 같이, 이러한 배치는 두 개의 유전자가 상호 간섭하지 않고 향상된 수준으로 발현되는 것을 가능케 한다. 재조합 DNA가 바이러스 서열 대신 삽입되는 것이 유리하다.
이들 재조합 DNA는 동일하거나 상이한 전사 프로모터를 각각 함유할 수 있다. 이러한 구성은 발현이 고 수준으로 이루어질 수 있도록 하며, 유전자 발현의 향상된 조절을 제공한다. 이러한 경우에 있어서, 두 개의 유전자는 동일한 방향 또는 반대 방향으로 삽입될 수 있다.
이들은 또한 단일 전사체를 형성할 수 있다. 이러한 배치에 있어서, 두 재조합 DNA는 인접하고 있으며, 두 유전자가 단일 프로모터의 통제 하에 있고 단일 예비 메신저 RNA를 생성하도록 위치한다. 이러한 배열은 단일 전사 프로모터가 사용될 수 있도록 하므로, 유리하다.
결국, 본 발명에 따른 재조합 DNA의 사용은 상이한 유형, 즉 강하거나 약한, 조절되거나 본질적인, 조직 특이성 또는 편재성 프로모터의 사용을 가능케 한다.
발현 시그널 및 DNA 재조합체 각각의 위치의 선택은 치료 유전자 발현의 개선 및 면역 보호 효과에 있어 특히 중요하다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예는, 치료 유전자를 함유하는 제 1 재조합 DNA 및 면역 보호성 유전자를 함유하는 제 2 재조합 DNA를 포함하며, 이들 두 재조합 DNA가 E1 영역 내에 삽입되어 있는 결손 아데노바이러스를 사용한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예는, 치료 유전자를 함유하고 E1 영역 내에 삽입되어 있는 제 1 재조합 DNA 및 면역 보호성 유전자를 함유하고 E3 영역 내에 삽입되어 있는 제 2 재조합 DNA를 포함하는 결손 아데노바이러스를 사용한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스는 불완전, 즉 목적 세포 내에서 자발적으로 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명에 따른 결손 아데노바이러스 게놈에는, 적어도 감염 세포 내에서 상기 바이러스를 복제하기 위해 요구되는 서열이 결여되어 있다. 이들 영역은 제거되거나(전체 또는 부분적으로), 비기능성으로 되거나, 다른 서열, 특히 치료 유전자로 대체될 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스의 결손 특성은 본 발명의 벡터가 투여에 따라 분해되지 않음을 보증하므로, 중요하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명 아데노바이러스는 ITR 서열 및 캡시드화 서열을 포함하며, E1 영역 일부 또는 전부의 결실을 수반한다.
역 반복(ITR) 서열은 아데노바이러스의 복제 개시점을 나타낸다. 이들은 당업자에게 공지된 일반 분자 생물학적 기술을 이용하여 용이하게 분리될 수 있는 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 위치한다(도 1 참조). 인간 아데노바이러스(특히 혈청형 Ad2 및 Ad5)의 ITR 서열의 뉴클레오티드 서열은, 개의 아데노바이러스(특히 CAV1 및 CAV2)의 것과 마찬가지로, 참고 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, Ad5 아데노바이러스의 경우, 좌측 ITR 서열은 게놈의 뉴클레오티드 1 내지 103을 포함하는 영역에 대응된다.
캡시드화 서열(Psi 서열)은 바이러스 DNA를 캡시드화 하기 위해 요구된다. 따라서, 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스가 제조될 수 있도록 하기 위하여, 상기 영역이 존재하여야 한다. 아데노바이러스 게놈 내에서, 캡시드화 서열은 좌측 (5') ITR 과 E1 유전자 사이에 위치한다(도 1 참조). 이는 일반적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 인공적으로 분리되거나 합성될 수 있다. 인간 아데노바이러스(특히 혈청형 Ad2 및 Ad5)의 캡시드화 서열의 뉴클레오티드 서열은, 개의 아데노바이러스(특히 CAV1 및 CAV2)의 것과 마찬가지로, 참고 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, Ad5 아데노바이러스의 경우, 캡시드화 서열은 게놈의 뉴클레오티드 194 내지 358을 포함하는 영역에 대응된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스는 ITR 서열 및 캡시드화 서열을 포함하며, E1 및 E4 유전자 일부 또는 전부의 결실을 수반한다.
