CZ258197A3 - Medicamentous combination suitable for transfection and expression of exo-genes in vitro - Google Patents
Medicamentous combination suitable for transfection and expression of exo-genes in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- CZ258197A3 CZ258197A3 CZ972581A CZ258197A CZ258197A3 CZ 258197 A3 CZ258197 A3 CZ 258197A3 CZ 972581 A CZ972581 A CZ 972581A CZ 258197 A CZ258197 A CZ 258197A CZ 258197 A3 CZ258197 A3 CZ 258197A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- combination according
- gene
- adenovirus
- recombinant
- drug combination
- Prior art date
Links
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 33
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 9
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 155
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 133
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 26
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 claims description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 16
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 10
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 4
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 4
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 4
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 4
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 4
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 108700022375 Human herpesvirus 1 VP23 Proteins 0.000 claims description 3
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 claims 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 5
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 4
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 4
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 101150067954 B15R gene Proteins 0.000 description 3
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 3
- 102100035888 Caveolin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101000715467 Homo sapiens Caveolin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- -1 alpha-IAT Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101150067964 BcRF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000701168 Murine adenovirus 1 Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150044134 US28 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 2
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 102000005162 pleiotrophin Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 101150039990 B13R gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101150004850 CRMB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100232885 Cowpox virus (strain Brighton Red) CPXV209 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 102100026934 Mitochondrial intermediate peptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101100007739 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) crmA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101150039910 UL18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100004091 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B15R gene Proteins 0.000 description 1
- 101100340726 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR197 gene Proteins 0.000 description 1
- 101900286835 Vaccinia virus Soluble interferon alpha/beta receptor B18 Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 101150067246 crmA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 101150025873 dbp6 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000052 myelotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002556 myelotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Vynalez se týká oblastUgenové ťerapi<e„a„z.ejméjxa .použití adenovirů pro expresi zainteresovaného terapeutického genu. Vynález se zejména týká nového způsobu léčení patologických stavů genetického původu založeného na kombinovaném použití dvou typů terapeutických činidel.
Dosavadní stav techniky
Genová terapie spočívá v korekci nedostatečnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, atd.) zavedením genetické informace do buňky nebo orgánu vykazujících uvedenou nedostatečnost nebo anomálii. Tato genetická informace může být zavedena buá in vitro nebo ex vivo do buňky extrahované z orgánu, přičemž modifikovaná buňka je potom· znovu zavedena do organismu, anebo přímo i*n vivo do příslušné tkáně. V tomto druhém případě existují různé fyzikální transfekční techniky, mezi které patří také použití viru ve funkci vektoru. V tomto ohledu byly testovány různé viry za účelem stanovení jejich schopnosti infikovat některé buněčné populace. Jedná se zejména o retroviry (RSV, HMS, MMS, atd·.), vir HSV, adeno-přidružené viry a adenoviry.
těchto virů zejména adenoviry mají některé zajímavé vlastnosti pro použiti v genové terapii. Mají dosti široké hostitelské spektrum, jsou schopné infikovat kviescentní buňky a neintegrují se do genomu infikované buňky. Adenoviry jsou viry s lineární dvouřetezcovou DNA velikosti asi 36 kb. Jejich genom obsahuje zejména obrácenou repetiční sekvenci (ITR) na jejich konci, enkapsidační sekvenci, rané geny a pozdní geny (viz obr.1). Hlavní rané geny jsou geny El (Ela a Elb), E2,
E3 a E4. Hlavními pozdními geny jsou geny LI až L5.
rt
Vzhledem k výše uvedeným vlastnostem adenovirů, byly tyto viry již použity pro přenos genů. Za tímto účelem byly připraveny různé vektory odvozené od adenovirů zahrnující různé geny (beta-gal, OTC, alfa-IAT, cytokiny, atd.). V každé z těchto konstrukcí byl adenovir modifikován takovým způsobem, aby byl neschopný replikace v infikované buňce. Takto jsou konstrukcemi popsanými v rámci dosavadního stavu techniky adenoviry s delecemi oblastí El (Ela nebo/a Elb) a případně oblasti E3, přičemž v úrovni těchto delecí je vložena sekvence heterologní DNA (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; GoshChoudhury a kol., Gene 50 (1986)161).
Nicméně jak je tomu u všech známých virů, indukuje podání 'divokého adenoviru (Poutes a kol., J.Virol.65 (1991)1450) nebo defektního rekombinantního viru neschopného replikace (Yang a kolΡΝΑΞ(1994)4407) výraznou imunitní odezvu.
Hlavní zásadou imunitního systému je integrita individua neboli vlastní integrita. Podle této zásady imunitního systému dochází k eliminaci infekčních činidel a k odmítání implantovaných roubů a nádorů, aniž by se při tom tyto mocné obranné mechanismy organismu obrátili proti vlastnímu organismu a indukovaly v něm autoimunitní nemoci. Tento stav neodezvy na vlastní antigeny, v rámci které jsou eliminovány pouze cizí antigeny* je definován jako stav fyziologické tolerance. Za účelem eliminace cizích činidel rozvijí imunitní systém dva typy mechanismů. V rámci prvního z těchto mechanismů produkuje pomocí lymfocytů B specifické protilátky, přičemž se v tomto případě hovoří o humorální imunitě. Tyto protilátky váží' antigen a buó ho inaktivují nebo ho vyloučí z organismu. Druhý obranný mechanismus se týká buněčné imunity a využívá lymfocity T a z těchto cytotoxické lymfocyty nesoucí specifický receptor uvažovaného antigenu. Rozpoznání antigenu receptorem T vyžaduje, aby tento byl exprimován v kombinaci s proteiny kódovanými geny hlavního histokompatibilitního komplexu (CMH) třídy I a třídy II.
V důsledku toho tato imunitní odezva rozvinutá proti infikovaným buňkám představuje hlavní překážku při použití virálních vektorů v genové terapii, poněvadž 1) indukujíce destrukci infikovaných buněk omezuje dobu exprese terapeutického genu a tudíž i terapeutický účinek, 2) indukuje paralelně výraznou zánětovou odezvu a 3) způsobuje rychlou eliminaci infikovaných buněk po opakovaných injekcích. Je samozřejmé, že rozsah této imunitní odezvy vůči infikovaným buňkám se mění podle charakteru organu podstoupivšího injekci a v závislosti na použitém způsobu podání. Takto je exprese betagalaktozidázy kódovaná rekombinantním adenovirem dodaným do svalu imunokompetentních myší snížena na minimální úroveň 40 dnů po injekci (Kass.Eisler a kol., PNAS 90 (1993)11498). Stejně tak je exprese genů transfekovaných adenovirem· do játra významně snížena v průběhu 10 dnů následujících po injekci (Yang a kol. 1994, Immunity 1 433-442) a exprese faktoru IX přeneseného adenovirem do hepatocytů hemofilních psů vymizí 100 dnů po injekci (Kay a kol.,PNAS91(1994)2353).
V rámci perspektivního využití vektorů odvozených od adenovirů v genovém inženýrství se jeví jako nezbytné regulovat imunitní odezvu rozvinutou proti buňkám infikovaným uvedenými adenoviry.
Z výše uvedeného vyplývá, že uvedení v činnost imunitního systému vyžaduje především rozpoznání tímto imunitním systémem prvků, které jsou organismu cizí (nevlastní nebo vlastní avšak modifikované), jakými jsou vektory odvozené od adenovirů, které musí být v normálním čase zničeny. V průběhu posledních let byly vyvinuty imunointervenční strategie, jejichž cílem bylo vytvořit permisivní imunitní prostředí, tj. indukovat stav tolerance vůči předem definovaným cizím antigenům.
A přesně v této úrovni působí vynález. Vynález směřuje k zabránění rychlé eliminaci adenovirů z infikovaných buněk a tedy k prodloužení exprese in vivo terapeutického genu, kte'rétyťo' buňky nesou'. ” ...........
V nedávné době přihlašovatel prokázal, že ko-exprese některých genů do infikovaných buněk je schopná indukovat imunoprotekční účinek a způsobit tak, že vektory nebo/a infikované buňky unikají působení imunitního systému. Jsou zejména používány adenoviry, ve kterých je exprese zainteresovaného terapeutického genu kopulována s expresí imunoprotekčního genu {FR n° 9412346). Může se zejména jednat o gen, jehož produkt působí na činnost hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) nebo na účinnost cytokinů a umožňuje tak výrazně snížit nebo dokonce potlačit jakoukoliv imunitní odezvu vůči uvedenému vektoru nebo vůči infikovaným buňkám. Takto dochází k alespoň částečné inhibici exprese proteinů MHC nebo prezentace antigenu, což má za následek výhodu spočívající ve značném omezení imu-. nitní reakce na přítomnost vektoru nebo infikovaných buněk a tedy v prodloužení terapeutického účinku.
