SK166798A3 - Peptide derivatives, process for their preparation, pharmaceutical composition them containing, and their use - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka určitých nových derivátov peptidov, ktoré majú farmakologicky využiteľné vlastnosti na použitie pri liečbe autoimúnnych ochorení alebo ochorení, ako je •V reumatoidná artritída, a iných ochorení sprostredkovaných T-bunkami i? závislými od MHC triedy II. Vynález sa týka aj farmaceutických

V prostriedkov obsahujúcich nové peptidové deriváty, spôsobu ich prípravy a ich použitia pri liečbe jedného alebo viacerých vyššie uvedených ochorení alebo stavov a pri výrobe nových liečiv na použitie pri liečbe týchto ochorení.

Doterajší stav techniky

Stimulácia imunitnej odpovede človeka závisí od rozpoznania proteínových antigénov T-bunkami. Avšak T-bunky nemôžu na antigén ₄ odpovedať samé o sebe, ale sú. aktivované antigénom, len keď sa ν' tento komplexu j e s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu

V (MHC) na povrchu buniek obsahujúcich antigén, ako sú B-bunky, makrofágy alebo dendritické bunky.

Molekuly MHC triedy I vyvolávajú odpoveď zabíjačských T-buniek (T-killer cells), čím dôjde k zničeniu buniek nesúcich antigén. Molekuly MHC triedy II vyvolávajú odpoveď pomocných T-buniek (T-helper cells), ktorá kontroluje expanziu a maturáciu vybraných B-buniek (t. j. vznik protilátok špecifických k antigénu) a aktiváciu makrofágov. ¹ ,

Kritickou požiadavkou imunitného systému je schopnosť rozlišovať medzi vlastnými a cudzorodými antigénmi. Toto rozlišovanie je nutné preto, aby mohol imunitný systém odpovedať na vniknutie cudzích patogénov a zároveň zachovávať toleranciu k vlastným proteínom a tým pôsobiť preventívne proti poškodeniu normálneho tkaniva. Autoimúnne ochorenia vznikajú, ak sa poruší vlastná tolerancia a tak sa umožní, aby imunitný systém reagoval proti vlastným tkanivám, čím vznikajú spoje pri reumatoidnej artritíde. Predpokladá sa, že udržanie tolerancie, a teda zabránenie vzniku autoimúnnych ochorení, je kriticky závislé od funkcie MHC molekúl.

I

Zistenie, že mnoho autoimúnnych ochorení je spojených s dedičnosťou určitých MHC alel, svedčí o kľúčovej úlohe molekúl MHC pri patogenéze autoimúnnych ochorení. Napríklad viacnásobná skleróza je spojená s dedičnosťou HLA-DR2, diabetes mellitus závislý od inzulínu je spojený s dedičnosťou HLA-DR3 a Hashimotova tyreoiditída je spojená s dedičnosťou HLA-DR5. Mimoriadne silná väzba existuje medzi dispozíciou a vývojom chronickej zápalovej reumatoidnej artritídy a dedičnosti HLA-DR4Dw4 a/alebo HLA-DR4Dwl4 a/alebo HLA-DR1. Predpokladá sa teda, že autoimúnne ochorenia zahŕňajúce MHC molekuly sa viažu na určité vlastné antigény a prenášajú ich do T-buniek, čím sa stimuluje autoimúnna odpoveď. Iné peptidy, ktoré sa môžu viazať na autoimúnne molekuly spojené s MHC a/alebo buď predchádzajú väzbe alebo vytláčajú už viazané vlastné antigény a/alebo peptidy, ktoré inhibujú aktiváciu T-buniek (najmä aktivitu patogénnych T-buniek (napríklad Thl-buniek)) a/alebo peptidy, ktoré zvyšujú aktivitu ochranných T-buniek (napríklad Th2buniek) alebo peptidy, ktoré interagujú s molekulami MHC pomocou alternatívneho mechanizmu pôsobenia tak, že predchádzajú alebo modifikujú stimuláciu autoimúnnej odpovede cez tzv. molekuly MHC, môžu špecificky potlačiť autoimúnnu odpoveď.

Činidlo tohto druhu by mohlo poskytnúť liečbu autoimúnnych ochorení a zároveň zamedziť všeobecné potlačenie imunitného systému, čím sa obmedzia nežiaduce vedľajšie účinky. Toto by malo významné výhody pred doteraz používanou liečbou ochorení, ako je reumatoidná artritída. V súčasnosti sa reumatoidná artritída lieči najskôr pomocou činidiel zmierňujúcich symptómy, ako je NSAID, ktoré nemajú akýkoľvek užitočný vplyv na zlepšenie ochorenia a sú často spojené s nežiaducimi vedľajšími účinkami. Liečba závažnejších ochorení spolieha na použitie tzv. činidiel druhej línie. Tieto činidlá sú často cytotoxickými zlúčeninami, ktoré majú obmedzenú účinnosť a môžu spôsobovať niektoré komplikácie vzhľadom na svoju toxicitu. Činidlá modifikujúce ochorenie bez pridruženej nešpecifickej cytotoxicity by teda boli veľmi prospešné pri liečbe reumatoidnej artritídy.

V medzinárodných patentových prihláškach číslo WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707 sa uvádzajú peptidy, ktoré sa viažu na molekuly MHC a inhibujú aktiváciu T-buniek.

Hoci sa objavilo mnoho peptidov, ktoré inhibujú aktiváciu T-buniek obmedzených HLA-DR pomocou väzby na molekuly HLA-DR, stále existuje potreba alternatívnych zlúčenín, ktoré sa viažu na také molekuly a/alebo buď pôsobia preventívne proti väzbe alebo vytláčajú už viazané vlastné antigény a/alebo inhibujú aktiváciu T-buniek a/alebo zvyšujú aktivitu ochranných T-buniek alebo zlúčenín, ktoré interagujú s molekulami MHC pomocou alternatívneho mechanizmu pôsobenia tak, že predchádzajú alebo modifikujú stimuláciu autoimúnnej odpovede, ktorá spôsobuje ochorenia alebo stavy uvedené vyššie.

Podstata vynálezu

Zistili sme, že deriváty peptidov podľa predkladaného vynálezu (uvedené nižšie) majú prekvapivo tieto farmakologicky využiteľné vlastnosti a toto zistenie je základom predkladaného vynálezu.

Podľa jedného aspektu predkladaný vynález poskytuje derivát peptidu všeobecného vzorca I (uvedený nižšie) alebo jeho farmaceutický prijateľnú sol, kde

P je hydrofóbny zvyšok;

AA^-, AA.2, AA^, AAS AA$, AA^, AA\ a ΑΑθ sú zvyšky L-aminokyselín, kde jeden, dva alebo tri zo zvyškov AA^·, AA^, a AA^ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II (uvedeného nižšie), kde n je celé číslo 1, 2, 3 alebo 4;

X je skupina -NH-CO-, skupina -CO- (karbonylová skupina) alebo skupina -O-CO- (oxykarbonylová skupina);

Rl a R³ sú vybrané z (A), (B) a (C), kde (A) je skupina všeobecného vzorca -(CH₂)_a-CO-N(R³)(R⁴), kde a je celé číslo 1 alebo 2 a R³ a R⁴ sú nezávisle od seba vybrané zo skupín - [ (CH₂) bO]_m-R^a, kde R^a je metylová skupina alebo etylová skupina a m je celé číslo 1, 2, 3, 4 alebo 5; ak m je 1, b je 2 alebo 3 a ak m je 2, 3, 4 alebo 5, hodnota b v každej skupine ~(CH₂)b^(3_ je nezávisle vybraná z hodnôt 2 a 3;

(B) je skupina všeobecného vzorca -(CH₂)_c0(CH₂)^-CO-N(R³)(R⁶), kde c je celé číslo 2 alebo 3, d je celé číslo 1, 2 alebo 3, a R³ a R® sú nezávisle od seba vybrané zo skupín - [ (CH₂) _e0]p-R^, kde R^ je metylová skupina alebo etylová skupina a p je celé číslo 1, 2, 3, 4 alebo 5; ak p je 1, e je 2 alebo 3 a ak p je 2, 3, 4 alebo 5, hodnota e pre každú skupinu -(CH₂)_eO- je nezávisle vybraná z hodnôt 2 a 3; a (C) je skupina všeobecného vzorca -[(CH₂)fO]_g-R⁷, kde R⁷ je metylová skupina alebo etylová skupina a g je celé číslo 1, 2, 3, 4 alebo 5; ak g je 1, f je 2 alebo 3 a ak g je 2, 3, 4 alebo 5, hodnota f v každej skupine -(CH₂)fO- je nezávisle vybraná z hodnôt 2 a 3; alebo

AA^, AA³, AA³, AA³, AA⁷ a AA³ sú zvyšky L-aminokyselín, kde jedna alebo obe skupiny AA¹· a AA⁷ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definuje vyššie a AA⁴ spoločne s . AA³ tvoria skupinu všeobecného vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va (uvedené nižšie) , kde Ra, Rb a Rz sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorú tvorí atóm vodíka a alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka a A je atóm kyslíka alebo metylénová skupina;

alebo AA^-, AA³, AA³, AA⁴, AA³ a AA³ sú zvyšky L-aminokyselín, kde jedna alebo obe skupiny AA³ a AA⁴ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definuje vyššie a AA³ spoločne s AA³ tvoria skupinu všeobecného vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va (uvedené nižšie) , kde Ra, Rb a Rz sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorú tvorí atóm vodíka a alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka a A je atóm kyslíka alebo metylénová skupina; a

Q je hydroxylová skupina, aminoskupina, skupina NRcRd, kde Rc je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, 2-karbamoylcyklopentylová skupina, 2-pyridylmetylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylová skupina, 3-karbamoylfenylová skupina, 4-karbamoylfenylová skupina, 4-(karbamoylmetyl)fenylová skupina, 4-(karboxymetyl)fenylová skupina, 2-morfolinoetylová skupina a skupina všeobecného vzorca -A^-G^, kde A^ je alkylénová skupina obsahujúca 3 až 7 atómov uhlíka, alebo

Al je vybraná (1) zo skupiny všeobecného vzorca -A²-B²-, kde A² je p-fenylénová skupina alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a B² je alkylénová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka alebo A² je metylénová skupina a B² je p-fenylénová skupina alebo 1,4-cyklohexylénová skupina; a φ (2) zo skupiny všeobecného vzorca -A³-B³-C³-, kde A³ je metylénová skupina, B³ je p-fenylénová skupina alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a C³ je alkylénová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka; a je skupina všeobecného vzorca -N=C[N(Rp)2]2' kde každá skupina Rp je nezávisle vybraná zo skupiny, ktorú tvorí atóm vodíka, metylová skupina, etylová skupina a propylová skupina; a Rd je atóm vodíka alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka; alebo Q je 1-piperazinylová skupina; 4-metyl-l-piperazinylová skupina, 4-[2-(2-hydroxyetoxy)etyl]-1-piperazinylová skupina, 4-amidino-l-piperazinylová skupina, 1-piperidylová skupina alebo v polohe 4 substituovaná 1-piperidylová skupina, kde substituentom v polohe 4 je karboxylová skupina, karbamoylová skupina, N-(2-aminoetyl)karbamoylová skupina a N-(4-aminobutyl)karbamoylová skupina; alebo Q je sekvencia 1 až 6 aminokyselinových zvyškov alebo ich amid.

Podľa ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje derivát peptidu všeobecného vzorca I (uvedeného nižšie) alebo jeho farmaceutický prijatelnú sol, kde AA¹, AA³r AA³, AA^, AA³, AA^, AA⁷ a AA³ sú zvyšky l-aminokyselín, kde AA¹, AA^, a AA⁷ sú vybrané zo zvyškov l-aminokyselín všeobecného vzorca II (uvedeného · nižšie) , kde n, X, R¹ a R³ majú rovnaký význam, ako sa uviedlo vyššie; alebo AA¹, AA³, AA³, AA^, AA⁷ a AA³ sú zvyšky l-aminokyselín, kde jedna zo skupín AA¹ a AA⁷ je vybraná zo zvyškov l-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definuje vyššie, a AA^ spoločne s AA³ tvoria skupinu všeobecného vzorca Hla, ako sa definuje vyššie; alebo AA¹, AA³, AA³, AA^, AA³ a AA³ sú zvyšky l-aminokyselín, kde jedna zo skupín AA¹ a AA⁴ je vybraná zo zvyškov l-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definuje vyššie, a AA^ spoločne s AA⁷ tvoria skupinu všeobecného vzorca Hla, ako sa definuje vyššie; a P a Q majú ktorýkolvek z významov definovaných vyššie.

Je potrebné poznamenať, že aminokyselina Q môže mať nezávisle stereochémiu D i L. Ďalej je potrebné uviesť, že ak je Q definované ako hydroxylová skupina (OH) 7 ide o hydroxylovú skupinu C-konca aminokyseliny AA³. Podobne, ₍ ak je Q definované ako aminoskupina, skupina NRcRd, piperazinylová skupina, piperidylová skupina, atď, znamená to, že hydroxylová skupina C-koncovej aminokyseliny AA³ je nahradená touto skupinou. Je potrebné poznamenať aj to, že ak sa uvedie termín aminokyselina, ide o α-aminokyselinu. Je potrebné poznamenať aj to, že ak sa uvedie termín i-aminokyselina, zahŕňa aj aminokyseliny, ako je Gly, 2,2-dietylGly, azaalanín a azaglycín, ktoré neobsahujú chirálne atómy uhlíka. Ďalej je potrebné uviesť, že všeobecný termín alkylová skupina zahŕňa tak variant s priamym reťazcom, ako aj variant z reťazcom rozvetveným, ak to počet atómov uhlíka umožňuje. Rovnaké pravidlo platí aj pre ostatné zvyšky.

Ďalej je potrebné uvedomiť si, že ak obe skupiny R¹ a R³ znamenajú skupiny všeobecného vzorca (A), hodnoty a, R³ a R^ v skupine R¹ môžu byť rovnaké alebo rôzne než tieto skupiny v skupine R³. Podobne ak obe skupiny R¹ a R³ znamenajú skupiny všeobecného vzorca (B) , hodnoty c, d, R³ a R^ v skupine R¹ môžu byť rovnaké alebo rôzne než tieto skupiny v skupine R³, a ak obe skupiny R¹ a R³ znamenajú skupiny všeobecného vzorca (C), hodnoty f, g a R⁷ v skupine Rl môžu byť rovnaké alebo rôzne než tieto hodnoty v skupine R².

Odborníkom v tejto oblasti je známe, že zlúčeniny, ktoré majú chirálne centrum, môžu existovať vo forme racemátu (alebo, ak je prítomné viac než jedno chirálne centrum, v zmesi diastereomérov) alebo ako opticky aktívny enantiomér alebo diastereomér. V tejto oblasti je známe aj to, že prípadná biologická aktivita spojená s racemickou alebo diastereomérnou zmesou môže vznikať prevažne alebo iba z jedného opticky aktívneho izoméru. Preto je potrebné poznamenať, že sa vynález týka akejkoľvek formy derivátu peptidu všeobecného vzorca I, ktorý má vyššie uvedené farmaceutický využiteľné vlastnosti. V tejto oblasti je známe, akým spôsobom získať jeden opticky aktívny izomér, napríklad pomocou rozdelenia racemickej alebo diastereomérnej zmesi obsahujúcej izomér použitím bežných techník, ako je chromatografia, alebo pomocou chirálnej syntézy, pričom sa použijú vhodné opticky aktívne východiskové látky alebo medziprodukty, pričom príklady sú uvedené nižšie. V tejto oblasti je známe aj to, ako určiť farmakologické vlastnosti takýchto racemických alebo diastereomérnych zmesí a jednotlivých opticky aktívnych izomérov, napríklad použitím testov, ktoré sú opísané nižšie. Pre odborníka v tejto oblasti je preto ľahké získať príslušné izoméry derivátov peptidov všeobecného vzorca I, ktoré majú výhodné farmakologické vlastnosti uvedené v predkladanom vynáleze. Je potrebné uviesť, že predkladaný vynález zahŕňa aj všetky polymorfné formy, všetky tautoméry alebo všetky solváty alebo ich zmesi, zmesi derivátov peptidov všeobecného vzorca I, ktoré majú výhodné farmakologické vlastnosti uvedené v súlade s predkladaným vynálezom.

Vhodné nezávislé významy zvyškov α-aminokyselín AA¹, AA², AA², AA⁴, AA², AA², AA⁷ a AA², ak nie sú zvyškami aminokyseliny všeobecného vzorca II alebo netvoria časť skupiny všeobecného vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va, zahŕňajú napríklad tie, ktoré sa skladajú z 20 prírodných aminokyselín kódujúcich genetický kód, najmä alanínu (Ala), kyseliny glutámovej (Glu), glycínu (Gly), histidínu (His), izoleucínu (íle), lyzínu (Lys), asparagínu (Asn), glutamínu (Gin), arginínu (Arg), treonínu (Thr), vallnu (Val) a prolínu (Pro). Vhodné sú aj zvyšky aminokyselín, ako je sarkozín (Sar), 3, 3,3-trifluóralanín, 2,2-dietylglycín, kyselina 2,3-diaminopropánová (Dap), kyselina 2,4-diaminobutánová (Dab), kyselina

2-aminobutánová (Abu), homoarginín, homofénylalanín, trans-4-hydroxyprolín (Hyp), azaalanín (H2N-N(CH3)-COOH; Azala), azaglycín (H2N-NH-COOH; Azgly), kyselina 1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-kar. boxylová (Tie), kyselina oktahydroindol-2-karboxylová (Oic), kyselina dekahydroizochinolín-3-karboxylová (Dic) (ak sa uvádza skratka < Dic, znamená formy, kde spojenia kruhov majú obe konfiguráciu E alebo obe konfiguráciu S) . Môžu sa použiť aj zvyšky zodpovedajúce N^-metylovaným aminokyselinám, rovnako ako zvyšky zodpovedajúce aminokyselinám, ktoré majú esterifikovanú karboxylovú skupinu vo vedľajšom reťazci (napríklad alkylesterová skupina obsahujúca 1 až 6 atómov uhlíka alebo benzylesterová skupina) a alkylovanú aminoskupinu vo vedľajšom reťazci (napríklad metylovanú), acetylovanú alebo na karbamát prevedenú aminoskupinu vo vedľajšom reťazci (napríklad alkylkarbamát (ako je.metylkarbamát alebo etyľkarbamát),

.. fenylkarbamát , alebo benzylkarbamát) . Medzi ďalšie vhodné významy patrí glycín substituovaný v polohe 2, kde substituentom v polohe 2 je skupina vzorca -(CH2)_SNH2, kde s je 1 až 3, alebo skupina vzorca “(CH2)pN(Re)3⁺.X~, kde p je 2 až 4 a X” je protiión (ako je acetát, trifluóracetát, hydroxid alebo chlorid) alebo skupina vzorca “ (CH2) qN (Re) 2, kde q je 0 až 4 alebo skupina vzorca

- (CH2) _rN=C [N (Re) 2] 2' kde r je 1 až 4 a kde každá skupina Re v naposledy uvedených troch skupinách je nezávisle vybraná zo skupiny, ktorú tvorí atóm vodíka a alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka (ako je metylová skupina alebo etylová skupina).'