특히 바람직한 구체예에서, E1, E3 및 E4 유전자의 일부 또는 전부, 보다 바람직하게는 E1, E3, L5 및 E4 유전자의 일부 또는 전부가 본 발명에 따른 아데노바이러스의 게놈으로부터 결실되어 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 다양한 기원의 아데노바이러스로부터 제조될 수 있다. 따라서, 그 구조 및 특성이 일정 한도까지 변화하나 공통적인 유전적 구조를 보이는 상이한 혈청형의 아데노바이러스가 존재한다. 결과적으로, 본원에 기술된 방법에 의하여 어떠한 유형의 아데노바이러스에 대해서도 당업자에 의한 복제가 용이하다.
보다 상세하게는, 본 발명의 아데노바이러스는 인간, 동물 또는 이들의 혼합 기원일 수 있다.
인간 기원의 아데노바이러스에 관해서는, C 그룹 내에 분류된 것들을 이용하는 선택이 주어진다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에서, 상이한 혈청형의 인간 아데노바이러스 중에, 유형 2 또는 유형 5 (Ad 2 또는 Ad 5) 아데노바이러스를 이용하는 선택이 주어진다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스는 또한 동물 기원이거나 동물 기원 아데노바이러스로부터 유도된 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서는 동물 기원의 아데노바이러스가 매우 효율적인 방식으로 인간을 감염시킬 수 있으며, 이들은 시험된 인간 세포 내에서 스스로 번식할 수 없음을 입증한다(출원 FR 93 05954 참조). 본원에서는 또한 동물 기원의 아데노바이러스는 어떠한 방식으로도 인간 기원 아데노바이러스에 의하여 보충될 수 없으며, 따라서 감염 입자의 형성을 유도할 인간 아데노바이러스의 존재하에, 생체 내에서의 재조합 및 증식의 위험을 제거함을 입증한다. 유전자 치료에서 벡터로서 바이러스의 이용에 있어 고유한 위험은 매우 낮으므로, 아데노바이러스 또는 동물 기원 아데노바이러스 영역의 이용은 특히 유리하다.
본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐(예 : Mav 1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 새 또는 기타 원숭이 (예 : SAV) 기원일 수 있다. 보다 상세하게, 언급될 수 있는 새의 아데노바이러스는, 예를 들면 Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830) 또는 K-11 (ATCC VR-921) 균주 또는 기타 ATCC VR-831 내지 835 균주와 같은 ATCC로부터 이용할 수 있는 혈청형 1 내지 10이다. 사용될 수 있는 소의 아데노바이러스는, 특히 ATCC VR-313, 314, 639 내지 642, 768 및 769의 ATCC로부터 이용할 수 있는 상이한 혈청형이다. 특히 VR-591 내지 594, 941 내지 943, 195 내지 203의 번호로 ATCC에 언급되어 있는 아데노바이러스와 같은 원숭이 아데노바이러스, 돼지 아데노바이러스, 양 아데노바이러스 유형 5 (ATCC VR-1343) 또는 유형 6 (ATCC VR-1340), 쥐 아데노바이러스 FL(ATCC VR-550) 및 E02308 (ATCC VR-528) 등이 또한 언급될 수 있다.
동물 기원의 상이한 아데노바이러스 중에, 본 발명의 범위 내에서 아데노바이러스 또는 개 기원의 아데노바이러스 영역, 특히 CAV2 [예를 들면, 맨하탄 균주 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800)] 아데노바이러스의 모든 균주를 이용할 선택이 주어진다. 개의 아데노바이러스는 많은 구조적 연구의 목적이 되어 왔다. 따라서, 아데노바이러스 CAV1 및 CAV2의 완전한 제한 지도가 종래 기술에서 설명되었고(Spibey et al., J. Gen, Virol 70 (1989). 165), ITR 서열뿐 아니라 E1a 및 E3 유전자 또한 클로닝되고 서열 분석되었다(특히, Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241, Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
본 발명에 따른 결손 아데노바이러스는 상이한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
첫번째 방법은 시험관 내에서 제조된(연결에 의하여 또는 플라스미드 형태로) 결손 재조합 바이러스 DNA를 컴피턴트 세포주, 즉 결손 바이러스를 보충하기 위해 요구되는 모든 기능을 트랜스로 운반하는 세포주로 형질 감염시키는 것에 있다. 이러한 기능은 바람직하게는 세포의 게놈 내로 통합되어, 재조합의 위험을 피할 수 있도록 하며, 세포주에 증진된 안정성을 부여한다.