Podstata vynalezu
Přihlašovat neočekávatelně prokázal, že je možné výrazně prodloužit terapeutický účinek vektoru tím, že se k němu přidruží imunosupresor. Přitom eliminace uvažovaného vektoru nebo/a destrukce infikovaných buněk imunitním systémem je zpožděna o dobu, která je výrazně delší než doba zpoždění, kterou by bylo možné očekávat při součtu imunoprotekčních účinků uvedeného vektoru a imunosupresoru. Výhodně léková kombinace podle vynálezu indukuje pseudo-nečinnost imunitního systému, která je příznivá pro dlouhodobou expresi terapeutického genu.
Ve smyslu tohoto vynálezu je imunosupresorem každá sloučenina, která je schopna inhibovat částečně nebo úplně alespoň jednu imunitní signalizační cestu. Obecně se imunosupresory používají obvykle při transplantacích za účelem předcházení odmítnutí cizorodých roubů a při léčení některých autoimunitních chorob. Klasicky používanými látkami jsou buů chemické imúnóšuprěsořy, jakými jsou 'kortikóšteroidy, azathioprin, cyklo1· sporin, FK506, nebo biologické imunosupresory, jakými jsou
A polyklonální nebo monoklonální protilátky. První kategorie imunosupresorů a z této zejména cyklosporin a FK506 inhibují významnou měrou produkci cytokinů, jako například produkci interleukinu 2, které hrají podstatnou úlohu při diferenciaci a proliferaci lymfocytních'buněk. Bohužel účinnost tohoto typu imunosupresoru vyžaduje permanentní podávání, které je při při více nebo méně dlouhé době aplikace v rozporu s jejich toxicitou. Takto je azathiopropin potenciálně myelotoxic ký, zatímco cyklosporin. je nefrotoxický a může kromě toho způsobit hypertenzi nebo neurologické poruchy.
Pokud jde o protilátky, jedná se o protilátky řízené proti lymfoidním buňkám imunitního systému. První protilátkou použitou jako imunosupresor byla anti-CD3 řízená proti lymfocytům T Jejím cílem je jeden z polypeptidových řetězců molekuly CD3, který tvoří receptor pro antigen buněk T. Z toho vyplývá funkční inaktivace buněk T CD3+ rozpoznaných protilátkou V případě problematiky, která je zde předmětem zájmu, by podání imunosupresoru tohoto typu společně s podáním rekombinantního adenoviru obsahujícího terapeutický gen bylo schopné blokovat imunitní reakci hostitele vůči virálnímu vektoru nebo/a vůči jeho produktům exprimovaným na povrchu infikovaných buněk. Na stejriém principu lze využít protilátky anti-CD4, anti-CD2, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, anti-ICAM-1 a antiLFA-1.
Přihlašovatel nyni vyvinul nový způsob obzvláště účinného a výrazného zpoždění nebo dokonce inhibice reakce imunitního systému, při kterém nedochází k problémům toxicity.
Přesněji definováno, vynález je odvozen od prokázání obzvláště výrazného synergického účinku spojeného s kombinovaným použitím rekombinantního adenoviru, ve kterém je exprese zainteresovaného terapeutického genu kopulována s expresí imunoprotekČního genu, který byl popsán výše, a alespoň jednoho imunosupresního činidla.
První předmět vynálezu se tedy týká lékové kombinace alespoň jednoho imunosupresního činidla a alespoň jednoho rekombinantního adenoviru, jehož genom obsahuje první rekombinantní .DNA obsahující terapeutický gen a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen, pro následné, přerušované nebo/a časově současné použití vhodné pro exogenovou transfekci in vivo nebo/a ex-vivo.
Jak již bylo uvedeno výše, spočívá vynález zejména na prokázání synergického účinku mezi aktivitou imunosupresního činidla a účinkem imunoprotekčního genu exprimovaného na expre si terapeutického genu.
Toto kombinované použití umožňuje výrazně prodloužený terapeutický účinek a výhodně vyžaduje významně snížené dávky zejména imunosupresního činidla.
Jak to bude uvedeno dále, mohou být obě složky kombinovaného ošetření použity následně, přerušovaně nebo/a časově současně. Výhodně se imunosupresní činidlo injikuje před a po injekci adenoviru. Podle této formy provedení vynálezu může být podání imunosupresního činidla provedeno v časovém odstupu a výhodně může být pravidelně obnovováno. V tomto specifickém případě jsou obě složky kondicionovány odděleně. V případě současného podání mohou být obě složky smíšeny bezprostředně před společným podáním nebo mohou být naopak podány současně avšak odděleně. Zejména mohou být způsoby podání obou činidel odlišné.
V rámci vynálezu lze jako imunosupresní činidlo použít každou sloučeninu, která jě schopna inhibovat částečně nebo úplně alespoň jednu imunitní signalizační cestu. Toto činidlo může být zejména zvoleno z látek, jakými jsou cyklosporin, FK506, azathioprin, kortikosteroidy a každá mono- nebo polyklonální protilátka. Jedná se výhodně o protilátky schopné inaktivovat imunní molekuly nebo vyvolat destrukci imunních buněk nesoucí -tyto-mol ek-uTy. Jako-protilátku 1-ze ze jména. po-..
užít protilátky anti-CD4, anti-CD3, anti~CD2, anti-CD8, antiCD28, anti-B7, anti-ICAM-1, anti-LFAA-1. Může se rovněž jednat o hybridní molekuly, jakými jsou CTLA41g, fuzní protein mezi molekulou CTLA-4-(homolog k CD28) a imunoglobulinem.
Místo GIFc této molekuly vázané s molekulou B7 se ukazuje schopným inhibovat aktivaci buněk T (D.J. Lenschow, Science, 257, 789, 1992). Je samozřejmé, že rozsah vynálezu není nikterak omezen na výše uvedené imunosupresory. Tyto imunosupresory mohou být použity v izolované formě nebo v kombinací.
Pokud jde o rekombinantní DNA přítomné v genomu adenoviru použitého v rámci vynálezu, jedná se o fragmenty DNA obsahující uvažovaný gen (terapeutický nebo imunoprotekční) a případně signály umožňující jeho expresi konstruované in vitro a potom vložené do genomu adenoviru. Rekombinantními DNA použitými v rámci vynálezu) mohou být komplementární DNA (DNAc), genomové DNA (DNAg) nebo hybridní konstrukce sestávající například z DNAc, do které by byly vloženy jeden nebo několik intronů. Může se rovněž jednat o syntetické sekvence nebo semisyntetické sekvence. Tyto DNA mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního a jiného původu. Výhodně se používají DNAc nebo DNAg.
Jako terapeutický gen použitelný pro konstrukci vektorů podle vynálezu lze uvést gen kódující produkt majicí terapeutický účinek. Takto kódovaným produktem může být protein, peptid, RNA a podobně.
Pokud jde o proteinový produkt, může jít o produkt homologní vůči cílové buňce (tj. produkt, který je v cílové buňce normálně exprimován v případě, že tato buňka nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě, umožňuje exprese proteinu například léčit nedostatečnou expresi v buňce nebo expresi neaktivního nebo slabě aktivního proteinu způsobenou nějakou modifikací, a nebo ještě nadměrnou expresi uvedeného proteinu-. Terapeuticky gen múze- takto- kodovat buněčný .protein mající zvýšenou stabilitu, modifikovanou účinnost a podobně.
Proteinový produkt může být rovněž heterologní vůči cílové buňce. V tomto případě může exprimovaný protein například doplňovat nebo nahrazovat některou deficitní aktivitu v buňce, čímž činí buňku schopnou bojovat proti uvažované patologii nebo u ní stimuluje imunitní odezvu.
Jako terapeutické proteinové produkty ve smyslu vynálezu lze uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, interleukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, atd., apoliproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), protein CFTR sdružený s mukoviscidosou, protinádorové supresní geny: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory implikované při koagulaci: faktory VII, VIII, IX, geny zasahující do reparace DNA a podobně.
Jak již bylo uvedeno výše, může být terapeutickým genem rovněž antimediátorový gen nebo antimediátorová sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genu nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na RNA komplementární k buněčným RNAm a blokovat tak jejich translací na protein technikou popsanou v patentu EP 140 308. Antimediátory rovněž obsahují sekvence kódující ribozomy, které jsou schopné selektivně rozkládat cílové RNA (EP 321 201).
Terapeutické geny mohou být lidského zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního a jiného původu. Tyto geny mohou být získány libovolnou známou technikou a zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank.