Vhodné významy pre hydrofóbny zvyšok P (ktorý je pripojený k aminoskupine N-koncovej aminokyseliny AA^) zahŕňajú napríklad organické hydrofóbne skupiny ako sú hydrofóbne alifatické, aromatické, heteroaromatické alebo zmiešané alifaticko/aromatické alebo alifaticko/heteroaromatické organické skupiny obsahujúce 5 až 20 atómov uhlíka (a 1, 2 alebo 3 heteroatómy vybrané zo skupiny, ktorú tvorí atóm kyslíka, atóm síry a atóm dusíka pre skupiny obsahujúce heteroatóm), napríklad skupina vzorca R-, skupina R-CO-, skupina R-SO2-, skupina R-O-CO-, skupina R-NH-CO-, skupina R-O-CS-, skupina R-S-CO-, skupina R-NH-CS-, skupina R-S-CS- a skupina R-CS-, kde R je napríklad alkylová skupina obsahujúca 5 až 10 atómov uhlíka, arylová skupina, heteroarylová skupina, arylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 10 atómov uhlíka, heteroarylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 10 atómov uhlíka, diarylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 8 atómov uhlíka, arylalkenylová skupina obsahujúca v alkenylovej časti 2 až 10 atómov uhlíka, arylcyklopropylová skupina, cykloalkylová skupina obsahujúca 5 až 10 atómov uhlíka, cykloalkylalkylová skupina obsahujúca v cykloalkylovej časti 5 až 10 atómov uhlíka a v alkylovej časti 2 až 6 atómov uhlíka, 3-bifenylová skupina, 4-bifenylová skupina, 4-cyklohexylfenylová skupina, 2-naftyloxymetylová skupina,

3-naftyloxymetylová skupina, a tetrahydronaftylová skupina, arylová alebo heteroarylová skupina, kde skupiny R môžu niesť jeden alebo viacero substituentov, ktorými sú alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, atóm halogénu, kyanoskupina alebo alkoxylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka. Jedno zvláštne uskutočnenie podlá predkladaného vynálezu zahŕňa napríklad zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde P je skupina R-CO-, ako sa definuje vyššie. Ďalšie zvláštne uskutočnenie podlá predkladaného vynálezu zahŕňa napríklad deriváty peptidu všeobecného vzorca I, kde P je hydrofóbna alifatická, aromatická alebo alifaticko/aromatická organická skupina obsahujúca 5 až 20 atómov uhlíka.

R môže mať napríklad nasledovné konkrétne významy: ak je to alkylová skupina obsahujúca 5 až 10 atómov uhlíka: pentylová skupina, izopentylová skupina, terc-pentylová skupina, 2-metylpentylová skupina, hexylová skupina, izohexylová skupina, 5-metylhexylová skupina a oktylová skupina; ak je to arylová skupina: fenylová skupina, naftylová skupina a indenylová skupina; ak je to heteroarylová skupina: 2-, 3-, 5- alebo 6-indolylová skupina, 2-, 3-, 5alebo 6-indolinylová skupina, 2-, 3-, 5- alebo 6-benzo[b]tiofenylová skupina, tienylová skupina, 2-, 4- alebo 5-benzotiazolylová skupina, 2-, 4- alebo 5-benzoxazolylová skupina, 2-, 4- alebo 5-benzimidazolylová skupina, 1,4-benzodioxanylová skupina pripojená v polohe 2-, 3-, 6- alebo 7- a 2-, 3-, 5- alebo 6-benzofuranylová skupina; ak je to arylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 10 atómov uhlíka: arylalkylová skupina obsahujúca 2 až 6 atómov uhlíka (kde arylovú časť tvorí napríklad akákoľvek špecifická arylová skupina uvedená vyššie a alkylovú časť obsahujúcu 7. až 6 atómov’ uhlíka tvorí napríklad metylénová skupina, etylénová skupina, trimetylénová skupina, tetrametylénová skupina a pentametylénová skupina) ako je 2-fenyletylová skupina, 3-fenylpropylová skupina, 4-fenylbutylová skupina a 5-fenylpentylová skupina; ak je to heteroarylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 10 atómov uhlíka: heteroarylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 6 atómov uhlíka (kde heteroarylovú časť tvorí napríklad akákoľvek špecifická heteroarylová skupina uvedená vyššie a alkylovú časť obsahujúcu 2 až 6 atómov uhlíka tvorí napríklad metylénová skupina, etylénová skupina, trimetylénová skupina, tetrametylénová skupina a pentametylénová skupina) 2-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)etylová skupina; ak je to diarylalkylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 8 atómov uhlíka: diarylaklylová skupina obsahujúca v alkylovej časti 2 až 6 atómov uhlíka,· ako je 2,2-difenyletylová skupina, 3,3-difenylpropylová skupina a 4, 4-difenylbutylová skupina; ak je to arylalkenylová skupina obsahujúca v alkenylovej časti 2 až 10 atómov uhlíka: arylalkenylová skupina obsahujúca v alkenylovej časti 2 až 6 atómov uhlíka ako je styrylová skupina, 3-fenylpropen-2-ylová skupina a 4-fenylbuten-l-ylová skupina; ak je to arylcyklopropylová skupina: fenylcyklopropylová skupina, 1-naftylcyklopropylová skupina a 2-naftylcyklopropylová skupina; ak je to cykloalkylová skupina obsahujúca 5 až 10 atómov uhlíka a v alkylovej časti 2 až 6 atómov uhlíka: 2-(cyklohexyl)etylová skupina, 3-(cyklohexyl)propylová skupina a 4-(cyklohexyl)butylová skupina. Prípadnými substituentami na arylovej skupine skupiny R sú napríklad metylová skupina, etylová skupina, atóm chlóru, atóm brómu, atóm jódu, metoxyskupina, etoxyskupina a kyanoskupina.

Medzi hydrofóbne zvyšky P patria napríklad aj hydrofóbne L-aminokyseliny, ako je fenylalanín (Phe) a jeho hydrogenované analógy, ako je cyklohexylalanín (Cha), parachlór-Phe, 3-(2-tienyl)11 alanín, tyrozín (Tyr), Tyr(Ometyl), tryptofán (Trp), bifenylalanín, 3-(1-naftyl)alanín, 3-(2-naftyl)alanín a ich hydrogenované analógy,

3- (1-adamantyl)alanín (Ada), Glu(Obenzyl) , 3-(benzyloxy)-Ala, 3- (benzylsulfanyl)-Ala a 9-fluorenyl-Gly; každá z týchto skupín môže prípadne niesť na N-konci hydrofóbny alifatický, aromatický, heteroaromatický alebo' zmiešaný alifaticko/aromatický alebo alifaticko/heteroaromatický organický zvyšok, ako sa definuje vyššie. Alternatívne môže hydrofóbna aminokyselina prípadne niesť napríklad ďalšiu sekvenciu 1 až 3 aminokyselín, ktoré sú vybrané zo všetkých vhodných významov uvedených vyššie pre AA^ až ΑΑθ. Napríklad P zahŕňa sekvencíe Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe a Ala-Ala-Ala-Phe. Prvá aminokyselina takejto ďalšej sekvencíe 1 až 3 aminokyselín (čítané zľava doprava) môže byť L- alebo D-aminokyselinou a môže prípadne niesť aj hydrofóbnu alifatickú, aromatickú, heteroaromatickú alebo zmiešanú alifaticko/aromatickú alebo alifaticko/heteroaromatickú organickú skupinu, ako sa definuje vyššie.

Prípadne môže byť P napríklad skupina 3-'(benzyloxykarbonyl) -propionyl-Phe, skupina 3-(benzyloxykarbonyl)propionyl-Cha,' skupina

4- (benzyloxykarbonyl)butyryl-Phe, skupina 4-(benzyloxykarbonyl)butyryl-Cha, skupina (5-oxopyrolidin-2-yl)karbonyl-Phe-Tyr, skupina (5-oxopyrolidin-2-yl)karbonyl-Glu(Obenzyl)-Tyr, skupina acetyl-Glu- (Obenzyl)-Tyr, skupina difenylmetyl-CONH-CH2CH2~CO-Cha, skupina difenylmetyl-CONH-CH2CH2-CO-Tyr, skupina difenylmetyl-CONH-CH2CH2-CH2~CO-Cha, skupina difenylmetyl-CONH-CH2CH2CH2~CO-Tyr, skupina difenylmetyl-NHCO-CH2CH2CH2-CO-Cha, skupina difenylmetyl-NHCO-CH2CH2CH2-CO-Tyr, skupina benzyl-NHCO-CH2CH2-CO-Cha, skupina benzyl-NHCO-CH2CH2.-CO-Tyr, skupina N-acetyl-4-chlór-p-hydroxy-Phe, skupina fenoxyfenyl-NHCO-, skupina benzyl-NHCO-CH2CH2-CO-(N-metyl-Phe), skupina benzyl-NHCO-CH2CH2-CONH-CH(CHPh2)-CO, skupina benzyl-NHCO-CH2CH2^_CO-Tyr, 3,3-difenylpropionylová skupina, trans-cinamoylóvá skupina, 5-fenylvalerylová skupina a 3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)propionylová skupina.

Výhodnou skupinou P je napríklad skupina Ph-(CH2)4-CO- (5-fenylvaleryl (Phv)), skupina Ph-(CH2)4-CS- a 3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)propionylová skupina.

Medzi vhodné hydrofóbne zvyšky P patria napríklad 3-(2-kyanobenzo [b] tiofen-5-yl) propionylová skupina a 5-fenylvalerylová_; skupina (Phv), najmä však druhá z týchto skupín.

Ak Rc je je skupina všeobecného vzorca -A^-G^, A1 je konkrétne, ak je to alkylénová skupina, napríklad metylénová skupina, etylénová skupina, propylénová skupina a butylénová skupina; a B^ je konkrétne, ak je to alkylénová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, napríklad metylénová skupina, etylénová skupina a propylénová skupina; a C³ je, ak je to alkylénová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka, napríklad metylénová skupina, etylénová skupina a propylénová skupina.

Medzi konkrétne skupiny -aI-G^ patrí napríklad 3-guanidinopropylová skupina, 4-(2-guanidinoetyl)fenylová skupina, 4-(2-morfolinoetyl-NH-C0-CH2)fenylová skupina a 4-{4-[2-(2-hydroxyetoxy)etylpiperazin-l-yl-C0-CH2)fenylová skupina.

Konkrétnymi skupinami Q, ak sú to sekvencie 1 až 6 aminokyselinových zvyškov, sú napríklad sekvencie aminokyselinových zvyškov nezávisle vybraných z akýchkoľvek vhodných nezávislých skupín AA^ až ΑΑθ definovaných vyššie (ako je Ala-Thr-Gly-OH) , alebo ich Danalógy, alebo sekvencie obsahujúce tak D- ako aj L-aminokyseliny, alebo ich amidy, ako je amid odvodený od amoniaku, alkylamínu obsahujúceho 1 až 4 atómy uhlíka (ako je metylamín) alebo dialkylamínu obsahujúceho v každej alkylovej skupine 1 až 4 atómy uhlíka (ako je. dimetylamín).

Medzi výhodné skupiny Q patria napríklad 4-karbamoyl-l-piperidylová skupina (zvyšok od piperidín-4-karboxamidu (Pip-NH2)), 4-karboxy-l-piperidylová skupina (zvyšok od piperidín-4-karboxylovej kyseliny (Pip-OH)), 4-(karbamoylmetyl)anilinoskupina (zvyšok od 4-aminofenylacetamidu (Papa-NH2)), 4-(karboxymetyl)anilinoskupina (zvyšok od 4-aminofenyloctovej kyseliny (Papa-OH)) a 4-(2-guani13 dinoetyl)anilinoskupina (zvyšok od 2-(4-aminofenyl)etylguanidínu (Papa-NHC(=NH)NH2)) Zvlášť výhodnými skupinami Q sú Pip-NH2 a Papa-NH2, a najmä Papa-NH2.

Medzi konkrétne nové deriváty peptidov podľa predkladaného vynálezu patria napríklad peptidové zlúčeniny všeobecného vzorca I

definované vyššie, kde:
(D	vo	vzorci II, n - 1 a	X =	-CO-;
(2)	vo	vzorci II, n = 4 a	X =	-NHCO-;
(3)	vo	vzorci II, R3- a R2	sú	skupiny	(rovnaké	alebo	rôzne) vzorca
(A) ,	kde	a = 1;
(4)	vo	vzorci II, R3- a R2	sú	s kupiny	(rovnaké	alebo	rôzne) vzorca

(A) , kde R³ a R⁴ sú skupiny (rovnaké alebo rôzne) vzorca -[(CH₂)_bO]_m-R^a, kde b = 2;

(5)	vo	vzorci	II, R1	a	R2	sú skupiny	(rovnaké	alebo	rôzne)	vzorca
(A) ,	kde R3	a R4	sú	skupiny (rovnaké alebo	rôzne)	vzorca
-[(CH2)bO]m-R,	kde m =	1,	2	alebo 3;
(6)	vo	vzorci	II, R1	a	R2	sú skupiny	(rovnaké	alebo	rôzne)	vzorca
(B) ,	kde	c = 2;
(7)	vo	vzorci	II, R1	a	R2	sú skupiny	(rovnaké	alebo	rôzne)	vzorca
(B) ,	kde	d = 2;
(8)	vo	vzorci	II, R1	a	R2	sú skupiny	(rovnaké	alebo	rôzne)	vzorca
(B) ,	kde R3	a R6	sú	skupiny (rovnaké alebo	rôzne)	vzorca

-[(CH₂)_eO]_p-R^e, kde e = 2;

(9) vo vzorci II, R^ a R² sú skupiny (rovnaké alebo rôzne) vzorca (B) , kde R³ a R³ sú skupiny (rovnaké alebo rôzne) vzorca -[(CH₂)_eO]p-R^e, kde p = 1;

(10) vo vzorci II, R³· a R² sú skupiny (rovnaké alebo rôzne) vzorca (C) , kde f = 2; a (11) vo vzorci II, R¹ a R² sú skupiny (rovnaké alebo rôzne) vzorca (c), kde g = 3; a kde, ak sa neuvádza inak, AA¹, AA², AA², AA⁴, AA², AA², AA⁷, AA², P a Q majú akýkoľvek z významov uvedených vyššie.

Konkrétne významy pre R², R⁴, R² a R², a R¹ a R², ak sú tieto skupiny vybrané zo skupín všeobecného vzorca -[(CH2)fO]g-R⁷, zahŕňajú napríklad skupinu -CH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2CH2OCH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3, skupinu -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2OCH3 a skupinu -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2-OCH3.

Medzi ďalšie konkrétne nové peptidové deriváty podľa predkladaného vynálezu patria napríklad nasledovné peptidové deriváty všeobecného vzorca I:

(i) P-AA¹-AA²-AA³-II-AA²-AA²-AA⁷-AA⁸-Q;

(i i) P -11 - AA² - AA³ - AA⁴ - AA⁵ - AA ² - AA⁷ - AA⁸ - Q ;

(iiij P-AA¹-AA²-AA³-111a-AA²-11-AA⁸-Q ;

(iv) P-AA¹-AA²-7\A³-AA⁴-/VA⁵-AA²-II-AA⁸-Q;

(v) P-7\A¹-AA²-AA³-II-7\A²-IIIa-AA⁸-Q;

(vi) P-11-AA² -AA³-AA⁴-AA⁵-11 Ia-AA⁸-Q;

kde II je zvyšok i-aminokyseliny všeobecného vzorca II, ako sa definuje vyššie, a Hla je skupina vzorca Hla, ako sa definuje nižšie, a kde, ak sa neuvádza inak, AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA², AA²,· AA⁷, AA⁸, P a Q majú akýkoľvek význam, vrátane konkrétnych a výhodných významov, ako sa definuje vyššie (je potrebné uviesť, že v skupinách (i) až (vi) , kde sa vyskytuje skupina AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA², AA², AA⁷ alebo AA⁸ ide o zvyšky L-aminokyselín a prítomnosť a poloha skupiny vzorca II alebo Hla je špecificky označená). Skupiny (i) až (vi) sú ďalším nezávislým aspektom predkladaného vynálezu.

Medzi peptidové deriváty zvláštneho významu obsahujúce (i) až (vi) patria napríklad deriváty, kde vo vzorci II, n = 1 alebo 2, X = karbonylová skupina a R¹ a R⁸ sú skupiny všeobecného vzorca (C) (najmä kde f = 2, g = 3 a/alebo R⁷ = metylová skupina, ako je skupina -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3) alebo sú obe skupiny vzorca (A) (najmä kde a .= 1, b = 2, m = 1 alebo 3 a/alebo R^a = metylová skupina, ako je' skupina -CH2CON(CH2CH2OCH3)2 alebo skupina -CH2CON[(CH2CH2O)3CH3]2)· Zvlášť dôležité zo skupín (i) až (vi) sú peptidové deriváty skupín (i) a (v). Medzi výhodné peptidové deriváty patria napríklad zlúčeniny skupiny (v), v ktorých vo vzorci II, n = 1, X = karbonylová skupina a R¹ a R⁸ sú obe skupiny všeobecného vzorca (A).

Vhodnými významami pre AA¹ až AA⁸ (ak AA¹, AA⁴ alebo AA⁷ nie je zvyšok aminokyseliny vzorca II a ak AA⁴ spoločne s AA⁸ alebo AA⁸ spoločne s AA⁷ nie sú skupiny vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va) sú napríklad:

AA¹ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Ala, íle, Tyr, Val-, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluóralanín, najmä Ala, íle, Arg,. Gap, GapMe, zvlášť Ala, Arg a íle, a výhodnejšie Ala a Arg;

AA⁸ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, íle, Tie, 3,3,3-trifluóralanín a Νθ-dietyl-Lys, najmä Ala, Arg, íle, Lys a Tie, zvlášť Ala, Arg, íle a Tie a výhodnejšie Ala, a Arg;

AA⁸ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Ala, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn a N⁸-dietyl-Dap, zvlášť Ala, His, Asp a Asn, najmä Ala a Asn, a výhodnejšie Ala;

AA⁴ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His a N⁸-dietyl-Lys, zvlášť Ala, Arg. Lys a His, najmä Ala, Arg a His, a výhodnejšie Ala;

AA⁵ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser a N⁸-dietyl-Dap, zvlášť Thr, Val a Dap, a najmä Thr a Val;

AA^ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His a Dap (najmä Ala a Pro) ;

AA⁷ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic a Dic (najmä Ala a Arg);

ΑΑθ vybraná zo skupiny, ktorú tvorí Ala, Gly, Dap, azaalamín a azaglycín, najmä Ala, Gly a azaglycín a zvlášť Ala a Gly.

(kde Gap má význam uvedený pre zvyšok vzorca -NH-CH[CH2~NH-C(=NH)-NH2J-CO-, a kde GapMe4 má význam uvedený pre zvyšok vzorca -NH-CH(CH₂N=C[N(CH₃)₂]2C0-).

Ďalšími individuálnymi nezávislými skupinami derivátov peptidov podlá predkladaného vynálezu sú napríklad peptidové deriváty všeobecného vzorca I, kde jedna alebo dve skupiny AA^·, AA^ a AA⁷ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definuje vyššie, a ostatné skupiny AA^, AA^, ΑΑθ, AA^, ΑΑθ, AA$, AA⁷ a ΑΑθ sú zvyškami L-aminkyselín (vrátane vhodných špecifických a výhodných významov, ktoré sa uvádzajú vyššie).

Ak peptidový derivát všeobecného vzorca I obsahuje skupiny vzorca III, IV, IVa alebo V, špecifické významy pre Ra vo vzorci II a Rb vo vzorci IV a IVa a Rz vo vzorci V sú, ak sú to alkylové skupiny, metylová skupina, etylová skupina, propylová skupina a izopropylová skupina. Z derivátov peptidov obsahujúcich skupinu vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va, sú výhodné deriváty obsahujúce skupinu Hla.

Ďalší výhodný aspekt podľa predkladaného vynálezu zahŕňa peptidové deriváty všeobecného vzorca I, ktoré obsahujú zvyšok arginínu, najmä zlúčeniny, kde AA^ alebo ΑΑθ sú arginín. (ako sú zlúčeniny, v ktorých časťou sekvencie ΑΑ^-ΑΑθ-ΑΑθ je Ala-Arg-Ala alebo Arg-Ala-Ala) .

Deriváty peptidov podlá predkladaného vynálezu, ktoré sú zvlášť dôležité, zahŕňajú napríklad špecifické uskutočnenia uvedené nižšie v príkladoch. Z týchto derivátov sú zvlášť dôležité pepti17 dové deriváty z príkladov 3 a 6 a tieto zlúčeniny alebo ich farmaceutický prijatelné soli tvoria ďalšie rysy predkladaného vynálezu.

(Sekvencia s identifikačným číslom: 3) ch₃och₂ch₂^ ch₃och₂ch₂

Phv—A la —Arg —A la—N H

Thr—N X 'r' 'Ala—N H I = H

O CH₃ ^ch₂ch₂och₃ ch₂ch₂och₃

ch₂conh₂

Príklad 3 (Sekvencia s identifikačným číslom: 6)

CH₂CH2OCH2CH2OCH2CH₂OCH₃ \_n/CH₂CH2OCH2CH2OCH2CH₂OCH3

CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH3 N 'CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ o .—, o x

Phv—Arg—Ala—Ala —N

O CH,

Ala—N H

ch₂conh₂

Príklad 6

Ďalší aspekt podlá predkladaného vynálezu tvoria chránené (napríklad skupinou Fmoc) alebo nechránené aminokyseliny' všeobecného vzorca II, kde n, X, R·*· a R^ majú akýkoľvek význam, vrátane konkrétnych a výhodných významov, uvedený vyššie.

Farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú napríklad soli peptidových derivátov, ktoré sú dostatočne bázické, napríklad derivátov, ktoré obsahujú voľnú aminoskupinu, s kyselinami tvoriacimi fyziologicky prijatelné anióny, ako sú soli s minerálnymi kyselinami, napríklad halogénvodíkmi (ako je chlorovodík a bromovodík), sulfónovými kyselinami a fosfónovými kyselinami, a s organickými kyselinami, ako je kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina vínna, kyselina mandľová, kyselina p-toluénsulfónová, kyselina metánsulfónová, kyselina trifluóroctová a pod., a soli peptidových derivátov, ktoré sú dostatočne kyslé, napríklad derivátov, ktoré majú voľnú karboxylovú skupinu, s bázami tvoriacimi fyziologicky prijateľné katióny, ako sú soli s alkalickými kovmi (ako je sodík alebo draslík), soli s kovmi alkalických zemín (ako je horčík alebo vápnik) soli s hliníkom a amónne soli, rovnako ako soli s vhodnými organickými bázami, ako je etanolamín, metylamín, dietylamín, izopropylamín, trimetylamín a pod. .

Ako sa uvádza vyššie, deriváty peptidov všeobecného vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľné soli, budú mať užitočný farmakologický vplyv u teplokrvných živočíchov (vrátane človeka) pri liečbe autoimúnnych ochorení a/alebo stavov, na liečbu symptómov alebo ako modifikačné činidlo alebo profylaktické činidlo. Medzi takéto ochorenia patrí napríklad reumatoidná artritída, viacnásobná skleróza, Goodpasturov syndróm, idiopatická trombocytopenická purpura, mladícka reumatoidná artritída, celiakia, systémový lupus erythematosus, ankyloidná spondylitída, Sjorgenov syndróm, myasténia gravis, diabetes typu I (závislý od inzulínu), Hashimotove ochorenie, Graveove ochorenie, Addisonove ochorenie, skleroderma, polymyozitída, dermatomyozitída, jednoduchý pemfigus, pemfigoidná bulóza, autoimúnna hemolytická anémia, zhubná anémia, glomerulonefritída, odmietnutie transplantátu a pod., najmä reumatoidná artritída a viacnásobná skleróza.

Využiteľnosť peptidových derivátov .všeobecného vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľných solí sa môže stanoviť použitím mnohých štandardných testov a klinických štúdií, vrátane tých, ktoré sa opisujú v medzinárodných patentových prihláškach číslo WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707 (alebo ich modifikáciách) a pomocou testov opísaných nižšie. Deriváty peptidov všeobecného vzorca I sa vyznačujú významnou aktivitou pri jednom alebo viacerých takýchto testoch alebo štúdiách.

Test A

Test väzby čisteného HLA-DR peptidu in vitro (tento test sa môže použiť na demonštráciu väzby derivátov peptidov všeobecného vzorca I na molekuly MHC triedy II súvisiacich s ochorením).

μΐ biotín-FHA307-320 (FHA (307-320)-peptid derivatizovaný na N-konci biotínom s dlhým reťazcom (Biotín-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) pri vlnovej dĺžke 800 nm vo fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (PBS)) sa inkubuje s 30 μΐ čisteného HLA-DR4Dw4 pri koncentrácii medzi 0,5 a 5 pg/ml v mikrotitračnej doske s jamkami v tvare V (V-jamky) (Nunc) počas 48 hodín s inhibítorom peptidov alebo bez neho. Na konci inkubačnej periódy sa 100 μΐ inkubátu prevedie na dosky na test s enzýmom naviazaným na imunosorbent (ELISA test) (Nunc), ktoré sa predtým potiahli anti-MHC protilátkou (L243 kolekcia kultúr amerického typu (ATCC) HBSS opísaná v Lampson & Levy,' J. Immunol. 125, 293-299 (1980)) pri koncentrácii 10 pg/ml na 1 hodinu pri teplote miestnosti a potom sa počas 1 hodiny .blokuje 1 % teľacím sérovým albumínom (BSA) v PBS a 0,05 % Tween 20. Po ďalšej 1 hodine sa neviazaný peptid vymyje a na 2 hodiny pri teplote miestnosti sa pridá 1/4000 zriedená streptavidínperoxidáza (Sigma) v PBS s 0,01 % vhodného detergenta, ako je NP-40 (Sigma). Po ďalšom premytí sa do každej jamky pridá tetrametylbenzidénový (TMB) substrátový roztok (1 TMB tableta (Sigma) v 10 ml 0,1 M citrát/acetát pufra, pH 6,0 s 36 μΐ hydroperoxidu močoviny (UHPO) (Fluka)). Reakcia sa ukončí pridaním 2 M kyseliny sírovej (10 μΐ na jamku) a pomocou merania absorbancie pri vlnovej dĺžke 450 nm sa určí množstvo viazaného peptidu. Inhibičná aktivita peptidov sa získa pomocou vynesenia absorbancie oproti koncentrácii. .

Čistený HLA-DR4Dw4 sa získa nasledovným spôsobom:

(i) Expresia HLA-DR v baculovírusovom systéme

Expresia rekombinovaných proteínov v bunkách z baculovírusových vektorov je postupom používaným na získanie vysokého výťažku rekombinovaného proteínu (Luckow, V. A. & Summers,

M. D., Biotechnology 6, 547-551 (1988)). Aby sa umožnila expresia heterodimérneho HLA-DR, napríklad HLA-DR4Dw4, z jedného rekombinovaného baculovírusového vektora (čo odporuje získaniu oddelených rekombinovaných vírusov pre a a β reťazce a potom koinfekcii), pripraví sa dvojnásobný rekombinovaný baculovírus, ktorý obsahuje a a β reťazce.

cDNA kódujúca sekvencia a polypeptidu sa klonuje do transferového vektora pacYMl (Matsuura, Y, Possee, R. D. , Overton, H. A & Bishop, D. H. L., J. Gen Virol. 68, 1233-1250 (1987)), aby sa uviedla expresia proteínu pod kontrolu polyhedrínového promótora. Jednotka sa zavedie do genómu baculovírusu pomocou homológnej rekombinácie v bunkách Sf21 a vytvorí sa jednoduchý rekombinant baculovírusu pre reťazec a. Techniky na kultiváciu a infekciu buniek, na homológnu rekombináciu a detekciu/izoláciu rekombinovaného vírusu sa podrobne opisujú v Summers, M. D. D. & Smith, G. E., A Manual of Methods for Baculovírus Vectors and Insect Celí Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555 (1987). Molekulárne genetické techniky používané na prípravu rekombinovaných vektorov sú tiež dostupné v literatúre a podrobne sa opisujú v Sambrook, J, Fritsch, E. E. & Maniatis, T., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nt^ Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Aby sa pripravil dvojnásobne rekombinovaný baculovírus, cDNA kódujúca β reťazec sa klonuje do transferového vektora pAcUWl (Weyer, U, Knight, S. & Possee, R. D., J. Gen. Virol. 71, 1525-1543 (1990)), a tak sa uvedie expresia proteínu pod kontrolu P10 promótora. Jednotka sa potom vloží do genómu jedného rekombinovaného baculovírusu nesúceho reťazec a. Dvojnásobne rekombinované vírusy sa detegujú pomocou nabodkovania · buniek infikovaných náhodne zobranými vírusmi z transfekcie na membrány a ich reakciou s monoklonálnou protilátkou, napríklad L243, ktorá špecificky rozpozná HLA- -DR heterodimér. Viazanie protilátky na Sf21 bunky sa deteguje použitím štandardných prietokových cytometrických techník, ktoré sú ľahko dostupné z literatúry.

Stabilné dvojnásobne rekombinované baculovírusy vylučujúce HLA-DR sa čistia z povlaku.

(ii) Čistenie HLA-DR od buniek

Použitá metóda je modifikáciou metódy opísanej Gorgom a kol.

I (Gorga a kol., J. Biol. Chem. 262, 16087-16094 (1987)). HLA-DR vylučujúce bunky baculovírusu/Sf21 (10 1, čo je približne 2 x ΙΟ^θ buniek) sa rozpustia v 100 ml 5 mM EDTA (sodná soi) , 50 mM Tris-HC1, pH 8,5, 2 % NP-40, 150 nM chloridu sodného, 1 mM jódacetamidu, 1 mM PMSF pomocou homogenizácie 10 ťahmi teflónového skleneného homogenizéra. Homogenizát sa odstreďoval pri 100 000 g počas 1 hodiny a oddelil sa supernatant. Anti-HLA-DR monoklonálna protilátka LB3.1 (Gorga a kol., Celí. Immunol. 103, 160-172 (1986)) kovalentne viazaná v pomere 50 mg L243 na 10 ml proteín A-sefarózy (Pharmacia) a preinkubovaná s 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 % NP-40 (20 objemov kolóny), potom 0,15 M chloridu sodného, 50 nM Na2HPC>4, pH 7,0, 1 % oktylglukozidom (20 objemov kolóny). HLA-DR sa eluuje

50-mM dimetylamínu, pH 11,0, 0,15 M chloridu sodného, 1 % oktylglukozidom. Frakcie z kolóny sa okamžite neutralizujú 1 M Tris-HCl, pH 8,0 a zahustia sa ultraodstredením cez membránu Centricon 10. Obsah proteínu sa určí pomocou BCA proteínového testu (Pierce) a čistota pomocou SDS-PAGE elektroforézy.

Vo všeobecnosti, deriváty peptidov všeobecného vzorca I, ktoré sa definujú vyššie a ktoré sa testovali v teste A, sa vyznačovali významnou inhibíciou pri koncentrácii asi 10 μΜ alebo podstatne nižšej.

Ďalší výhodný aspekt predkladaného vynálezu zahŕňa derivát peptidu všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ, ktorá sa neviaže na HLA-DR3, ale viaže sa na HLA-DR1 a/alebo HLA-DR4Dw4 a/alebo HLA-DR4Dwl4. HLA-DR3 je všeobecná HLA-DR alela, ktorá nesúvisí s reumatoidnou artritídou. Teda u pacientov s reumatoidnou artritídou, ktorí majú HLA-DR3 ako jednu z jeho alel (čo je približne jedna tretina z celkového počtu pacientov s reumatoidnou artritídou), nebudú takéto deriváty peptidov všeobecného vzorca I zasahovať do normálnej úlohy HLA-DR3 v obrannej funkcii hostiteľa.

Použitie takýchto derivátov peptidov je preto zvlášť výhodné na liečbu pacientov s reumatoidnou artritídou, pretože dochádza k menšej imunosupresii než pri použití neselektívnych látok viažucich

DR.

Pomocou variantu testu A sa odhadla schopnosť peptidu podľa vynálezu viazať jednu alebo viacero molekúl HLA-DR .nasledovným spôsobom:

(i) Čistenie typov HLA-DR z bunkových kmeňov

Použitá metóda je modifikáciou metódy opísanej Gorgom a kol.,

J. Biol. Chem. 262, 16087-16094 (1987). Ľudské HLA-DR antigény sa čistili z rôznych bunkových kmeňov pomocou imunoafinitnej chromatografie. 1 x 10³ - 5 x 10³ sedimentovaných buniek príslušného bunkového kmeňa z Hom 2 (zdroj DRI), BBF (zdroj DR2), AVL-B (zdroj DR3) , JAH (zdroj DR4Dw4), JHAF (zdroj DR4Dwl3) alebo Pell7 (zdroj DR4Dwl4) sa rozpustí približne pri teplote 4° C v 50 ml 5 mM EDTA (sodná sol), 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 % NP-40, 150 mM chloridu sodného, 1 mM jódacetamidu, 1 mM PMSF, pomoco.u homogenizácie 10 ťahmi teflónového skleneného homogenizéra. Homogenizát sa potom odstreďoval pri 100 000 g počas 1 hodiny a odoberal sa supernatant. Anti-HLA-DR monoklonálna protilátka LB3.1 (Gorga a kol., Celí. Immunol. 103, 160-173 (1986)) kovalentne kondenzovaná k CNBr-Sefaróze 4B (Pharmacia) sa ekvilibruje so 150 mM chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 % NP-40 a inkubuje sa cez noc so supernatantom. Živica sa potom umiestni na kolónu a premyje sa 0,15 M chloridu sodného, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % oktylglukozidom (20 objemov kolóny). HLA-DR sa eluuje 50 mM dietylamínu, pH 11,0, 0,15 M chloridom sodným, 1 % oktylglukozidom. Frakcie z kolóny sa okamžite neutralizujú 0,5 M HEPES NaOH, pH 7,4. Obsah proteínu sa určí pomocou Biorad proteínového testu a čistota pomocou SDS-PAGE elektroforézy.

(ii) Test selektivity viazania peptidu

200 nM biotín-FHA3Q7-320 ^v pufrovanom solnom roztoku (PBS) sa inkubuje s čisteným HLA-DRl, DR2, DR4Dw4, DR4Dwl3 alebo DR4Dwl4 (2-20 pg/ml) v mikrotitračných doskách s jamkami v tvare V (Nunc) s inhibítorom peptidov alebo bez neho v testovanom pufri (PBS, 0,01 % NP-40 (Sigma)). Na inhibíciu DR3 sa 400 nM Biotín-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH sa inkubuje s čisteným DR3 (20 pg/ml), a inkubuje sa tak, ako sa opisuje vyššie. Po 48 hodinách sa inkubáty zapracovali a určila sa absorbancia tak, ako sa opisuje vyššie. Inhibičná aktivita ' peptidov vyjadrená ako hodnota IC50 sa vypočíta použitím Software Microcal Origin na počítači.

Test B

Inhibícia aktivácie T-buniek in vitro (tento test sa môže použiť na demonštráciu schopnosti derivátov peptidov všeobecného vzorca I inhibovat imunitnú odpoveď T-buniek sprostredkovanú molekulami MHC triedy II)

Peptidové inhibítory sa testovali na schopnosť blokovať stimuláciu B52.24 hybridómovej línie T-buniek myší, ktoré reagujú na FHA307-320 peptid (H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) prítomný v HLA-DR4Dw4 molekulách. Látka B52.24 sa pripraví fúziou T-buniek lymfatických uzlín izolovaných z FHA307-320 imunizovaných HLA-DR4Dw4 transgénnych myší (medzinárodná patentová prihláška číslo WO 95/03331) s kmeňom BW5147 myších lymfatických T-buniek (White a kol., J. Immunol. 143, 1822 (1989)) ako sa uvádza v práci Woods a kol., J. Exp. Med. 180, 173-181 (1994) a všeobecnými metódami na prípravu hybridómov T-buniek opísanými v Current Protocols in Immunology, oddiel 2.7.21.

Peptidové inhibítory sa zmiešali pri koncentrácii od 100 do. 0,1 μΜ (alebo nižšej) s antigénnym peptidom FHA3Q7_320 ^s buď rôznymi koncentráciami medzi 100 a 0,1 μΜ alebo s pevnou koncentráciou 10 μΜ zriedením v kultivačnom médiu RPMl-1640 (Gibco) na 96 jamkovej mikrotitračnej doske (Nunc) na konečný objem 100 μΐ. Pomocou gluteraldehydu sa na 30 s ustálili B-bunky s expresiou HLA-DR4Dw4 (napríklad JAH EBV transformované kmene lymfoblastoidných buniek - Európska kolekcia kultúr ECACC 85102909) alebo B-bunky izolované z HLA-DR4Dw4 homozygotných jedincov a transformované pomocou Epstein-Barr vírusu metódou opísanou v Current Protocols in Immunology, oddiel 7.22.1 (suspendovaním na 30 sekúnd v 1 % gluteraldehyde (Sigma) pri koncentrácii 4 x 10² buniek/ml). Potom sa na 3 minúty pridal ekvivalentný objem 20 mM lyzínu (Sigma). Bunky sa spracovali odstredením pri 300 g, premyli.sa v roztoku RPMI-1640 a naniesli sa na mikrotitračné dosky obsahujúce antigénne a inhibítorové zlúčeniny s koncentráciou 2 x 10² buniek na jamku. Mikrotitračné dosky sa inkubovali počas 2 hodín pri teplote 37° C a v atmosfére s 5 % CO2Mikrotitračné dosky sa potom premyli v roztoku RPMI-1640 odstredením pri 300 g, dvakrát sa odplynili, potom sa pridali hybridné T-bunky kmeňa B52.24 pri koncentrácii 1 x 10² buniek na jamku v kultivačnom médiu (RPMI-1640, 10 % fetálne hovädzie sérum (Gibco) a 2 mM glutamínu (Gibco)). Mikrotitračné dosky sa potom inkubovali počas ďalších dvoch dní pri teplote 37° C v atmosfére s 5 % CO2. Dosky sa potom počas 10 minút odstredili pri 300 g a z každej jamky sa pred biologickým testom na obsah IL-2 odobralo 150 μΐ roztoku na zmrazenie pri teplote -20° C.

Kultivačné dosky obsahujúce roztoky na testovanie sa ponechali pri teplote miestnosti roztopiť a 100 μΐ roztoku sa previedlo na čerstvú dosku s 96 jamkami s okrúhlym dnom. Použitím kultivačného média (RPMI-1640 (Gibco), 10 % hovädzieho fetálneho séra (Advanced Proteín Products), 100 μg/ml streptomycínu a 100 U/ml penicilínu (Gibco), 2 mM L-glutamínu (Gibco) a 50 μΜ 2-merkaptoetanolu (Sigma)) sa uskutočnilo 1 : 1 sériové zriedenie IL-2, čím sa získala štandardná krivka 250 jednotiek/ml až 0,04 jednotky/ml IL-2. Od IL-2 závislý kmeň buniek ako CTLL-2 bunky (Náture 268, 154-156 (1977)) alebo HT-2 bunky (J. Immunol. Methods 94-104 (1987)) sa spracovali a dvakrát premyli kultivačným médiom, a potom sa opäť suspendovali pri koncentrácii 5 x 10⁴ buniek/ml. Potom sa do každej jamky štandardnej krivky a testovaných vzoriek pridalo 100 μΐ suspenzie od IL-2 závislých buniek. Kultivačné dosky sa inkubovali počas 72 hodín pri teplote 37° C v atmosfére s 5 % CO. Potom sa do každej jamky pridalo 20 μΐ (ImCi) 3H-tymidínu (Amersham Inter25 national) a dosky sa vrátili do inkubátora na ďalších 16 hodín. Obsah každej dosky sa previedol na filtračnú podložku zo skleného vlákna a zmerala sa rádiokativita pomocou β scintilačného počítača.

Vo všeobecnosti platí, že peptidové deriváty vzorca I uvedeného vyššie, ktoré sa testovali testom B, sa vyznačujú silnou inhibíciou pri koncentrácii asi 10 μΜ alebo podstatne nižšej.

Test C

Peptidom stimulovaná DTH (oneskorený typ hypersenzitivity) u myší Balb/c (test sa dá použiť na dôkaz in vivo aktivity peptidových derivátov vzorca I na zvieracom modeli)

Balb/c samice myší (18 - 20 g) v skupinách po 5 sa podkožné očkovali do slabín 0,1 ml emulzie ovalbumínu (Sigma) (2 mg/ml v saline) zmiešané v pomere 1 : 1 (objemovo) s kompletným Freundovým činidlom (Sigma). Po siedmich dňoch sa stanovila hrúbka chodidla použitím duálneho odpichovacieho mikrometra, a potom sa do chodidla zadnej končatiny vstrekla 30 μΐ podkožná injekcia 1 % teplom zrazeného ovalbumínového proteínu vo fyziologickom roztoku. Dvadsaťštyri hodín po vstreknúť! antigénu sa chodidlá opäť zmerali a vypočítala sa DTH odozva ako percento zvýšenia hrúbky chodidla po injekcii v porovnaní s kontralaterálnou (druhou) stranou. Inhibítory sa podávali trojdennými osmotickými minipumpičkami (Alzet) implantovanými 24 hodín pred podaním antigénu v dávke od 10 mg/kg/deň až do 0,1 μg/kg/deň. Stupeň inhibície sa vypočítal z hodnoty opuchu inhibítorom ošetreného chodidla a hodnoty opuchu chodidla ošetreného kontrolnou dávkou nosiča, a to vydelením hodnotou kontrolnej vzorky a vynásobením 100.