두번째 방법은 시험관 내에서(연결에 의하여 또는 플라스미드 형태로) 제조된 결손 재조합 바이러스 DNA와 헬퍼 바이러스 DNA를 적절한 세포주로 동시 형질 감염시키는 것에 있다. 이러한 방법이 사용될 때, 재조합 아데노바이러스의 결손 기능을 모두 보충할 수 있는 이용 가능한 컴피턴트 세포주를 가질 것이 요구되지는 않는다. 이는 일부 기능이 헬퍼 바이러스에 의하여 보층되기 때문이다. 이러한 헬퍼 바이러스는 그 자체로 불완전하며, 세포주가 이를 보충하기 위하여 요구되는 기능을 트랜스로 운반한다. 사용될 수 있는 세포주 중에, 특히 두번째 방법의 범위 내에서 언급될 수 있는 것은, 태아의 신장 세포주 293, KB 세포, Hela, MDCK 및 GHK 세포 등이다 (실시예 참조).
결과적으로, 증식된 벡터들은 회수되고, 정제되며, 일반적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 증폭된다.
한 구체예에 의하면, 적절한 결실 및 두 재조합 DNA를 수반하는 결손 재조합 바이러스 DNA를 시험관 내에서 연결에 의하거나 플라스미드 형태로 제조하는 것이 가능하다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 유리하게는 특정 바이러스 유전자, 특히 E1, E3, E4 및/또는 L5 유전자 일부 또는 전부의 결실을 수반한다. 이러한 결실은 관련 유전자를 감염시키는 임의 유형의 억제에 부합 할 수 있다. 이는 특히 상기 유전자의 암호화 영역 일부 또는 전부 및/또는 상기 유전자를 전사하기 위한 프로모터 영역 일부 또는 전부의 결실의 문제일 수 있다. 이러한 결실은 일반적으로 결손 재조합 바이러스 DNA 상에서, 실시예에 기술한 분자 생물학적 기술을 이용하여, 예를 들면 적절한 제한 효소로 분해 후 연결함으로써 수행된다. 그리고 나서, 효소를 이용하여 절단 후 연결함으로써, 재조합 DNA가 상기 DNA 내로 선별 영역 내에서 선택된 방향으로 삽입될 수 있다.
상기와 같이 하여 수득되고, 결과적으로 적절한 결실 및 두 재조합 DNA를 수반하는 DNA는, 상기 결실 및 재조합 DNA를 수반하는 결손 재조합 아데노바이러스가 직접 생성될 수 있도록 한다. 제 1 변이체는, 유전자가 단일 전사 단위 형태로 또는 분리된 프로모터의 통제하에 배열되어 있으나, 게놈 내의 동일 영역 내로 삽입되는 재조합 아데노바이러스를 얻는데 있어 특히 적합하다.
재조합 바이러스를 두 단계로 제조함으로써, 두 재조합 DNA가 연속적으로 도입될 수 있도록 하는 것 또한 가능하다. 이러한 경우에 있어서, 적절한 결실(또는 상기 결실 중 일부) 및 재조합 DNA 중 하나를 수반하는 제 1 재조합 바이러스 DNA가 연결에 의하거나 플라스미드 형태로 작제된다. 그리고 나서 상기 DNA는 상기 결실 및 하나의 재조합 DNA를 수반하는 제1 재조합 바이러스를 생성하는데 사용된다. 이어서 이러한 제 1 바이러스의 DNA가 분리되고 제 2 재조합 DNA, 적합한 결실(그 부분은 제 1 바이러스에 존재하지 않는다), 및 상동성 재조합을 허용하는 부위를 운반하는 제 2 플라스미드 또는 제 2 결손 재조합 바이러스의 DNA를 동시형질감염시킨다. 이로 인해 이러한 제 2 단계는 2개의 재조합 DNA를 운반하는 결손 재조합 바이러스를 생성한다. 이러한 제조 변형은 아데노바이러스 게놈의 2개의 상이한 부위로 삽입된 2개의 재조합 DNA를 운반하는 재조합 바이러스를 제조하는 데에 특히 적합하다.
본 발명에 따른 2개의 시제, 즉 면역억제제와 재조합 아데노바이러스는 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등의 경로에 의해 이들을 투여할 목적으로 제형화 될 수 있다.
바람직하게는, 각각의 약학 제형은 주입가능한 제형에 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제는 특히 멸균, 등장 염용액(모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라서 멸균수 또는 생리학적 식염수를 첨가함으로써 주입가능한 용액을 구성할 수 있게 하는 건조된, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.
주입에 사용되는 면역억제제와 아데노바이러스의 용량은 상이한 매개 변수에 따라서, 특히 사용되는 투여의 모드, 관련된 병리, 발현될 유전자 또는 그밖에 원하는 치료 지속 기간에 따라서 조정될 수 있다.
일반적인 방법에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104내지 1014pfu/㎖, 바람직하게는 106내지 1010pfu/㎖를 함유하는 용량의 형태로 제형하고 투여한다. 용어 pfu(플라크-형성 단위)는 고려중인 용액의 감염력에 상응하고 적합한 세포 배양액을 감염시키고 일반적으로 5일 후에 감염된 세포의 수를 세므로써 측정한다. 바이러스 용액의 pfu를 측정하는 기술은 문서로 잘 기록되어 있다. 면역억제제, 좀더 상세하게 관심의 대상이 되는 면역억제제일 경우, 이들의 용량과 주입의 모드는 이들의 본질에 따라서 변화한다. 이러한 2개의 매개변수의 조정은 당분야에 숙련된 전문가의 역량안에서 이루어진다.
본 발명에 따른 의약 배합물은 다수의 병리를 치료하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다. 이의 아데노바이러스에 삽입된 치료 유전자에 따라서, 이것은 특히 유전 장애(이소증, 췌장섬유증 등), 신경퇴행 질환(알츠하이머, 파킨슨, ALS 등), 과대증식성 병리(암, 재협착증 등), 응혈 장애 또는 지단백혈증과 연계된 병리, 바이러스 감염에 연계된 병리(간염, AIDS 등) 등을 치료하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 청구된 의약 배합물을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기의 설명적이지만 제한적이지 않은 것으로 생각되는 실시예의 도움으로 좀더 완전하게 기재될 것이다.
실시예 1
RSV의 LTR 프로모터의 조절하의 치료 유전자(E.coli의 LacZ 유전자)와 RSV의 LTR 프로모터의 조절하의 gp19k 유전자를 E1 영역내에 삽입된 채로 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제.
이러한 아데노바이러스는 Ad5 아데노바이러스의 좌측 부분, 두개의 재조합 DNA 및 Ad5 아데노바이러스의 영역(단백질 IX에 상응)을 운반하는 플라스미드와 다양한 결실을 운반하는 결손 아데노바이러스의 DNA 사이의 상동성 재조합에 의해 작제된다.
1. 벡터 pAD5-gp19k-βgal의 작제(도 3)
1.1. 플라스미드 pGEM-gp19k의 작제
플라스미드 pAD-gp19k-βgal은 아데노바이러스 단백질 gp19k를 암호화하는 cDNA 서열을 함유한다. 이러한 플라스미드는 하기와 같이 작제된다. 플라스미드 pGEM-E3을 생성하기 위해서 야생형 Ad5 아데노바이러스 게놈의 XbaI 단편을 분리하고 플라스미드 pGEM(Promega)의 상응하는 부위로 클로닝한다. 이어서 gp19k를 암호화하는 서열을 함유하는 HinfI 단편(야생형 Ad5 아데노바이러스의 뉴클레오티드 28628 내지 29634)을 플라스미드 pGEM-E3로부터 분리한다. 이러한 단편의 말단을 E.coli DNA 폴리머라아제 I의 클레나우 단편의 작용에 의해서(cf. 일반적인 분자 생물학적 기술) 무뎌지게 하고 이어서 수득된 단편을 플라스미드 pGEMzf+(Promega)의 SmaI 부위로 클로닝한다.
수득된 플라스미드를 pGEM-gp19k라고 명명한다 (도 3).
1.2. 벡터 pAD5-gp19k-βgal의 작제
본 실시예는 이들 자체의 프로모터, 아데노바이러스의 좌측 부분 및 상동성 재조합을 허용하는 보충 부분(단백질 pIX)을 포함하는 2개의 재조합 DNA 중에 하나를 함유하는 플라스미드의 작제에 대해 기재한다. 이러한 벡터는 하기의 플라스미드 pAd.RSVβGal로부터 작제된다.
플라스미드 pAd.RSVβGal은 5'3' 방향으로
-ITR 서열, 복제 기원, 캡시드화 시그널 및 EIA 인핸서를 포함하는 아데노바이러스 Ad5의 좌측 말단에 상응하는 PvuII 단편,
- RSV 프로모터(Rous sarcoma 바이러스로부터)의 조절하에 β-갈락토시다제를 암호화하는 유전자,
- 플라스미드 pAd.RSVβGal과 아데노바이러스 d1324 사이에서 상동성 재조합을 허용하는 아데노바이러스 Ad5 게놈의 제 2 단편을 함유한다. 플라스미드 pAd.RSVβGal은 Stratford-Perricaudet 등에 의해 기재되어 있다 (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
플라스미드 pAd.RSVβGal을 우선 효소 EagI와 ClaI로 절단한다. 이것은 특히 아데노바이러스 Ad5의 좌측 부분과 RSV로부터의 LTR 프로모터를 운반하는 제 1 단편을 생성한다. 병행하여, 플라스미드 pAd.RSV.RSVβGaI를 또한 효소 EagI과 XbaI으로 절단한다. 이것은 특히 상동성 재조합을 허용하는 RSV의 LTR 프로모터, LacZ 유전자 및 아데노바이러스 Ad5 게놈의 단편을 운반하는 단편의 제 2 유형을 생성한다. 이어서 ClaI-EagI과 EagI-XbaI 단편을 gp19k(cf. 도 3)을 암호화하는 서열을 운반하는 플라스미드 pGEM-gp19k(실시예 1.1)로부터 XbaI-ClaI의 존재하에 분해한다. 이러한 방법으로 수득된 벡터를 pAD5-gp19k-βgal이라고 명명하고, 따라서 이것은
- ITR 서열, 복제 기원, 캡시드화 시그널 및 E1A 인핸서를 포함하는 아데노바이러스 Ad5의 좌측 말단에 상응하는 PvuII 단편,
- RSV 프로모터(Rous sarcoma 바이러스로부터)의 조절하에 gp19k를 암호화하는 서열,
- RSV 프로모터(Rous sarcoma 바이러스로부터)의 조절하에 β-갈락토시다제를 암호화하는 유전자,
- 상동성 재조합을 허용하는 아데노바이러스 Ad5 게놈의 제 2 단편을 함유한다.
2. 재조합 아데노바이러스의 작제
2.1. E1 영역에서 결실되고 E1 영역 내에 동일한 방향으로 삽입된 2개의 재조합 DNA를 운반하는 재조합 아데노바이러스의 작제.
벡터 pAD5-gp19k-βgal을 선형화하고 E1 유전자에서 불충분한 아데노바이러스 벡터를 가지고 아데노바이러스 E1(E1A와 E1B) 영역에 의해 암호화된 작용을 트랜스로 제공하는 헬퍼 세포(세포주 293)로 동시형질감염시킨다.
좀더 간략하게, 아데노바이러스 Ad-gp19k-βgal, △E1은 하기의 프로토콜에 따라 아데노바이러스 Ad-RSVβgal(cf. 상기에서 언급된 Stratford-Perricaudet등)과 벡터 PAD5-gp19k-βgal 사이에서 생체내 상동성 재조합에 의해 수득된다 : 상동성 재조합이 일어날 수 있게 하기 위해서 XmnI로 선형화한 플라스미드 pAD5-gp19k-βgal과 효소 ClaI로 선형화한 아데노바이러스 Ad-RSVβgal을 칼슘 포스페이트의 존재하에 세포주 293으로 동시형질감염시킨다. 이어서 이러한 방법으로 생성된 재조합 아데노바이러스를 플라크 정제에 의해 선별한다. 분리 후, 재조합 아데노바이러스의 DNA를 세포주 293에서 증폭시키고, 이에 따라 비정제 결손 재조합 아데노바이러스를 약 1010pfu/㎖의 역가로 함유하는 배양 상등액이 생성된다.
일반적으로, 바이러스 입자는 공지된 기술[참조문헌: Graham et al., Virology 52 (1973) 456]에 따라 염화세슘 구배 중에서 원심분리로 정제한다. 아데노바이러스 Ad-gp19k-βgal, △E1은 -80℃에서 20% 글리세롤중에 저장할 수 있다.
2.2 E1 및 E3 영역에 결실이 있고 E1 영역안에 동일한 배향으로 삽입되어 있는 두 재조합 DNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스의 작제(도 4).
벡터 pAD5-gp19k-βgal을 선형화하여 E1 및 E3 유전자가 결손되어 있는 아데노바이러스 벡터와 함께 아데노바이러스 E1(E1A 및 E1B) 영역에 의하여 암호화된 기능을 트랜스로 제공하는 헬퍼 세포중으로(293 세포주) 동시형질감염시킨다.
더 정확히 말해서, 아데노바이러스 Ad-gp19k-βgal, △E1, △E3를 돌연변이체 아데노바이러스 Ad-dl1324(Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543)과 벡터 pAD5-gp19k-βgal간의 상동성 재조합에 의하여 하기 프로토콜에 따라 수득한다: 효소 ClaI으로 선형화한 플라스미드 pAD5-gp19k-βgal 및 아데노바이러스 Ad-dl1324를 상동성 재조합이 일어날 수 있도록 하기 위하여 인산칼슘의 존재하에서 세포주 293 중으로 동시형질감염시킨다. 이러한 방식으로 생성된 재조합 아데노바이러스를 이어서 플라크 정제에 의하여 선별한다. 분리 후, 재조합 아데노바이러스의 DNA를 세포주 293 중에서 증폭시키고, 이에 따라 비정제 결손 재조합 아데노바이러스를 약 1010pfu/㎖의 역가로 함유하는 배양 상등액이 생성된다.
일반적으로, 바이러스 입자는 공지 기술에 따라 염화세슘 구배중에서 원심분리로 정제한다[참조문헌: Graham et al., Virology 52(1973) 456]. 이어서, 재조합 아데노바이러스의 게놈을 서던 블롯 분석으로 확인한다. 아데노바이러스 Ad-gp19k-βgal, △E1, △E3는 -80℃에서 20% 글리세롤중에 저장할 수 있다.
실시예 2: 본 발명에 따른 의약 배합물의 면역보호 활성의 입증
60마리의 DBA/2 마우스 성체 암컷을 무작위로 10 마리씩 6 그룹으로 분할한 다음 각각 하기의 주사 프로토콜에 따라 처리한다:
-그룹 1a:
0일에 4.109pfu의 Ad-RSVβgal 바이러스로 정맥내 주사하면서 -2, -1, 1, 2, 3, 4 및 5일 째 되는 날에 10㎍의 항-CD3 모노클로날 항체를 안내 주사한다[참조문헌: Stratford-Perricaudet et al. 전술].
-그룹 1b:
바이러스로서 4.109pfu의 Ad-gp 19k-βgal 바이러스를 사용하는 것을 제외하고는 그룹 1a에서와 동일한 처리를 한다(도4).
-그룹 2a:
250㎍의 항-CD4 모노클로날 항체를 -2, -1, 1, 4 및 7일에 복강내 주사, 및 0일에 4.109pfu의 Ad-RSV βgal 바이러스를 정맥내 주사한다.
-그룹 2b:
바이러스로서 4.109pfu의 Ad-gp 19k-βgal 바이러스를 사용하는 것을 제외하고는 그룹 2a에서와 동일한 처리를 한다.
그룹 3a:
면역억제제의 어떠한 동반 투여없이 4.109pfu의 Ad-βgal을 정맥내 주사한다.
-그룹 3b:
면역억제제의 어떠한 동반 투여없이 4.109pfu의 Ad-gp19k-βgal을 정맥내 주사한다.
다양한 시간대에서, 각 그룹에서 2마리를 이들의 간 및 비장의 적출로 참수시킨다.
2.1 주사 후 D15에 적출해 낸 비장세포내 림프구 주 아집단(CD3+, CD4+ 및 CD8+) 분포의 면역형광성 분석
분리해 낸 세포의 현탁액을 적출해 낸 비장으로부터 제조한다. 세포 샘플을 각각의 림프구 아집단에 특이성을 띠는 항체를 사용하여 면역형광성에 의하여 분석한다. 형광성 세포를 세포형광측정기(Becton Dickinson FACS Scan)의 보조로 판독한다. 결과를 하기의 표 1에 제시하였다.
| 그룹 3aAd-βgal | 그룹 3bAd-βgal-gp19k | 그룹 1a항-CD3/Ad-βgal | 그룹 2a항-CD4/Ad/βgal | |||||
| 세포 표면에서 βgal을 발현하는 세포의 % | ||||||||
| CD3 | 20.0 | 17.5 | 20.6 | 21 | 5.4 | 6.1 | 12 | 10.3 |
| CD4 | 13.4 | 12.6 | 15.3 | 16.8 | 4.4 | 5.1 | 2.7 | 4.1 |
| CD5 | 5.5 | 5.5 | 6.1 | 6 | 2.02 | 2.3 | 7.9 | 6.6 |
항-CD3로 처리한 동물에 있어서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 명확한 감소는 항-CD4로 처리된 동물에 있어서 CD4+ 세포의 선택적인 감소에서와 같이 주목된다.
2.2. 감염 후 D32에서 적출해 내고 βgal을 발현하는 조직적합성 표적 세포에 관하여 시험관내에서 자극시킨 비장세포의 세포독성능의 분석
처리 동물의 비장으로부터 분리해 낸 제 2 비장세포 샘플을 시험관내에서 4일간 표면에서 β-갈락토시다제를 발현하는 P815 세포의 존재하에서 배양한다. 배양 말미에 가서, 이들 비장세포의 세포독성 활성을 Cr51로 표지한 P815-βgal 표적 세포에 관하여 평가한다. 세포용해당 %로 나타낸 세포독성 활성을 주효세포 및 표적 세포의 비를 달리하면서 통상의 방법으로 측정한다. 결과를 표 2에 나타냈다.
| 그룹 | 2b | 3A |
| 처리 | 항-CD4/Ad-βgal-gp19k | AD-βgal |
| 주효체/표적비 | % 세포용해 | |
| 80/1 | 4 2 | 13 14 |
| 40/1 | 2 1 | 13 9 |
| 20/1 | 1 1 | 5 9 |
| 10/1 | 0 0 | 2 5 |
| 5/1 | 0 1 | 1 2 |
항-CD4로 처리한 동물, 즉 그룹 2b로부터 적출한 비장세포의 세포독성능의 매우 뚜렷한 중화가 보인다.
2.3. 15일 및 32일 후 간에서의 β-갈락토시다제 활성의 발현
간을 절단하여 β-갈락토시다제 활성을 보이기 위하여 X-gal로 및 섹션의 조직학을 입증하기 위하여 에오신으로 염색한다. 결과를 표 3에 나타냈다.
| βgal 발현세포의 수 | ||
| 15일 | 32일 | |
| 그룹 2a:(항-CD4/Ad-βgal) | 1 | 1 |
| 그룹2b: (항-CD4/Adgp19k-βgal) | 250 | 50 |
| 그룹 3a: (Ad-βgal) | 3 | 0 |
| 그룹 3b:(Ad gp19k-βgal) | 25 | 0 |
상기의 결과로부터, Adgp19k-βgal과 함께 항-CD4 항체의 주사는 현저하게 연장되는 고려하에 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 주사 30일 후, 상당량의 β-갈락토시다제 활성이 그룹 2b의 경우에서 관찰되었다. 본 발명에 따라 유도되는 용인 현상의 결과로서 해석될 수 있는 이러한 연장은 항-CD4 면역억제제 및 재조합 아데노바이러스 Adgp19k-βgal의 각각의 효과의 단순한 병치로부터 예상될 수 있는 것 보다 월등히 더 크다,
더욱이, 그룹 2b의 경우 30일간의 기간에 거쳐서 어떠한 염증 반응도 관찰되지 않았다.
Claims (25)
- 생체내 및/또는 생체외에서 외인성 형질감염에 사용될 수 있는, 시간 경과에 따라 연속적, 간헐적 및/또는 동시 사용을 위한, 게놈이 치료 유전자를 함유하는 제 1 재조합 DNA 및 면역보호 유전자를 함유하는 제 2 재조합 DNA를 포함하는 적어도 하나의 재조합 아데노바이러스 및 적어도 하나의 면역억제제의 의약 배합물.
- 제 1 항에 있어서, 면역억제제가 바람직하게는 사이클로스포린, FK506, 아자티오프린, 코티코스테로이드 및 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 중에서 선택됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 2 항에 있어서, 관련 항체가 면역 분자를 불활성화시킬 수 있거나 이들 분자를 함유하는 면역 세포의 파괴를 유도할 수 있는 항체임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 3 항에 있어서, 항체가 항-CD4, -CD2, -CD3, -CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1 및 -LFA-1 항체 및 CTLA4Ig 중에서 선택됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유전자가 치료 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유전자가 치료 RNA를 암호화함을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역보호제가 산물이 주 조직적합성 복합체(MHC)의 활성 또는 사이토카인의 활성에 작용하는 유전자임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 7 항에 있어서, 면역보호 유전자가 산물이 MHC 단백질 또는 항원 출현의 발현을 적어도 부분적으로 억제하는 유전자임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역보호 유전자가 아데노바이러스의 gp19k에 대한 유전자, 허피스 바이러스의 ICP47 유전자, 또는 사이토메갈로바이러스의 UL18 유전자 중에서 선택됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈의 두 재조합 DNA가 단일 전사체를 구성함을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 재조합 DNA가 각각 동일하거나 상이한 전사 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 11 항에 있어서, 두 재조합 DNA가 동일 배향으로 삽입됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 11 항에 있어서, 두 재조합 DNA가 반대 배향으로 삽입됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 재조합 DNA가 바람직하게는 E1, E3 또는 E4 영역내 아데노바이러스 게놈의 하나의 동일한 부위에 삽입됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 14 항에 있어서, 두 재조합 DNA가 E1 영역에 삽입됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 재조합 DNA가 아데노바이러스 게놈내 상이한 부위중으로 삽입됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 16 항에 있어서, 재조합 DNA중 하나가 E1 영역에 삽입되고 다른 하나가 E3 또는 E4 영역에 삽입됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 ITR 서열 및 캡시드화를 허용하는 서열을 포함하고 E1 및 E4 유전자의 전부 또는 일부 결실을 함유하는 결손 재조합 아데노바이러스임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 18 항에 있어서, 관련 아데노바이러스가 ITR 서열 및 캡시드화를 허용하는 서열을 포함하고 E1, E3 및 E4 유전자의 전부 또는 일부 결실을 함유하는 아데노바이러스임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 관련 아데노바이러스가 자신의 게놈으로부터 E1, E3, L5 및 E4 유전자의 전부 또는 일부가 결실된 아데노바이러스임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 사람, 동물 또는 혼합 기원임을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 21 항에 있어서, 사람 기원의 재조합 아데노바이러스가 C 그룹으로 분류된 것들, 바람직하게는 유형 2 또는 유형 5 재조합 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 22 항에 있어서, 동물 기원의 아데노바이러스가 개, 소, 쥐, 양, 돼지, 조류 및 원숭이 기원의 아데노바이러스 중에서 선택됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제가 아데노바이러스 주사 전후에 주사됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
- 제 1 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제 및 재조합 아데노바이러스가 동시에 주사됨을 특징으로 하는 의약 배합물.
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