Imunosupresní gen použitý v rámci vynálezu může být' roz ličného typu. Jak již bylo vysvětleno výše, jedná se o gen, jehož produkt působí na aktivitu hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) nebo na aktivitu cytokinů. Výhodně se jedná o gen, jehož produkt inhibuje alespoň částečně expresi proteinů komplexu MHC nebo antigenovou prezentaci. Jako výhodné příklady lze uvést některé geny obsažené v oblasti E3 adenoviru, gen ICP47 viru herpes nebo gen UL18 cytomegaloviru.
Oblast E3 genomu adenoviru obsahuje různé čtecí fáze, které alternativím svíjením poskytují různé proteiny. Z těchto proteinů je protein Gp19k (nebo(E3-19k) transmembránovým glykosylovaným proteinem lokalizovaným v membráně endoplasmového retikula (RE). Tento protein obsahuje luminální doménu vázající molekuly komplexu MHC-I a C-terminální cytoplasmový konec schopný vázat mikrotubuly (nebo tubulin),. které působí při zakotvení proteinu gp19k v membráně RE. Protein Gpl9k je takto schopný zabránit expresi molekul MHC-I na povrchu buněk interakcí a sekvestrací v úrovni RE. Nicméně v nepřítomnosti virální replikace je protein gp19k slabě exprimován adenoviry. Jinak je exprese- gp19k rovněž přizpůsobena k realizaci svíjení. Zavedení do vektoru podle vynálezu rekombinantní DNA obsahující sekvenci (výhodně DNAc) kódující gp19k umožňuje regulovat a optimalizovat expresi uvedeného proteinu. Zejména použití konstitutivních promotorů a suprese ostatních čtecích fází umožňuje silně zvýšit expresi uvedeného proteinu a vymanit se ze závislosti na virální replikaci a přítomnosti indukčních prvků. To umožňuje obzvláště výhodným způsobem značně snížit lyži za použití.CTL infikovaných buněk a takto zvýšit a prodloužit in vivo produkci terapeutického genu.
Další proteiny kódované oblastí E3 genomu adenoviru, jakými jsou proteiny 10,4k a 14,5k, mají některé zajímavé vlastnosti s ohledem na jejich zavedení do vektorů podle vynálezu .
Gen IČP47 viru herpes simplex tvoří další imuftóprótekční gen, který je obzvláště zajímavý pro použití ve smyslu vynálezu. Buňky infikované virem herpes simplex vykazují odolnost proti lyži indukované pomocí CTL. Bylo prokázáno, že tato rezistence může být poskytnuta genem ICP47, který je schopen omezit expresi molekul MHC-I na povrchu buněk. Inkorporace genu ICP47 do rekombinantní DNA podle vynálezu umožňuje rovněž rekombinantním virům podle vynálezu uniknout imunitnímu systému.
Gen UL18 cytomegaloviru tvoří další výhodný příklad imunoprotekčního genu podle vynálezu. Produkt genu UL18 je schopný vázat beta2-mikroglobulin (Browne a kol.,Nátuře 347(1990) 770). beta2-Mikroglobulin je jedním z řetězců molekul MHC-I. Zabudování genu DL 18 do rekombinantní DNA podle vynálezu také umožňuje snížit počet funkčních buněk beta2-mikroglobulinu v buňkách infikovaných viry podle vynálezu a tedy snížit schopnosti těchto buněk produkovat kompletní a funkční molekuly MHC-I. Tento typ konstrukce tedy umožňuje chránit infikované buňky před lyží způsobenou CTL.
Jak již bylo uvedeno výše, je imunoprotekčním genem použitým v rámci vynálezu při jiném výhodném způsobu provedení gen, jehož produkt inhibuje aktivitu nebo signalizační cesty cytokinů. Cytokiny tvoří skupinu vylučovaných proteinů, které působí jako signalizační molekuly imunitního systému. Mohou přitahovat imunitní buňky, aktivovat je, indukovat jejich proliferaci a dokonce působit přímo na infikované buňky tak, že je zabíjejí.
Jako příklady genů, jejich produkt působí na aktivitu nebo signalizační cesty cytokinů lze uvést geny zasahující do syntézy cytokinů nebo jejichž produkt je schopen sekvestrovat cytokiny, antagonizovat jejich aktivitu nebo interferovat s interceluLárními signalizačními cestami. Jako výhod né příklady takových genů lze uvést zejména gen BCRF1 viru Epsteina a Barrové, geny crmA a CRMB viru cowpox, geny B15R a E..18R viru kravských neštovic, gen. US28 cytomegaloviru a geny E3.14,7, E3-10,4 a E3-14,5 adenoviru.
Gen B15R viru kravských neštovic kóduje rozpustný protein schopný vázat interleukin-1 beta (sekretovaná forma interleukinu-1) a takto bránit tomuto cytokinu vázat se na jeho buněčné receptory. Interleukin-1 je ve skutečnosti jeden z prvních cytokinů produkovaných v odezvu na antigenovou agresi a hraje velmi důležitou úlohu při signalizaci imunitního systému na počátku infekce. Možnost zabudovat gen B15R do vektoru podle vynálezu výhodně umožňuje redukovat aktivitu IL1beta zejména při aktivaci imunitních buněk a tím způsobem lokálně chránit infikované buňky virem podle vynálezu proti výrazné imunitní odezvě. Rovněž mohou být použity homologní geny genu B15R, jakým je například gen viru cowpox.
Stejným způsobem gen B18R viru kravských neštovic kóduje protein homologní s receptorem interleukinu-6. Tento gen nebo každý funkční homologní gen je rovněž použitelný ve vektorech podle vynálezu pro inhibici vazby interleukinu-6 na jeho buněčný receptor a takto pro lokální snížení imunitní odezvy.
Stejným způsobem může být použit i gen crmB viru cowpox. Tento gen kóduje ve skutečnosti sekretovaný protein schopný vázat TNF a konkurovat receptorům TNF na povrchu buněk. Tento gen tudíž umožňuje ve virech podle vynálezu lokákně snižovat koncentraci aktivního činidla TNF schopného ničit infikované buňky. Rovněž mohou být použity i jiné geny kódující proteiny schopné vázat TNF a inhibovat alespoň částečně jeho vazbu na jeho receptory.
Gen crmA viru cowpox kóduje protein mající inhibiční aktivitu proteáz typu serpinu, který je schopný inhibovat syntézu interleukinu-lbeta. Tento gen může být tedy použit pro lokální snížení koncentrace interleukinu-1 a takto pro omezení rozvinutí imunitní a zánětové odezvy.
Gen BCRF1 viru Epsťeina a Barrové kóduje analog interleukinu 10.· Produktem tohoto genu je cytokin schopný omezit imunitní odezvu a změnit její specifičnost mechanismem indukce proliferace .lymfocytů B.
Gen US28 cytomegaloviru kóduje protein homologní s receptorem zánětového proteinu makrofagů 1alfa (MIP-1alfa). Tento protein je tedy schopen působit jako konkureční činidlo receptorů MIP a inhibovat tak Lokálně aktivitu uvedeného zánětového proteinu.
Produkt genů E3-14,7, E3-1Q,4 a E3-14,5 adenoviru·je schopen blokovat přenos intercelulárního signálů med Loveného některými cytokiny. Když se cytokiny váží na jejich receptor na povrchu infikované buňky, dojde k přenosu signálu do jádra indukujícího buněčnou smrt nebo zastavení proteinové syntézy. To je zejména případ nekrózního faktoru nádorů. Inkorporace genů E3-14,7, E3-10,4 nebo/a E3-14,5 do rekombinantní DNA podle vynálezu za účelem jejich konstituční nebo regulované exprese umožňuje blokovaž intracelulární signalizaci indukovanou faktorem TNF a takto chránit buňky infikované rekombinantními viry podle vynálezu před toxickými účinky uvedeného cytokinu.
Lokální a přechodná inhibice může být obzvláště výhodná. Takové inhibice může být dosaženo zejména volbou specifič kých expresních signálů (například cytokin-dependentní promotory), jak to bude popsáno dále.
Je samozřejmé, že mohou být použity i další homologní geny nebo geny mající obdobné funkční vlastnosti pro konstruk ci vektorů podle vynálezu. Takové různé geny mohou být získány každou o sobě známou technikou a zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami, zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank. Kromě toho mohou být takové geny použity samos tatně nebo v kombinaci anebo v kombinacích.
Vložení uvažovaných genů ve formě rekombinantních DNA podle vynálezu nabízí větší pružnost při konstrukci adenovirů a umožňuje lepší regulaci uvedených expresních genů.