Peptidové deriváty vzorca I uvedené vyššie, ktoré sa testovali v teste C sa vo všeobecnosti vyznačovali silnou inhibíciou pri dávkach 1 mg/kg/deň alebo podstatne menších bez vyvolania akéhokoľvek zjavného toxikologického alebo iného než farmakologického účinku.

Test D (Test sa dá použiť na dôkaz in vivo aktivity peptidových derivátov vzorca I na zvieracom modeli artritídy).

Samice myší balb/c (19 - 21 g, skupiny po 5 - 10) sa očkujú v deň 0 a toto sa stupňuje až do dňa 7, a to podkožnou injekciou 0,1 ml emulzie obsahujúcej rovnaké objemy 2 mg/ml metylovaného albumínu hovädzieho séra (met-BSA, Sigma) vo fyziologickom roztoku a kompletného Freundovho činidla (Sigma) doplneným 2,5 mg/ml Myobacterium tubercolosis (MTB, kmeň C, DT a PN, MAFF, Weybridge, Surrey), čím sa získa konečná koncentrácia MTB 3,5 mg/ml. Navyše sa súčasne podá 0,1 ml injekcie 1 x 10^ organizmov Bordetella pertussis (Wellcome Pertussis vakcína) vo fyziologickom roztoku. Po štrnástich dňoch sa zvieratám do jedného kolenného kĺbu podá 10 μΐ vnútrokíbovej injekcie obsahujúcej 100 μg met-BSA vo fyziologickom roztoku a to použitím 30 G ihly a striekačky Hamilton. Do druhého kolena sa injikuje rovnaký objem fyziologického roztoku, čo poslúži ako kontrolná vzorka. Po trinástich dňoch sa stanoví veľkosť zápalu./opuchu. oboch kolien meraním duálnym odpichovacím mikrometrom. Uskutoční sa to rezom nožničkami s tupými koncami a lekárskymi kliešťami do kože asi 5 mm nad a pod kolenom a pokračuje sa po boku kolena, čím sa vytvorí kypsa, ktorá sa potom opatrne odstrihne, čím sa obnaží naspodku ležiaci kĺb. Meranie sa uskutoční cez najširšiu časť kolena v horizontálnej rovine na ohnutej končatine udržiavanej v zafixovanej polohe. Percento zväčšenia následkom zápalu v kolene so vstreknutým antigénom v porovnaní s kontrolnou vzorkou sa vypočíta podľa vzorca: (hrúbka kolena injikovaného antigénom - hrúbka kolena injikovaného fyziologickým roztom / hrúbka kolena injikovaného fyziologickým roztokom) x 100. Inhibítory sa podávali trojdennými osmotickými minipumpičkami (Alzet) implantovanými 24 hodín pred podaním antigénu v dávke od 10 mg/kg/deň až do 0,1 μg/kg/deň. Percento inhibície zápalu/opuchu sa vypočítalo z merania hrúbky resp. hodnoty opuchu v skupine ošetrenej inhibítorom a hodnoty v kontrolnej skupine ošetrenej iba dávkou nosiča, a to vydelením kontrolnou hodnotou a vynásobením 100.

Ďalšie vyhodnotenie choroby zahŕňa:

1) histologické vyšetrenie zápalu, synovitídy a erózie chrupavky/kosti uskutočnenej na zafixovanej časti kolena vyfarbenej hemotoxylínom a eozínom, a

2) stanovenie hladiny akútneho reaktantu v sére, sérového amyloidu P a/alebo haptoglobínu.

Peptidový derivát vzorca I uvedený vyššie sa môže v teste D vyznačovať silnou inhibíciou pri dávke 10 mg/kg/deň alebo podstatne nižšej.

Ako ilustrácia farmakologickej aktivity konkrétnych peptidových derivátov vzorca I sa vyznačovali zlúčeniny z príkladov 3 a 6 .silnou väzbou na HLA-DR4Dw4 v teste A (alebo variante testu A opísanej vyššie) pri koncentrácii 0,1 μΜ alebo nižšej a v teste C boli aktívne pri koncentrácii menšej než 0,1 mg/kg/deň. Zlúčenina z príkladu 3 sa vyznačovala aj silnou väzbou na HLA-DR4Dw4, ale zlúčeniny z príkladu 3 a 6 sa nevyznačovali silnou väzbou (IC50 > 10.0 μΜ) na HLA-DR1, HLA-DR2 alebo HLA-DR3. Obe zlúčeniny sa vyznačovali dobrou stabilitou vo. vode pri pH 3 a pH 7,6 a vo forme polymérneho extrahovaného depotného prostriedku sa vyznačovali minimálnym úbytkom v dôsledku rozkladu pri potláčaní a minimálnym rozkladom pri uvolnení z tohto depotného prostriedku.

Deriváty peptidov všeobecného vzorca I sa dajú pripraviť pomocou akýchkoľvek známych postupov používaných v chémii peptidov, ktoré sa dajú aplikovať na syntézu analogických peptidov.

Deriváty peptidov všeobecného vzorca I sa dajú pripraviť napríklad pomocou postupov, ktoré sú analogické s postupmi opísanými v Atherton & Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, (vydal IRL Press v Oxford University Press, 1989); Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis (vydal Pierce Chemical Company, Illinois 1984), Principles of Peptide Synthesis (vydal Springer Verlag, Berlín 1984); a v sérii kníh Amino Acids, Peptides and Proteins, diel 1-25 (vydala Royal Society of Chemistry, Cambridge 1994)

Výhodne sa deriváty peptidov všeobecného vzorca I pripravia pomocou postupnej syntézy v tuhej fáze. Použitím tejto techniky sa aminokyselina, ktorá sa má pripojiť na C-koniec aminokyseliny peptidu chráni na α-aminoskupine, a ak je to nutné, aj na vedľajšom reťazci, a kondenzuje sa s tuhým nosičom, napríklad so. živicou, ako je 2-chlórtritylchloridová živica alebo Merrifieldova živica (chlórmetylpolystyréndivinylbenzén) , ak sa po štiepení vyžaduje voľná karboxylová kyselina, alebo Rink Amid živica (4—(2',4'— dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl) fenoxy živica) alebo Rink Amid MBHA živica (N-[4-(2',4'-dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl)fenoxyacetamido-norleucyl]-4-metylbenzhydrylamínová živica (všetky dostupné od Calbiochem-Novabiochem) , ak sa po štiepení vyžaduje karboxamid, a potom sa odstráni ochranná skupina z α-aminoskupiny. Aminokyselina, ktorá sa má pripojiť na C-koniec aminokyseliny, sa chráni na a-aminoskupine, a ak je to nutné aj na vedľajšom reťazci, a kondenzuje sa s C-koncom aminokyseliny, ktorá zostala pripojená na tuhom nosiči. Postupný spôsob odstránenia skupiny chrániacej a-aminoskupinu a kondenzácia s ďalšou aminokyselinou sa opakuje, čím sa získa chránený alebo nechránený polypeptid pripojený na tuhom nosiči. Chránená aminokyselina všeobecného vzorca II sa môže pripraviť napríklad tak, ako sa opisuje v príkladoch alebo ako sa ilustruje v schéme 1 nižšie, alebo pomocou analogických postupov použitím symetrického alebo nesymterického amínu vzorca R^R^NH. Amíny všeobecného vzorca RiR^NH sa dajú pripraviť pomocou spôsobov, ktoré sú v tejto oblasti známe, napríklad tak, ako sa opisuje v príkladoch alebo ako sa ilustruje v schéme 2 nižšie, alebo analogickými spôsobmi. Činidlá a podmienky použité na uskutočnenie reakčných krokov v schémach 1 a 2, ako je alkylácia alkoholov a amínov, kondenzácia amínov a karboxylových kyselín, pričom vznikajú amidy, vznik močoviny a karbamátov a chránenie a odstránenie ochranných skupín, sú v tejto oblasti dobre známe a opisujú sa v štandardných učebniciach. Skupina vzorca III alebo IV sa do sekvencie zavedie pomocou vhodnej chránenej kyseliny (3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)alkánovej (pre peptidovú zlúčeninu obsahujúcu III, kde A je metylénová skupina) alebo zodpovedajúceho oxoanalógu získaného tak, ako sa opisuje v J. Med. Chem. 36, 256-263 (1993) alebo pomocou analógu (pre peptidovú zlúčeninu obsahujúcu III, kde A je atóm kyslíka) alebo kyseliny (6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl) alkánovej (pre peptidovú zlúčeninu obsahujúcu IV) na miesto chránenej aminokyseliny. Skupina vzorca V sa môže do sekvencie zaradiť použitím vhodnej chránenej kyseliny 3-amino-2-oxoperhydroazepín-l-alkánovej získanej podľa J. Med. Chem. 36, 256-263 (1993) (alebo analogickým spôsobom) , alebo tak, ako sa opisuje v príkladoch nižšie (alebo analogickým spôsobom) . Chránený alebo nechránený polypetid sa uvoľní z tuhého nosiča pomocou štandardných postupov, napríklad použitím zmesi kyseliny trifluóroctovej, trietylsilánu a vody.

Je potrebné uvedomiť si, že vedlajší reťazec ochrannej skupiny sa môže štiepiť v podmienkach používaných na uvoľnenie peptidu z tuhého nosiča alebo sa môže štiepiť v oddelenom kroku, pričom sa následne uvoľní peptid z tuhého nosiča. Ďalej je potrebné uvedomiť si, že spôsob výstavby polypeptidu sa môže upraviť použitím sekvencie dvoch alebo viacerých vhodne chránených aminokyselín vo vhodnom kondenzačnom kroku. Pri syntéze sa môže použiť ručná technika alebo sa môže uskutočňovať automaticky, pričom sa využíva napríklad Applied Biosystems .431A alebo 430A syntetizér peptidov, Advanced Chemtech ACT357 syntetizér peptidov alebo podobné automatické syntetizéry peptidov alebo sa môže použiť kombinácia oboch techník.

V priebehu syntézy peptidov sa aminokyselinové funkčné skupiny nezúčastňujúce sa reakcie chránia rôznymi ochrannými skupinami. Napríklad N-koncové aminoskupiny vo vedľajšom reťazci sa môžu chrániť použitím 9-fluorenylmetoxykarbonylovej skupiny (Fmoc), i

terc-butoxykarbonylovej skupiny (Boe),, bifenylizopropoxykarbonylovej skupiny (Bpoc), 2-(3,5-dimetoxyfenyl) propyl-2-oxykarbonylovej skupiny (Ddz), adamantyloxykarbonylovej skupiny (Adoc), alyloxykarbonylovej skupiny (Aloc), 2,2,2-trichlóretoxykarbonylovej skupiny (Troc), benzyloxykarbonylovej skupiny a rôznych substituovaných bezyloxykarbonylových skupín. Tieto ochranné skupiny sa môžu štiepiť, ak je to nutné, pomocou štandardných techník (napríklad pomocou kyslého alebo bázického spracovania, katalytickej hydrogenolýzy a reakcie s Pd (0) alebo so zmesou zinok/kýselina octová).

Medzi vhodné ochranné skupiny používané na chránenie guanidínovej skupiny vo vedľajšom reťazci v peptidoch obsahujúcich zvyšok arginínu patrí nitroskupina, adamantyloxykarbonylová skupina, 4-metoxy-2,3,6-trimetylbenzénsulfonylová skupina (Mtr), 2,2,5,7,8-pentametylchromán-6-sulfonylová skupina (Pmc) a (najmä) 2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofurán-5-sulfonylová skupina (Pbf).

Vhodnými ochrannými skupinami používanými na chránenie hydroxylovej skupiny vo vedľajšom reťazci sú terc-butylová skupina, benzylová skupina a tritylová skupina (Trt). Vhodnými ochrannými skupinami používanými pre imidazolové skupiny vo vedľajšom reťazci v peptidoch obsahujúcich zvyšok histidínu sú tritylová skupina, benzylová skupina, tozylová skupina, dinitrofenylová skupina, skupina Adoc, skupina Boe alebo skupina Fmoc.

Vhodnými ochrannými skupinami používanými na chránenie karboxylovej skupiny vo vedľajšom reťazci sú rôzne estery (napríklad metylesterová skupina, etylesterová skupina, tére-butylesterová skupina, benzylesterová skupina, nitrobenzylesterová skupina, alylová skupina a 9-fluorenylmetylesterová skupina.

Reakcia štiepenia ochranných skupín sa môže uskutočňovať pri teplotách v rozsahu 4 až 40° C (výhodne pri teplote blízkej teplote miestnosti) a v časovom rozsahu 10 minút až 24 hodín.

Vhodné spôsoby kondenzácie používanej na kondenzáciu jednotlivých aminokyselín zahŕňajú bežne používané azidy, symetrické anhydridy, zmiešané anhydridy a rôzne aktívne estery a karbodiimidy. V prípade rôznych karbodiimidov (napríklad dicyklohexylkarbodiimidu alebo diizopropylkarbodiimidu) sa môže použiť aj množstvo prísad (napríklad 1-hydroxybenzotriazol (HOBT) a N-hydroxysukcínimid). Ďalej sa môže kondenzácia aminokyselín dosiahnuť aj použitím mnohých iných činidiel, napríklad lH-benzotriazol-l-yloxytris(pyrolidinofosfóniumhexafluorofosfátu (PyBOP), 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluoroborátu (TBTU) a 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluoroborátu (HBTU). Kondenzačná reakcia sa môže uskutočňovať pri teplotách v rozsahu -20 až 40° C a v časovom rozsahu 10 minút až 24 hodín. Vhodným médiom na uskutočnenie kondenzačnej reakcie je napríklad N,N-dimetylformamid (DMF). Zvlášť vhodným spôsobom je použitie HBTU, HOBT a diizopropyletylamínu v dimetylformamide.

Príklady týchto a iných spôsobov syntézy peptidov sa uvádzajú v medzinárodných patentových prihláškach uvedených tu ako odkazy. Hydrofóbny zvyšok P, ktorý je skupinou vzorca R-, skupinou R-CO-, skupinou R-SO2-, skupinou R-O-CO-, skupinou R-NH-CO-, skupinou R-O-CS-, skupinou R-S-CO-, skupinou R-NH-CS-, skupinou R-S-CS- a skupinou R-CS- (alebo takou skupinou prítomnou ako substituent na koncovej aminoskupine P, kde P je hydrofóbna aminokyselina alebo hydrofóbna aminokyselina nesúca ďalšiu aminokyselinu) sa môže zaviesť napríklad v koncovom kroku pomocou alkylácie, acylácie alebo pomocou inej štandardnej modifikácie funkčnej skupiny koncovej aminokyseliny. Ak je potrebná modifikácia C-konca (aby sa získalo príslušné Q), môže sa uskutočniť po syntéze peptidu

I · . ¹ využitím bežných spôsobov na modifikáciu funkčných skupín. Alternatívne sa príslušné Q môže získať pomocou vhodnej voľby počiatočnej východiskovej živice a/alebo chránenej jednotky, ktorá sa najskôr kondenzuje so živicou (napríklad použitím vhodnej chránenej skupiny všeobecného vzorca H-Q). Typické príklady prípravy peptidových zlúčenín všeobecného vzorca I sa uvádzajú v príkladoch nižšie.

Typickým spôsobom na meranie stability derivátov peptidu podľa predkladaného vynálezu je nasledovný spôsob, kedy aby sa minimalizovalo mikrobiálne znečistenie a degradácia, sa všetko vybavenie, ktoré sa používa na prípravu roztokov peptidu, sterilizuje v autokláve a všetky manipulácie s materiálom sa uskutočňujú v skrini s laminárnym prúdením triedy II. Približne 20 ml roztoku Mcllvainovho pufra obsahujúceho kyselinu citrónovú a fosfát pri pH 3 alebo 7,6 obsahujúceho 0,02 % azidu sodného sa filtruje do 50 ml banky použitím sterilnej 0,22 μτπ filtračnej jednotky a 20 ml striekačky. V uzatvorenej fiolka sa presne odváži približne 1,2 mg peptidu. Použitím sterilnej pipetovej špičky sa k peptidu vo fiolke pridá dostatočné množstvo roztoku pufra, aby sa získala koncentrácia 0,1 mg/ml. Fiolka sa uzatvorí a pretrepe sa, pričom sa peptid rozpustí. Použitím sterilnej pipetovej špičky sa približne 1 ml alikvotné diely roztoku peptidu prevedú do 10 ml HPLC fioliek, ktoré sa potom uzatvoria. 5 fioliek sa skladuje pri teplote -18 až 37° C. Plocha píkov peptidu pre roztok sa určí pomocou HPLC použitím vhodných štandardov pred a po skladovaní pri teplote -18 až 37° C počas 1, 2, 3 a 4 týždňov, pričom sa v každom časovom úseku použije nová fiolka a vzorka sa stanoví dvakrát. Percentuálny obsah zvyšného peptidu po skladovaní pri teplote 37° C v každom časovom úseku sa určil z pomeru plochy piku peptidu v každom časovom úseku k počiatočnej ploche. Výhodné deriváty peptidov podlá predkladaného vynálezu obsahujú viac než 90 % a výhodne viac než 95 % zvyškového peptidu po skladovaní pri teplote 37° C tak pri pH 3 ako aj pri pH 7,6.

Deriváty peptidov všeobecného vzorca I sa zvyčajne podávajú teplokrvným živočíchom (vrátane človeka), ktorí takúto liečbu potrebujú, vo forme farmaceutických prostriedkov, ktoré sú vo farmácii známe.

V súlade s ďalším rysom predkladaný vynález poskytuje farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje derivát peptidu všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnú sol v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

Prostriedok môže byť vo forme vhodnej na orálne použitie, napríklad vo forme tabliet, toboliek, vodného alebo olejového roztoku, suspenzie alebo emulzie; na nazálne použitie, napríklad vo

I forme prášku na vdychovanie, nosného spreja alebo nosných kvapiek; na vaginálne alebo rektálne použitie, napríklad čapíkov; na inhalačné podávanie, napríklad dobre rozotreného prášku alebo aerosólu; na podávanie pod jazyk alebo na bukálne podávanie, napríklad vo forme tabliet alebo toboliek; alebo na parenterálne použitie (vrátane vnútrožilového, podkožného, medzisvalového, vnútrocievneho a infúzneho podávania), napríklad vo forme sterilného vodného roztoku alebo olejového roztoku alebo suspenzie. Prostriedky môžu byť vo forme vhodnej na miestne podávanie, ako sú krémy, masti a gély. Môžu byť aj vo forme náplastí na pokožku. Prostriedky sa vo všeobecnosti opisujú v kapitole 25.2 v Comprehensive Medicinal Chemistry, diel 5, vydavateľ Hansch a kol.,·Pergamon Press 1990.

Vo všeobecnosti sa dajú uvedené prostriedky pripraviť pomocou bežných postupov, pričom sa využívajú bežné prísady. Avšak v prípade prostriedkov na orálne podávanie môže byť vhodné, aby prostriedky obsahovali povlaky na ochranu polypeptidovej aktívnej zložky pred pôsobením enzýmov v žalúdku.

Výhodným prostriedkom podľa predkladaného vynálezu je prostriedok vhodný na orálne podávanie v jednotlivej dávkovacej forme, napríklad tablete alebo tobolke, ktorá obsahuje 2,5 až 500 mg, a výhodne 10 až 100 mg, polypeptidu v jednotlivej dávke, alebo prostriedok na parenterálne podávanie, ktorý obsahuje 0,5 až 100 mg polypeptidu na ml, a výhodne 1 až 10 mg polypeptidu na ml.

Prostriedok na parenterálne podávanie je výhodne roztok v izotonickej soľanke alebo izotonickej dextróze pufrovaný, ak je to nutné, na pH 5 až 9. Alternatívne sa môžu prostriedky na parenterálne podávanie upraviť na pomalé uvoľňovanie aktívnej zložky, kedy je množstvo polypeptidu na jednotlivú dávku zvyčajne vyššie než množstvo používané pri bežnom injekčnom podávaní prostriedku. Výhodný prostriedok na pomalé uvoľňovanie je prostriedok s kontinuálnym uvoľňovaním, napríklad prostriedok typu, ktorý sa opisuje v európskej patentovej prihláške číslo 58481, alebo pre peptidové deriváty všeobecného vzorca I, ktoré obsahujú najmenej jednu bázickú skupinu, prostriedok opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške číslo WO 93/24150. Určité deriváty peptidov pódia predkladaného vynálezu majú také charakteristiky rozpustnosti, ktoré umožňujú prípravu a spracovanie prostriedkov na parenterálne podávanie s pomalým uvoľňovaním, najmä prostriedkov obsahujúcich biologicky rozložiteľné polyestery, ako sú polylaktidy, a prípravu prostriedkov s pomalým uvoľňovaním, ktoré majú výhodnú uvoľňovaciu charak34 teristiku. Ďalej môžu deriváty peptidov podlá predkladaného vynálezu, ktoré obsahujú jednu alebo viac bázických skupín, najmä arginín, tvoriť aj peptidové polymérne soli s polyestermi zakončenými kyselinou, ako sú polylaktidy, a takéto peptidy a peptidové polymérne soli tvoria ďalší aspekt podlá predkladaného vynálezu. Určité takéto soli majú charakteristiku rozpustnosti, ktorá umožňuje zvlášť vhodným spôsobom prípravu a spracovanie prostriedkov na parenterálne podávanie s pomalým uvoľňovaním, napríklad ako sa opisuje v medzinárodnej patentovej prihláške číslo WO 93/24150, a prípravu prostriedkov s pomalým uvoľňovaním s výhodným uvoľňovacím profilom a výhodnou stabilitnou charakteristikou pri skladovaní. Výhodné prostriedky na parenterálne podávanie s pomalým uvoľňovaním sú upravené aj na uvoľňovanie v perióde najmenej 5 dní.

Výhodné deriváty peptidov podlá predkladaného vynálezu zahŕňajú deriváty, ktoré sa, ak sú vo forme vytlačovaného polymérneho prostriedku na skladovanie, vyznačujú minimálnou stratou spôsobenou degradáciou na výlisku, alebo ktoré sa vyznačujú minimálnou degradáciou pri uvoľnení z takéhoto prostriedku na skladovanie'. Typické spôsoby na meranie úrovne degradácie peptidov podľa predkladaného vynálezu sú nasledovné:

Príprava vytlačovaného polymérneho prostriedku peptidu na skladovanie

Asi 20 mg peptidu sa presne odváži a pridá sa dostatočné množstvo polyméru (50/50 % molárnych kopolyméru poly (Z?,L-kyselina mliečna/kyselina glykolová) s približnou strednou molárnou hmotnosťou 20 kDa a s približnou polydisperzitou 1,7 určenými pomocou vytesňovacej chromatografie (size exclusion chromatography), čím sa získa približne 20 % (hmotn./hmotn.) zmes. Tá sa rozpustí v ľadovej kyseline octovej neobsahujúcej anhydrid, čím sa získa 10 % (hmotn./objem) roztok. Roztok sa suší v chlade a získaný zmrazený produkt sa skladuje pred použitím vo vákuu.

Asi 100 mg zmrazeného materiálu sa vloží do bubna malého laboratórneho extrudéra a plunžerový piest sa stlačí, čím sa vzorka spojí. Extrudér sa zohreje na teplotu 90 až 95° C a pri tejto teplote sa udržiava počas 10 minút. Potom sa látka sušená v mraze pretláča účinkom tlaku, čím sa získa valcovitý výlisok s priemerom približne 1 mm.

Analýza obsahu peptidu v extrudovanom polymérnom prostriedku peptidu na skladovanie

Dve približne 5 mm dlhé extrudované časti polyméru obsahujúceho peptid sa presne odvážia a rozpustia sa v 1 ml ľadovej kyseliny octovej neobsahujúcej anhydrid v oddelených 25 ml odmerných bankách. Približne po 1,5 hodine sa objem každej banky doplní destilovanou vodou na objem 25 ml, čím dôjde k vyzrážaniu polyméru. Tuhý podiel sa odfiltruje použitím 0,5 gm Millex PTFE filtra a roztoky A sa zhromaždia.

Séria štandardných roztokov sa pripraví zo zásobného roztoku peptidu v destilovanej vode s koncentráciou 0,5 mg/ml a zásobného roztoku polyméru v ľadovej kyseline octovej neobsahujúcej' anhydrid s koncentráciou ' 2,5 mg/ml, pričom sa každý' roztok doplní destilovanou vodou na objem 10^!ml:

Koncentrácia	Objem zásobného	Objem zásobného
peptidu	roztoku polyméru	roztoku peptidu
(gg/ml)	(gl)	(gl)
50	1000	1000
40	1000	800
30	1000	600
20	1000	400
10	1000	200
5	1000	100
0	1000	0

Každý štandard sa filtruje cez 5 gm Millex PTFE filter a alikvotné diely filtrátu spoločne s alikvotnými dielmi roztoku A sa analyzujú pomocou HPLC, pričom sa každá vzorka stanoví dvakrát.

Obsah peptidu v prostriedku extrudovaného polyméru na skladovanie sa vypočíta z koncentrácie peptidu v roztoku A, ktorá sa určí pomocou porovnania plochy piku peptidu v roztoku A s plochou piku peptidu zo štandardných roztokov. Výhodné deriváty peptidov podlá predkladaného vynálezu sa vyznačujú minimálnou stratou spôsobenou degradáciou na výlisku a teda obsah peptidu v prostriedku extrudovaného polyméru sa blíži teoretickej hodnote približne 20 % hmotnostných.

Degradácia peptidu pri in vitro uvoľnení z extrudovaného polymérneho prostriedku na skladovanie

Roztok Mcllvainovho pufru obsahujúceho kyselinu citrónovú a fosfát pri pH 7,6 obsahujúci 0,02 % azidu sodného sa filtruje cez 0,22 μιη filter a skladuje sa pri teplote 4° C. Do dvoch malých fioliek sa umiestni približne 10 mg extrudovaného polyméru na skladovanie obsahujúceho peptid a pridajú sa 2 ml pufrovacieho roztoku. Fiolky sa potom uzatvoria a skladujú sa vo vodnom kúpeli pri teplote 37° C počas 1 mesiaca. Vo vhodných časových intervaloch sa v priebehu tohto času odoberú tri 0,6 ml alikvotné diely uvoľneného média a analyzujú sa pomocou HPLC alebo sa pred HPLC analýzou skladujú v HPLC fiolkách zmrazené na teplotu -18° C. Do každej fiolky obsahujúcej skladovaciu hmotu sa pridá 1,8 ml pufrovacieho roztoku, aby sa vymenilo uvoľnené médium, ktoré sa odstraňovalo v každom časovom úseku.

Priemerné množstvo neporušeného peptidu v uvoľňovacom médiu v každom časovom úseku sa určí pomocou HPLC porovnaním plochy piku peptidu v uvoľnenom médiu s plochou piku peptidu zo štandardného pufrovacieho roztoku peptidu so známou koncentráciou, pričom sa každá vzorka stanoví dvakrát. Približné priemerné množstvo degradovaného produktu peptidu v uvoľnenom médiu v každom časovom úseku sa určí pomocou HPLC porovnaním plochy ďalších nových píkov v uvolnenom médiu s plochou piku peptidu zo štandardných pufrovacích roztokov peptidu so známymi koncentráciami a za predpokladu, že sa nemení extinkčný koeficient. Priemerný kumulatívny in vitro uvoľňovací profil nepoškodeného peptidu a celkové množstvo peptidu (nepoškodeného peptidu a degradačného produktu peptidu) sa určí z množstva nepoškodeného peptidu a degradačného produktu peptidu v uvoľnenom médiu v každom časovom úseku. Výhodné deriváty peptidov podľa predkladaného vynálezu sa vyznačujú minimálnou degradáciou pri in vitro uvoľňovaní a teda sa vyznačujú celkovou degradáciou peptidového produktu nižšou než 10 % a výhodne nižšou než 5 % celkového množstva peptidu po 1 mesiaci in vitro uvolňovania v Mcllvainovom pufrovacom roztoku pri pH 7,6 a teplote 37° C.

Prostriedky podľa predkladaného vynálezu sa zvyčajne podávajú človeku tak, že sa napríklad denná dávka pohybuje v rozsahu 10 μς až 500 mg, výhodne 0,1 až 100 mg, u pacienta s hmotnosťou 70 kg, pričom sa táto dávka môže podávať po častiach. Presné množstvo podávaného prostriedku a spôsob a forma podania môže závisieť od hmotnosti, veku a pohlaví pacienta a od konkrétneho ochorenia alebo stavu, ktorý sa lieči a od jeho závažnosti, v súlade s princípmi používanými v lekárskej praxi.

Derivát peptidu všeobecného vzorca.-1 alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ sa môže výhodne podávať na liečebné a profylaktické účely aj spoločne s jedným alebo viacerými farmakologickými činidlami, ktoré sú v tejto oblasti všeobecne známe ako cenné látky pri liečbe alebo zmiernení symptómov (alebo ako činidlá upravujúce ochorenie) jedného alebo viacerých ochorení alebo stavov uvedených vyššie, ako je NSAID (ako je ibuprofén alebo piroxicam), analgetiká (ako je paracetamol), kortikosteroidy, svalové relaxanty, inhibítory lipoxygenázy, metotrexát, azatipyrín, D-penicilamín, Cyklosporín A alebo terapia monoklonálnymi protilátkami (ako je anti-CD4 alebo anti-TNF). Pri diabete sa môžu peptidové zlúčeniny podávať spoločne s inzulínom alebo inými liečivami pre diabetes alebo komplikácie diabetu (ako je inhibítor aldózreduktázy). Je potrebné poznamenať, že takáto kombinovaná liečba tvorí ďalší aspekt podľa predkladaného vynálezu.

V súlade s ďalším aspektom predkladaný vynález poskytuje spôsob liečby autoimúnnych alebo zápalových ochorení sprostredkovaných T-bunkami závislými od MHC triedy II, napríklad jedného teplokrvným potrebujú.

alebo viacerých ochorení alebo uvedených stavov, pričom spôsob zahŕňa podávanie účinného množstva derivátu peptidu všeobecného vzorca X alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli živočíchom (vrátane človeka), ak takúto liečbu

Predkladaný vynález poskytuje aj použitie derivátu peptidu všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli pri príprave nových liečiv na použitie pri liečbe autoimúnnych alebo zápalových ochorení sprostredkovaných T-bunkami závislými od MHC triedy II.

Okrem uvedeného použitia zlúčenín pri liečbe človeka, derivát peptidu všeobecného vzorca I sa dá využiť aj vo veterinárnej liečbe podobných stavov u teplokrvných živočíchov, ako sú psi, mačky, kone a dobytok. Vo všeobecnosti sa pri takejto liečbe derivát peptidu všeobecného vzorca I podáva v analogickom množstve a analogickým spôsobom ako sa opisuje pri podávaní človeku. Deriváty peptidov všeobecného vzorca I sú cenné aj ako farmakologické nástroje pri vývoji a štandardizácii testovacích systémov na hodnotenie účinkov molekúl MHC triedy II u laboratórnych zvierat, ako sú mačky, psi, králiky,' .opice, potkany a myši, a pri výskume nových alebo zlepšených liečebných činidiel alebo diagnostických činidiel.

Predkladaný vynález bude ďalej ilustrovaný nasledovnými príkladmi, ktorý vynález neobmedzujú, v ktorých, ak sa neuvádza inak:

(i) Zahusťovanie a odparovanie sa uskutočňuje pomocou rotačného odparovania vo vákuu;

(ii) operácia sa uskutočňuje pri teplote miestnosti, t. j. pri teplote 18 až 26° C;

(iii) výťažky, ak sa uvádzajú, sú uvedené len na lepšiu zrozumiteľnosť a nie sú nutne maximálnymi dosiahnuteľnými výťažkami, ktoré sa dajú získať po dôslednom výskume;

(iv) používajú sa nasledovné skratky (aj v schémach 1 a 2):

Phv = 5-fenylvaleryl; Boe = terc-butoxykarbonyl; t-Bu = terc-butyl; DMF = N,Ν-dimetylformamid; HOBT = 1-hydroxybenzotriazol; Met = metionín; Fmoc = 9-fluorenylmetoxykarbonyl; Fmoc-Pip-OH = kyselina N-(9-fluorenylmetoxykarbonyl)piperidín-4-karboxylová; Fmoc-Papa-OH = kyselina 4-[N-(9-fluorenylmetoxykarbonyl)amino]fenyloctová; Z alebo Cbz = benzyloxykarbonyl; Pmc = 2,2,5, 7,8-pentametylchromán-6-sulfonyl; Pbf = 2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofurán-5-sulfonyl; Trt = trityl; THF = tetrahydrofurán; DMSO = dimetylsulfoxid; HBTU = 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumhexafluorofosfát; DIPEA = diizopropyletylamín; TFA = kyselina trifluóroctová; HPLC = vysokotlaková kvapalinová chromatografia na reverznej fáze (ktorá sa, ak sa neuvádza inak, uskutočňuje na kolóne Vydac C]_g 218TP54,

4,6 x 250 mm);

(v) velmi rýchla chromatografia a chromatografia na silikagéli sa uskutočňuje na Merck Kieselgel 60 (č. 9385) získaným od E. Merck, Darmstadt, Nemecko;

(vi) !h-NMR spektrá -sa určujú pri 200 MHz v deuterochloroforme alebo perdeuterodimetylsulfoxide (dg-DMSO) použitím tetrametylsilá'nu (TMS) ako vnútorného štandardu, a sú vyjadrené ako hodnoty chemického posunu (δ) v ppm vzhľadom na TMS, pričom na označenie dôležitých píkov sa používajú bežné skratky: s, singlet; m, multiplet; t, triplet; š, široký, d, dublet;

(vii) na zavedenie zvyškov Lys, Thr, Arg alebo His sa použili nasledovné Fmoc-chránené aminokyseliny:

pre Lys: Fmoc-Lys (Boe)-OH; pre Thr: Fmoc-Thr (OBu-1)-OH; pre Arg: Fmoc-Arg(Pmc)-OH alebo Fmoc-Arg(Pbf)-OH; a pre His: Fmoc-His(Trt)-OH;

(viii) ak sa vo vzorci objaví -II-, znamená to zvyšok L-aminokyseliny vzorca II, ako sa uvádza nižšie, pričom bývajú uvedené hodnoty n, X, R¹ a R²; a (ix) ak sa vo vzorci objaví -Hla-, znamená to skupinu všeobecného vzorca Hla, ako sa uvádza nižšie.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

I

Príprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (sekv. č.: 1) (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R¹ = R² =

-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)

1.1 Príprava N^-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-N 4,N^-bis(2-(2-(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl}-L-asparagínu

(a) l-Bróm-2-(2-metoxyetoxy)etán (30 g) sa v dusíkovej atmosfére pridá k miešajúcemu sa roztoku N-benzyldietanolamínu (10 g) v tetrahydrofuráne (100 ml). Potom sa po častiach za chladenia vodným kúpeľom pridá hydrid sodný (5,3 g 60 % disperzie v minerálnom oleji). Po ukončení pridávania sa zmes mieša počas 2 hodín a po častiach sa pridá ďalšie množstvo hydridu sodného (4,4 g 60 % disperzie v minerálnom oleji). Zmes sa potom nechá miešať počas 16 hodín pri teplote miestnosti. K reakčnej zmesi sa opatrne pridá voda (50 ml) a rozloží sa tak nadbytok hydridu sodného a zo zmesi sa odparia organické rozpúšťadlá. K zvyšku sa pridá voda a zmes sa pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej okyslí na pH 2 a potom sa extrahuje dietyléterom (2 x 100 ml). Extrakty sa vylejú. pH vodnej vrstvy sa potom pomocou prídavku koncentrovaného roztoku hydroxidu sodného upraví na 12 a extrahuje sa dietyléterom (2 x 150 ml) . Éterové extrakty sa spoja, premyjú solankou, vysušia nad síranom horečnatým a odparia ' sa dosucha. Zvyšok sa prečistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa použije gradient chloroform až 5 % metanol/chloroform za nasýtenia koncentrovaným vodným roztokom amoniaku. Príslušné frakcie sa spoja a odparia sa dosucha, čím sa získa gumovitá látka (12 g). Pridá sa metanol (100 ml), potom 10 % paládium na uhlí (2,5 g) a mravčan amónny (7,2 g) a zmes sa mieša v dusíkovej atmosfére počas 1 hodiny pri teplote 60° C. Zmes sa potom ochladí, prefiltruje a odparí dosucha. Zvyšok sa prečistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa použije gradient chloroform až 10 % metanol/chloroform za nasýtenia koncentrovaným vodným roztokom amoniaku. Príslušné frakcie sa spoja a odparia dosucha, čím sa získa N,N-bis(2-[2-(2-metoxyetoxy)etoxy]-etyl}amín vo forme gumy (7,1 g);

NMR (deuterochloroform): 2,8 (m, 4H) , 3,3 (s, 6H) , 3,45 (m, 4H) ,

3,6 (m, 16H).

(b) N-Metylmorfolín (1,6 g), α-benzylester kyseliny N-terc-butyloxykarbonyl-L-asparágovej (2,6 g), hydroxybenzotriazol (2,16 g) a hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (1,68 g) sa za miešania pridá k N,N-bis{2-[2-(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl}amínu (2,5 g) v dimetylformamide (12 ml). Zmes sa mieša počas 16 hodín a potom sa pridá 2 % kyselina octová vo vode (50 ml) . Zmes sa extrahuje dietyléterom (2 x 50 ml) a spojené organické extrakty sa premyjú roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vysušia sa nad síranom horečnatým. Prchavé látky sa odparia, čím sa získa a-benzylester kyseliny N³-terc-butyloxykarbonyl-N⁴,N⁴-bis{2-[2-(2-metoxyetoxy) etoxy] etyl } -L-asparágove j vo forme gumy (2,8 g);

NMR (deuterochloroform): 1,4 (s, 9H), 2,9 (m, 1H) , 3,2 (m, 1H) , 3,4 (s, 6H), 3,6 (m, 24H), 4,6 (m, 1H), 5,2 (kv, 2H), 5,8 (d, 1H), 7,4 (s, 5H).

(c) 10 % Paládium na uhlí (0,8 g) a cyklohexén (1,6 g) sa pridajú k roztoku α-benzylesteru kyseliny N²-terc-butyloxykarbonyl-N⁴,N⁴-bis-{2-[2-(2-metoxyetoxy) etoxy] etyl}-L-asparágovej (2,6 g) v metanole (20 ml) a zmes sa zohrieva počas 2 hodín na teplotu 55° C. Zmes sa potom ochladí, prefiltruje a odparí. K zvyšku sa pridá acetón (20 ml), voda (8 ml) a koncentrovaná kyselina chlorovodíková (2 ml) . Zmes sa zohrieva počas 1 hodiny na teplotu 55° C, ochladí sa a pomocou nadbytku tuhého hydrogenuhličitanu sodného sa upraví pH na 7. K zmesi sa pridá fluorenylmetylsukcínimidylkarbonát (1,36 g) a zmes sa mieša počas 16 hodín. Prchavé zložky sa odparia a zvyšok sa extrahuje medzi vodu (25 ml) a dietyléter (50 ml) . Vodná vrstva sa oddelí a pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej sa okyslí na pH 3. Zmes sa potom extrahuje dichlórmetánom (50 ml) . Organický extrakt sa premyje vodou, vysuší sa nad síranom horečnatým a odparí sa, čím sa získa N²-(9-fluorenylmetoxykarbonyl) -N⁴,N⁴-bis{2- [2-(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl}-L-asparagín (nižšie uvedený ako Fmoc-Asp (PE)-OH) vo forme gumy (2 g);

NMR (deuterochloroform) : 2,8 (kv, 1H) , 3,4 (kv, 1H) 3,4 (s, 6H) ,

3,6 (m, 24H), 4,2 - 4,6 (m, 4H) , 6,3 (d,. 1H) , 7,4 (m, 4H) , 7,6 (m, 2H), 7,8 (d, 2H).