Takto mohou být rekombinantní DNA (a tedy oba zainte13 resované geny) zabudované do adenovirálních vektorů podle vynálezu sestaveny a uspořádány různými 2působy.
Mohou být nejdříve vloženy do stejného místa genomu adenoviru nebo do různých zvolených míst tohoto genomu. Rekombinantní DNA mohou být zejména vloženy alespoň částečně v úrovni oblastí El, E3 nebo/a E4 genomu adenoviru tak, že nahrazují nebo doplňují virální sekvence.
Výhodně se rekombinantní DNA vloží alespoň částečně v úrovni oblastí El, E3 nebo E4 genomu adenoviru. V případěže se vloží na dvě různá místa, potom se upřednostňuje v rámci vynálezu použití oblastí El a E3 nebo E1 a E4. Příklady ve skutečnosti ukazují, že tato organizace umožňuje zvýšenou expresi obou genů, aniž by přitom docházelo k interferenci mezi těmito geny. Výhodně se rekombinantní DNA vloží tak, že nahrazují virální sekvence.
Tyto rekombinantní DNA mohou potom každá obsahovat transkripční promotor, přičemž tyto promotory mohou být stejné nebo odlišné. Tato konfigurace umožňuje dosáhnou vyšší expresní hladiny a nabízí lepší regulaci exprese genů. V tomto případě mohou být oba geny vloženy ve stejné orientaci nebo v opačných orientacích.
Rekombinantní DNA mohou rovněž tvořit jednotnou transkripční entitu. V této konfiguraci jsou obě rekombinantní DNA přilehlé a uložené takovým způsobem, že oba geny jsou pod kontrolou jediného promotoru a poskytují jedinou premediátorovou RNA. Toto uspořádání je výhodné poněvadž umožňuje použití jediného transkripčního promotoru.
Konečně použití rekombinantních DNA podle vynálezu umožňuje použití transkripčních promotorů odlišného charakteru a zejména silných nebo slabých promotorů, regulovaných nebo konstitučních promotorů, tkáňově specifických nebo ubikvitárr.ích promotorů a podobně. , .
Volba expresních signálů a respektivní poloha rekombi14 nantních DND je obzvláště důležitá pro dosažení zvýšené exprese terapeutického genu a výrazného imunoprotekčního účinku.
V rámci obzvláště výhodného způsobu provedení vynálezu se používá defektní adenovir obsahující první rekombinantní DNA obsahující terapeutický gen a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen, přičemž obě rekombinantní DNA jsou vloženy v úrovni oblasti E1.
V rámci jiného obzvláště výhodného způsobu provedení vynálezu se používá defektní adenovir obsahující první rekombinantní DNA obsahující terapeutický gen vložený v úrovni oblasti E1 a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen vložený v oblasti E3.
Jak již bylo uvedeno výše, jsou adenoviry podle vynálezu defektními viry, což znamená, že jsou neschopné replikovat se autonomním způsobem v cílové buňce. Obecně je tedy genom defektního adenovirů podle vynálezu zbaven alespoň sekvencí nezbytných pro replikaci uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být bud odstraněny ({-.zcela nebo částečně) nebo mohou být učiněny nefunkčními anebo mohou být nahrazeny jinými sekvencemi a zejména terapeutickými geny. Defektní charakter adenovirů podle vynálezu je důležitým faktorem, poněvadž zajišťuje nerozšiřování se vektorů podle vynálezu po podání.
V rámci výhodné formy provedení vynálezu obsahují adenoviry podle vynálezu sekvence XTR a sekvenci umožňující enka psidaci a mají deleci celku nebo části genu E1.
Sekvence obrácené repetice (ITR) tvoří počátek replikace adenovirů. Tyto sekvence jsou lokalizované na koncích 3' a 5' virálního genomu (viz obr.l), odkud mohou být snadno izolovány klasickými technikami molekulární biologie, které jsou pro technika v daném oboru dobře známými technikami. Nukleotidová sekvence sekvencí ITR lidských adenovirů {zejména sérotypů Ad2 a Ad5) je popsána v literatuře a to stejně jako psích adenovirů (zejména CAV1 a CAV2). Pokud jde například o adenovir Ad5, odpovídá levá sekvence ITR oblasti obsahující nukleotidy 1 až 103 uvedeného genomu.
Enkapsidační sekvence (také označovaná jako sekvence Psi) je nezbytná pro enkapsidaci virální DNA. Tato oblast musí být přítomna k tomu, aby umožnila přípravu defektních rekombinantních adenovirů podle vynálezu. Enkapsidační sekvence je lokalizována v genomu adenovirů mezi levou ITR (5') a genem El (viz obr.l). Tato sekvence může být izolována nebo uměle syntetizována klasickými technikami molekulární biologie. Nukleotidová sekvence enkapsidační sekvence lidských adenovirů (zejména sérotypů Ad2 a Ad5) je popsána v literatuře, stejně jako enkapsidační sekvence psích adenovirů (zejména CAV1 a CAV2). Pokud jde o adenovir Ad5, odpovídá enkapsidační sekvence oblasti obsahující nukleotidy 194 až 358 genomu.
Výhodněji obsahují adenoviry podle vynálezu sekvence ITR a sekvenci umožňující enkapsidaci a mají deleci celku nebo části genů El a E4.
V rámci výhodné formy provedení vynálezu je genom adenovirů podle vynálezu zbaven delecemi celku nebo části genů El, E3 a E4 a výhodně také celku nebo části genů E1, E3, L5 a E4.
Adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny z adenovirů různých původů. Ve skutečnosti existují různé typy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, avšak které mají srovnatelnou genetickou organizaci. Takto mohou být instrukce popsané v přihlášce vynálezu odborníkem snadno použity pro libovolný typ adenovirů.
Adenoviry podle vynálezu mohou být lidského, zvířecího nebo smíšeného (lidského a zvířecího) původu.
Pokud jde o adenoviry lidskéhopůvodu,dáváse přednost použití adenovirů zařazených do skupiny C. Z různých sérotypů lidských adenoviru se v rámci vynálezu přednostně používají adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5).
Jak již bylo uvedeno výše, mohou být adenoviry podle vynálezu rovněž zvířecího původu nebo mohou obsahovat sekvence pocházející z adenoviru zvířecího původu. Přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že adenoviry zvířecího původu jsou schopné infikovat s vysokou účinností lidské buňky a že jsou neschopné propagovat se v lidských buňkách, ve kterých byly testovány (viz přihláška FR 93 05954). Přihlašovatel také prokázal, že adenoviry zvířecího původu nejsou nikterak transkomplementovány adenoviry lidského původu, což eliminuje jakékoliv rekombinaČní a propagační riziko in vivo v přítomnosti lidského adenoviru, které by jinak mohlo vést k tvorbě infekčních částic. Použití adenoviru nebo oblasti adenoviru zvířecího původu je tedy obzvláště výhodné vzhledem k tomu, že je tak ještě dále sníženo riziko spojené s použitím viru jako vektoru v genové terapii.
Adenoviry zvířecího původu použitelnými v rámci vynálezu mohou být adenoviry psího, bovinního, murinního (například: Mávl, Beard a kol.,Virology 75 (1990)81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (příklad: SAV). Z ptačích adenoviru lze zejména uvést sérotypy 1 až 10 dostupné v ATCC, jako například kmeny Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ACTT VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828),
J2-A(ATCC VR-829), T8-A(ATCC VR-830), K-11(ATCC VR-921), nebo také kmeny ATCC VR-831 až 835. Z bovinních adenovirů lze použít různé známé sérotypy, a zejména sérotypy dostupné v ATCC (typy 1 až 8) pod odkazy ATCC VR-313, 314, 639-649, 768 a 769. Rovněž je možné uvést murinní adenoviry FL (ATCC VR-550) a E20380 (ATCC VR-528), ovčí adenovir typu 5 (ATCC VR-1343) nebo typu 6 (ATCC VR-1340), prasečí adenovir 5359) nebo opičí adenoviry a to zejména adenoviry uvedené v ATCC pod čísly VR-591-594, 941-943, 195-203, a .'podobně,
Ž adenoviru zvířecího původu se v rámci vynálezu výhod17 ně používají adenoviry nebo oblasti adenoviru psího původu a zejména všechny kmeny adenovirů CAV2 /kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-80,/. Psí adenoviry jsou předmětem četných strukturních studií. V rámci dosavadního stavu techniky (spibey a kol.,J.Gen.Virol.70(1989)165) byly takto popsány úplné restrikčni mapy adenovirů CAV1 a CAV2 a rovněž byly klonovány a sekvencovány geny Ela a E3, jakož i sekvence ITR (viz zejména Spibey a kol.,Virus Res.14(1989)241; Linné, Virus Res.
23(1992,119,WO91/11525).
Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny různými způsoby.
První z těchto způsobů spočívá v transfekci defektního rekombinantního viru připraveného in vitro (buď ligací nebo ve formě plasmidu) do kompetentní buněčné řady, tj. do řady nesoucí v trans všechny funkce nezbytné ke komplementací defektního viru. Tyto funkce jsou výhodně integrované do genomu buňky, což umožňuje vyvarovat se rekombinačním rizikům a posky tuje buněčné řadě zvýšenou stabilitu.
Druhý přístup spočívá v ko-transfekci do příslušné buněčné řady DNA defektního rekombinantního viru připraveného' in vitro (buď ligací nebo ve formě plasmidu) a DNA viru helper Podle této metody není nezbytné, mít k dispozici kompetentní buněčnou řadu schopnou komplementovat všechny defektní funkce rekombinantního adenoviru^ Část těchto funkcí je ve skutečnosti komplementována virem helper. Tento vir helper musí být sám o sobě defektní a buněčná řada nese v trans funkce nezbytné k jeho komplentaci. Z buněčných řad použitelných výhodně v rámci vynálezu při tomto druhém přístupu lze zejména uvést lidskou embryonální renální řadu 293t buňky KB, buňky Hela, MDCK, GHK, a podobně (viz příklady).
Potom se multiplikované vektory rekuperují, purifikují a amplifikují klasickými technikami molekulární biologie.
Podle variantního provedení je možné připravit in vitro a to bu5 ligací nebo ve formě plasmidu DNA defektního rekombinantního viru nesoucí příslušné delece a obě rekombinantní DNA.Jak již bylo uvedeno výše, mají vektory podle vynálezu deleci celku nebo části některých virálních genů, zejména genů El, E3, E4 nebo/a L5. Tato delece může odpovídat jakémukoliv typu potlačení působícímu na uvažovaný gen. Zejména se může jednat o potlačení celku nebo části kódující oblasti uvedeného genu nebo/a celku nebo části promoční oblasti transkripce uvedeného genu. Uvedená suprese se obecně provede na DNA defektního rekombinantního viru, například digescí pomocí restrikčních enzymů a potom ligací technikami molekulární biologie, jakož i technikami popsanými v příkladech. Rekombinantní DNA mohou být potom vloženy do této DNA enzymatickým štěpením a potom ligací v úrovni selekovaných oblastí a ve zvolené orientaci.
Takto získaná DNA, která tedy nese příslušné delece a obě rekombinantní DNA, umožňuje přímo generovat defektní rekombinantní adenovir nesoucí uvedené delece a rekombinantní DNA. Tato první varianta je obzvláště vhodná pro realizaci rekombinantních adenovirů, ve kterých jsou geny uspořádány ve formě jediné transkripční jednotky anebo pod kontrolou oddělených promotorů, které jsou však vloženy do stejného místa genomu.
Rovněž je možné připravit rekombinantní vir ve dvou etapách, umožňujících následné zavedení obou rekombinantních DNA. Takto se DNA prvního rekombinantního viru nesoucího příslušné delece (nebo část uvedených deleci) a jednu z rekombinantních DNA konstruuje ligací nebo ve formě plasmidu. Tato DNA se potom použije pro generování prvního rekombinantního viru nesoucího uvedené delece a jednu rekombinantní DNA. DNA tohoto prvního viru se potom izoluje a ko-transfekuje s druhým plasmidem nebo DNA druhého defektního rekombinantního viru nesoucího druhou rekombinantní DNA, příslušné delece (část nepřítomná na prvním viru) a oblast umožňující homologní re.. kombinaci. Tato druhá etapa takto .generuje, .defektní rekombinantní vir nesoucí obě rekombinantní DNA. Tato varianta přípra19 vy je obzvláště vhodná pro přípravu rekombinantních virů nesoucích obě rekombinantní DNA vložené do dvou různých oblastí genomu adenovirů.
Obě činidla podle vynálezu, tj.imunosupresor a rekombinantní adenovir mohou být formulovány tak, aby získané formulace byly vhodné pro topické, perorální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální a další podání.
Výhodně farmaceutická formulace nebo farmaceutické formulace obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče vhodné pro injikovatelnou formulaci. Může se zejména jednat o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý a-podobně, nebo směsi těchto solí) mající sterilní a izotonický charakter nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované kompozice, které po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku poskytují rekonstituované injikovatelné tekutiny .
Dávky ímunosupresoru a adenovirů použité pro injekci mohou být závislé na různých faktorech, zejména na použitém způsobu podání, na léčené patologii, na genu, který má být exprimován nebo také na požadované době léčení.
Obecně se rekombinantní adenoviry podle vynálezu formulují a podávají ve formě dávek obsahujících mezi 1Q4 a 10^4 pfu/ml, výhodně mezi 10 a 10 pfu/ml. Výraz pfu (plaque forming unit) odpovídá infekční potenci uvažovaného roztoku a je stanoven infikováním příslušné buněčné kultury a stanovením, obvykle po 5 dnech, počtu pláží infikovaných buněk. Techniky stanovení koncentrace pfu virálního roztoku jsou velmi dobře zdokumentované v literatuře. Pokud jde o imunosupresory, mění se jejich dávky a injekční podání podle jejich charakteru. Nastavení obou těchto parametrů je ve schopnostech odborníka v daném oboru.
Léková kombinace podle vynálezu může být použita pro léčení nebo prevenci četných patologických stavů. Podle terapeutického genu vloženého do jeho adenovirů může být uvedená kombinace použita pro léčení nebo prevenci genetických chorob (dystr fie, muskoviscidóza, atd.), neurodegenerativních chorob {Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, ALS, atd.), hyperproliferativních patologií (rakoviny, restenóza, atd.), patologií spojených s poruchamy koagulace nebo dyslipoproteinemiemi, patologií spojených s virálními infekcemi (hepatitidy, AIDS, atd.), a dalších patologických stavů.
Předmětem vynálezu je rovněž každý způsob terapeutického ošetření, při kterém se použije nárokovaná léková kombinace .
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně definován formulací patentových nároků.
Stručný popis obrázků
Na připojených výkresech
-obr.1 znázorňuje genetickou organizaci adenovirů Ad5. Úplná sekvence adenovirů Ad5 je k dispozici na základě údajů zjištěných sekvencováním a umožňuje f odborníkovi selekovat nebo vytvořit každé restrikční místo a takto izolovat libovolnou oblast genomu.
-Obr.2 znázorňuje restrikční kartu adenovirů CAV2, kmen Manhattan (podle Spibey a kol., kterýžto odkaz již byl uveden výše).
-Obr.3 znázorňuje vektor pAD5-gp19k-betagal a
-obr.4 znázorňuje konstrukci adenovirů Ad-gp19k-beta- -- -- ·- gal.,deltaE.1óeltaE3.- ...... .......
A·,· .
Metody klasicky používané v molekulární biologii, jako preprativní extrakce plasmidové DNA, odstředění plasmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinu fenolem nebo soustavou tvořenou směsí fenolu a chloroformu, precipitace DNA v solném prostředí ethanolem nebo isopropanolem, transformace do Escherichia colii, atd., jsou o sobě známé a hojně popsané v literatuře /Maniatis T. a kol., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,1982; Ausubel F.M. a kol. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987/.
Plasmidy typu pBR322, pUC a fagy série M13 jsou komerčně dostupné (Bethesda Research Laboratories).
Za účelem ligace mohou být fragmenty DNA separovány podle velikosti elektroforézou na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, precipitovány ethanolem a potom inkubovány v přítomnosti DNA ligázy fagu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
Naplnění proemineitních konců 5' může být provedeno Klenowovým fragmentem z DNA polymerázy I od E.coli (Biolabs) podle specifikací dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA polymerázy fagu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5' se provede šetrným ošetřením nukleázou SI.
I
Řízená mutageneze in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena metodou vyvinutou Taylor-em a kol. /Nucleic Acids Res. 13(1985)8749-8764/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
Enzymatická amplifikace fragmentu DNA technikou nazývanou PCR /Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K.
-----a -k-ol., Science 2 3-0 ( 1 9.8.5.) 1 350-1 3.54.; Mullis K.B. a Fallona F.
A.,Meth.Enzym.155(1987)335-350/ může být provedena za použití činidla DNA thermal .cycler (Perkin Elmer Cetus) podle specifikací výrobce.
Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sanger-em a kol. /Proč.Nati.Acad.Sci.USA,74 (1977)5463-5467/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
Použité buněčné řady
V následujících příkladech se použijí nebo mohou být použity následující buněčné řady:
- lidská embryonální renální řada 239 (Graham a kol.,
J.Gen.Virol.36 (1977)59). Tato řada obsahuje zejména ve formě integrované ve svém genomu levou část genomu lidského adenoviru Ad5 (12 %).