1.2 Príprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Aia-Pip-NH2 (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R¹ = R² =

-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)

Peptid sa pripraví pomocou Fmoc syntézy na tuhej fáze, pričom sa vychádza zo živice Fmoc Rink Amid MBHA Resin (Novabiochem; 0,50 g, 0,25 mmol). V postupe sa kombinuje automatizovaná syntéza a ručná syntéza, pričom sa použije Bond Elut skúmavka (Varian; 15 ml) opatrená na dne filtrom.

Najskôr sa získa Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-živica použitím ABI 431 prístroja na automatickú syntézu peptidov pomocou odstránenia ochranných skupín zo živice a následnou kondenzáciou a odstránením ochrannej skupiny z Fmoc-Pip-OH (353 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) a Fmoc-Val-OH (339 mg, 1 mmol), pričom sa dodržiavajú podmienky odporučené výrobcom pre jednoduché acylácie zahŕňajúce HBTU/HOBT. Po odstránení ochranných skupín sa živica premyje dimetylformamidom (10 x 10 - 20 ml). Karboxylová kyselina (1 mmol) sa aktivuje HBTU (1 ekvivalent), HOBT (1 ekvivalent) a DIPEA (2 ekvivalenty) v dimetylformamide asi 11 minút pred prevedím t

na živicu. Acylácia sa uskutočňuje približne počas 60 minút a živica sa potom premyje dimetylf ormamidom (10 x 10 - 20 ml) . Odstránenie ochrannej skupiny Emoc v každom kroku sa uskutočňuje pomocou 20 % roztoku piperidínu v dimetylformamide (dve spracovania s 5 ml vždy po 10 minútach). Po každom odstránení ochrannej skupiny sa živica dôkladne premyje dimetylformamidom (5 x 10 ml).

Zostávajúce zvyšky v sekvencii sa postupne kondenzujú a odstraňujú sa z nich ochranné skupiny ručne. Kondenzácia sa uskutočňuje pomocou pridania roztoku vhodnej Fmoc-chránenej aminokyseliny (1 mmol), dimetylformamidu (1,5 ml), HOBT (165 mg, 1 mmol) a diizopropylkarbodiimidu (155 μΐ, 1 mmol) k živici. Kondenzácia prebieha približne počas 30 minút, živica sa premyje dimetylformamidom (5 x 10 ml) a pomocou Kaiserovho testu (Kaiser, E. a kol. Anál. Biochem. 34, 595 (1970)) sa u malého množstva živice overí, či kondenzácia prebehla úplne. Odstránenie ochrannej skupiny sa uskutoční tak, ako sa opisuje vyššie. Týmto spôsobom sa Fmoc-Asp(PE)-OH (323 mg, 0,5 mmol), Emoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) a kyselina 5-fenylvalérová (178 mg, 1 mmol) postupne kondenzujú na živicu. Kondenzácia kyseliny 5-fenylvalérovej sa uskutoční dvakrát, než sa dosiahne pozitívny výsledok Kaiserovho testu.

i Peptid sa odštiepi zo živice použitím zmesi kyseliny trifluóroctovej (7,9 ml) a trietylsilánu (0,395 ml). Po 2 hodinách sa živica premyje dichlórmetánom (asi 150 ml) a výsledný roztok sa odparí dosucha. Vzniknutá tuhá látka sa extrahuje medzi éter (25 ml) a vodu (25 ml) a potom sa éterová vrstva extrahuje ďalším podielom vody (2 x 25 ml). Vodné vrstvy sa spoja a sušia za chladu.

Surový produkt sa prečistí pomocou preparatívnej RP-HPLC (Vydac 218TP1022 kolóna, 250 mm x 22 mm). Surový produkt sa nanesie v 10 ml zmesi 20 % acetonitril/voda. Chromatografia prebieha eluovaním gradientom acetonitril voda obsahujúcim 0,1 % kyseliny trifluóroctovej pri prietoku 12 ml/min. Frakcie obsahujúce produkt sa spoja a sušia za mrazu, čím sa získa .Phy-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (kde II je zvyšok L-aminokyseliny vzorca II, kde n = 1; X = karbonylová skupina a R¹ = R²

-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2) vo forme bielej tuhej látky (83 mg).

Produkt sa charkterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (kolóna Vydac C]_q 218TP54, 4,6 x 250 mm, elúcia zmesou acetonitril a voda obsahujúcou 0,1 % kyseliny trifluóroctovej, pričom sa použije gradient 10 - 50 % acetonitrilu počas 30 minút, prietok 1,0 ml/min), zistená 94 % čistota, retenčný čas 23,29 minúty.

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 1220,7 (MH⁺).

Analýza aminokyselín (kyslá hydrolýza počas 24 hodín, pričom sa použije 6 N roztok kyseliny chlorovodíkovej obsahujúci 1 % fenolu pri teplote 130° C) poskytla Ala 5,82, Val 0,98, Asp 1,19.

Fmoc-Pip-OH sa získa spôsobom, ktorý je analogický so spôsobom opísaným v Atherton, E. & Sheppard, R. C., Solid Phase Peptid Synthesis: A Practical Approach, IRL Press 1989, strana 51 z N-Fmoc-L-metionínu.

Fmoc-Pip-OH: NMR (perdeuterodimety.lsulfoxid): 1,3 (m, 2H) , 1,7 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,9 (t, 2H) , 3,7 (m, 1H), 4,2 (t, 1H), 4,4 (d,. 2H), 7,4 (m, 4H), 7,7 (d, 2H) , 7,9 (d, 2H) ;

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 352,2 (MH⁺).

Príklad 2

Príprava Phv-II-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (sekv. č.: 2) (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R¹ = R² “CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)

Syntéza sa uskutoční použitím podobného spôsobu ako sa opisuje v príklade 1.2 pomocou postupnej kondenzácie (ručnej) Fmoc-Lys(Boc)-OH (468 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol), Fmoc-Asp (PE)-OH (323 mg, 0,5 mmol) a kyseliny 5-fenylvalérovej (178 mg, 1 mmol) na Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-živicu (získaná použitím ručnej kondenzácie). Peptid sa odštiepi zo živice a surový produkt sa prečistí použitím podobných podmienok ako sa opisujú v príklade 1. Produkt sa charakterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej špektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 20 - 50 % acetonitrilu počas 30 minút, prietok 1,0 ml/min), retenčný čas 16,4 minúty.

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 1277,8 (MH⁺).

’ I

Analýza aminokyselín poskytla Asp 1,07, Lys 1,05, Ala 4,9, Val 0,92.

Príklad 3

Príprava Phv-Ala-Arg-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH2 (sekv. č.: 3) (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; Rl = R³ =

-CH₂CON(CH₂CH₂OCH3)₂)

3.1. Príprava N³-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-N^, N^-bis[N,N-bis-(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]-L-asparagínu (a) N-Metylmorfolín (2 g), hydroxybenzotriazol (4 g), bis(2-metoxyetyl) amín (3,5 g) a hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (3,8 g) sa pridá ku kyseline N-(bezyloxykarbonyl)-iminodioctovej (2,7 g) v dimetylformamide (15 ml) a zmes sa mieša počas 16 hodín. Prchavé podiely sa odparia a zvyšok sa extrahuje medzi vodu a dichlórmetán. Organický extrakt sa premyje vodou, vysuší sa nad síranom horečnatým a odparí sa. Zvyšok sa prečistí pomocou kolónovej chromatografie na silikagéli, pričom sa eluuje gradientom chloroform až 10 % metanol/chloroform, čím sa získa N- (benzyloxykarbonyl)iminodi-[Ν,Ν-bis(2-metoxyetyl)]acetamid vo forme gumy (2,3 g);

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 3,1-3,4 (4 singlety spôsobené rotamérmi, 12H) , 3,5 (m, 16H) , 4,2 (s, 4H) , 5,05 (s, 2H) , 7,3 (m, 5H) .

(b) 10 % Paládium na uhlí (0,2 g) a cyklohexén (2 ml) sa pridajú k N-(benzyloxykarbonyl)iminodi-[Ν,Ν-bis(2-metoxyetyl)]acetamidu (3,5 g) v etanole (20 ml) a zmes sa mieša v dusíkovej atmosfére pri teplote 55° C počas 4 hodín. Reakčná zmes sa ochladí, prefiltruje a odparí. K roztoku zvyšku v dimetylformamide (15 ml) sa za miešania pridá N-metylmorfolín (1,4 g), hydroxybenzotriazol (1,85 g), a-benzylester kyseliny N-terc-butyloxykarbonyl-L-asparágovej (2,4 g) a hydrochlorid 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu (1,6 g). Zmes sa mieša počas 16 hodín a potom sa pridá 2 % kyselina octová vo vode (50 ml) a extrahuje sa dietyléterom (2 x 50 ml) . Spojené organické extrakty sa premyjú roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vysušia sa nad síranom horečnatým a odparia sa, čím sa získa a-benzylester N^vterc-butyloxykarbonyl)-N^,N^-bis-[N,N-bis(2-metoxyetyl) karbamoylmetyl] -L-asparagínu vo forme gumy (4,1 g);

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 1,4 (s, 9H) , 2,6 (m, 2H) , 3,2 (prekrývajúce sa singlety spôsobené rotamérmi, 12 H), 3,4 (m, 16H) , 4,0 - 4,4 (m, 5H), 5,1 (s, 2H), 6,8 (d, 1H), 7,4 (s, 5H) .

(c) Použitím analogického postupu ako v príklade 1, časť (c), ale použitím α-benzylesteru N^-terc-butyloxykarbonyl)-Ν^,Ν^-bis-[N,N-bis-(2-metoxyetyl) karbamoylmetyl]-L-asparagínu (4 g) ako východiskovej látky, sa získa N^-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-Ν^,Ν^-bis- [N, N-bis (2-metoxyetyl) karbamoylmetyl] -L-asparagín (nižšie uvádzaný ako Fmoc-Asp (TE) -OH) vo forme gumy (3 g);

NMR (deuterochloroform) : 2,8 (m, 1H) , 3,1 (m, 1H) , 3,3 (prekrývajúce sa singlety spôsobené rotamérmi, 12H), 3,6 (m, 16H),

4.2 - 4,8 (m, 8H), 6,4 (d, 1H) , 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,8 (d, 2H) .

3.2 Príprava Phv-Ala-Arg-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH2 (vzorec II: n = 1; X karbonylová skupina; R^x = r2 -CH2CON(CH2CH2OCH3)2)

Syntéza sa uskutočňuje podobným spôsobom, ako sa opisuje v príklade. 1.2, pomocou odstránenia ochrannej skupiny zo živice 'a postupnej kondenzácie a odstránení ochrannej skupiny s Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, kyselinou (2S)-2-{ (3R)-3-[N-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl) amino] -2-oxopyrolidin-l-yl }propiónovou (Fmoc-IIIa-OH) , Fmoc-Thr(OBu-t)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH a kyselinou 5-fenylvalérovou pri príslušných kondenzačných krokoch, ktoré sa uskutočňujú ručne. Produkt sa charakterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 10 - 50 % acetonitril počas 30 minút, prietok 1.0 ml/min), retenčný čas 21,88 minúty.

Hmotnostné spektroskopia, m/e ' (ES⁺) 1395,8 (MH⁺).

Analýza aminokyselín poskytla Asp 1,04, Thr 0,93, Ala 3,12, Arg 0,92.

Fmoc-Papa-OH sa získa analogickým spôsobom, ako sa opisuje v Atherton, E & Sheppard, R. C., Solid Phase Peptid Synthesis: A Practica Approach, IRL Press 1989, strana 51 z N-Fmoc-L-metionínu.

Fmoc-Papa-OH: NMR (pardeuterodimetylsulfoxid) : 3,5 (s, 2H) , 4,25 (t, 1H) , 4,5 (d, 2H), 7,1 (d, 2H) , 7,4 (m, 6H) , 7,75 (d, 2H), 7,9 (d, 2H), 9,6 (s, 1H);

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 372,1 (M-H)^-.

Kyselina (2S)—2 —{ (3R)-3-[N-(9-fluorenylmetoxykarbonyl)amino] 2-oxopyrolidin-l-ylJpropiónová (Fmoc-IIIa-OH) sa získa nasledovným spôsobom:

(i) Príprava Boe-(D)-Met-(L)-Ala-OMe

N-Metylmorfolín (5,6 g), hydrochlorid metylesteru L-alanínu (3,9 g), HOBT (4,6 g) a 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (5,3 g) sa pridá k roztoku Boe- (D) -metionínu (7 g, 0,028 mol) v suchom dimetylformamide (50 ml) . Zmes sa mieša cez noc. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa extrahuje medzi dichlórmetán (100 ml) a 5 % vodný roztok kyseliny octovej (50 ml) . Státím vykryštalizuje HOBT, ktorý sa odstráni filtráciou, organická vrstva sa oddelí, premyje vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vysuší nad síranom horečnatým a odparí. Zvyšok (8,5 g) sa prečistí pomocou veľmi rýchlej chromatografie na lieviku s fritou, pričom sa eluuje zmesou dichlórmetán a éter (0 až 100 % éter). Frakcie obsahujúce produkt sa spoja a odparia, čím sa získa Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe vo forme gumy (7,2), ktorá státím vykryštalizuje.

NMR (deuterochloroform) : 1,4 (d, 3H) , 1,45 (s, 9H), 1,95 (m, 1H) ,

2,1 (s, 3H), 2,1 (m, 1H), 2,6 (m, 2H), 3,75 (s, 3H) , 4,3 (š s, 1H), 4,6 (m, 1H) , 5,3 (m, 1H) , 6,9 (š s, 1H) .

(ii) Príprava metyl (2S)-2-{(3R)-3-[N-(terc-butyloxykarbonyl)amino] -2-oxopyrolidin-l-yl}propionátu

Poznámka: Táto sekvencia sa musí pripraviť v suchých podmienkach so suchým rozpúšťadlom, inak prebieha epimerácia.

Metyljodid (10 ml) sa pridá k Boe-(D)-Met-(L)-Ala-OMe (8 g) v zmesi dimetylformamidu (20 ml) a dichlórmetánu (20 ml) a zmes sa nechá stáť počas 16 hodín a potom sa odparí dosucha. Pridá sa ďalšie množstvo dichlórmetánu (2 x 50 ml) a znovu sa odparí, aby sa odstránil nadbytok metyljodidu a zvyšok sa rozpustí v zmesi dimetylformamid (300 ml) a dichlórmetán (300 .ml) . Zmes sa ochladí na teplotu približne 5° C a naraz sa pridá hydrid sodný (0,76 g 80 % disperzie v minerálnom oleji) a zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 2 hodín. Pridá sa nasýtený vodný roztok chloridu amónneho (50 ml) a zmes sa odparí dosucha a potom sa extrahuje medzi éter a vodu. Éterový extrakt sa premyje solankou, vysuší sa a odparí sa, čím sa získa guma, ktorá sa prečistí pomocou velmi rýchlej chromatografie v lieviku s fritou (25 % etylacetát v hexáne až 100 % etylacetát), čím sa získa metyl (2S)-2-{(3R)-3-[N-(terc-butyloxykarbonyl) amino] -2-oxopyrolidin-l-yl Jpropionát vo forme gumy (4,2 g), ktorá státím vykryštalizuje;

NMR (deuterochloroform) : 1,4 (s, 9H) , 1,4 (d, 3H) , 1,8 (m,. 1H) , 2,6 (m, TH),· 3,4 (m, 2H) , 3,7 (m, 3H) , 3,7 (m, 3H) , 4,2 (m, 1H) , 4,9 (kv, 1H), 5,2 (š s, 1H).

(iii) Príprava kyseliny (2S)-2-{(3R)-3-[N-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)amino]-2-oxopyrolidin-l-ylJpropiónovej (Fmoc-IIIa-OH)

Metyl (2S)—2—{ (3R)-3-[N-(terc-butyloxykarbônyl) amino]-2-oxopyrolidin-l-ylJpropionát (4 g) sa zohrieva na teplotu varu v zmesi acetónu (60 ml), vody (40 ml) a koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (24 ml) počas 3 hodín a zmes sa odparí dosucha. Pridá sa voda a odparenie sa zopakuje. Zvyšok sa rozpustí vo vode (15 ml) a pridá sa nadbytok tuhého hydrogenuhličitanu sodného. Pridá sa 9-f luorenylmetylsukcinimidylkarbonát (5,2 g) v acetóne (30 ml). Zmes sa mieša počas 16 hodín a potom sa rozpúšťadlo odstráni odparením a zvyšok sa extrahuje medzi vodu a éter. Vodná vrstva sa oddelí, okyslí sa pomocou kyseliny chlorovodíkovej na pH 3 a extrahuje sa dichlórmetánom. Organická vrstva sa premyje vodou, vysuší sa nad síranom horečnatým a odparí' sa, čím sa získa biela pena, ktorá vykryštalizuje po triturácii s éterom. Získa sa kyselina (2S)-2-{(3R)-3-[N-(9-fluorenylmetoxykarbonyl)amino]-2-oxopyrolidin-l-ylJpropiónová vo forme bielej tuhej látky (4,2 g), teplota topenia 190 - 193° C (za rozkladu);

NMR (deuterochloroform): 1,4 (d, 3H), 2,0 (m, 1H) , 2,6 (m, 1H) , 3,4 (m, 2H) , 4,2 (t, 1H), 4,4 (m, 3H), 4,9 (m, 1H), 5,8 (š s, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,7 (d, 2H).

Príklad 4

Príprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (sekv. č.: 4) (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R¹ = R²

-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)

Príprava sa uskutočňuje použitím podobného spôsobu ako v príklade 1.2, pričom sa použije Fmoc-Asp(TE)-OH miesto Fmoc-Asp(PE)-OH vo vhodnom kondenzačnom stupni.

Produkt sa charakterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 10 - 50 % acetonitril počas 30 minút, prietok 1.0 ml/min), retenčný čas 23,9 minúty.

I . '

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 1274,7 (MH⁺).

Analýza aminokyselín: Asp 1,03, Ala 5,94, Val 0,98.

Príklad 5

Príprava Phv-Arg-Ala-Ala-IIIa-Ala-II-Ala-Papa-NH2 (sekv. č. : 5) (vzorec II: n = 1; X karbonylová skupina; R¹ = R^ =

-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)

Príprava sa uskutočňuje použitím podobného spôsobu ako v príklade 1.2, pomocou postupnej kondenzácie a odstránení ochranných skupín (ručne) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(PE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH, Fmoc-Ala-OH (dvakrát), Fmoc-Arg(Pbf)-OH a kyseliny 5-fenylavelérovej, následného odštiepenia živice a prečistenia pomocou prepáratívnej RP-HPLC. Produkt sa charakte52 rizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 10 - 50 % acetonitril počas 30 minút, prietok 1.0 ml/min), retenčný čas 20,45 minúty.

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 656,4 (M⁺2H⁺⁺).

Analýza aminokyselín: Arg 1,06, (Ala + Hla) 4,85, Asp 1,09.

Príklad 6

Príprava Phv-Arg-Ala-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NH2 (sekv. č. : 6) (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R·*· = R² =

-CH₂CON[(CH₂CH₂O)3CH3]₂)

6.1 Príprava N² - (9-fluorenylmetyloxykarbonyl) -N⁴,N⁴-bis(N,N-bis-{2- [2- (2-metoxyetoxy) etoxy] etyl}karbamoylmetyl) -L-asparagínu

Použitím analogického spôsobu ako v príklade 3.1 na prípravu Fmoc-Asp(TE)-OH, ale použitím úmerného množstva bis{2-[2-(2-metoxyetoxy) etoxy] etyl } amínu v časti (a) miesto bis(2-metoxyetyl)amínu, sa získa N² - (9-fluorenylmetyloxykarbonyl) -N⁴, N⁴-bis (N, N-bis {2 - [253

- (2-metoxyetoxy) etoxy] etyl} karbamoylmetyl) -L-asparagín (nižšie uvedený ako Fmoc-Asp(TPE)-OH vo forme oleja;

NMR (deuterochloroform) : 2,9 (m, 1H) , 3,1 (m, 1H) , 3,4 (m, 12H) , 3,6 (m, 48H), 4,2 - 4,6 (m, 8H) , 7,4 (m, 4H) , 7,6 (m, 2H) , 7,8 (d, 2H) .

Pri uskutočňovaní krokov (a) a (b) sa získajú nasledovné medziprodukty v tomto poradí:

N- (benzyloxykarbonyl)iminodi-(N,N-bis{2-[2-(2-metoxyetoxy)etoxy]-etyl})acetamid;

NMR (deuterochloroform): 3,4 (m, 12H) , 3,6 (m, 48H) , 4,3 (s, 2H) ,

4.4 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,3 (s, 5H).

α-benzylester N^-terc-butyloxykarbonyl-N^N^-bis(N,N-bis{2-[2- (2í

-metoxyetoxy) etoxy] etyl} karbamoylmetyl) -L-asparagínu;

NMR (deuterochloroform): 1,9 (s, 9H) , 2,7 (m, 1H) , 3,05 (m, 1H) ,

3.4 (m, 12H) , 3,6 (m, 48H) , 4,4 (m, 5H) , 5,2 (s, 2H) , 5,9 (š d, 1H) , 7,4 (m, 5H) .

6.2 Príprava Phv-Arg-Ala-Ala-II-Thr-IIIa-Ala-Papa-NHZ (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R^ = R^ =

-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)

Príprava sa uskutočňovala použitím podobného postupu ako sa opisuje v príklade 1.2, postupnou kondenzáciou a odstránením ochranných skupín (ručne) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH, Fmoc-Thr (OBu-1) -OH, Fmoc-Asp (TPE)-OH, Fmoc-Ala-OH (dvakrát), Fmoc-Arg(Pbf)-OH a kyseliny 5-fenylvalérovej, následným odštiepením živice a prečistením pomocou preparatívnej RP-HPLC. Produkt sa charakterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 10 - 50 % acetonitril počas 30 minút, prietok 1.0 ml/min), retenčný čas 23,61 minúty.

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 1748,0 (MH⁺).

Analýza aminokyselín: Arg 1,01, Ala 3,18, Hla 1,05, Asp 0,97, Thr 0,78.

Príklad 7

Príprava Phv-Ala-Ala-Ala-II-Thr-Pro-Arg-Gly-Papa-NH2 (sekv. č.: 7) (vzorec II: n = 1; X = karbonylová skupina; R¹ =

-CH₂CON(CH₂CH₂OCH3)2)

Príprava sa uskutočňovala použitím podobného postupu ako sa opisuje v príklade 1.2, postupnou kondenzáciou a odstránením ochranných skupín (ručne) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(OBu-t)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, Fmoc-Ala-OH (trikrát), a kyseliny 5-fenylvalérovej, následným odštiepením živice a prečistením pomocou preparatívnej RP-HPLC. Produkt sa charakterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 20 - 50 % acetonitril počas 30 minút, prietok 1.0 ml/min), retenčný čas 16,07 minúty.

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 1395,7 (MH⁺).

Analýza aminokyselín: Arg 1,01, Ala 3,06, Asp 1,02, Thr 0,92, Pro 0,92, Gly 1,05.

Príklad 8

Príprava Phv-II-Arg-Ala-His-Vai-IIIa-Ala-Papa-NH2 (sekv. č.: 8) (vzorec II: n = 2; X = karbonylová skupina; Rl = R^

-CH₂CON(CH₂CH₂OCH₃)₂)

8.1 Príprava Νθ- (9-fluorenylmetyloxykarbonyl) -N^,N^-bis[N,N-bis-(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl] -L-glutamínu

Použitím analogického spôsobu ako v príklade 3.1 na prípravu Fmoc-Asp(TE)-OH, ale použitím príslušného množstva a-benzylesteru kyseliny N-terc-butyloxykarbonyl-L-glutámovej/ v časti (b) miesto α-benzylesteru kyseliny N-terc-butyloxykarbonyl-L-asparágovej, sa získa N⁸-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-N⁴,N⁴-bis[Ν,Ν-bis-(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]-L-glutamín (nižšie uvedený ako Fmoc-Glu(TE)-OH vo forme oleja;

NMR (deuterochloroform) : 2,0 - 2,4 (m, 4H) , 3,3 (m, 12H), 3,5 (m,

16H), 4,2 - 4,6 (m, 8H), 7,4 (m, 4H) , 7,6 (m, 2H) , 7,8 (d, 2H) .

Pri uskutočňovaní kroku (b) sa získa nasledovný medziprodukt:

α-benzylester N²-terc-butyloxykarbonyl-N⁴,N⁴-bis[Ν,Ν-bis(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]-L-glutamín vo forme gumy;

NMR (deuterochloroform): 1,4 (s, 9H), 2,0 (m, 1H), 2,2 (m, 1H), 2,4 (m, 2H), 3,3 (s, 12H) , 3,5 (m, 16H) , 4,1 - 4,5 (m, 5H) , 5,2 (s, 2H), 7,3 (s, 5H).

8.2 Príprava Phv-II-Arg-Ala-His-Val-IIIa-Ala-Papa-NH2 (vzorec II: n = -CH2CON(CH2CH2OCH3) 2)

2; X karbonylová skupina; R^ = R^ =

Príprava sa uskutočňovala použitím podobného postupu ako sa opisuje v príklade 1.2, postupnou kondenzáciou a odstránením ochranných skupín (ručne) Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-IIIa-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, .Fmoc-Glu(TE)-OH a kyseliny 5-fenylvalérovej, následným odštiepením živice a prečistením pomocou preparatívnej RP-HPLC. Produkt sa charakterizoval pomocou HPLC, hmotnostnej spektroskopie a analýzy aminokyselín, ako sa uvádza nižšie.

RP-HPLC (gradient 10 - 50 % acetonitril počas 30 minút, prietok 1.0 ml/min), retenčný Čas 22,23 minúty.

Hmotnostná spektroskopia, m/e (ES⁺) 1472,2 (MH⁺).

Analýza aminokyselín: Arg 0,95, Ala 2,17, His 0,98, Glu 0,99, Val 0,92, Hla 0,96.

Príklad 9

Zlúčeniny podlá predkladaného vynálezu sa dajú podávať pri liečebnom alebo profylaktickom použití teplokrvným živočíchom·, ako je človek, vo forme bežných farmaceutických prostriedkov, pričom typický príklad je nasledovný:

Roztok na injekčné podávanie

0,01 až 100 mg aktívnej zložky sa rozpustí v 2 ml vodného nosiča na injekčné podávanie, čím sa získa koncentrácia 0,01 až 100 mg/ml. Vodné vehikulum na injekčné podávanie sa pufruj e na pH medzi 5 až 8 použitím farmaceutický prijateľných pufrovacích látok (napríklad fosfátu alebo acetátu) a obsahuje farmaceutický prijateľné činidlá upravujúce tonus (napríklad chlorid sodný alebo dextrózu), pomocou ktorých sa získa izotonický roztok. Vehikulum môže prípadne obsahovať aj iné farmaceutický prijateľné prísady, ako sú rozpúšťadlá (napríklad dimetylsulfoxid, etanol, propylén57 glykol alebo polyetylénglykol), konzervačné látky a antioxidanty. Použitou aktívnou látkou môže byť zlúčenina uvedená v príkladoch a môže byť bežne prítomná vo forme farmaceutický prijateľnej soli

Poznámka:

(1) ¹ Pre peptidy obsahujúce skupinu vzorca IV, kyselina (S)-2-[l-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-yl]propiónová (Fmoc-IV-OH), sa môže získať nasledovným spôsobom:

(i) Príprava (RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolínu

Metylester N-benzyloxykarbonylprolínu (13 g) v tetrahydrofuráne (20 ml) sa v dusíkovej atmosfére pri teplote -78° C prikvapká k lítiumdiizopropylamidu (27,5 ml, 2 M v hexáne/tetrahydrofuráne) v tetrahydrofuráne (100 ml). Zmes sa mieša počas 30 minút a potom sa prikvapká alyljodid (5,5 ml) a zmes sa mieša počas ďalších 30 minút a potom sa nechá zohriať na teplotu miestnosti. Zmes sa potom pridá k vodnému roztoku chloridu amónneho (200 ml) a extrahuje sa éterom (2 x 200 ml). Éterová vrstva sa odparí a zvyšok sa prečistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa použije gradient hexán až 20 % etylacetát/hexán. Po odparení vhodných frakcií dosucha sa získa metyl (RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolinát (9 g) vo forme oleja.

8,5 g tejto látky sa rozpustí v metanole (40 ml) a pridá sa hydroxid sodný (4,5 g) vo vode (20 ml) a zmes sa zohrieva počas minút na teplotu varu. pH zmesi sa potom pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej upraví na 7 a metanol sa odparí. Potom sa pH zmesi upraví na 3 a zmes sa extrahuje éterom (2 x 50 ml) . Spojené éterové extrakty sa odparia, čím sa získa (RS)-2-alyl-N- (benzyloxykarbonyl)prolín vo forme gumy;

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid (100° C)): 1,9 (m, 2H) , 2,1 (m, 2H) ,

2,6 (kv, 1H) , 2,9 (kv, 1H) , 3,4 (m, 1H) , 3,6 (m, 1H) , 5,0 (m, 4H) , 5,75 (m, 1H), 7,3 (m, 5H) .

(ii) Príprava metylesteru [ (RS) -2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl)]prolyl- (S)-alanínu

HOBt (7,7 g), N-metylmorfolín (6,6 g), hydrochlorid metylesteru L-alanínu (4,5 g) a 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (5,7 g) sa pridá k (RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolínu (6,5 g) v dimetylformamide (30 ml) a zmes sa mieša počas 18 hodín a potom sa odparí. Zvyšok sa extrahuje medzi éter a vodu, prefiltruje sa, čím sa odstráni HOBt a organická vrstva sa oddelí. Organická vrstva sa 'odparí a zvyšok sa prečistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa použije gradient 20 % etylacetát v hexáne až 50 % etylacetát v hexáne. Príslušné frakcie sa spoja a odparia dosucha, čím sa získa metylester [ (RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl) ]prolyl-(S)-alanínu (7 g);

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid (100° C)): niektoré zdvojené piky spôsobené zmesou diastereomérov, 1,25 a 1,3 (2d, 3H), 1,75 (m, 2H) ,

2,2 (m, 2H) , 2,65 (m, lH)m, 2,9 (m, 1H) , 3,4 (m, 1H) , 3,65 (2s,

3H) , 3,7 (m, 1H), 4,3 (2kv, 1H), 5,0 (m, 4H), 5,7 (m, 1H) , 7,3 (m, 5H) , 7,4 a 7,5 (š s, 1H) .

(iii) Príprava metyl (S)-2-(l-benzyloxykarbonyl-6-oxa-l,7-diazaspi. ro[4,4]non-7-yl)propionátu (Cbz-IV-OMe)

Oxid osmičelý (1,5 ml 4 % vodného roztoku) sa pridá k metylesteru [(RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl)]prolyl-(S)-alanínu (1,45 g) v zmesi metanol (30 ml) a voda (20 ml). Zmes sa mieša počas 10 minút v argónovej atmosfére a po častiach sa pridá jodistan sodný (2,45 g). Zmes sa mieša' počas 2 hodín a potom sa pridá voda (100 ml) a zmes sa extrahuje etylacetátom (2 x 70 ml) . Spojené extrakty sa vysušia a odparia, čím sa získa guma (1,4 g). Guma sa rozpustí v dichlórmetáne (30 ml) a prikvapká sa trietylsilán (0,65 g) a kyselina trifluórocotvá (4 g). Zmes sa mieša počas 3 hodín, odparí sa a zvyšok sa extrahuje medzi vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného a éter. Éterový extrakt sa oddelí a odparí dosucha. Zvyšok sa prečistí pomocou chromatografie na silikagéli, pričom sa použije gradient 25 % etylacetát v hexáne až 100 % etylacetát. Príslušné frakcie sa spoja a odparia dosucha, čím sa získa metyl (S)-2-(l-benzyloxykarbonyl-6-oxa-l,7-diazaspiro-[4,4] ηοη-7-yl)propionát (0,8 g);

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid (100° C)): niektoré zdvojené piky spôsobené zmesou diastereomérov, 1,25 a 1,35 (2d, 3H) , 1,95 (m,

6H), 3,1 - 3,5 (m, 4H) , 3,6 a 3,65 (2s, 3H) , 4,5 a 4,65 (2kv, 1H) , 5,05 (m, 2H), 7,25 (m, 5H) .

(iv) Príprava kyseliny (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-yl)-propiónovej (H-IV-OH)

OH

O

Uhličitan draselný (2,5 g) sa pridá k metyl (S)-2-(1-benzyloxykarbonyl-6-oxa-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-yl)propionátu (3,3 g) v zmesi metanol (40 ml) a voda (40 ml) a zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 10 hodín. Pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej sa pH upraví na 5 a zmes sa odparí dosucha. Zvyšok sa rozpustí vo vode (40 ml) a pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej sa pH upraví na 3. Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 50 ml) . Spojené extrakty sa vysušia nad síranom horečnatým a odparia sa, čím vznikne pena (2,8 g), ktorá sa rozpustí v metanole (20 ml) a pridá sa cyklohexén (0,7 g) a 10 % paládium na uhlí (0,5 g). 'Zmes sa zohrieva počas 2 hodín na teplotu varu, ochladí· sa, prefiltruje a filtrát sa odparí, čím sa získa kyselina (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-yl)propiónová vo forme peny (1,9 g);

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): niektoré zdvojené piky spôsobené zmesou diastereomérov, 1,25 a 1,3 (2s, 3H) , 1,8 (m, 4H) , 2,0 (m,

2H), 3,0 (m, 2H), 3,3 (m, 2H) , 4,5 (m, 1H).

(v) Príprava kyseliny (S)-2-[l-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-6~ -oxo-1,7-diazaspiro [4,4] ηοη-7-yl]propiónovej (Fmoc-IV-OH) .

Nadbytok tuhého hydrogenuhličitanu sodného sa pridá ku kyseline (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-yl)propiónovej (0,42 g) vo vode (2 ml) a potom sa pridá 9-fluorenylmetylsukcínimidylkarbonát (0,7 g) v acetóne (3 ml). Zmes sa mieša počas 18 hodín. Zmes sa potom vyleje do vody (10 ml), extrahuje sa éterom (10 ml) a vodná vrstva sa oddelí (éterový extrakt sa vyleje). Pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej sa pH vodnej vrstvy upraví na 3 a potom sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 10 ml) . Extrakty sa spoja, vysušia sa nad síranom horečnatým a odparia, čím sa získa kyselina (S) -2-[1-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro [4,4] ηοη-7-yl]propiónová (0,62 g) vo forme bielej peny;

NMR (pardeuterodimetylsulfoxid (100° C)): niektoré zdvojené piky spôsobené zmesou diastereomérov, 1,3 (2d, 3H), 1,6 - 2,0 (m, 6H) , 3,05 (m, 1H) , 3,2 - 3,45 (m, 3H), 4,2 - 4,4 (m, 1H) , 4,5 (m, 1H) ,

6,2 (s, 2H), 7,35 (m, 4H), 7,8 (m, 4H).

(2) Pre zlúčeniny obsahujúce skupinu vzorca Va, kyselina . (3S)—3 — - (9-fluorenylmetoxykarbonylamino) -2-oxoperhydroazepín-l-octová sa môže pripraviť nasledovným spôsobom:

(i) (3S)-3-Amino-s-kaprolaktám (25 g) a trietylamín (19,7 g) sa rozpustí v tetrahydrofuráne (200 ml) a ochladí sa na teplotu 5° C. Počas 30 minút sa prikvapká benzylchloroformiát (33 g) v tetrahydrofuráne (50 ml) . Reakčná zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 18 hodín a potom sa vyleje do vody (500 ml). Reakčná zmes sa extrahuje etylacetátom (3 x 100 ml). Spojené extrakty, sa vysušia nad síranom horečnatým a odparia. Zvyšok sa trituruje éterom (40 ml) a prefiltruje sa, čím sa získa (S) -3-benzyloxykarbonylamino-s-kaprolaktám (20 g) vo forme bielej tuhej látky;

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid) : 1,1 - 2,0 (m, 6H) , 2,9 3,2 (m, 2H) , 4,1 - 4,25 (m, 1H), 5,0 (s, 2H), 7,25 - 7,4 (m, 5H) , 7,75 (t, 1H) .

(ii) Zmes hydridu sodného (2 g) v dimetylformamide (100 ml) sa ochladí v prúde argónu na teplotu 0° C. Po častiach sa v priebehu 20 minút pridá (3S)-3-benzyloxykarbonylamino-8-kaprolaktám (10 g) takou rýchlosťou, aby teplota reakčnej zmesi neprekročila 5° C. V miešaní pri teplote 0° C sa pokračuje počas 40 minút a v priebehu 10 minút sa prikvapká terc-butylbrómacetát (8,2 g). Reakčná zmes sa mieša počas 1 hodiny pri teplote 0° C a ďalších 18 hodín pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa vyleje do vody (600 ml) a extrahuje sa etylacetátom (6 x 75 ml). Spojené extrakty sa premyjú vodou (3 x 100 ml), vysušia sa nad síranom horečnatým a odparia. Zvyšok sa prečistí pomocou MPLC na silikagéli, pričom sa eluuje zmesou 20 % etylacetát/dichlórmetán, čím sa získa terc-butyl (3S)-3-benzyloxykarbonylamino-2-oxoperhydroazepín-l-acetát (15 g) vo forme oleja;

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 1,4 (s, 9H) , 1,5 - 1,9 (m, 6H) , 3,5 - 3,65 (m, 1H) , 3,9 - 4,15 (m, 2H) , 4,4 (m, 1H), 5,0 (s, 2H) , 7,1 (d, 1H), 7,35 (m, 5H).

Hmotnostná spektroskopia: m/e (ES⁺) 377 (MH⁺).

(iii) terc-Butyl (3S) -3-benzyloxykarbonylamino-2-oxoperhy.droazepín-1-acetát (15 g) sa rozpustí v etanole (150 ml) a prepláchne sa argónom. Pridá sa 10 % paládium na uhlí (1,5 g) a banka sa evakuuje a naplní sa vodíkom z balónika. Reakčná zmes sa mieša počas 4 hodín pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa potom prepláchne argónom a prefiltruje sa cez kremelinu. Filtrát sa odparí, čím sa získa terc-butyl (3S)-3-amino-2-oxoperhydroazepín-l-acetát (7,7 g) vo forme viskózneho oleja.

NMR (deuterochloroform): 1,45 (s, 9H), 1,55 - 2,05 (m, 6H) , 3,2 3,3 (d, 1H) , 3,5ť - 3,75 (dva prekrývajúce sa dublety, 2H) , 3,95 4,25 (kv, 2H).

Hmotnostná spektroskopia: m/e (ES ⁺ ) 243,2 (MH⁺).

(iv) Roztok terc-butyl (3S).-3-benzyloxykarbonylamino-2-oxoperhydroazepín-l-acetátu (7 g) v tetrahydrofuráne (50 ml) sa pridá k roztoku uhličitanu sodného (3 g) vo vode (30 ml) . Potom sa v priebehu 30 minút za miešania prikvapká roztok N-(9-fluorenylmetoxykarbonyloxy)sukcínimidu (9,7 g) v tetrahydrofuráne (100 ml). Pridá sa voda (200 ml) a reakčná zmes sa extrahuje etylacetátom (3 x 100 ml) . Spojené extrakty sa premyjú solankou (100 ml) , vysušia sa nad síranom horečnatým a odparia sa. Zvyšok sa prečistí pomocou MPLC na silikagéli, pričom sa eluuje najskôr dichlórmetánom a postupne až zmesou 15 % etylacetát/dichlórmetán, čím sa získa terc-butyl (3 S) — 3 — (9-fluorenylmetoxykarbonylamino) -2-oxoperhydroazepín-l-acetát (10,9 g) vo forme číreho oleja;

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 1,45 (s', 9H) , 1,5 - 2,15 (m, 6H) , 3,1 - 3,25 (m, 1H), 3,6 - 3,75 (m, 1H), 4,0 - 4,5 (m, 5H) , 6,25 (d, 1H), 7,25 - 7,45 (m, 4H) , 7,6 (d, 2H), 7,75 (d, 2H) .

Hmotnostná spektroskopia: m/e (ES⁺) 465,2 (MH⁺).

(v) terc-Butyl (3S)-3-(9-fluorenylmetoxykarbonylamino)-2-oxoperhydroazepín-l-acetát (10,5 g) sa rozpustí v dichlórmetáne (30 ml) a pridá sa kyselina trifluórocotvá (20 ml) . Reakčná zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 18 hodín. Pridá sa dichlórmetán (100 ml) a reakčná zmes sa premyje vodou (4 x 100 ml) , vysuší sa nad síranom horečnatým a odparí sa. Zvyšok sa prečistí pomocou MPLC na silikagéli, pričom sa eluuje zmesou 25 % etylacetát/dichlórmetán a potom etylacetátom, čím sa získa olej . Po triturácii izohexánom sa získa biela pena, ktorá sa prefiltruje a vysuší vo vákuu pri teplote 60° C, čím sa získa kyselina (3S)-3-(9-fluorenylmetoxykarbonylamino)-2-oxoperhydroazepín-l-octová (5,5 g);

NMR (perdeuterodimetylsulfoxid): 1,4 - 1,95 (m, 1H), 3,15 - 3,4 (m, 1H) , 3,55 - 3,7 (m, 1H) , 3,9 - 4,2 (m, 2H) , 4,25 - 4,45 (m, 2H) , 7,15 (d, 1H), 7,25 - 7,45 (m, 4H), 7,75 (m, 2H) , 7,85 (d, 2H) .

Hmotnostná spektroskopia: m/e (ES^-) 407,1 (M-H^-).

Chemické vzorce:

P—AA¹—AA2—AA3—AA4—AA5—ΑΑθ—AA7—AA⁸—Q

R¹

Schéma 1

HO /^° R’r'NH (CH₂)_n

BocNH

OCHjPh r'r²n r° m_n

BocNH

OCH_zPh

NH.

(CH₂)

2'n r’r²n 'r (?H₂)_n .

BocNH

OH r’r²n

BocNH . OCH.Ph

NH.CO.Níťŕi² (°Η₂)_η

FmocNH

OH

H₂N

OH (?H₂)_n

Ζ.ΝΗ

O r'r²nh r'r²n.co.ci

OCH₂Ph

R'R²N r° (?^H2>.

h₂n·

OH x° (CH₂)_n

FmocNH \^°

NH.CO.OPh(4-NO₂) ' r’r^:

Wn r’r²nh

OH nh.co.nr’r²

BocNH

OCH-Ph (^CH2)n

BocNH

OCHjPh

NH.CO.NR'R² nh.co.nr’r² (CH₂)n

T°

OH

Wn

BocNH

O

OH l_n2

O.CO.NR R'

o.co.nr’r²

o.co.nr’r² (ch₂)„

Z.NH

OCH₂Ph > (CH₂)_n .

η₂ν\^°

OH

FmocNH'''^ θ OH

Schéma 2

H₂N[(CH₂),O]_gR , (CH₂)_a.C0.0H (CH₂)_a.C0.0^:Bu or

Λ

Hal.[(CH₂),Ol_gR

HN .KCH^OiX •RCH^O^R' .[(CH₂),O]_gR⁷ '((CH₂),O]_gR⁷ , /[(CH₂)_bO]_mR⁷

-N (CHJ„ '^KWy.OUR⁷

HN'

Z—N t \ z n Z—N O (^{a = 1}) (CH₂)_a

F^oh o

HN ,[(CH₂)_bO]_mR⁷ '((CHAOLR⁷

-N (CH₂)^ W<V HN <, /((CHJhOl.R⁷

-N (cki ^X'K^CH=l.°l-^R’ ,[(CH₂)_bO]_mR⁷ (CH₂)_a

P^N\ o ^[(ΟΗ₂)₆Ο]^⁷

Z—N

TOa /TOV >-^N^ •((CHX01 R ,(CH₂)_cOH

Hal.(CH₂)_dCO.O.Bu (d = 1 or 3) alebo

PhCH.N '(CH₂)_cOH

PhCH₂N ^CH^OtCH^.CO.O'Bu (CH₂)_cO(CH₂)_d.CO.O‘Bu

Bu.O.CO.

(d = 2)

PhCH₂N /(CH^OCCH^CO.OH (CH₂)_cO(CH₂)_a.CO.OH ,[(CH₂)_eOl_pR' (CH₂)_cO(CH₂)_dCON / ^t(CH₂)_eO]_pR^{s PhCHzN}x /K^cH₂)_eOl_pR⁶ (CH₂)_cO(CH₂)_dCON

K^CH₂)_eO]_pR^a (CH₂) O(CH₂)_dCON, ^í(CH₂)_aO]_pR ^X(CH₂)_eO(CH_a)_eCON^X' l(CH₂)_eOl_pR^D ' í{CH₂)_eO]_pR^Ď

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:

(i) Žiadateľ:

(A)	Meno:	ZENECA LIMITED
(B)	Ulica:	15 STANHOPE GATE (C) CITY: Londýn
(E)	Štát:	Veľká Británia
(F)	Poštový	kód (ZIP): W1Y 6LN
(G)	Telefón:	0171 304 5000
(H)	telefax:	0171 304 5151
(I)	Telex:	0171 834 2042

(ii) Názov vynálezu: Deriváty peptidov, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje (iii) Počet sekvencií: 8 (iv) Počítačová forma:

(A) Typ nosiča: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, verzia #1,30 (EPO) (vi) Údaje o predošlej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: GB 9611881.5 (B) Priorita dňa: 7. 6. 1996 (vi) Údaje o predošlej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: GB 9622890.3 (B) Priorita dňa: 2. 11. 1996 (2) Údaje o sekvencii identifikačné číslo 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Ďalšie informácie: /produkt = iný/poznámka = 5-fenyl pentanoyl-Ala (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 4 · (D) Ďalšie informácie: /produkt = iný/poznámka = (N⁴,N⁴ -bis{2- [2-(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl})-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid

ΊΟ (B) Pozícia: 8 (D) Ďalšie informácie: /produkt = iný/poznámka = Ala-pipe ridín-9-karboxamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 1:

Xaä Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa

5 (2) Údaje o sekvencii identifikačné číslo 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché _r (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = 5-fenylpentanoyl - (N⁴,N⁴-bis{2-[2-(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl})-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 8 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = Ala-piperidín-9· -karboxamid (xi) Popis sekvencíe: sekvencia identifikačné číslo 2:

Xaa Ala Ala Lys Val Ala Ala Xaa

5 (2) Údaje o sekvencii identifikačné číslo 3:

(i) Charakteristiky sekvencíe:

(A) Dĺžka: 6 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Ďalšie informácie: /produkt = iný/poznámka = 5-fenyl pentanoyl-Ala (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 4 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = {N^,N^-bis[N,N -bis(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]}-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 6 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = [(S)-2-((R)-3

-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl] -Ala-4-aminofenylacetamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 3:

Xaa Arg Ala Xaa Thr Xaa

5 (2) Údaje o sekvencii identifikačné číslo 4:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Ďalšie informácie: /produkt = iný/poznámka = 5-fenyl pentanoyl-Ala (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 4 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = (N⁴, N⁴-bis[N,N . -bis(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]}-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 8 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = Ala-piperidín-9 karboxamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 4:

Xaa Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa

5 (2) Údaje o sekvencií identifikačné číslo 5:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 6 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = 5-fenylpentanoyl -Arg (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 4 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = [(S)-2-((R)-3

-amíno-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 5 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = (N⁴,N⁴-bis{2-[2 -(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl})-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 6 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = Ala-9-aminofenyl acetamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 5:

Xaa Ala Ala Xaa Xaa Xaa

5 (2) Údaje o sekvencii identifikačné číslo 6:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 6 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = 5-fenylpentanoyl -Arg (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 4 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = [N⁴,N⁴-bis(N,N -bis{2-[2-(2-metoxyetoxy)etoxy]etyl}karbamoylmetyl)]-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 6 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = [(S)-2-((R)-3 -amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 6:

Xaa Ala Ala Xaa Thr Xaa

5 (2) Údaje o sekvencií identifikačné číslo 7:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) ' Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = 5-fenylpentanoyl -Ala (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 4 , (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = {N⁴,N⁴-bis[N,N -bis(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]}-Asn (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 8 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = Gly-9-aminofenyl acetamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 7:

Xaa Ala Ala Xaa Thr Pro Arg Xaa

5 (2) Údaje o sekveneii identifikačné číslo 8:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 6 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Typ vlákna: jednoduché (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 1 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = 5-fenylpentanoyl -{N⁴,N⁴-bis[N,N-bis(2-metoxyetyl)karbamoylmetyl]}-Gin (ix) Znaky:

(A) Meno/označenie: Peptid (B) Pozícia: 6 (D) Iné údaje: /produkt = iný/poznámka = [(S)-2-((R)-3

-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) Popis sekvencie: sekvencia identifikačné číslo 8:

Xaa Arg Ala His Val Xaa

Claims (19)

1. Derivát peptidu všeobecného vzorca I

P-7U\¹-AA²-AA³-7U\⁴-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q (I) alebo jeho farmaceutický prijateľná sol, kde

P je hydrofóbny zvyšok;

AA¹, AA², AA³, AA⁴, AA⁵, AA⁶, AA⁷ a AA⁸ sú zvyšky L-aminokyselín, kde 1, 2 alebo 3 zo zvyškov AA^-, AA⁴ a AA⁷ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II

R¹

I kde n je celé číslo 1, 2, 3 alebo 4;

X je skupina -NH-CO-, skupina -CO- alebo skupina -0-C0-;

R¹ a R² sú vybrané zo skupiny, ktorú tvoria (A) , (B) a (C), kde (A) je skupina všeobecného vzorca· -(CH2)_a-CO-N(R³)(R⁴), kde a je celé číslo 1 alebo 2 a R³ a R⁴ sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorú tvorí skupina -[(CH2)^0]m^_Ra< kde R^a je metylová skupina alebo etylová skupina a m je celé číslo 1, 2, 3, 4 alebo 5; ak m je 1, b je 2 alebo 3 a ak m je 2, 3, 4 alebo 5, b je v každej jednotke -(CH2)fc>0- nezávisle vybrané z 2 a 3;

(B) je skupina všeobecného vzorca -(CH2)_CO(CH2)j-CO-N(R³)(R⁸), kde c je celé číslo 2 alebo 3, d je celé číslo 1, 2 alebo 3, a R³ a R⁸ sú nezávisle od seba vybrané zo skupín všeobecného vzorca -[(CH2)_eO]p~Rb, kde je metylová skupina alebo etylová skupina a p je celé číslo 1, 2, 3, 4 alebo 5; ak p je 1, e je 2 alebo 3 a ak p je 2, 3, 4 alebo 5, e je v každej jednotke -(CH2)_eO- nezávisle vybraná z 2 a 3; a (C) je skupina všeobecného vzorca -[(CH2)fO]g-R⁷, kde R⁷ je metylová skupina alebo etylová skupina a g je celé číslo 1, 2, 3, 4 alebo 5; ak g je 1, f je 2 alebo 3 a ak g je 2, 3, 4 alebo 5, hodnota f v každej jednotke -(CH2)fO- je nezávisle 2 a 3; alebo

AA¹, AA², AA³, AA⁶, AA⁷ a AA⁸ sú zvyšky L-aminokyselín, kde jeden alebo viacero zo zvyškov AA¹ a AA⁷ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definovali a AA^ spoločne s AA³ tvoria skupinu všeobecného vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va;

(IHa) (III)

ΛΛΑΛΛΓΖ

Ŕb

ΛΛΛΛΛΛΛ (IV) (IVa) kde Ra, Rb a Rz sú nezávisle od seba vybrané zo skupiny, ktorú tvorí atóm vodíka a alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka a A je atóm kyslíka alebo metylénová skupina; alebo

AaI, Aa2, AA^, AA⁴, ΑΑθ a ΑΑθ sú zvyšky L-aminokyselín, kde jedna alebo obe skupiny AA¹ a AA⁴ sú vybrané zo zvyškov L-aminokyselín všeobecného vzorca II, ako sa definovalo, a ΑΑθ spoločne s ΆάΤ tvoria skupinu všeobecného vzorca III, Hla, IV, IVa, V alebo Va, ako sa definovalo; a

Q je hydroxylová skupina, aminoskupina, skupina NRcRd, kde Rc je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka, 2-karbamoylcyklopentylová skupina, 2-pyridylmetylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylová skupina, 4-karbamoylcyklohexylmetylová skupina, 3-karbamoylfenylová skupina, 4-karbamoylfenylová skupina, 4-(karbamoylmetyl)fenylová skupina, 4-(karboxymetyl)fenylová skupina, 2-morfolinoetylová skupina a skupina všeobecného vzorca -A^-G^, kde A^ je alkylénová skupina obsahujúca 3 až 7 atómov uhlíka, alebo

A¹ je vybraná (1) zo skupín všeobecného vzorca -A^-B^-, kde A^ je p-fenylénová skupina alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a je alkylénová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka alebo a2 je metylénová skupina a B^ je p-fenylénová skupina alebo 1,4-cyklohexylénová skupina; a (2) zo skupín všeobecného vzorca -Ä^{3 *}-B³-C³-, kde A³ j_e metylénová skupina, B³ je p-fenylénová skupina alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a C³ je alkylénová skupina obsahujúca 1 až 3 atómy uhlíka; a

G¹ je skupina všeobecného vzorca -N=C[N(Rp)2]2’ kde každá skupina Rp je nezávisle vybraná zo skupiny, ktorú tvorí atóm vodíka, metylová skupina, etylová skupina a propylová skupina; a Rd je atóm vodíka alebo alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka; alebo Q je 1-piperazinylová skupina, 4-metyl-l-piperazinylová skupina, 4-[2-(2-hydroxyetoxy) etyl]-1-piperazinylová skupina, 4-amidino-l-piperazinylová skupina, 1-piperidylová skupina alebo 1-piperidylová skupina substituovaná v polohe 4, kde substituent v polohe 4 je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí karboxylová skupina, karbamoylová skupina, N-(2-aminoetyl)karbamoylová skupina a N-(4-aminobutyl)karbamoylová skupina; alebo Q je sekvencia 1 až 6 aminokyselinových zvyškov alebo ich amid.

2. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický'prijateľná soľ podľa nároku 1, ktorý je derivátom peptidu všeobecného vzorca P-AA¹-AA²-AA³-II-AA⁵-AA⁶-AA⁷-AA⁸-Q, kde AA¹, AA², AA³, AA⁵, AA⁶, AA⁷ a AA⁸ sú zvyšky L-aminokyselín, P a Q majú rovnaký význam, ako sa definuje v nároku 1, a II je zvyšok L-aminokyseliny všeobecného vzorca II, ako sa definuje v nároku 1.

3. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná sol podľa nároku 1, ktorý je derivátom peptidu všeobecného vzorca P-AAi-AA²-AA³-IIIa-AA⁵-II-AA⁸-Q, kde skupiny AA¹, AA², AA³, AA⁵ a AA⁸ sú zvyšky L-aminokyselín, P a Q majú rovnaký význam, ako sa uvádza v nároku 1, II je zvyšok L-aminokyseliny všeobecného vzorca II, ako sa definuje v nároku 1, a Hla je skupina všeobecného vzorca Hla, ako sa definuje v nároku 1.

4. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ podľa nároku 1, ktorý je derivátom peptidu všeobecného vzorca P-AA^-AA²AA³-II-AA³-IIIa-AA^{7 8}-Q, kde skupiny AA^, AA², AA³, AA³ a AA⁸ sú zvyšky A-aminokyselín, P a Q majú rovnaký význam, ako sa definuje v nároku 1, II je zvyšok A-aminokyseliny všeobecného vzorca II, ako sa definuje v nároku 1, a Hla je skupina všeobecného vzorca Hla, ako sa definuje v nároku 1.

5. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná sol podľa nároku 1, ktorý je derivátom peptidu všeobecného vzorca P-II-AA²AA³-AA⁴-AA⁵-IIIa-AA⁸-Q, kde AA², AA³, AA⁴, AA⁵ a' AA⁸ sú zvyšky L-aminokyselín, P a Q majú rovnaký význam, ako sa definuje v nároku 1, II je zvyšok A-aminokyseliny všeobecného vzorca II, ako sa definuje v nároku 1, a Hla je skupina všeobecného vzorca Hla, ako sa definuje v nároku 1.

6. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde P je alifatická skupina, aromatická skupina alebo zmiešaná alifaticko/aromatická organická skupina obsahujúca 5 až 20 atómov uhlíka alebo heterocyklická alebo zmiešaná alifaticko/heterocyklická organická skupina obsahujúca 5 až 20 atómov uhlíka a 1, 2 alebo 3 heteroatómy vybrané zo skupiny, ktorú tvorí atóm kyslíka, atóm síry a atóm dusíka.

7. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde vo zvyšku A-aminokyseliny všeobecného vzorca II, n je 1 alebo 2, X je karbonylová skupina a R¹ a R² sú obe rovnakými skupinami všeobecného vzorca (A) alebo sú obe rovnakými skupinami všeobecného vzorca (C), ako sa definuje v nároku 1.

8. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná sol podlá nároku 7, kde R¹ a R³ sú obe skupinami -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3, alebo sú obe skupinami -CH2CON(CH2CH2OCH3)2 alebo sú obe skupinami -CH₂CON[(CH₂CH₂O)3CH3] 2 ·

9. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde AA¹ až AA³, ak sú prítomné, sú vybrané zo zvyškov nasledovných aminokyselín:

AA¹ je vybrané z Ala, íle, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluóralanínu;

AA² je vybrané z Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, íle, Tie, 3,3,3-trifluóralanínu a N³-dietyl-Lys;

AA³ je vybrané z Ala, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn a

N³-dietyl-Dap; AA^ je vybrané N³-dietyl-Lys; z Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, AA³ je vybrané N³-dietyl-Dap; z Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, AA³ je vybrané z Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His a Dap; AA⁷ je vybrané z Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic a Dic; AA³ je vybrané z Ala, Gly, Dap, azaalanínu í a azaglycínu.

10. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná sol podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, kde Q je vybrané zo skupiny, ktorú tvorí 4-karbamoyl-l-piperidylová skupina a 4-(karbamoylmetyl)anilinoskupina.

11. Derivát peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, kde hydrofóbnou skupinou P je 5-fenylvalerylová skupina.

12. Derivát peptidu podľa nároku 1 alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ, ktorým je zlúčenina

JS alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, kde Phv je 5-fenylvalerylová skupina.

13. Derivát peptidu pódia nároku 1 alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ, ktorým je zlúčenina

CH₂CH₂OCH₂CH2OCH2CH₂OCH₃ \_n/CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ o

_n/CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₃ ^xch₂ch₂och₂ch₂och₂ch₂och₃

Phv—Arg—Ala—Ala —N H

N

O

CH

Ala—N H ch₂conh₂ alebo jej farmaceutický prijateľná soľ, kde Phv je 5-fenylvalerylová skupina.

14. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje derivát peptidu všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijatelnú soľ podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, spoločne s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

15. Spôsob prípravy derivátu peptidu alebo jeho farmaceutický prijateľné soli podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa postupnú kondenzáciu vo vhodnom poradí vhodne chránených aminokyselín alebo sekvencii dvoch alebo viacerých vhodne chránených aminokyselín, vhodne chránenej skupiny všeobecného vzorca H-II-OH, H-III-OH, H-IIIa-OH, H-IV-OH, H-IVa-OH, H-V-OH alebo H-Va-OH a prípadne vhodne chránenej skupiny všeobecného vzorca H-Q, nasledovanou prípadnou úpravou funkčnej skupiny Nkoncovej aminoskupiny, zavedením hydrofóbnej skupiny P a odstránením akýchkoľvek zvyšných ochranných skupín a akéhokoľvek tuhého nosiča.

16. Spôsob liečby T-bunkami sprostredkovaného od MHC triedy II závislého autoimúnneho alebo zápalového ochorenia, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie účinného množstva derivátu peptidu všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli podľa nároku 1 teplokrvným cicavcom v prípade, že takúto liečbu potrebujú.

17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že sa lieči reumatoidná artritída a cystická fibróza.

18. Použitie derivátu peptidu všeobecného vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli podľa nároku 1 na prípravu nových liečiv na použitie pri liečbe T-bunkami sprostredkovaného od MHC triedy II závislého autoimúnneho alebo zápalového ochorenia.

19. Chránená alebo néchránená aminokyselina všeobecného vzorca II alebo jej soľ, kde n, X, R¹ a R² majú rovnaký význam, ako sa definuje v nároku 1.