- Lidská buněčná řada KB: pocházející z lidského, .epidermálního karcinomu. Tato buněčná řada je dostupná v ATCC (referenční číslo: CCL17), stejně jako podmínky umožňující její kultivaci.
- Lidská buněčná řada Hela: pochází z karcinomu lidského epitelu. Tato řada je dostupná v ATCC (refereční číslo: CCL2), stejně jako podmínky umožňující její kultivaci.
- Psí buněčná řada MDCK: podmínky kultivace buněk MDCK byly popsané zejména Macatney-em a kol., Science 44(1988)9.
- Buněčná řada gm DBP6 (Brough a kol., Virology 190 (1992) 624). Tato buněčná řada je tvořena buňkami Hela nesoucí mi gen E2 adenoviru pod kontrolou LTR z MMTV.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce defektních rekombinantních adenovirů obsahujících terapeutický gen (gen LacZ z E.coli) pod kontrolou promotoru LTR od RSV a gen gp19k pod kontrolou promotoru LTR od RSv, přičemž oba geny jsou vloženy v úrovni oblasti El.
Tyto adenoviry byly konstruovány homologní rekombinací mezi plasmidem nesoucím levou část adenoviru Ad5, obě rekombinantní DNA a oblast adenoviru Ad5 (odpovídající proteinu IX) a DNA defektního adenoviru nesoucího různé delece
1. Konstrukce vektoru pAD5-gp19k-beta-gal (obr.3)
1.1. Konstrukce plasmidů pGEM-gp19k
Plasmid pAD5-gp19k-beta-gal obsahuje sekvenci DMA kódující protein gpl9k adenoviru. Tento plasmid byl konstruován následujícím způsobem. Byl izolován fragment Xbal genomu divokého adenoviru Ad5 obsahujícího oblast E3 a tento byl klonován do odpovídajícího místa plasmidů pGEM (Promega) za účelem generování plasmidů pGEM-E3. Fragment Hinfl obsahující kódující sekvenci proteinu gp19k (nukleotidy 28628 až 29634 divokého adenoviru Ad5) byl potom izolován z plasmidů pGEM-E3. Konce, tohoto fragmentu se uvolní působením Klenowova fragmentu DNÁ polymerázy od E.coli (viz obecné techniky molekulární biologie), načež se získaný fragment klonuje do místa Smál plasmidů pGEMzf+ (Promega).
Získaný plasmid byl označen jako pGEM-gpl9k (obr.3).
1.2. Konstrukce vektoru pAD5-gp19k-beta-gal.
Tento příklad popisuje konstrukci plasmidů obsahujícího jednu nebo obě rekombinantní DNA obsahující jejich vlastní promotor, levou část genomu adenoviru a suplementární část (protein pIX)umožňující homologní rekombinací. Tento vektor byl konstruován z plasmidů pAd.RSvbetaGal následujícím způso- --bem. ....... ........
Plasmid pAd.RSVbetaGal obsahuje v orientací 5' směrem k 3' :
- fragment PvuII odpovídající levému konci adenoviru Ad5 obsahující: sekvenci ITR, počátek replikace, enkapsidační signály a amplifikátor,
- gen kódující beta-galaktosidázu pod kontrolou promotoru RSV (vir Rousova sarkomu),
- druhý fragment genomu adenoviru Ad5, který umožňuje homologní rekombinaci mezi plasmidem pAd.RSVbetaGal a adenovirem dl 324. Plasmid pAd.RSVbetaGal byl popsán Stratford-Perricaudet-em a kol. (J.Clin.Invest. 90(1992)626).
Plasmid pAd.RSVbetaGal byl nejdříve digerován enzymy Eagl a Clal. Tato digesce generuje první fragment nesoucí zejména levou část adenoviru Ad5 a promotor LTR viru RSV. Paralelně se vyřízne enzymy Eagl a Xbal plasmid pAdRSVbetaGal.
To poskytne druhý typ fragmentu nesoucího zejména promotor LTR viru RSV, gen LacZ a fragment genomu adenoviru Ad5, který umožní homologní rekombinaci. Fragmenty Clal-Eagl a Eagl-Xbal se potom ligují v přítomnosti fragmentu Xbal-Clal plasmidu pGEM gp19k (příklad 1.1) nesoucího kódující sekvenci gp19k (viz obr.3). Takto získaný vektor označený jako pAD5-gp19k-betaGal tedy obsahuje:
- fragment PvUII odpovídající levému konci adenoviru Ad5 obsahujícímu : sekvenci ITR, počátek replikace, enkapsidační signály a amplifikátor E1A,
- sekvenci kódující gp19k pod kontrolou promotoru viru RSV (vir Rousova sarkomu),
- gen kódující beta-galaktosidázu pod kontrolou promotoru viru RSV (vir Rousova sarkomu) a
-druhý fragment genomu adenoviru Ad5, který umožňuje homologní rekombinaci.
2. Konstrukce rekombinantních adenovirů
2.1. Konstrukce rekombinantního adenovirů s deleci v oblasti El, nesoucího obě rekombinantní DNA vložené ve stejné orientaci v úrovni oblasti El
Vektor pAD5-gp19k-beta-gal byl linearizován a kotransfekován s deficitním adenovirálním vektorem v genu El do buněk helper (řada 293) přinášejících v trans funkce kočované oblast mi E1 (E1A a E1B) adenovirů.
Přesněji definováno, adenovir Ad-gp19k-beta-gal,delta El se získá homologní rekombinací in vivo mezi adenovirem Ad-RSVbeta-gal (viz Stratford-Perricaudet, kterýžto odkaz byl citován výše) a vektorem pAD5-gp19k-beta-gal podlé následujícího protokolu: plasmid pAD5-gp19k-beta-gal linearizovaný pomocí XmnI a adenovir Ad-RSVbeta-gal linearizovaný enzymem Clal se kotransfekují do buněčné řady 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem umožnění homologní rekombinace. Takto generované rekombinantní adenoviry se potom selekují purifikací na desce. Po izolaci se DNA rekombinantního adeno;viru amplifikuje v buněčné řadě 293, což vede k supernatantu* nad kultivačním prostředím obsahujícímu nepurifikovaný rekombinantní defektní adenovir mající koncentraci asi 10 pfu/ml.
Virální částice se obecně purifikují odstředěním na gra dientu chloridu česného o sobě známou technikou (viz zejména Graham a kol., Virology 52(1973)456). Adenovir Ad-gpl9k-betagal,deltaE1 může být přechováván při'teplotě -80 °C ve 20¾ glycerolu.
2.2. Konstrukce rekombinantního adenovirů s delecemi v oblastech El a E3, nesoucího obě rekombinantní DNA vložené ve stejné orientaci v úrovni oblasti El (obr.4).
Vektor pAD5-gpl9k-beta-gal se linearizuje a kotransfekuje adenovirálním vektorem deficitním v genech E1 a E3 do bu26 něk helper (řada 293) přinášejících v trans funkce kódované oblastmi El (EIA a E1B) adenoviru.
Přesněji definováno, adenovir Ad-gpl9k-beta-gal,delta El,delta E3 se získá homologní rekombinací in vivo mezi mutantním adenovirem Ad-d11324 (Thimmappaya a kol., Cell 31 (1982) 543) a vektorem pAD5-gp19k-beta-gal podle následujícího protokolu: plasmid pAD5-gp19k-beta-gal a adenovir Ad-d11324 linearizovaný enzymem Clal se kotansfekují do buněčné řady 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem umožnění homologní rekombinace. Rekombinantní adenoviry, které byly takto získány se potom selekují purifikací na desce. Po izolaci se rekombinantní adenovir amplifikuje v buněčné řadě 293, což vede k supernatantu nad kultivačním prostředí obsahujícímu nepurifikovaný rekombinantní defektní adenovir mající koncentraci asi 1010 pfu/ml.
Virální částice se obecně purifikují odstředěním v gradientu chloridu česného o sobě známou technikou (viz zejména Graham a kolVirology 52(1973)456). Genom rekombinantního adenoviru byl potom ověřen analýzou Southern blot. Adenovir Ad-gpl9k-beta-gal,deltaEl,deltaE3 může být přechováván při teplotě -80 °C ve 20¾ glycerolu.
Příklad 2
Prokázání imunoprotekční aktivity lékové kombinace podle vynálezu dospělých myších samiček DBA/2 se náhodně rozdělí do šesti skupin po deseti myších a tyto myši se ošetří podle následujícího injekčního protokolu:
-skupina 1a:
dostane intraokulární injekci 1O^ug monoklonálních protilátek -arn- ti -CD 3 . ve-dnech -2, -1-, 1-,-2, 3-, -4-- a—5- a v den..O dostane intravenózní injekci 4.10 pfu viru Ad-RSVbeta-gal (viz
Stratford-Perricaudet a kol, viz výše),
-skupina 1b:
je ošetřena stejným způsobem jako skupina 1a za použití kong centrace viru 4.10 pfu viru Ad-gp 19k-beta-gal (obr.4),
-skupina 2a:
dostane intraperitoneální injekci 250/Ug monoklonálních protilátek anti-CD4 ve dnech -2,-1, 1, 4 a 7 a v den 0 dostane , g intravenozní injekci 4.10 pfu viru Ad-RSVbeta-gal,
-skupina 2b:
je ošetřena stejným způsobem jako skupina 2a za použití virál g ní koncentrace 4.10 pfu viru Adgpl9k-beta-gal,
-skupina 3a:
- . 9 dostane intravenozní injekci 4.10 pfu Ad-beta-gal bez soucas ného podání imunosupresoru a
-skupina 3b:
. 9 dostane intravenozní injekci 4.10 pfu Ad-gpl9k-beta-gal bez současného podání imunosupresoru.
V různých časech byly vždy dvě zvířata z každé skupiny utracena za účelem odběru játer a sleziny.
2.1. Imunofluorescentní analýza rozdělení hlavních subpopulací lymfocytů (CD3+, CD4+ a CD8+) uvnitř splénocytů odebraných v den 15 po injekci slezin pomocí pulaci
Suspenze izolovaných buněk se připraví z odebraných Vzorek těchto buněk se analyzuje imunofluorescenčně specifických protilátek pro každou lymfocytovou^ubpoOdecíťání'fluórešcenthích bůňělc’bylo provedeno za-poi suito 111 u i r> onLL· 1 užití cytofluorometru (FACS Schan-Becton Dickinson). Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce I.
Tabulka I
| Skupina 3a Ad-^gaí | Skupina 3b Ad-Pgal- gpl9k | Skupina la anti CD3/ Ad-pgal | Skupina 2a anti CD4/ Ad-Pgal | |||||
| % buněk exprimunících beta-gal na povrchu buněk | ||||||||
| CD3 | 20,4 | 17,5 | 20,6 | 21 | 5,4 | 6.1 | 12 | 10,3 |
| CD4 | 13,4 | 12,6 | 15,3 | 16,8 | 4,4 | 5,1 | 2,7 | 4,1 |
| CD8 | 5,5 | 5,5 | 6,1 | 6 | 20,2 | 23 | 7,9 | 6,7 |
Z tabulky je zřejmý jednoznačný úbytek buněk CD3 + , CD4 + a CD8+ u zvířat ošetřených protilátkou anti-CD3 a selektivní úbytek buněk CD4 + u zvířat ošetřených protilátkou anti~CD4. .
2.2. Analýza cytotoxické kapacity splenocytů odebraných v den 32 po injikci a stimulovaných in vitro vůči histokompatibilním cílům exprimujícícm beta-gal
Druhý vzorek splenocytů izolovaných z ošetřených zvířat byl kultivován in vitro po dobu 4 dnů v přítomnosti buněk P815 exprimujících na jejich povrchu beta-galaktosidázu.
Po ukončení.kultivace se vyhodnotí cytotoxické aktivita splenocytů vůči cílovému P815-beta-gal značenému radioaktivním izotopem Cr^\ Cytotoxické aktivita vyjádřená procentickou cytolýzou byla stanovena konvenčním způsobem v přítomnosti různých poměrů efektivních buněk a cílových buněk. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce II.
Tabulka II
| Skupina | 2b | 3A |
| Ošetření | Anti-CD4/ Ad-(3gal-gpl9k | AD-Pgal |
| Poměr efektivních a cílových buněk | Cytolýza (%) | |
| 80/1 | 4 2 | 13 14 |
| 40/1 | 2 1 | 13 9 |
| 20/1 | 1 1 | 5 9 |
| 10/1 | 0 0 | 2 5 |
| 5/1 | 0 1 | 1 2 |
Splenocyty, odebrané zvířatům, která byla ošetřena protilátkou CD4, tj. zvířatům skupiny 2b, vykazují jednoznačnou neutralizaci jejich cytotoxické kapacity.
2.3. Exprese aktivity beta-galaktosidázy v játrech po 15 a 32 dnech
Játra se rozdělí na úseky a vybarví X-gal za účelem zviditelnění (vyvíjení) aktivity beta-galaktosidázy a eosinem za účelem zviditelnění histologie řezu. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce III
| Tabulka III | Počet buněk exprimujících M | |
| 15 | 32 | |
| Skupina 2a: (anti-CD4/ Ad-$gal) | 1 | 1 |
| Skupina 2b: (anti-CD4/ Ad gpl9k3gal) | 250 | 50 |
| Skupina 3a: (Ad-Pgal) | 3 | 0 |
| Skupina 3b: (Ad gpl9k-Pgal) | 25 | 0 |
- 30 Z výše uvedených výsledků vyplývá, že injekce protilátky anti-CD4 sdružená s injekcí Adgpl9k-beta-gal indukuje výrazně prolongovanou expresi uvažovaného genu. Takto je možné pozorovat 30 dnů po injekcích v případě skupiny 2b významnou beta-galaktosidázovou aktivitu. Toto prodloužení, které může být interpretováno jako důsledek jevu tolerance indukovaného podle vynálezu, je výrazně vetší, než je prodloužení, * které by bylo možné očekávat v případě jednoduchého součtu účinků imunosupresoru anti-CD4 a rekombinantního adenoviru * Ad gp19k -beta-gal.
Navíc nebyla po 30 dnech v případě skupiny 2b pozorová na žádná zánětová reakce.
Claims (25)
1. Léková kombinace alespoň jednoho imunosupresního činidla a alespoň jednoho rekombinantního adenoviru, jehož genom obsahuje první rekombinantní DNA obsahující terapeutický gen a druhou rekombinantní DNA obsahující imunoprotekční gen pro následné, přerušované nebo/a časově současné použití vhodné pro exogenovou transfekci in vivo nebo/a ex-vivo.
2. Léková kombinace podle nároku 1, vyznačená tím, že imunosupresní činidlo se výhodně zvolí z množiny zahrnující cyklosporin, FK506, azathioprin, kortikosteroidy a monoklonální a polyklonální protilátky.
3. Léková kombinace podle nároku 2, vyznačená tím, že se jedná o protilátky schopné inaktivovat imunní molekuly nebo vyvolat destrukci buněk nesoucích tyto molekuly.
4. Léková kombinace podle nároku 3, vyznačená tím, že protilátka se zvolí z množiny zahrnující anti-CD4, anti-CD2, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD28, anti-B7, anti-ICAM-1, anti-LFA-1 a CTLA4Ig.
5. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že terapeutický gen kóduje terapeutický protein.
6. - Léková kombinace podle některého z -nároků 1 až. 4, v y značená tím, že terapeutický gen kóduje terapeutickou RNA.
7. Léková kombinace podle některého 2 předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunoprotekčním genem je gen, jehož produkt působí na aktivitu hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) nebo na aktivitu cytokinů.
8. Léková kombinace podle nároku 7, vyznačená tím, že imunoprotekčním genem je gen, jehož produkt inhibuje alespoň částečně expresi proteinů komplexu MHC nebo anti genovou prezentaci.
9. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunoprotekční gen je zvolen z množiny zahrnující gen gp19k adenoviru, gen ICP47.' viru herpes a gen UL18 cytomegaloviru.
10. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že obě rekobinantní DNA genomu adenoviru tvoří jedinou transkripční entitu.
11 . Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA obsahují každá svůj transkripční. promotor, přičemž tyto promotory jsou bu<3 identické nebo odlišné.
12. Léková kombinace podle nároku 11, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA jsou vloženy ve stejné orientaci .
13. Léková kombinace podle nároku 11, vyznačená ť ím že obé rékómb'iňánťní' DNA jsou'vloženy v opačné- orientaci .
14. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároku, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA jsou vloženy do stejného místa genomu adenoviru, výhodně v úrovni oblastí El, E3 nebo E4.
15. Léková kombinace podle nároku 14, vyznačená tím, že obě rekombinantní DNA jsou vloženy v úrovni oblasti El.
16. Léková kombinace podle některého z nároků 1 až 13, vy značená tím, že obe rekombinantní DNA jsou vloženy do různých míst genomu adenoviru.
17. Léková kombinace podle nároku 16, vyznačená tím, že jedna z rekombinantních DNA je vložena v úrovni oblasti El a druhá rekombinantní DNA je vložena v úrovni oblas ti E3 nebo E4.
18. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, Že adenovirem je defektní rekombinantní adenovir obsahující sekvence ITR a sekvenci umožňující enkapsidaci, a nesoucí deleci celku nebo části genů El a E4.
19. Léková kombinace podle nároku 18, vyznačená tím, že se jedná o adenovir obsahující sekvence ITRa sekvenci umožňující enkapsidaci, a nesoucí deleci celku nebo části genů El, E3 a E4,
20. Léková kombinace podle některé z nároků 1 až 19, vyznačený tím, že se jedná o adenovir, jehož genom je deleci zbaven celku nebo části genů El, E3, L5 a E4.
21. Léková kombinace podle některého z předcházejících ná34 roků, vyznačený tím, že rekombinantní adenovir je lidského, zvířecího nebo smíšeného původu.
22. Léková kombinace podle nároku 21, vyznačená tím, že rekombinantní adenoviry lidského původu jsou zvoleny z adenovirů zařazených do skupiny C, výhodně z rekombinantních adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5).
,»;
*
23. Léková kombinace podle nároku 22, vyznačená tím, že adenoviry zvířecího původu jsou zvoleny z množiny zahrnující psí, bovinní, murinní, ovčí, prasečí, ptačí a opičí adenoviry.
24. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunosupresní činidlo je injikováno před a po injekci adenovirů.
25. Léková kombinace podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že imunosupresní činidlo a rekombinantní adenovir se injikují současně.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501662A FR2730411B1 (fr) | 1995-02-14 | 1995-02-14 | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
| PCT/FR1996/000218 WO1996025177A1 (fr) | 1995-02-14 | 1996-02-12 | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ258197A3 true CZ258197A3 (en) | 1997-11-12 |
Family
ID=9476106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ972581A CZ258197A3 (en) | 1995-02-14 | 1996-02-12 | Medicamentous combination suitable for transfection and expression of exo-genes in vitro |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030004091A1 (cs) |
| EP (1) | EP0809516B1 (cs) |
| JP (1) | JPH11500430A (cs) |
| KR (1) | KR100402540B1 (cs) |
| AT (1) | ATE204481T1 (cs) |
| AU (1) | AU717218B2 (cs) |
| BR (1) | BR9607310A (cs) |
| CA (1) | CA2211039C (cs) |
| CZ (1) | CZ258197A3 (cs) |
| DE (1) | DE69614668T2 (cs) |
| DK (1) | DK0809516T3 (cs) |
| ES (1) | ES2163612T3 (cs) |
| FI (1) | FI119176B (cs) |
| FR (1) | FR2730411B1 (cs) |
| GR (1) | GR3036438T3 (cs) |
| HU (1) | HU222991B1 (cs) |
| IL (1) | IL117116A0 (cs) |
| MX (1) | MX9706017A (cs) |
| NO (1) | NO320072B1 (cs) |
| PT (1) | PT809516E (cs) |
| SK (1) | SK282235B6 (cs) |
| WO (1) | WO1996025177A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA961161B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6451571B1 (en) | 1994-05-02 | 2002-09-17 | University Of Washington | Thymidine kinase mutants |
| WO1998008539A1 (en) * | 1996-08-26 | 1998-03-05 | Chiron Corporation | Postinfection human immunodeficiency virus (hiv) vaccination therapy |
| AU1288099A (en) | 1997-10-30 | 1999-05-24 | Cornell Research Foundation Inc. | A method of inhibiting an immune response to a recombinant vector |
| JP2003523721A (ja) | 1998-12-31 | 2003-08-12 | カイロン コーポレイション | 抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用 |
| WO2000074688A1 (en) * | 1999-06-08 | 2000-12-14 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Methods for preventing formation of inhibitory antibodies in the setting of gene therapy |
| FR2799472B1 (fr) * | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| CN100494182C (zh) * | 2000-05-12 | 2009-06-03 | 基酶有限公司 | 肿瘤坏死α因子信号的调节因子 |
| CA2452015C (en) | 2001-07-05 | 2012-07-03 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US7569217B2 (en) * | 2001-09-24 | 2009-08-04 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus E1 and E4 regions |
| US20030211075A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-11-13 | Thorpe Philip E. | Combined compositions for tumor vasculature coagulation and treatment |
| ES2371635T3 (es) * | 2002-11-21 | 2012-01-05 | Genzyme Corporation | Combinación de un derivado de diamida y agentes inmunosupresores para inhibir el rechazo de transplantes. |
| ATE493980T1 (de) * | 2002-11-21 | 2011-01-15 | Genzyme Corp | Verwendung eines diamidderivats zur verhinderung der chronischen transplantatabstossung |
| JP2007520566A (ja) * | 2004-02-04 | 2007-07-26 | ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク | 自己免疫治療のための抗ｃｄ３及び抗原特異的免疫療法 |
| WO2008013918A2 (en) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Myelin Repair Foundation, Inc. | Cell cycle regulation and differentiation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5962694A (en) * | 1992-12-31 | 1994-08-15 | Exemplar Corporation | Producing cells for transplantation to reduce host rejection and resulting cells |
| WO1994016080A1 (en) * | 1993-01-08 | 1994-07-21 | Exemplar Corporation | An in vitro/in vivo method for identifying anti-neoplastic drugs |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5872154A (en) * | 1995-02-24 | 1999-02-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus |
-
1995
- 1995-02-14 FR FR9501662A patent/FR2730411B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-12 AU AU47238/96A patent/AU717218B2/en not_active Ceased
- 1996-02-12 MX MX9706017A patent/MX9706017A/es unknown
- 1996-02-12 CZ CZ972581A patent/CZ258197A3/cs unknown
- 1996-02-12 PT PT96903080T patent/PT809516E/pt unknown
- 1996-02-12 WO PCT/FR1996/000218 patent/WO1996025177A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-02-12 IL IL11711696A patent/IL117116A0/xx unknown
- 1996-02-12 CA CA2211039A patent/CA2211039C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-12 AT AT96903080T patent/ATE204481T1/de active
- 1996-02-12 DE DE69614668T patent/DE69614668T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 SK SK1108-97A patent/SK282235B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 HU HU9800635A patent/HU222991B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 ES ES96903080T patent/ES2163612T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 DK DK96903080T patent/DK0809516T3/da active
- 1996-02-12 BR BR9607310A patent/BR9607310A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-12 KR KR1019970705594A patent/KR100402540B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-12 JP JP8524707A patent/JPH11500430A/ja not_active Ceased
- 1996-02-12 EP EP96903080A patent/EP0809516B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 US US08/894,246 patent/US20030004091A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-13 ZA ZA961161A patent/ZA961161B/xx unknown
-
1997
- 1997-08-13 NO NO19973724A patent/NO320072B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 FI FI973323A patent/FI119176B/fi not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-23 GR GR20010400947T patent/GR3036438T3/el unknown
-
2004
- 2004-04-14 US US10/823,682 patent/US20040265276A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019216631B2 (en) | Enhanced adoptive cell therapy | |
| AU712243B2 (en) | Defective adenoviruses including a therapeutic gene and an immunoprotective gene | |
| ES2310924T3 (es) | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. | |
| ES2167365T5 (es) | Vectores adenovirales de origen animal y utilizacion en terapia genica. | |
| Bromberg et al. | Interactions between the immune system and gene therapy vectors: bidirectional regulation of response and expression | |
| US20020142989A1 (en) | Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system | |
| JPH11507835A (ja) | 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物 | |
| WO1998035028A9 (en) | An oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system | |
| US20070244064A1 (en) | Methods and compositions to induce antitumor response | |
| NO321454B1 (no) | Defektiv, rekombinant adenovirus inneholdende en heterolog DNA-sekvens hvis ekspresjon i en malcelle tillater i det minste partielt a inhibere celledeling, anvendelser og farmasoytisk preparat derav. | |
| Ritter et al. | Stimulatory and inhibitory action of cytokines on the regulation of hCMV-IE promoter activity in human endothelial cells | |
| CZ258197A3 (en) | Medicamentous combination suitable for transfection and expression of exo-genes in vitro | |
| EP0729516A1 (fr) | Adenovirus recombinants pour la therapie genique des cancers | |
| WO2000022124A2 (en) | Methods and compositions to induce antitumor response | |
| WO1997028269A1 (en) | Transduced human hematopoietic stem cells | |
| DEMATTEO et al. | Gene transfer for the treatment of hepatobiliary neoplasms | |
| FONG | RONALD P. DEMATTEO, MD YUMAN FONG, MD, FACS | |
| FR2729674A1 (fr) | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |