KR20000016465A - 펩티드 유도체 - Google Patents

펩티드 유도체

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KR20000016465A
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돈 리사 로얄
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Abstract

본 발명은 화학식 I, 즉 P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q(식 중, P, AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7, AA8및 Q는 본 명세서에서 정의한 바와 같은 다양한 의미를 가짐)로 표시된 약학적으로 유용한 펩티드 유도체 및 이것의 약학적으로 허용 가능한 염과, 이들을 함유한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규 펩티드 유도체는 류마티스양 관절염과 같은 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가 면역 또는 염증성 질병을 치료하는데 유효하다. 또한, 본 발명은 신규의 펩티드 유도체를 제조하는 방법과 본 발명의 화합물을 약학적 치료시 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

펩티드 유도체
인체 면역 반응의 자극은 T 세포에 의한 단백질 항원의 인식에 따라 좌우된다. 그러나, T 세포는 항원에 단독으로 반응할 수 없고, 항원 제공 세포, 예를 들어 B 세포, 대식세포 또는 수상돌기 세포의 표면상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원에 의해서만 유도된다.
MHC 클래스 I 분자는 항원을 보유하는 세포의 파괴를 초래하는 T-킬러 세포 반응을 유도한다. MHC 클래스 II 분자는 선택된 B 세포의 확장 및 성숙을 조절하는 T-헬퍼 세포 반응(즉, 항원-특이 항체의 생성)과 대식 세포의 활성화를 유도한다.
면역 시스템의 중요한 필요 조건은 "자가" 및 "비자가"(즉, 이종) 항원을 구별하는 능력에 있다. 이러한 구별력은 면역 시스템이 자가 단백질에 대한 면역 내성을 유지하면서 침입하는 이종 병원체에 대한 반응을 증가시킴으로써, 정상 조직에 대한 손상을 방지할 수 있게 하는데 필요하다. 자가 면역 질병은 면역 시스템으로 하여금 류마티스양 관절염에서 관절과 같은 자가 조직에 대해 반응할 수 있게 하는 자가 면역 내성이 파괴되었을 때 발생한다. 면역 내성을 유지하여 자가 면역 질병을 피하는 것은 MHC 분자의 작용에 따라 결정적으로 좌우된다고 생각된다.
많은 자가 면역 질병이 특정 MHC 대립 유전자의 유전과 관련이 있다는 관찰 결과는 자가 면역 질병의 병인론에 MHC 분자가 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 예를 들면, 다발성 경화증은 HLA-DR2의 유전과 관련이 있고, 인슐린 의존성 진성 당뇨병은 HLA-DR3 및/또는 HLA-DR4의 유전과 관련이 있으며, 하시모토 갑상선 염은 HLA-DR5의 유전과 관련이 있다. 구체적으로, 만성 염증성 관절 질병인 류마티스양 관절염의 발생에 대한 소인과 HLA-DR4Dw4 및/또는 HLA-DR4w14 및/또는 HLA-DR1의 유전 사이에는 특히 강한 연관성이 존재한다. 자가 면역 질병과 관련된 MHC 분자는 특정 자가-항원에 결합하고 이 항원을 T세포에 제공함으로써 자가 면역 반응을 자극하는 것으로 생각된다. 자가 면역과 관련된 MHC 분자에 결합하고/결합하거나, 이 결합을 방지하거나 이미 결합된 자가-항원을 치환시키고/치환시키거나, T 세포 활성[구체적으로, 병원성 T 세포(예를 들면, Th 1 세포)의 활성]을 억제하고/억제하거나, 보호성 T 세포(예를 들면, Th2 세포)의 활성을 증가시킬 수 있는 기타 펩티드, 또는 MHC 분자를 통해 매개된 자가 면역 반응의 자극을 방지하거나 완화시키기 위해서 대안적인 작용 메카니즘에 의해 상기 MHC 분자와 상호 작용하는 펩티드는 자가 면역 반응을 특이적으로 억제할 수 있다.
이러한 종류의 약물은 면역 시스템의 전반적인 억제를 피함으로써 해로운 부작용을 제한하면서 자가 면역 질병에 대한 치료법을 제공할 수 있다. 이러한 유형의 프로필은 류마티스양 관절염과 같은 질병에 대한 현행 치료법에 비해 상당한 장점을 제공한다. 초창기부터 NSAID와 같은 증상 경감제를 사용하여 류마티스양 관절염을 치료하는 것이 현행 실시되고 있는 치료법인데, 이것은 병의 진행에 대해 이로운 효과를 제공하지 못하고, 원하지 않는 부작용과 관련되어 있는 경향도 있다. 보다 심한 중증 질병의 치료는 제2-계통제(second-line agent)로 불리우는 약물의 사용에 의존한다. 이러한 약물들은 제한된 효능을 가지고 있고, 심각한 독성 문제를 야기할 수 있는 경향이 있는 일반적인 세포 독성 화합물이다. 그러므로, 비특이적 세포 독성과 연관이 없는 질병 완화제는 류마티스양 관절염의 치료에 상당한 이점을 제공할 수 있다.
펩티드는 국제 특허 출원, 공개 번호 WO 92/02543호, WO 93/05011호 및 WO 95/07707호에 개시되어 있으며, 이 펩티드는 MHC 분자에 결합하여 T-세포 활성을 억제한다.
다수의 펩티드는 HLA-DR 분자에 결합함으로써 HLA-DR 제한된 T-세포 활성화를 억제하는 것으로 관찰되었지만, 상기 언급한 질병 또는 증상을 유발하는 자가 면역 반응의 자극을 방지하거나 완화시키기 위해, 상기 분자에 결합하고/결합하거나, 이 결합을 방지하거나 이미 결합된 자가 항원을 치환시키고/치환시키거나, T-세포 활성화를 억제하고/억제하거나, 보호성 T-세포의 활성을 증가시키는 대안적인 화합물, 또는 대안적인 작용 메카니즘에 의해 MHC 분자와 상호 작용하는 대안적인 화합물이 여전히 요구되고 있다.
본 발명자들은 본 발명의 펩티드 유도체(후술함)가 놀랍게도 약리학적으로 유용한 성질을 갖고 있다는 사실을 발견하였고, 이것을 기초로 하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 류마티스양 관절염 및 기타 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 질병과 같은 자가 면역 질병 또는 의학적 증상을 치료하는데 사용하기에 약리학적으로 유용한 성질을 보유한 특정 신규 펩티드 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규 펩티드 유도체의 약학 조성물, 상기 펩티드 유도체의 제조 방법, 및 상기 언급한 1종 이상의 질병 또는 의학적 증상의 치료 시에 그리고 이러한 의학적 치료에 사용하기 위한 신규 약제의 제조 시에 상기 펩티드 유도체를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
상기 화학식 Ⅰ에서,
P는 소수성 잔기이고;
AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7및 AA8은 L-아미노산 잔기로서, AA1, AA4및 AA7중에 1개, 2개 또는 3개는 하기 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되거나;
[상기 화학식 Ⅱ에서,
n은 1, 2, 3 또는 4인 정수이고;
X는 -NH-CO-, -CO-(카르보닐) 또는 -0CO-(옥시카르보닐)이며;
R1과 R2는 다음의 (A), (B) 및 (C), 즉 (A) a가 1 또는 2인 정수이고, R3과 R4가 화학식 -[(CH2)bO]m-Ra{여기서, Ra는 메틸 또는 에틸이고, m은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며, m이 1인 경우 b는 2 또는 3이고, m이 2, 3, 4 또는 5인 경우 각각의 -(CH2)bO- 단위에서의 b 값은 2 와 3으로부터 각각 선택됨}로 표시된 기로부터 각각 선택되는 것인, 화학식 -(CH2)a-CO-N(R3)(R4)로 표시된 기;
(B) c가 2 또는 3인 정수이고, d가 1, 2 또는 3인 정수이며, R5와 R6이 화학식 -[(CH2)eO]p-Rb{여기서, Rb는 메틸 또는 에틸이고, p는 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며, p가 1인 경우 e는 2 또는 3이고, p가 2, 3, 4 또는 5인 경우 각각의 -(CH2)eO- 단위에서의 e 값은 2와 3으로부터 각각 선택됨}로 표시된 기로부터 각각 선택되는 것인, 화학식 -(CH2)c-O(CH2)d-CON(R5)(R6)로 표시된 기; 및
(C) 화학식 -[(CH2)f-O]g-R7{여기서, R7은 메틸 또는 에틸이고, g는 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며, g가 1인 경우 f는 2 또는 3이고, g가 2, 3, 4 또는 5인 경우 각각의 -(CH2)fO- 단위에서의 f 값은 2 와 3으로부터 각각 선택됨}로 표시된 기
로부터 선택됨];
또는 AA1, AA2, AA3, AA6, AA7및 AA8은 L-아미노산의 잔기로서, AA1과 AA7중에 1개 또는 2개 모두가 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되고, AA4가 AA5와 함께 하기 화학식 Ⅲ, 화학식 Ⅲa, 화학식 Ⅳ, 화학식 Ⅳa, 화학식 Ⅴ 또는 화학식 Ⅴa로 표시된 기를 형성하거나;
[상기 식들 중, Ra, Rb 및 Rz는 수소와 (C1-C4)알킬로부터 각각 선택되고, A는 산소 또는 메틸렌임]
또는 AA1, AA2, AA3, AA4, AA5및 AA8은 L-아미노산의 잔기로서, AA1과 AA4중에 1개 또는 2개 모두가 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되고, AA6이 AA7과 함께 상기 화학식 Ⅲ, 화학식 Ⅲa, 화학식 Ⅳ, 화학식 Ⅳa, 화학식 Ⅴ 또는 화학식 Ⅴa[상기 식들 중, Ra, Rb 및 Rz는 수소와 (C1-C4)알킬로부터 각각 선택되고, A는 산소 또는 메틸렌임]로 표시된 기를 형성하고;
Q는 OH, NH2, NRcRd이며, 여기서 Rc는 (C1-C4)알킬, 2-카르바모일시클로펜틸, 2-피리딜메틸, 4-카르바모일시클로헥실, 4-카르바모일시클로헥실메틸, 3-카르바모일페닐, 4-카르바모일페닐, 4-(카르바모일메틸)페닐, 4-(카르복시메틸)페닐, 2-모르폴리노에틸 및 화학식 -A1-G1[식중, A1은 (C3-C7)알킬렌이거나, 또는 A1은 (1) A2가 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고, B2가 (C1-C4)알킬렌이거나, 또는 A2가메틸렌이고, B2가 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌인 화학식 -A2-B2-로 표시된 기와 (2) A3이 메틸렌이고, B3이 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이며, C3이 (C1-C3)알킬렌인 화학식 -A3-B3-C3-로 표시된 기로부터 선택되고, G1은 Rp가 수소, 메틸, 에틸 및 프로필로부터 각각 선택되는 것인 화학식 -N=C[N(Rp)2]2로 표시된 기임]로 표시된 기로부터 선택되고, Rd는 수소 또는 (C1-C4)알킬이거나;
또는 Q는 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-(2-(2-히드록시에톡시)에틸)-1-피페라지닐, 4-아미디노-1-피페라지닐, 1-피페리딜 또는 4-치환된-1-피페리딜[여기서, 4-치환체는 카르복시, 카르바모일, N-(2-아미노에틸)카르바모일 및 N-(4-아미노부틸)카르바모일로부터 선택됨]이거나;
또는 Q는 1개 내지 6개의 아미노산 잔기의 서열 또는 이것의 아미드이다. 본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명은, AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7및 AA8이 잔기로서, AA1, AA4및 AA7중의 하나가 상기 언급한 화학식 Ⅱ[n, X, R1및 R2는 상기 정의한 모든 의미들을 지님]로 표시된 L-아미노산 잔기로부터 선택되거나; 또는 AA1, AA2, AA3, AA6, AA7및 AA8이 L-아미노산 잔기로서, AA1과 AA7중의 하나가 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산 잔기로부터 선택되고, AA4가 AA5와 함께 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅲa로 표시된 기를 형성하거나; 또는 AA1, AA2, AA3, AA4, AA5및 AA8이 L-아미노산 잔기로서, AA1과 AA4중의 하나가 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산 잔기로부터 선택되고, AA6이 AA7과 함께 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅲa로 표시된 기를 형성하며; P와 Q가 상기 정의한 모든 예들을 갖는 것인, 앞서 언급한 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
Q의 아미노산은 각각 D-입체화학 또는 L-입체화학을 가질 수 있다. 또한, Q를 히드록시(OH)로서 정의할 때, 이것은 C-말단 아미노산 AA8의 히드록시기임을 의미한다. 유사하게, Q를 NH2, NRcRd, 피페라지닐, 피페리딜 등으로서 정의할 때, 이것은 C-말단 아미노산 AA8의 히드록시기가 그러한 기들로 치환된다는 것을 의미한다. 또한, 아미노산을 언급한 경우, 이것은 α-아미노산을 의미한다. 마찬가지로, L-아미노산을 언급한 경우, 그 아미노산에는 키랄 탄소 원자를 갖지 않는 Gly, 2,2-디에틸Gly, 아자-알라닌 및 아자-글리신과 같은 아미노산도 포함된다. 또한, "알킬"과 같은 포괄적인 용어는 탄소수가 허용되는 한 다양한 직쇄형 또는 분지쇄형을 모두 포함한다. 동일한 규정이 기타 라디칼에 대해서도 적용된다.
또한, R1과 R2가 모두 화학식 (A)로 표시된 기일 때, R1에서 a, R3및 R4은 R2의 것들과 동일하거나 상이할 수 있다. 유사하게, R1과 R2가 모두 화학식 (B)로 표시된 기일 때, R1에서 c, d, R5및 R6은 R2의 것들과 동일하거나 상이할 수 있으며, R1과 R2가 모두 화학식 (C)로 표시된 기일 때, R1에서 f, g 및 R7은 R2의 것들과 동일하거나 상이할 수 있다.
키랄 중심을 가진 화합물은 라세미체(또는 1개 이상의 키랄 중심을 갖는 경우에는 부분입체 이성질체 혼합물)의 형태 또는 광학 활성 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체로 존재할 수 있다는 것이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 라세믹 혼합물 또는 부분입체 이성질체 혼합물과 관련된 특정 생물학적 활성은 대체적으로 또는 전적으로 단일의 광학 활성 이성질체로부터 유도될 수 있다는 것이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 그러므로, 본 발명은 전술한 약학적으로 유용한 성질을 지닌 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 모든 형태에 관한 것이다. 또한, 본 명세서에 예시된 바와 같이, 단일의 광학 활성 이성질체를 얻는 방법, 예를 들면 이성질체를 함유한 라세믹 혼합물 또는 부분입체 이성질체 혼합물로부터 크로마토그래피와 같은 종래 기술을 사용하거나, 또는 적당한 광학 활성 출발 물질 또는 중간 물질을 사용하여 키랄 합성시켜 상기 단일의 광학 활성 이성질체를 얻는 방법이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 예를 들면 본 명세서에 개시된 분석 시험들을 사용하여 라세믹 혼합물 또는 부분입체 이성질체 혼합물과 개개의 광학 활성 이성질체의 약리학적 성질을 결정하는 방법이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 그러므로, 당업자는 앞에서 언급한 유용한 약리학적 성질을 가진 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 특정 이성질체를 용이하게 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 앞에서 언급한 유용한 약리학적 성질을 가진 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 모든 다형체 형태, 모든 호변 이성질체나 모든 용매화물, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
화학식 Ⅱ로 표시된 아미노산 잔기가 아니거나, 화학식 Ⅲ, 화학식 Ⅲa, 화학식 Ⅳ, 화학식 Ⅳa, 화학식 Ⅴ 또는 화학식 Ⅴa로 표시된 기의 일부를 형성하지 않는 경우에, α- 아미노산 잔기 AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7및 AA8에 적합한 각각의 예로는, 예를 들면 유전자 코드에 의해 암호화된 20 종의 천연 아미노산, 구체적으로 알라닌(Ala), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소로이신(Ile), 리신(Lys), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 아르기닌(Arg), 트레오닌(Thr), 발린(Val) 및 프롤린(Pro)을 들 수 있다. 예를 들면, 사르코신(Sar), 3,3,3-트리플루오로알라닌, 2,2-디에틸글리신, 2,3-디아미노프로판산(Dap), 2,4-디아미노부탄산(Dab), 2-아미노부탄산(Abu), 호모아르기닌, 호모페닐알라닌, 트랜스-4-히드록시프롤린(Hyp), 아자-알라닌[H2N-N(CH3)-COOH; Azala], 아자-글리신[H2N-NH-COOH; Azgly], 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic), 옥타히드로인돌-2-카르복실산(Oic), 데카히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Dic)의 아미노산의 잔기도 적합하다(여기서, Dic는 양 고리 접합점이 모두 R 배열 또는 모두 S 배열을 갖는 형태를 의미한다). 상응하는 N2-메틸화된 아미노산의 잔기 뿐만 아니라, 유리된 측쇄 카르복실산 작용기가 에스테르화(예를 들면, C1-6알킬 또는 벤질 에스테르로서 에스테르화됨)되고, 유리된 측쇄 아미노기가 알킬화(예를 들면, 메틸화됨)되고, 아세틸화되거나 또는 카바메이트[예를 들면, 알킬(예를 들면,메틸 또는 에틸) 카바메이트, 페닐 카바메이트 또는 벤질 카바메이트]로 전환된 것인 상응하는 아미노산의 잔기를 사용할 수도 있다. 기타 적합한 예로는 2-치환체가 화학식 -(CH2)sNH2(여기서, s는 1 내지 3임)로 표시된 기, 또는 화학식 -(CH2)pN(Re)3 +.X-[여기서, p는 2 내지 4이고, X-는 짝이온(예를 들면, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 수산화물 또는 염화물)임]로 표시된 기, 또는 화학식 -(CH2)qN(Re)2(여기서, q는 0 내지 4임)로 표시된 기, 또는 화학식 -(CH2)rN=C[N(Re)2]2(여기서, r은 1 내지 4임)로 표시되는 기인 2-치환된 글리신의 잔기를 들 수 있는데, 마지막 3개 기의 Re는 각각 수소 및 C1-4알킬(예를 들면, 메틸 또는 에틸)로부터 선택된다.
소수성 잔기 P(이것은 N-말단 아미노산 AA1에 결합되어 있는 것임)에 적합한 예로는, 탄소 원자 수가 5 내지 20이고, 헤테로아릴 함유 기인 경우 산소, 황 및 질소로부터 선택된 헤테로 원자 수가 1, 2 또는 3인 소수성 지방족, 방향족, 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/방향족이나 지방족/헤테로방향족 유기 기와 같은 유기 소수성 기, 예를 들면 화학식 R-, R.CO-, R.SO2- R.O.CO-, R.NHCO-, -R.O.CS-, R.S.CO- R.NHCS-, R.S.CS- 및 R.CS-로 표시된 기를 들 수 있는데, 여기서 R의 예로는 (C5-C10)알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C2-C10)알킬, 헤테로아릴(C2-C10)알킬, 디아릴(C2-C8)알킬, 아릴(C2-C10)알케닐, 아릴시클로프로필, (C5-C10)시클로알킬, (C5-C10)시클로알킬(C2-C6)알킬, 3-바이페닐, 4-바이페닐, 4-시클로헥실페닐, 2-나프틸옥시메틸, 3-나프틸옥시메틸, 페녹시페닐 및 테트라히드로나프틸을 들 수 있으며, 이 R의 예 중에서 아릴 또는 헤테로아릴 기는 1종 이상의 (C1-C4)알킬, 할로게노, 시아노 또는 (C1-C4)알콕시 치환체를 함유할 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시태양에는, 예를 들면 P가 상기 정의한 바와 같은 R.C0-인 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체가 포함된다. 또 다른 본 발명의 바람직한 실시태양에는 예를 들면, P가 탄소 원자 수가 5 내지 20인 소수성 지방족, 방향족 또는 지방족/방향족 유기 기인 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체가 포함된다.
R의 구체적인 예로는 (C5-C10)알킬인 경우: 펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 2-메틸펜틸, 헥실, 이소헥실, 5-메틸헥실 및 옥틸; 아릴인 경우: 페닐, 나프틸 및 인데닐; 헤테로아릴인 경우: 2-인돌릴, 3-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 2-인돌리닐, 3-인돌리닐, 5-인돌리닐, 6-인돌리닐, 2-벤조[b]티오페닐, 3-벤조[b]티오페닐, 5-벤조[b]티오페닐, 6-벤조[b]티오페닐, 티에틸, 2-벤조티아졸일, 4-벤조티아졸일, 5-벤조티아졸일, 2-벤즈옥사졸릴, 4-벤즈옥사졸릴, 5-벤즈옥사졸릴, 2-벤즈이미다졸릴, 4-벤즈이미다졸릴, 5-벤즈이미다졸릴, 2-, 3-, 6- 또는 7-위치에 결합된 1,4-벤조디옥사닐, 2-벤조푸라닐, 3-벤조푸라닐, 5-벤조푸라닐 및 6-벤조푸라닐; 아릴(C2-C10)알킬인 경우: 아릴(C2-C6)알킬[여기서, 아릴 부분의 예로는 상기 주어진 아릴에 대한 모든 구체적인 예를 들 수 있고, (C2-C6)알킬 부분의 예로는, 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌 및 펜타메틸렌을 들 수 있음], 예를 들면 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 4-페닐부틸 및 5-페닐펜틸; 헤테로아릴(C2-C10)알킬인 경우: 헤테로아릴(C2-C6)알킬[여기서, 헤테로아릴 부분의 예로는 상기 주어진 헤테로아릴에 대한 모든 구체적인 예를 들 수 있고, (C2-C6)알킬 부분의 예로는 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌 및 펜타메틸렌을 들 수 있음], 예를 들면 2-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)에틸; 디아릴(C2-C8)알킬인 경우: 디아릴(C2-C6)알킬, 예를 들면 2,2-디페닐에틸, 3,3-디페닐프로필 및 4,4-디페닐부틸; 아릴(C2-C10)알케닐인 경우: 아릴(C2-C6)알케닐, 예를 들면 스티릴, 3-페닐프로펜-2-일 및 4-페닐부텐-1-일; 아릴시클로프로필인 경우: 페닐시클로프로필, 1-나프틸시클로프로필 및 2-나프틸시클로프로필; (C5-C10)시클로알킬인 경우: 시클로펜틸, 시클로헥실 및 1-아다만틸; 및 (C5-C10)시클로알킬(C2-C6)알킬인 경우: 2-(시클로헥실)에틸, 3-(시클로헥실)프로필 및 4-(시클로헥실)부틸을 들 수 있다. R의 아릴기상의 치환체에 대한 구체적인 예로는, 메틸, 에틸, 클로로, 브로모, 요오도, 메톡시, 에톡시 및 시아노를 들 수 있다.
또한, 소수성 잔기 P의 예로는, 소수성 L-아미노산, 예를 들면 페닐알라닌(Phe)과 이것의 수소 첨가된 유사체, 예를 들면 시클로헥실알라닌(Cha), 파라-클로로Phe, 3-(2-티에닐)알라닌, 티로신(Tyr), Tyr(O메틸), 트립토판(Trp), 바이페닐알라닌, 3-(1-나프틸)알라닌, 3-(2-나프틸)알라닌 및 이들의 수소 첨가된 유사체, 3-(1-아다만틸)알라닌(Ada), Glu(O벤질), 3-(벤질옥시)Ala, 3-(벤질설파닐)Ala 및 9-플루오레닐Gly를 들 수 있으며, 이들 각각은 상기 정의하거나 예시한 바와 같이 임의로 N-말단 상에 소수성 지방족, 방향족, 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/방향족이나 지방족/헤테로방향족 유기 기를 함유할 수 있다. 대안적으로, 소수성 아미노산은, 경우에 따라서 예컨대, 상기 정의한 바와 같은 AA1내지 AA8에 적합한 독립적인 모든 예로부터 선택된 1개 내지 3개의 아미노산 서열을 더 함유할 수 있다. P의 예로는 특정 서열 Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe 및 Ala-Ala-Ala-Phe을 들 수 있다. 1개 내지 3개의 추가 아미노산 서열의 제1 아미노산(왼쪽에서 오른쪽으로 판독함)은 L-아미노산 또는 D-아미노산일 수 있으며, 또한 임의로 상기 정의하거나 예시한 소수성 지방족, 방향족, 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/방향족이나 지방족/헤테로방향족 유기 기를 함유할 수 있다.
또한, P의 구체적인 예로는, 3-(벤질옥시카르보닐)프로피오닐-Phe, 3-(벤질옥시카르보닐)프로피오닐-Cha, 4-(벤질옥시카르보닐)부티릴-Phe, 4-(벤질옥시카르보닐)부티릴-Cha, (5-옥소-피롤리딘-2-일)카르보닐-Phe-Tyr, (5-옥소-피롤리딘-2-일)카르보닐-Glu(O벤질)-Tyr, 아세틸-Glu(O벤질)-Tyr, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2.CO-Cha, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2.CO-Tyr, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2CH2.CO-Cha, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr, 디페닐메틸.NHCO.CH2CH2CH2.CO-Cha, 디페닐메틸.NHCO.CH2CH2CH2.CO-Tyr, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO-Cha, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, N-아세틸-4-클로로-베타-히드록시Phe, 4-페녹시페닐.NHCO-, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO.(N-메틸Phe), 벤질.NHCO.CH2CH2.CONH.CH(CHPh2)CO, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, 3,3-디페닐프로피오닐, 트랜스-신나모일, 5-페닐발레릴 및 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐을 들 수 있다.
중요한 P의 구체적인 예로는 페닐.(CH2)4.CO-(5-페닐발레릴(Phv)), 페닐.(CH2)4.CS- 및 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐을 들 수 있다.
바람직한 소수성 잔기 P의 예로는, 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐 및 5-페닐발레릴(Phv)을 들 수 있는데, 특히 후자인 5-페닐발레릴(Phv)이 보다 더 바람직하다.
Rc가 화학식 -A1-G1로 표시된 기일 때, A1의 구체적인 예로는 알킬렌인 경우, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌을 들 수 있고; B2의 구체적인 예로는 (C1-C4)알킬렌인 경우, 메틸렌, 에틸렌 및 프로필렌을 들 수 있으며; C3의 구체적인 예로는 (C1-C3)알킬렌인 경우, 메틸렌, 에틸렌 및 프로필렌을 들 수 있다.
-A1-G1의 구체적인 예로는, 3-구아니디노프로필, 4-(2-구아니디노에틸)페닐, 4-(2-모르폴리노에틸.NH.CO.CH2)페닐 및 4-(4-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]피페라진-1-일.CO.CH2)페닐을 들 수 있다.
1개 내지 6개의 아미노산 잔기의 서열인 경우, R4의 구체적인 예로는, 상기정의한 AA1내지 AA8에 적합한 모든 독립적인 예로부터 각각 선택된 L-아미노산 잔기의 서열(예를 들면, Ala-Thr-Gly-OH) 또는 이것의 D-유사체, 또는 D-아미노산과 L-아미노산을 둘 다 함유하는 서열 또는 이것의 아미드, 예를 들면 암모니아, (C1-C4)알킬아민(예를 들면, 메틸아민) 또는 디(C1-C4)알킬아민(예를 들면, 디메틸아민)으로부터 유도된 아미드를 들 수 있다.
Q의 바람직한 예로는, 4-카바모일-1-피페리딜[피페리딘-4-카르복사미드(Pip-NH2)의 잔기], 4-카르복시-1-피페리딜[피페리딘-4-카르복실산(Pip-OH)의 잔기], 4-(카바모일메틸)아닐리노[4-아미노페닐아세트아미드(Papa-NH2)의 잔기], 4-(카르복시메틸)아닐리노[4-아미노페닐아세트산(Papa-OH)의 잔기] 및 4-(2-구아니디노에틸)아닐리노[2-(4-아미노페닐)에틸구아니딘(Pape-NHC(=NH)NH2)의 잔기]를 들 수 있다. Q의 구체적인 예로는 Pip-NH2와 Papa-NH2가 바람직하며, 후자 Papa-NH2가 특히 더 바람직하다.
본 발명의 구체적인 신규 펩티드 유도체의 예로는, 하기와 같이 정의되는 화학식 Ⅰ의 펩티드 화합물을 들 수 있다:
(1) 화학식 Ⅱ에서, n = 1이고, X = -CO-이며;
(2) 화학식 Ⅱ에서, n = 4이고, X = -NHCO-이며;
(3) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 a = 1인 화학식 (A)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이고;
(4) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 R3과 R4이 화학식 -[(CH2)bO]m-Ra{여기서, b = 2임}로 표시된 기(동일하거나 상이함)인 화학식 (A)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이며;
(5) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 R3과 R4이 화학식 -[(CH2)bO]m-Ra{여기서, m =1, 2 또는 3임]로 표시된 기(동일하거나 상이함)인 화학식 (A)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이고;
(6) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 c = 2인 화학식 (B)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이며;
(7) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 d = 2인 화학식 (B)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이고;
(8) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 R5와 R6이 화학식 -[(CH2)eO]P-Re[e =1임]로 표시된 기(동일하거나 상이함)인 화학식 (B)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이며;
(9) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 R5와 R6이 화학식 -[(CH2)eO]P-Re[p =1임]로 표시된 기(동일하거나 상이함)인 화학식 (B)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이고;
(10) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 d = 2인 화학식 (C)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이고;
(11) 화학식 Ⅱ에서, R1과 R2는 g = 3인 화학식 (C)로 표시된 기(동일하거나 상이함)이며;
그리고 달리 언급이 없는 경우, AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA5, AA7, AA8, P 및 Q는 전술한 바와 같은 의미를 갖는다.
R1과 R2가 화학식 -[(CH2)fO]g-R7로 표시된 기로부터 선택되는 경우, R3, R4, R5및 R6의 구체적인 예로는 -CH2CH2OCH3, -CH2CH2CH2OCH3, -CH2CH2OCH2CH2OCH3, -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3, -CH2CH2CH2OCH2CH2OCH3, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3, -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2OCH3및 -CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 구체적인 신규 펩티드 유도체의 예로는 다음과 같은 군으로 이루어진 펩티드 유도체를 들 수 있다:
(ⅰ) P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-AA6-AA7-AA8-Q;
(ⅱ) P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q;
(ⅲ) P-AA1-AA2-AA3-Ⅲa-AA6-Ⅱ-AA8-Q;
(ⅳ) P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-Ⅱ-AA8-Q;
(ⅴ) P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-Ⅲa-AA8-Q; 및
(ⅵ) P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-Ⅲa-AA8-Q.
상기 식중에서, Ⅱ는 전술한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기를 나타낸 것이고, Ⅲa은 전술한 바와 같은 화학식 Ⅲa로 표시된 기를 나타내며, 달리 언급이 없는 경우, AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA5, AA7, AA8, P 및 Q는 본 명세서에서 정의되어 있는 구체적인 예 및 바람직한 예를 비롯한 모든 의미를 갖는다[AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7또는 AA8이 존재하는 상기 (ⅰ) 내지 (ⅵ)의 군에서, 이들은 L-아미노산 잔기이고, 이들은 화학식 Ⅱ 또는 화학식 Ⅲa로 표시된 기의 존재와 위치는 특정되게 지정되어 있다]. 상기 (ⅰ) 내지 (ⅵ)의 군은 각각 본 발명의 독립적인 측면들이다.
상기 (ⅰ) 내지 (ⅵ)에 속하는 매우 중요한 펩티드 유도체의 예로는, 화학식 Ⅱ에서, n = 1 또는 2이고, X = 카르보닐이며, R1과 R2는 둘 다 화학식 (C)[특히, f = 2, g = 3 및/또는 R7= 메틸, 예를 들면 -CH2CHOCH2CH2OCH2CH2OCH3)]로 표시된 기이거나 또는 둘 다 화학식 (A)[특히, a = 1, b = 2, m = 1 또는 3 및/또는 Ra= 메틸, 예를 들면 -CH2CON(CH2CH2OCH3)2또는 -CHCON((CH2CH2O)3CH3)2]로 표시된 기인 것들을 들 수 있다. 상기 (ⅰ) 내지 (ⅵ)의 군 중에, (ⅰ)와 (ⅴ)는 매우 중요하다.
AA1내지 AA8(AA1, AA4또는 AA7이 화학식 Ⅱ로 표시된 아미노산의 잔기가 아닐 경우와 AA4가 AA5와 함께 또는 AA6이 AA7과 함께 화학식 Ⅲ, Ⅲa, Ⅳ, Ⅳa, Ⅴ 또는 Ⅴa로 표시된 기를 형성하지 않는 경우)의 바람직한 예로는,
Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4및 3,3,3-트리플루오로알라닌, 구체적으로는 Ala, Ile, Arg, Gap 및 GapMe4, 특별하게는 Ala, Arg 및 GapMe4, 보다 더 특별하게는 Ala 및 Arg으로부터 선택된 AA1;
Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-트리플루오로알라닌 및 N6-디에틸Lys, 구체적으로는 Ala, Arg, Ile, Lys 및 Tic, 특별하게는 Ala, Arg, Ile 및 Tic에서, 보다 더 특별하게는 Ala 및 Arg로부터 선택된 AA2;
Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn 및 N3-디에틸Dap, 구체적으로는 Ala, His, Asp 및 Asn, 특별하게는 Ala 및 Asn, 보다 특별하게는 Ala로부터 선택된 AA3;
Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His 및 N6-디에틸Lys, 구체적으로는 Ala, Arg, Lys 및 His, 특별하게는 Ala, Arg 및 His, 보다 특별하게는 Ala로부터 선택된 AA4;
Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser 및 N3-디에틸Dap, 구체적으로는 Thr, Val 및 Dap, 특별하게는 Thr 및 Val로부터 선택된 AA5;
Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His 및 Dap, 특별하게는 Ala 및 Pro로부터 선택된 AA6;
Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic 및 Dic, 특별하게는 Ala 및 Arg로부터 선택된 AA7; 및
Ala, Gly, Dap, 아자알라닌 및 아자글리신, 구체적으로는 Ala, Gly 및 아자글리신, 특별하게는 Ala 및 Gly로부터 선택된 AA8을 들 수 있다(상기 식중에서, Gap는 잔기 -NH.CH[CH2NH.C(=NH).NH2].CO-이고, GapMe4는 잔기 -NH.CH(CH2N=C[N(CH3)2]2).CO-임).
또한, 본 발명의 구체적인 펩티드 유도체의 독립적인 군의 예로는, AA1, AA4및 AA7중에 1개 또는 2개가 앞에서 정의한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되고, AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7및 AA8의 나머지 잔기가 L-아미노산의 잔기(앞에서 정의한 적합한 예, 구체적인 예 및 바람직한 예를 포함함)인 것인 화학식 Ⅰ로 표시된 펩티드 유도체를 들 수 있다.
화학식 Ⅰ로 표시된 펩티드 유도체가 화학식 Ⅲ, Ⅳ, Ⅳa 또는 Ⅴ로 표시된 기를 함유할 경우, 화학식 Ⅲ에서 Ra, 화학식 Ⅳ 및 Ⅳa에서 Rb 및 화학식 Ⅴ에서 Rz의 구체적인 예로는, 알킬, 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필을 들 수 있다. 화학식 Ⅲ, Ⅳ, Ⅳa, Ⅴ 및 Ⅴa로 표시된 기를 함유한 펩티드 유도체 중에서, 화학식 Ⅲa로 표시된 기를 함유한 펩티드 유도체가 바람직하다.
또한, 본 발명의 한 바람직한 측면은 아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드 유도체, 특별하게는 AA1또는 AA2가 아르기닌인 화합물(예를 들면, 부분 서열 AA1-AA2-AA3이 Ala-Arg-Ala 또는 Arg-Ala-Ala인 화합물)을 포함한다.
매우 중요한 펩티드 유도체의 예로는 하기 실시예에서 설명된 구체적인 실시 태양의 것들을 들 수 있다. 이들 중, 실시예 3과 실시예 6의 펩티드 유도체는 대단히 중요하며, 이들 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염들은 본 발명의 추가 특징을 제공한다.
실시예 3(서열 번호: 3)
실시예 6(서열 번호: 6)
또한, 본 발명의 한 측면은 전술한 바와 같이 n, X, R1및 R2이 구체적인 예 및 바람직한 예를 비롯하여 모든 예를 갖는 화학식 Ⅱ로 표시되는, 보호(예를 들면, Fmoc를 사용하여 보호함)된 아미노산 또는 보호 해제된 아미노산을 포함한다.
예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염의 예로는, 충분히 염기성인 펩티드 유도체, 예를 들면 유리 아미노기를 갖는 것들의 경우, 생리학적으로 허용 가능한 음이온을 형성하는 산과의 염, 예를 들면 할로겐화수소(예를 들면, 염화수소 및 브롬화수소), 황산 및 인산과 같은 무기산과의 염 및, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 트리플루오로아세트산 등과 같은 유기산과의 염을 들 수 있으며, 충분히 산성인 펩티드 유도체, 예를 들면 유리 카르복실산기를 갖는 것들의 경우, 생리학적으로 허용 가능한 양이온을 형성하는 염기와의 염, 예를 들면 알칼리 금속(예를 들면, 나트륨 및 칼륨)과의 염, 알칼리 토금속(예를 들면, 마그네슘 및 칼슘)과의 염, 알루미늄과의 염, 암모늄과의 염 뿐만 아니라 에탄올아민, 메틸아민, 디에틸아민, 이소프로필아민, 트리메틸아민 등과 같은 적합한 유기 염기와의 염을 들 수 있다.
전술한 바와 같이, 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염은 질병 완화제로서 또는 예방 치료제로서 증상을 치료하기 위해 일련의 자가 면역 질병 또는 의학적 증상을 지닌 항온 동물(인간을 포함함)에 이로운 약리학적 효과를 제공한다. 이러한 질병의 예로는, 류마티스양 관절염, 다발성 경화증, 굿파스튜어 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반, 유년기 류마티스양 관절염, 복강 질병, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 중증 근무력증, 유형 I (인슐린 의존성) 당뇨병, 하시모토병, 그레이브스병, 아디손병, 경피증, 다발성 근염, 피부근염, 심상성 펨피구스, 수포성 펨피고이드, 자가 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 사구체 신염, 이식 거부반응 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 류마티스양 관절염 및 다발성 경화증을 들 수 있다.
화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염의 유용성은 국제 특허 출원 공개 번호 WO92/02543호, WO93/05011호 및 WO95/07707호에 개시된 것들(또는 이들의 변형예) 및 후술하는 것들을 비롯한 각종 표준 시험 및 임상 연구를 이용하여 평가할 수 있다. 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 1종 이상의 시험 또는 연구에 있어서 현저한 활성을 나타내었다.
시험 A:펩티드의 결합성 분석(이 분석법은 질병과 관련된 MHC 클래스 II 분자에 대한 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 결합성을 입증하는데 사용할 수 있다). 비오틴-FHA307-320[FHA(307-320)펩티드, N-말단에서 장쇄 비오틴에 의해 유도된 것임, 인산염 완충된 염수 용액(PBS)중의 800 nM의 비오틴-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH] 30 ㎕를, 억제제 펩티드를 함유하거나 함유하지 않는 V자형-웰의 미세 역가판(눙크)에서 농도가 0.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖인 정제된 HLA-DR4Dw4 30 ㎖와 함께 48 시간 동안 항온 처리한다. 항온 처리한 후, 항온 처리물 100 ㎕를, 1시간 동안 실온에서 10 ㎍/㎖ 농도로 항-MHC 항체[L243-미국 모식균 배양소(ATCC)HB55; 문헌(람손 및 레비, J. Immunol. 125, 293-299, 1980)에 개시되어 있는 바와 같이 배양한 것임]에 의해 미리 피복된 효소면역 흡착 측정(ELISA) 평판(눙크)으로 이동시킨 다음, PBS 및 0.05% 트윈 20 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 1시간 동안 차단시킨다. 1 시간이 더 경과한 후, 결합되지 않은 펩티드를 세척하여 제거하고, NP-40(시그마)과 같은 적합한 세정제 0.01%와 함께 PBS중의 스트렙타비딘 퍼옥시다제(시그마)의 1/4,000 희석액을 동안 실온에서 2 시간 동안 첨가한다. 이 추가의 세척을 수행한 후, 테트라메틸벤지덴(TMB) 기질 용액[36 ㎕ 우레아 과산화 수소(UHPO)(플루카)을 사용하여 pH 6.0로 만든 0.1 M 구연산염/아세트산염 완충제의 용액 10 ㎖ 중의 1TMB 정제(시그마)]을 각 평판에 첨가한다. 2 M 황산을 첨가(웰당 10 ㎕씩 첨가함)하여 반응을 종결시키고, 450 nm에서의 흡광도를 판독하여 펩티드 결합의 양을 정량한다. 흡광도를 농도에 대해 도시함으로써 펩티드의 억제 활성을 얻는다.
정제된 HLA-DR4Dw4는 다음과 같이 얻을 수 있다:
(i) 바큘로비루스 시스템에서 HLA-DR의 발현
바큘로비루스 벡터에 의해 곤충 세포내에서 재조합 단백질을 발현시키는 것은 고수율의 재조합 단백질을 얻는 공지된 절차다[루코브 브이에이 및 섬머스 엠디, Biotechnology, 6, 47-551(1988)]. 단일 재조합 바큘로비루스 벡터(α 쇄 및 β 쇄에 대해 별도의 재조합 비루스를 가지고 있기 때문에 동시-감염시키는 것과는 상반됨)에 의한 헤테로 이량체 HLA-DR, 예를 들면 HLA-DR4Dw4를 발현시키기 위해서는 α쇄 및 β 쇄를 보유하는 이중 재조합 바큘로비루스를 작제해야 한다.
α 폴리펩티드의 서열을 암호화시키는 cDNA를 전달 벡터 pacYM1[마츠우라 와이., 포쎄 알디, 오버톤 에이치에이 및 비숍 디에이치엘, J. Gen. Virol., 68, 1233-1250(1987)]내로 클론시켜 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 단백질을 발현시킨다. 이 단위체를 Sf21 곤충 세포내에서 동종 재조합에 의해 바큘로비루스 게놈 내로 삽입시켜 α쇄에 대한 단일 재조합 바큘로비루스를 형성시킨다. 재조합 비루스의 동종 재조합 및 검출/분리를 위한 곤충 세포의 배양 및 감염 기술은 문헌[ 섬머스, 엠디디 및 스미스 지이 등, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures: Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555(1987)]에 충분히 개시되어 있다. 재조합 벡터를 작제하는데 사용되는 분자 유전자 기술은 문헌상의 내용을 쉽게 이용할 수 있는데, 문헌[삼브룩 제이, 피취 이에프 및 마니아티스 티, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2판. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 가장 잘 개시되어 있다.
이중 재조합 바큘로비루스를 제조하기 위해서, β쇄를 암호화시키는 cDNA를 전달 벡터 pAcUW1[웨이어 유, 나이트 에스 및 포쎄 알디, J. Gen. Virol., 71, 1525-1534(1990)]내로 클론시켜 P10 프로모터의 조절하에 단백질을 발현시킨다. 이어서, 이 단위체를 α쇄를 보유하는 단일 재조합 바큘로비루스의 게놈 내로 삽입시킨다. 이중 재조합 비루스는, 형질 감염 부분으로부터 무작위로 취한 비루스에 의해 감염된 곤충 세포를 막상에 스포팅시키고, 이것과 HLA-DR 헤테로 이량체를 특이적으로 인식하는 단일 클론성 항체(예를 들면, L243)와 반응시킴으로써 검출한다. Sf21 곤충 세포에 대한 항체의 결합성은 문헌상에서 용이하게 이용 가능한 표준 유동 세포계측법을 사용하여 검출한다. HLA-DR을 발현시키는 안정한 이중 재조합 바큘로비루스는 플라크-정제한다.
(ii) 곤충 세포로부터 HLA-DR의 정제
사용된 방법은 문헌[조르가 등, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094(1987)]에 개시된 것의 변형 방법이다. HLA-DR을 발현하는 바큘로비루스/Sf21 세포(10 ℓ, 대략 2×1010세포에 해당함)를, 테프론 유리 균질화기로 10회 스트로크하여 균질화시킴으로써, 5 mM EDTA(나트륨염), 50 mM 트리스-HCl pH 8.5, 2% NP40, 150 nM NaCl, 1 mM 요오도아세트아미드 및 1 mM PMSF의 용액 100 ㎖ 중에 용해시킨다. 균질화물을 1시간 동안 100,000g으로 회전시키고, 상청액을 수거한다. 프로테인-A-세파로스 급유동(파마시아) 10 ㎖에 대해 L243 50 mg의 비율로 공유 결합으로 커플링되어 있는, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.1% NP-40으로 예비-항온 처리한 항-HLA-DR 단일 클론성 항체 LB3.1[조르가 등, Cell. Immunol. 103, 160-172(1986)]을 상청액과 함께 밤새 동안 항온 처리시킨다. 이어서, 수지를 칼럼 내로 붓고, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.1% NP-40(20 컬럼 부피)로 세척한 다음, 이어서 0.15 M NaCl, 50 nM Na2HPO4, pH 7.0, 1% 옥틸글루코시드(20 컬럼 부피)로 세척한다. HLA-DR을 50 mM 디에틸아민 pH 11.0, 0.15 M NaCl, 1% 옥틸글루코시드로 용출시킨다. 컬럼 분획물을 1 M 트리스-HCl, pH 8.0으로 즉시 중화시키고, 센트리콘-10 막을 통해 초원심분리로 농축시킨다. BCA 단백질 분석(피어스)에 의해 단백질 함량을, 그리고 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 순도를 측정한다.
일반적으로, 시험 A에서 시험된 앞서 정의한 바와 같은 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 농도 대략 10μM 또는 그 이하로도 상당한 억제를 나타내었다.
또한, 본 발명의 한 측면은 HLA-DR3에는 결합하지 않지만, HLA-DR1 및/또는 HLA-DR4Dw4 및/또는 HLA-DR4Dw14에 결합하는 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. HLA-DR3은 류마티스양 관절염과 관련이 없는 공통의 HLA-DR 대립 유전자이다. 따라서, 대립 유전자중 하나로서 HLA-DR3을 보유하는 류마티스양 관절염 환자(류마티스양 관절염 환자의 대략 1/3임)에 있어서, 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 숙주-방어 작용중에서 HLA-DR3의 정상적 작용을 저해하지 않는다. 그러므로, 펩티드 유도체를 사용하는 것은, 이 펩티드 유도체가 비선택적인 DR-결합제와 함께 발생하는 면역 억제를 감소시키기 때문에 류마티스양 관절염 환자를 치료하는데 매우 유용하다.
시험 A의 변형 방법으로서, 1종 이상의 HLA-DR 분자에 결합하는 본 발명의 펩티드의 능력을 다음과 같이 평가하였다:
(i) 세포주로부터 HLA-DR 유형의 정제
사용한 방법은 문헌[조르가 등, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094(1987)]에 개시된 것의 변형 방법이었다. 인체 HLA-DR 항원을 면역 친화도 크로마토그래피에 의해 각종 세포주로부터 정제하였다. 요약하여 설명하면, Hom 2(DR1의 공급원), BBF(DR2의 공급원), AVL-B(DR3의 공급원), JAH(DR4Dw4의 공급원), JHAF(DR4Dw13의 공급원) 또는 PE117(DR4Dw14의 공급원)으로부터 선택된 적합한 세포주의 1×109개 내지 5×109개의 펠렛화된 세포를, 대략 4℃에서 테프론 유리 균질화기로 10회 스크로크하여 균질화시킴으로써, 5 mM EDTA(나트륨염), 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 2% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM 요오도아세트아미드 및 1 mM PMSF의 용액 50 ㎖중에 용해시켰다. 균질화물을 1 시간 동안 100,000g으로 회전시키고, 상청액을 수거하였다. CNBr-세파로스 4B(파마시아)에 공유 결합으로 커플링되어 있는 항-HLA-DR 단일 클론성 항체 LB3.1[조르가 등, Cell. Immunol. 103, 160-173(1986)]을 150 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 0.1% NP-40으로 예비-평형시키고, 그 상청액을 밤새 동안 항온 처리하였다. 이어서, 수지를 칼럼 내로 팩킹시키고, 0.15 M NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1% 옥틸글리코시드(20 컬럼 부피)로 세척하였다. HLA-DR을 50 mM 디에틸아민 pH 11.0, 0.15 M NaCl, 1% 옥틸글리코시드로 용출시켰다. 컬럼 분획물을 0.5 M HEPES NaOH, pH 7.4로 즉시 중화시켰다. 비오라드(Biorad) 단백질 분석법에 의해 단백질 함량을, 그리고 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 순도를 측정하였다.
(ii) 펩티드 선택적 결합성 분석
인산염 완충된 염수 용액(PBS)중의 200 nM 비오틴-FHA307-320를, 분석용 완충액(PBS, 0.01% NP40(시그마))중의 억제제 펩티드를 함유하거나 또는 함유하지 않는 V자형-웰 미세 역가판(눙크)에서 정제된 HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4Dw13 또는 DR4Dw14(2 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖)와 함께 항온 처리하였다. DR3 억제의 경우, 400nM 비오틴-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr- Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH를 정제된 DR3(20 ㎍/㎖)과 함께 항온 처리하고, 전술한 바와 같이 항온 처리하였다. 48 시간이 경과한 후, 항온 배양물을 처리하고, 시험 A에 개시된 바와 같이 흡광도를 측정하였다. 펩티드의 억제 활성은 IC50값으로 표시하고, PC용 마이크로칼 오리진 소프트웨어(Microcal Origin Software)를 사용하여 계산하였다.
시험 B:시험관내 T세포 활성의 억제. (이 분석법은 MHC 클래스 II 분자에 의해 또는 이를 통해 매개되는 T세포 면역 반응을 억제시킬 수 있는 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 능력을 입증하는데 사용할 수 있다).
HLA-DR4Dw4 분자에 의해 제공되는 FHA307-320펩티드(H-Pro-Lys-Tyr-Val- Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)에 반응하는 B52.24 쥐 T 세포 하이브리도마주의 자극을 차단하는 능력에 대해 억제 펩티드를 시험하였다. 문헌[우즈 등, J. Exp. Med. 180, 173-181(1994)]에 개시된 바와 같이, BW5147 쥐 T세포 림프종주[화이트 등, J. Immunol. 143, 1822(1989)]를 사용하여 FHA307-320면역화된 HLA-DR4Dw4 변이 마우스(국제 특허 출원 공개 WO95/03331호)로부터 취한 림프절 T 세포를 융합시킨 다음, 문헌[Current Protocols in Immunology, 2권, 7.21]에 개시된 T 세포 하이브리도마의 생성에 대한 일반적인 방법으로 B52.24를 제조하였다.
농도가 100 μM 내지 0.1 μM(또는 그 이하)인 억제 펩티드를, 최종 부피가 100 ㎕인 96-웰 미세 역가 평판(눙크)내의 RPM1-1640 배양 배지(기브코) 중에 희석하여 10 μM 고정 농도로 고정시키거나 또는 100 μM 내지 0.1μM의 농도로 다양하게 한 항원 펩티드 FHA307-320와 혼합시켰다. HLA-DR4Dw4 발현 B 세포, 예를 들면 JAH EBV 형질 전환된 림프아구 세포주(유럽 모식균 배양소 ECACC 85102909), 또는 문헌[Current Protocols in Immunology 7.22.1]에 개시된 방법에 따라 HLA-DR4Dw4 동종 접합체로부터 취하여 엡스텐 바르 비루스에 의해 형질 전환된 B 세포를, 30초 동안 4×106세포/㎖가 되도록 1% 글루테르알데히드(시그마)중에 현탁시킴으로써 글루테르알데히드로 고정시킨 후, 동일한 부피의 200 mM 리신(시그마)을 3분 동안 첨가하였다. 세포를 300 g으로 원심 분리하여 회수하고, RPMI-1640으로 세척한 다음, 항원 및 억제 화합물을 웰당 2×105세포 농도로 함유한 미세 역가판에 첨가하였다. 미세 역가판을 37℃에서 5% CO2로 2 시간 동안 항원 처리하였다.
이어서, 미세 역가판을 300 g에서 원심 분리하여 RPMI-1640 중에서 세척하고, B 25.24 T 세포 하이브리도마주를 첨가하기 전에 배양 배지[RPMI-1640, 10% 태아 소 혈청(기브코) 및 2mM 글루타민(기브코)]중에서 웰당 105세포 농도로 2회 흡입시켰다. 이어서, 미세 역가판을 37℃에서 5% CO2로 2 일 동안 더 항원 처리하였다. 그 후, 상기 판을 300 g으로 10분 동안 원심 분리시키고, IL-2 함량에 대한 생체 분석을 수행하기 전에 모든 웰로부터 수거한 상청액 150 ㎕을 -20℃로 냉동시켰다.
분석하고자 하는 상청액을 함유하는 배양 평판을 실온에 방치하여 해동시킨 다음, 이 상청액 100 ㎖를 새로운 96개의 둥근 바닥 웰 평판으로 이동시켰다. IL-2의 일련의 1:1 희석액을, 배양 배지[(RPMI-1640(기브코), 10% 태아 소 혈청(어드밴스드 프로테인 프로덕츠), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린(기브코), 2 mM L-글루타민(기브코) 및 50 μM 2-머캅토에탄올(시그마)]를 사용하여 제조함으로써, 250 유니트/㎖ 내지 0.04 유니트/㎖인 최종 IL-2의 표준 곡선을 형성시켰다. CTLL-2세포[Nature 268 154-156(1977)] 또는 HT-2 세포[J. Immunol. Methods 94-104(1987)]와 같은 IL-2 의존성 세포주를 수거하고, 5×104세포/㎖로 재현탁시키기 전에 배양 배지를 사용하여 2회 세척하였다. IL-2 의존성 세포 현탁액 100 ㎕를 표준 곡선의 샘플의 웰 및 시험 샘플의 웰에 각각 첨가하였다. 배양 평판을 37℃에서 5% CO2로 72 시간 동안 항온 처리하였다. 이 후, 3H-티미딘(아머샴 인터내쇼날) 20 ㎕(1mCi)를 각각의 웰에 첨가하고, 평판을 다시 항온조에 두어 16 시간 동안 더 항온 처리하였다. 각 평판의 내용물을 유리 섬유 필터 매트상에 수거하고, 방사능 활성을 베타평판 신틸레이션 계수관을 사용하여 측정하였다.
일반적으로, 시험 B에서 시험된 앞서 정의한 바와 같은 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 농도 대략 10 μM 또는 그 이하로도 상당한 억제를 나타내었다.
시험 C:BALB/C 마우스에서 펩티드 자극된 DHT(지연형 민감성). (이 분석법은 동물 모델에서 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 생체내 활성을 입증하는데 사용할 수 있다). 1 군당 5 마리인 Balb/c 암컷 마우스(18 g 내지 20 g)를 완전 프로인트 보조액(시그마)과 1:1로 혼합된 난알부민(시그마)(염수중의 2 ㎎/㎖)의 유화액 0.1 ㎖로 측면상에 피하내 주사로 면역시켰다. 7 일이 경과한 후,이중 캘리퍼 마이크로미터를 사용하여 발바닥 두께를 측정한 다음, 염수중의 1% 가열-응집된 난알부민 단백질의 발바닥내 주사액 30 ㎕로 뒷 발바닥 한쪽에 항원 투여하였다. 항원 투여한 지 24 시간이 경과한 후, 발바닥을 측정하고 반대편 대조군의 발바닥에 비해 주사된 발바닥에서 발바닥 두께의 증가율로 DTH 반응을 계산하였다. 억제제를 10 ㎎/kg/일 내지 0.1 ㎍/kg/일 범위의 투여량으로 항원 투여하기 24 시간 전에 이식된 삼투압 미니-펌프(알제트)에 의해 3 일간 투여하였다. 억제 정도는, 부형제를 사용한 대조군의 발바닥 팽창 값으로부터 억제제를 사용하여 치료한 발다닥의 팽창 값을 뺀 후, 대조군의 팽창 값으로 나눈 다음, 100 %를 곱하여 계산하였다.
일반적으로, 시험 C에서 시험된 앞서 정의한 바와 같은 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는, 명백한 독소 효과 또는 기타 바람직하지 않은 약리학적 효과가 전혀 없이, 1 ㎎/kg/일 또는 그 이하의 양으로도 상당한 억제를 나타내었다.
시험 D:(이 분석법은 관절염을 보유한 동물 모델에서 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체의 생체내 활성을 입증하는데 사용할 수 있다).
Balb/c 암컷 마수스(19 g 내지 21 g, 5 마리∼10 마리/군)을 0일 째에 면역시키고, 7일 째에는 염수중의 메틸화된 소 혈청 알부민(met-BSA, 시그마)과 2.5 mg/㎖ 마이코박테리움 투더콜로시스(Mycobacterium tudercolosis)(MTB, 균주 C, DT 및 PN, MAFF, 웨이브릿지, 서레이)에 의해 보충되어 최종 MFB 농도 3.5 mg/㎖를 제공하는 완전 프로인트 보조액을 각각 2 mg/㎖씩 동일 부피로 함유하는 유화액인 피하내 주사액 0.1 ㎖을 사용하여 추가 자극시킨다. 이와 동시에, 염수중의 109보르델텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 유기체(웰컴 퍼투시스 백신)의 복강내 주사액 0.1 ㎖를 사용하여 추가 투여한다. 14 일이 경과한 후, 30G 바늘과 해밀턴 주사기를 사용하여 염수중의 met-BSA 100 ㎍를 함유하는 관절내 주사액 10 ㎕를 동물의 무릎 관절에 항원 투여한다. 반대쪽 무릎은 동일 부피의 염수를 주사하고 대조군으로 사용한다. 양쪽 무릎과 관련된 염증/팽창의 정도를 이중-캘리퍼 마이크로미터를 사용하여 13 일이 경과한 후에 측정한다. 이것은 단부가 무딘 가위 및 핀셋으로 무릎 위와 아래 대략 5 mm로 피부를 절개한 후, 무릎의 측면을 따라 아래의 관절을 노출시키도록 조심스럽게 절단한 조직편을 형성시킴으로써, 달성된다. 측정 값들은 고정된 위치에 유지된 구부려진 다리에서, 수평 평면상으로 무릎의 가장 넓은 부분을 통해 측정한 것이다. 대조군에 비해 항원-투여된 무릎에서 염증 증가율(%)은 수학식[{(항원 주사된 무릎 두께 - 염수 주사한 무릎 두께)/염수 주사한 무릎 두께}×100]에 의해 계산한다. 억제제를 10 ㎎/kg/일 내지 0.1 ㎍/kg/일의 투여량으로 항원 투여하기 24 시간 전에 이식된 삼투압 미니-펌프(알제트)에 의해 14 일 동안 투여한다. 염증/팽창의 억제율(%)은 부형제를 사용한 대조군 팽창 값으로부터 억제제 치료군의 팽창 값을 뺀 후, 대조군의 팽창 값으로 나눈 다음, 100를 곱하여 계산한다. 추가의 질병 평가는 1) 헤모톡실린(haemotoxylin) 및 에오신으로 염색한 고정된 무릎부에서 수행되는 염증, 활액막염 및 연골/뼈 침식의 조직학적 평가법 및 2) 혈청, 혈청 아밀로이드 P 및/또는 헵토글로빈중 급성상 반응물의 농도 측정법을 포함한다.
앞서 정의한 바와 같은 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 시험 D에서 대략 10 mg/kg/일 또는 이하의 양으로도 상당한 억제를 나타낼 수 있다.
화학식 I로 표시된 특정 펩티드 유도체의 약리학적 활성을 예시 설명한 바에 의하면, 실시예 3 및 실시예 6의 화합물은 시험 A(전술한 시험 A의 변형 방법)에서 농도가 0.1 μM 또는 그 이하인 HLA-DR4Dw4에 상당한 결합성을 나타내었으며, 시험 C에서 〈0.1mg/kg/일에서 활성을 나타내었다. 또한, 실시예 3의 화합물은 HLA-DR4DW4에 상당한 결합성을 나타내었지만, 실시예 3 또는 실시예 6의 화합물은 HLA-DR1, HLA-DR2 또는 HLA-DR3에 상당한 결합성(IC50〉 100 μM)을 전혀 나타내지 못하였다. 또한, 양 실시예의 화합물은 pH 3 및 pH 7.6에서 우수한 수성 안정성을 나타내었으며, 압출된 중합체 데포우(depot) 제제의 형태에서 압출시 분해로 인한 최소 손실과 데포우 제제로부터의 방출시 최소 분해를 나타내었다.
또한, 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 유사 펩티드의 합성에 적용할 수 있는 펩티드 화학 분야에 공지된 모든 방법에 의해 제조할 수 있다.
화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는, 문헌[아더톤 및 쉐파드, " Solid Phase Peptide Synthesis: A practical aprroach"; 옥스포드 유니버시티 프레스의 IRL 프레스에서 출판(1989)]에 개시된 것들과 유사한 절차를 사용하여 얻을 수 있다. 또한, 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 문헌[스튜워트 및 영, " Solid Phase Peptide Synthesis"; 일리노이주 소재의 피어스 케미칼 콤파니에서 출판(1984)], 문헌["Principles of Peptide Synthesis"; 베를린 소재의 스프링거-베르락에 의해 출판(1984)], 및 문헌 시리즈["Amino Acids, Peptides and Proteins"; 1권 내지 25권; 25권은 1994에 출판됨, 영국 캠브리지, 로얄 소사이어티 오브 케미스트리에서 출판]에 개시된 절차를 사용하여 얻을 수도 있다.
화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 고체상 연속적 합성법으로 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 기술을 사용하면, 펩티드의 C-말단 아미노산으로 될 수 있는 아미노산은, α-아미노기에서, 필요한 경우 측쇄에서 보호되며, 고체 지지체, 예를 들면 수지, 예를 들면 절단 후 유리 카르복실산이 필요한 경우 2-클로로트리틸클로라이드 수지나 메리필드(Merrifield) 수지(클로로메틸폴리스티렌-디비닐벤젠), 절단 후 카르복사미드가 필요한 경우 링크 아미드(Rink Amid) 수지[4(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시 수지] 또는 링크 아미드 MBHA 수지[N-(4(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르로이실)-4-메틸 벤즈히드릴아민 수지](2가지 모두 칼바이오켐-노바바이오켐사의 제품임)에 커플링된 후, α아미노기 상의 보호기가 제거된다. C-말단 아미노산에 결합시키고자 하는 아미노산은, α-아미노기에서, 필요한 경우 측쇄에서 보호되며, 고체 지지체상에 결합되어 있는 C-말단 아미노산에 커플링된다. α-아미노 기를 보호 해제시켜 다음의 아미노산에 커플링시키는 단계적 방법을 반복하여 보호되거나 보호 해제된 폴리펩티드를 고체 지지체에 부착시킨다. 화학식 Ⅱ로 표시되는 보호된 아미노산은, 예를 들면 실시예에서 설명되거나 하기 반응식 1에 도시된 바와 같이, 또는 그와 유사한 방법에 의해 화학식 R1R2NH로 표시되는 대칭성 아민 또는 비대칭성 아민 을 사용함으로써 얻을 수 있다. 화학식 R1R2NH로 표시된 아민은, 예를 들면 실시예에서 설명되거나 하기 반응식 2에 도시된 바와 같이, 해당 기술 분야에 알려진 방법 또는 이것과 유사한 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다.
상기 반응식 1 및 반응식 2의 반응 단계들, 예를 들면 알콜 및 아민의 알킬화 반응, 아민 및 카르복실산을 커플링시켜 아미드를 형성시키는 반응, 우레아 및 카르바메이트를 형성시키는 반응, 그리고 보호 반응 및 보호기의 보호 해제 반응을 수행하기 위해 사용되는 시약 및 조건들은 모두 해당 기술 분야에 잘 알려져 있을뿐만 아니라 일반 참고 문헌에 상세히 기술되어 있다. 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ로 표시된 기는, 문헌[J. Med. Chem., 36, 256-263(1993)]에 기재되어 있는 바와 같이, 얻어지는 적당하게 보호된(3-아미노-2-옥소-피롤리딘-1-일)알칸온산(A가 메틸렌인 화학식 Ⅲ을 함유한 펩티드 화합물인 경우) 또는 이에 상응하는 옥사 유사체를 사용하거나, 또는 보호된 아미노산 대신에 (6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]-논-7-일)알칸산(화학식 Ⅳ을 함유한 펩티드 화합물인 경우) 또는 이것의 유사체 (A가 산소인 화학식 Ⅲ을 함유하는 펩티드 화합물인 경우)를 사용함으로써, 서열 내에 결합된다. 화학식 Ⅴ로 표시된 기는, 문헌[J. Med. Chem., 36, 256-263]에 기재되어 있는 바와 같이, 얻어지는 적당하게 보호된 3-아미노-2-옥소퍼히드로아제핀-1-알칸산(또는 이것의 유사체)을 사용함으로써 서열 내로 결합될 수 있다. 보호되거나 또는 보호 해제된 폴리펩티드는 표준적인 절차, 예를 들면 트리플루오로아세트산, 트리에틸실란 및 물의 혼합물을 사용하여 고체 지지체로부터 유리된다.
측쇄 보호기는 고체 지지체로부터 펩티드를 유리시키는데 사용되는 조건 하에서 절단하거나, 또는 고체 지지체로부터 펩티드를 유리시키기 전에 또는 후에 분리 단계로서 절단할 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 형성시키기 위한 절차는 특정 커플링 단계에서 2종 이상의 적합한 아미노산으로 이루어진 서열을 사용함으로써 변형시킬 수 있다. 합성은 수동 기술을 사용하거나 또는 자동 기술, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 431A 또는 430A 단백질 합성기, 어드밴스드 케미테크(Advanced Chemitech) ACT357 단백질 합성기 또는 유사 자동 펩티드 합성기 또는 상기 양 기술의 조합물을 사용할 수 있다.
펩티드의 조합 과정에서, 반응에 참여하지 않는 아미노산 작용기는 각종 작용기에 의해 보호된다. 예를 들면, N-말단 및 측쇄 아미노기는, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), t-부톡시카르보닐(Boc), 비페닐이소프로폭시카르보닐(Bpoc), 2-[3,5-디메톡시페닐]프로필-2-옥시카르보닐(Ddz), 아다만틸옥시카르보닐(Adoc), 알킬옥시카르보닐(Aloc), 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐(Troc), 벤질옥시카르보닐 및 각종 치환된 벤질옥시카르보닐기를 사용하여 보호할 수 있다. 이들 보호기는 필요한 경우에 표준 기술(산 처리 또는 염기 처리, 접촉 수소 첨가 분해 및 Pd(O) 처리 또는 아연/아세트산 처리)에 의해 절단할 수 있다.
아르기닌 잔기를 함유한 펩티드에서 측쇄 구아니디노 기를 보호하기 위해 사용되는 적합한 보호기로는 니트로, 아다만틸옥시카르보닐, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐(Mtr), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 및 (특별하게는) 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf)기를 들 수 있다.
측쇄 히드록시기를 보호하기 위해 사용되는 적합한 보호기로는 t-부틸, 벤질 및 트리틸(Trt)을 들 수 있다. 히스티딘 잔기를 함유한 펩티드에서 측쇄 이미다졸기를 보호하기 위해 사용되는 적합한 보호기로는 트리틸, 벤질, 토실, 디니트로페닐, Adoc, Boc 또는 Fmoc기를 들 수 있다.
측쇄 카르복실기를 보호하기 위해 사용되는 적합한 보호기로는 각종 에스테르(예를 들면, 메틸, 에틸, t-부틸, 벤질, 니트로벤질, 알릴 및 9-플루오레닐메틸)를 들 수 있다.
보호기 절단 반응은 4℃ 내지 40℃(바람직하게는 대략 주위 온도 도는 그 이상의 온도)의 온도에서 10 분 내지 24 시간 동안 수행할 수 있다.
개개의 아미노산을 커플링시키기 위해 사용되는 적합한 커플링 방법으로는 보통 사용되는 아지드, 대칭형 무수물, 혼합된 무수물 및 각종 활성 에스테르와 카르보디이미드를 들 수 있다. 각종 카르보디이미드(예를 들면, 디시클로헥실-카르보디이미드 또는 디이소프로필-카르보디이미드)의 경우, 다수의 첨가제(예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 및 N-히드록시숙신이미드)를 첨가할 수도 있다. 또한, 아미노산 커플링은 다수의 기타 시약, 예를 들면 1H-벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU) 및 (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(HBTU)를 사용함으로써, 달성할 수 있다. 커플링 반응은 -20℃ 내지 40℃의 온도에서 10분 내지 24 시간 동안에 걸쳐 수행할 수 있다. 커플링 반응을 수행하기 위한 적합한 매체의 예로는, N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 들 수 있다. 특히 적합한 방법은 DMF중의 HBTU, HOBT 및 디이소프로필에틸아민을 사용하는 것을 포함한다.
펩티드를 합성하는 상기 방법 또는 기타 방법은 본 명세서에서 참고 인용한 국제 특허 출원 등에 예시되어 있다. 화학식 R-, R.CO-, R.SO2-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- 및 R.CS-의 기(또는 P의 말단 아미노기상에 치환체로서 존재하는 기, 여기서 P는 소수성 아미노산 또는 추가의 아미노산기를 함유한 소수성 아미노산임)인 소수성 잔기 P는, 예를 들면 알킬화, 아실화 또는 말단 아미노기의 기타 표준 작용기 변형에 의해 최종 단계에서 결합할 수 있다. C-말단 변형이 필요한 경우(Q의 구체적인 예를 얻기 위해서), C-말단 변형은 펩티드를 합성한 후에, 통상적인 작용기 변형을 사용하여 수행할 수 있다. 대안적으로, Q의 구체적인 예는 초기 출발 수지 및/또는 수지에 먼저 커플링된 보호체를 적절하게 선택함으로써(예를 들면, 화학식 H-Q의 적절하게 보호된 기를 사용함) 얻을 수 있다. 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 제조의 전형적인 예들은 후술하는 실시예에서 제공된다.
본 발명의 펩티드 유도체의 안정성을 측정하는 전형적인 절차는, 다음과 같이, 미생물 오염 및 분해를 최소화하기 위해서, 펩티드 용액을 제조하는데 사용되는 모든 장비를 오토클레이브에서 멸균시키고, 모든 재료의 이동을 클래스 II 층류 캐비닛에서 수행한다. 0.02% 나트륨 아지드를 함유한 pH 3 또는 pH 7.6의 맥일반스 구연산-인산염 완충 용액 대략 20 ㎖를 무균 0.22 ㎛ 필터 유니트 및 20 ㎖ 주사기를 사용하여 50 ㎖ 병내로 여과시킨다. 펩티드 대략 1.2 mg을 마개가 있는 병에 넣은 상태로 정확히 평량한다. 무균 피펫 팁을 사용하여, 충분한 양의 완충액을 병내의 펩티드에 첨가하여 펩티드 농도를 0.1 mg/㎖로 만든다. 병에 마개를 하고, 진탕시켜 펩티드를 용해시킨다. 무균 피펫 팁을 사용하여, 대략 펩티드 용액 1 ㎖인 분액을 10 개의 HPLC 병으로 이동시킨 후, 병에 마개를 한다. 5 개의 병을 -18℃와 37℃에서 저장한다. 용액에 대한 펩티드 피크 면적을, 초기에는 적합한 표준 물질을 사용하고, 나중에는 -18℃ 및 37℃에서 1, 2, 3 및 4 주 동안 저장한 각 시점에서 새로운 병을 사용하여 이중 시료 주입법으로 HPLC에 의해 측정한다. 각 시점에서 37℃ 저장 후에 남아있는 펩티드의 백분율은 초기 면적에 대한 각 시점에서의 펩티드 피크의 면적비로 측정한다. 본 발명의 바람직한 펩티드 유도체는 37℃에서 pH 3과 pH 7.6으로 저장한 후에 잔존하는 펩티드가 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상이다.
일반적으로, 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 약학 기술 분야에 알려져 있는 바와 같이, 약학 조성물의 형태로 치료를 요하는 항온 동물(인간 포함)에게 치료 또는 예방 목적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 경구용으로 적합한 형태, 예를 들면 정제, 캡슐, 수용액 또는 오일 용액, 현탁액 또는 유화액; 비강용으로 적합한 형태, 예를 들면 후제, 비측 스프레이 또는 점비약; 질 또는 직장용으로 적합한 형태, 예를 들면 좌약; 흡입 투여용으로 적합한 형태, 예를 들면 미세한 분말 또는 액상 에어로졸; 설하용 또는 협측용으로 적합한 형태, 예를 들면 정제 또는 캡슐; 또는 비경구용(정맥내, 피하내, 근육내, 혈관내 또는 주입)으로 적합한 형태, 예를 들면 무균 수용액 또는 오일 용액이나 현탁액 등일 수 있다. 조성물은 국부 투여용으로 적합한 형태, 크림, 연고 및 젤일 수 있다. 또한, 피부 패취도 가능하다. 일반적으로, 제제는 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry의 25.2장, Vol. 5, 한쉬 등 편저, Pergamon Press(1990)]에 개시되어 있다.
일반적으로, 상기 조성물은 통상적인 부형제를 사용하여 종래의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 경구 투여용 조성물의 경우, 조성물은 위에서 효소 활성으로부터 펩티드 활성 성분을 보호할 수 있는 코팅물을 포함하는 것이 편리할 수 있다.
바람직한 본 발명의 조성물은, 각 단위 투여량 중에 2.5 mg 내지 500 mg, 바람직하게는 10 mg 내지 100 mg의 폴리펩티드를 함유하는 단위 복용 형태, 예를 들면 정제 또는 캡슐로 경구 투여에 적합한 조성물 또는 용액 1 ㎖당 0.5 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 1 mg 내지 10 mg의 폴리펩티드를 함유하는 단위 형태로 비경구 투여에 적합한 조성물이다.
비경구 투여용 조성물은 필요한 경우 pH 5 내지 pH 9로 완충된 등장 염수 또는 등장 덱스트로스중의 용액인 것이 바람직하다. 대안적으로, 비경구용 조성물은 단위 투여량당 폴리펩티드의 양이 종래의 주입 제제를 사용할 때 요구되는 양보다 보통 더 많은 경우 서방성 제제로 고안된 것일 수 있다. 바람직한 서방성 제제는 연속적인 방출 제제, 예를 들면 유럽 특허 출원 제58481호에 개시된 형태의 제제, 또는 1종 이상의 염기성 기를 함유하는 화학식 I로 표시된 펩티드의 경우 국제 특허 출원 공개 번호 WO93/24150에 개시된 바와 같은 제제일 수 있다. 본 발명의 특정 펩티드는, 비경구용 서방성 제제, 특히 구체적으로, 폴리락티스와 같은 생체분해성 폴리에스테르를 함유한 제제를 제조 및 가공하고, 서방성 제제에 이로운 방출 프로필을 제공하는데 매우 적합한 용해도 특성을 보유하고 있다. 또한, 1종 이상의 염기성 기, 구체적으로 아르기닌을 함유한 본 발명의 펩티드는 산-말단화된 폴리에스테르와 펩티드-중합체 염, 예를 들면 폴리락티드를 형성할 수 있으며, 이러한 펩티드 및 펩티드-중합체 염은 본 발명의 추가의 특징을 구성한다. 이러한 특정 염은, 예를 들면 WO93/24150에 개시된 바와 같이, 비경구용 서방성 제제를 제조 및 가공하고, 서방성 제제에 이로운 방출 프로필과 저장 안정성을 제공하는데 매우 적합한 용해도 특성을 제공한다. 바람직한 서방성 제제는 단위 투여량당 폴리펩티드 1 mg 내지 100 mg(예를 들면, 5 mg 내지 50 mg)을 함유한다. 또한, 바람직한 비경구용 서방성 제제는 5일 이상 동안 천천히 방출되도록 고안된 것이다.
바람직한 본 발명의 펩티드 유도체는 압출 중합체 데포우 제제의 형태인 경우 데포우 제제로부터 방출시 최소의 분해를 나타내거나 압출시 분해에 의한 최소의 손실을 나타내는 것들을 포함한다. 본 발명의 펩티드의 분해 정도를 측정하기 위한 전형적인 방법은 다음과 같다:
펩티드를 함유한 압출된 중합체 데포우 제제의 제조
펩티드 대략 20 mg을 정확하게 평량하고, 충분한 양의 중합체[중량 평균 분자량이 약 20kD이고, 다분산성이 폴리스티렌 표준 물질에 대한 크기 배제 크로마토그래피로 측정할 때 대략 1.7인 50/50 몰% 폴리(D,L-락트산/글리콜산)공중합체]를 첨가하여 대략 20% w/w 혼합물을 생성시킨다. 이것을 무수물이 없는 빙초산에 용해시켜 대략 10% w/v 용액을 형성시킨다. 이 용액을 동결 건조시키고, 형성된 동결 건조 생성물을 사용하기 전에 진공하에 저장한다.
동결 건조된 물질 약 100 mg을 실험실용 소형 압출기 배럴에 적재하고, 피스톤으로 압착하여 샘플을 고화시킨다. 압출기를 90℃ 내지 95℃로 가열하고, 상기 온도로 10분 동안 유지한 다음, 동결 건조 물질을 압력 하에 압출시켜 직경이 대략 1 mm인 원통 형상의 압출물을 얻는다.
펩티드를 함유한 압출된 중합체 데포우 제제의 펩티드 함량 분석
펩티드를 함유하는 길이가 약 5 mm인 2개의 압출된 중합체 데포우를 정확하게 평량하고, 각각 별도의 25 ㎖ 부피 플라스크에서 무수물이 없는 빙초산 1 ㎖중에 용해시킨다. 약 1.5 시간이 경과한 후, 각각의 부피를 증류수를 사용하여 25 ㎖로 만들어 중합체를 침전시킨다. 고형분을 0.5 μM 밀렉스 PTFE 필터에 여과시켜 제거하고, 용액 A를 수거한다.
일련의 표준 용액은, 다음과 같이, 증류수중의 펩티드 원료 용액으로부터 0.5 mg/㎖를, 무수물이 없는 빙초산중의 중합체 원료 용액으로부터 2.5 mg/㎖를 각각 분취하고, 이들 각 용액을 증류수로 10 ㎖가 되게 만든다.
펩티드 농도(㎍/㎖) 원료 중합체 용액 부피(㎕) 원료 폡티드 용액의 부피(㎕)
50 1000 1000
40 1000 800
30 1000 600
20 1000 400
10 1000 200
5 1000 100
0 1000 0
각 표준 용액을 5 μm 밀렉스 PTFE 필터를 통해 여과시키고, 여과물의 분액을 용액 A의 분액과 함께 이중 시료 주입법을 사용하여 HPLC에 의해 분석한다. 펩티드의 압출된 중합체 데포우 제제의 펩티드 함량은 용액 A내 펩티드의 농도로 계산하는데, 이 농도는 용액 A내 펩티드 피크의 면적을 표준 용액으로부터 얻은 펩티드 피크 면적과 비교함으로써 측정된다. 바람직한 본 발명의 펩티드는 압출시 분해로 인한 손실을 최소화시키기 때문에 압출된 중합체 데포우 제제의 펩티드 함량을 이론 값 대략 20% w/w에 근접시킨다.
압출된 중합체 데포우로부터의 시험관내 방출시 펩티드 분해
0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 pH 7.6의 맥일반 구연산-인산염 완충액을 0.22 μ 필터를 통해 여과시키고, 4℃에서 저장한다. 펩티드 대략 10 mg을 함유하는 압출된 중합체 데포우를 2개의 작은 병에 넣고, 완충액 2 ㎖를 첨가한다. 이어서 병을 마개로 막고, 1개월 동안 37℃의 수욕에 저장한다. 1 개월이 경과한 후 적합한 시기에, 3개의 방출 매체 분액 0.6 ㎖를 각 병으로부터 수거하여, HPLC로 분석하거나 HPLC로 분석하기 전에 -18℃의 HPLC 병에 냉동 저장한다. 완충 용액 1.8 ㎖를, 데포우를 함유한 각각의 병에 첨가하여 각 시점에서 제거되는 방출 매체를 대체시킨다.
각 시점에서 방출 매체중의 손상되지 않은 펩티드의 평균 양은 이중 시료 주입법을 사용하여 방출 매체에서 얻은 펩티드 피크 면적을 공지된 농도의 펩티드 표준 완충액으로부터 얻은 펩티드 피크 면적과 비교하여 HPLC에 의해 측정한다. 각 시점에서 방출 매체의 펩티드 분해 생성물의 대략적인 평균 양은 방출 매체중의 새로운 추가 피크 면적을 공지된 농도의 펩티드 표준 완충액으로부터 얻은 펩티드 피크 면적과 비교함으로써, 흡광 계수가 변하지 않는다는 가정하에 HPLC에 의해 측정한다. 손상되지 않은 펩티드와 총 펩티드(손상되지 않은 펩티드와 펩티드 분해 생성물)의 시험관내 방출 프로필 상에서 평균 누적량은 각 시점에서 방출 매체중의 손상되지 않은 펩티드의 양과 펩티드 분해 생성물의 양으로부터 측정한다. 바람직한 본 발명의 펩티드는 시험관내에서 방출시 최소 분해를 나타냄으로써, 시험관내에서 방출시 1 개월이 경과한 후 pH 7.6 및 37℃에서 맥일반스 완충액 내로 총 펩티드중의 총 펩티드 분해 생성물을 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하로 나타낸다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 사람에게, 예를 들면 체중 70kg의 환자의 경우 1일 투여량이 10 ㎍ 내지 5000 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 100 mg이 되도록 투여하며, 필요할 경우에는 분할하여 투여한다. 투여되는 조성물의 정확한 양과 투여 경로 및 투여 형태는, 의료 분야에 알려진 일반 원리에 따라, 치료할 사람의 체격, 연령 및 성별, 치료하고자 하는 특정 질병 또는 의학적 증상 및 이들의 경중에 의해 좌우된다.
화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염은, 전술한 1종 이상의 질병 또는 의학적 증상의 징후들을 치료하거나 또는 경감시키는데 유용한 것으로 해당 기술 분야에 일반적으로 알려진 1종 이상의 기타 약물(또는 질병 완화제), 예를 들면 NSAID(예를 들면, 이부프로펜 또는 피록시캄), 진통제(예를 들면, 파라세타몰), 코르티코스테로이드, 근육 이완제, 리폭시게나아제 억제제, 메토트렉세이트, 아자티오프린, D-페니실아민, 시클로스포린 A 또는 단일 클론성 항체 치료제(예를 들면, 항-CD4 또는 항-TNF)와 함께 치료용 또는 예방용으로 투여하는 것이 방출할 수 있다. 당뇨병에서, 펩티드 유도체는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 치료하기 위한 인슐린 또는 기타 치료제(예, 알도스 리덕타제 억제제)와 함께 투여할 수 있다. 이러한 조합 치료법은 본 발명의 또 다른 특징을 구성한다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명은 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가 면역 또는 염증성 질병, 예를 들면 본 명세서에 기술되어 있는 1종 이상의 질병 또는 의학적 증상을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효량으로 그러한 치료가 필요한 항온 동물(인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 측면에 있어서, 또한 본 발명은 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가 면역 또는 염증성 질병의 치료에 사용하기 위한 신규 약제를 제조하는데 화학식 I로 표시된 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 이용하는 방법을 제공한다.
인체를 치료하는 약제로서의 용도외에, 또한 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체는 상업적으로 유용한 항온 동물, 예를 들면 개, 고양이, 말 및 소에 영향을 미치는 유사한 증상에 대한 수의학적 치료에도 유용하다.
일반적으로, 이러한 치료를 위해서는 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체를 인간에게 투여한 것과 유사한 양 및 방식으로 투여한다. 또한, 화학식 Ⅰ의 펩티드 유도체는 실험실용 동물, 예를 들면 고양이, 개, 토끼, 원숭이, 래트 및 마우스내에서 MHC 클래스 II 분자가 미치는 영향을 평가하기 위한 시험 시스템의 개발 및 표준화에 있어서 약리학적 도구로서, 신규하고 개선된 치료제를 계속적으로 찾기 위한 일부로서 또는 진단용 제제의 일부로서 유용하다.
본 발명은 후술하는 실시예에 의해 예시되지만 이에 국한되는 것은 아니고, 특별한 언급이 없으면 다음과 같은 조건을 사용하였다:
(i) 농축 및 증발은 진공 하에서 회전식 증발기에 의해 수행하였다.
(ii) 조작은 실온, 즉 18℃∼26℃에서 수행하였다.
(iii)수율은, 기재할 경우, 반드시 세밀한 공정 진행에 의해 얻을 수 있는 최대 수율인 것은 아니며, 단지 독자에 도움을 주기 위한 정도로만 기재하였다.
(iv) 다음과 같은 약어를 사용하였다(반응식 1 및 반응식 2):
Phv= 5-페닐발레릴; Boc= tert-부톡시카르보닐; tBu= tert-부틸; DMF= N,N-디메틸포름아미드; HOBT=1-히드록시-벤조트리아졸; Met= 메티오닌; Fmoc= 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; Fmoc-Pip-OH= N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)피페리딘-4-카르복실산; Fmoc-Papa-OH= 4-[N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)아미노]페닐아세트산; Z 또는 CbZ= 벤질옥시카르보닐; Pmc= 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐; Pbf= 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐; Trt= 트리틸; THF= 테트라히드로푸란; DMSO= 디메틸설폭시드; HBTU=2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트; DIPEA= 디이소프로필에틸아민; TFA= 트리플루오로아세트산; HPLC= 고압 액체 크로마토그래피; 및 RP-HPLC= 역상 고압 액체 크로마토그래피(기타 언급이 없으면, Vydac C18 칼럼 218TP54, 4.6 mm × 250 mm에서 수행함);
(v) 실리카상의 섬광 크로마토그래피 및 크로마토그래피는 메르크 키이젤겔(Merck Kieselgel) 60(제품 번호 9385; 독일 다름슈타트에 소재하는 메르크사의 제품)에서 수행하였다;
(vi) H1NMR 스펙트럼은 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 사용하여 CDCL3또는 d6-디메틸설폭시드(d6-DMSO)중에서 200Mhz하에 측정하였고, 화학적 이동(델타)값을 TMS에 대한 ppm으로 표시하였으며, 주요 피크에 대해서 다음과 같은 통상적인 약어를 사용하였다(s, 단일 피크; m, 다중 피크; t, 3중 피크; br, 피크의 폭이 넓음; d 이중 피크);
(vii) 다음과 같은 Fmoc-보호된 아미노산은 Lys, Thr, Arg 또는 His 잔기를 도입시키는데 사용하였다;
Lys의 경우: Fmoc-Lys(Boc)-OH; Thr의 경우: Fmoc-Thr(OBu)-OH; Arg의 경우: Fmoc-Arg(Pmc)-OH 또는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH; 및 His의 경우: Fmoc-His(Trt)-OH;
(viii) 화학식중에서, 상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 L-아미노산 잔기인 것을 의미한다(n, R1및 R2에 대한 구체적인 예가 주어짐); 및
(ix) 화학식 중에서, -Ⅲa-는 상기 화학식 Ⅲa로 표시된 기임을 의미한다.
실시예 1
Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH 2 (서열 번호 1)의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH20CH3)
1.1 N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)-L-아스파라긴의 제조
(a) 1-브로모-2-(2-메톡시에톡시)에탄(30 g)을, 테트라히드로푸란(100 ml) 중의 N-벤질디에탄올아민(10 g)의 교반된 용액에 질소 하에 첨가하였다. 이어서, 나트륨 히드라이드(미네랄 오일 중의 60% 분산액 5.3 g)를 조금씩 첨가하고, 이와 동시에 수조에서 냉각시켰다. 첨가를 끝마친 후, 그 혼합물을 2 시간 동안 교반하고, 나트륨 히드라이드(미네랄 오일 중의 60% 분산액 4.4 g)를 조금씩 더 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 물(50 ml)을 반응 혼합물에 유의하여 첨가하여 과량의 나트륨 히드라이드를 소실시키고, 혼합물을 증발시켜 유기 용매를 제거하였다. 잔류물에 물(100 ml)을 첨가하고, 그 혼합물을 진한 염산에 의해 약 pH 2로 산성화시킨 후, 디에틸 에테르(2 × 150 ml)를 사용하여 추출하였다. 추출물을 버렸다. 이어서, 수층을 진한 수산화나트륨 용액을 첨가하여 약 pH 12로 조정하고, 디에틸 에테르(2 × 150 ml)를 사용하여 추출하였다. 에테르 추출물을 혼합하고, 염수로 세척한 다음, MgSO4로 건조시킨 후, 증발 건조시켰다. 잔류물을 클로로포름에서 진한 수성 암모니아에 의해 포화된 5% 메탄올/클로로포름으로 증가시키는 구배를 사용하여 실리카 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적당한 분획물을 수집하고, 증발 건조시켜 검(gum; 12 g)을 생성시켰다. 메탄올(100 ml)을 첨가하고, 이어서 카본 상의 10% 팔라듐(2.5 g)과 암모늄 포르메이트(7.2 g)를 첨가한 다음, 이 혼합물을 질소 하에 60℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 냉각시키고, 여과한 다음, 증발 건조시켰다. 잔류물을 클로로포름에서 진한 수성 암모니아에 의해 포화된 10% 메탄올/클로로포름으로 증가시키는 구배를 사용하여 실리카 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적당한 분획물을 수집하고, 혼합하여 증발 건조시킴으로써, N,N-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)아민을 검(7.1 g)으로서 얻었; NMR(CDCl3): 2.8(m, 4H), 3.3(s, 6H), 3.45(m, 4H), 3.6(m, 16H).
(b) N-메틸모르폴린(1.6 g), N-tert-부틸옥시카르보닐-L-아스파르트산 α-벤질 에스테르(2.6 g), 히드록시벤즈다트리아졸(2.16 g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(1.68 g)을 교반하면서 디메틸포름아미드(12 ml) 중의 N,N-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)아민(2.5 g)에 첨가하였다. 이 혼합물을 16 시간 동안 교반한 후, 물(50 ml) 중의 2% 아세트산에 첨가하였다. 혼합물을 디에틸 에테르(2 × 50 ml)로 추출하고, 혼합된 유기 추출물을 중탄산나트륨 용액으로 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 휘발성 물질을 증발에 의해 제거함으로써, N2-tert-부틸옥시카르보닐-N4,N4-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)-L-아스파라긴 α-벤질에스테르를 검(2.8 g)으로서 얻었다; NMR(CDCl3): 1.4(s, 9H), 2.9(m, 1H), 3.2(m, 1H), 3.4(s, 6H), 3.6(m, 24H), 4.6(m, 1H), 5.2(q, 2H), 5.8(d, 1H), 7.4(s, 5H).
(c) 카본 상의 10% 팔라듐(0.8 g)과 시클로헥센(1.6 g)을 메탄올(20 ml) 중의 N2-tert-부틸옥시카르보닐-N4,N4-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]-에틸)-L-아스파라긴 α-벤질에스테르(2.6 g)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 55℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 이어서, 혼합물을 냉각시키고, 여과시킨 다음 증발시켰다. 잔류물에 아세톤(200 ml)과 물(8 ml)을 첨가하고, 이어서 진한 염산(2 ml)을 첨가하였다. 이 혼합물을 55℃에서 1 시간 동안 가열하고, 냉각시킨 다음, 과량의 고체 중탄산나트륨을 사용하여 약 pH 7로 조정하였다. 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카보네이트(1.36 g)을 첨가하고, 이 혼합물을 16 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 물(25 ml)과 디에틸 에테르(50 ml) 사이에 분배시켰다. 수층을 분리하고, 진한 염산을 사용하여 약 pH 3으로 산성화시켰다. 이어서, 혼합물을 디클로로메탄(50 ml)으로 추출하였다. 이 유기 추출물을 물로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 증발 건조시킴으로써, N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)-L-아스파라긴[이후 Fmoc-Asp(PE)-OH로 표기함]을 검(2 g)으로서 얻었다; NMR(CDCl3): 2.8(q, 1H), 3.4(q, 1H), 3.4(s, 6H), 3.6(m, 24H), 4.2-4.6(m, 4H), 6.3(d, 1H), 7.4(m, 4H), 7.6(m, 2H), 7.8(d, 2H).
1.2 Phv-Ala-Ala-Ala-II-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH 2 의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH20CH3)
펩티드는, 본드 엘류트(Bond Elut) 튜브[베리엔(Varian), 15 ml, 바닥부의 필터를 이용하여 여과시킴]를 사용하여 자동 합성과 수동 합성의 혼합 방법으로 Fmoc 링크 아미드 MBHA 레진(Fmoc Rink Amide MBHA Resin)(노바바이오켐, 0.50 g; 0.25 mmole)를 출발 물질로 하는 Fmoc 고체상 합성에 의해 제조하였다.
우선, Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-Resin은 수지를 보호 해제하고, 이어서 Fmoc-Pip-OH(353 mg, 1 mmol) Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol) 및 Fmoc-Val-OH(339 mg, 1 mmol)와 연속적으로 커플링시킨 후 보호 해제한 다음, 제조자가 의도한 조건 하에서 하기와 같이 HBTU/HOBT 화학적 작용을 포함하는 단일의 아실화 반응들을 수행함으로써, ABI 431 자동 펩티드 합성기를 사용하여 얻었다. 보호 해제시킨 후, 수지를 DMF(10 × 10 ml 내지 20 ml)로 세척시켰다. 수지에 전이시키기 전에, 카르복실산(1 mmol)을 DMF 중에서 HBTU(1 당량), HOBT(1 당량) 및 DIPEA(2 당량)로 대략 11 시간 동안 활성화시켰다. 아실화 반응을 대략 60 분 동안 수행한 후, 수지를 DMF(10 × 10 ml 내지 20 ml)로 세척하였다. 각 단계에서의 Fmoc 보호 해제는 DMF 중의 피페리딘의 20% 용액을 사용하여 수행하였다(각각 10 분 동안 5 ml씩 사용하여 2회 처리함). 각각 보호 해제시킨 후, 수지를 DMF(5 × 10 ml)로 충분히 세척하였다.
서열 상의 나머지 잔기를 연속적으로 수동에 의해 커플링시킨 후 보호 해제하였다. 커플링은 적당한 Fmoc-보호된 아미노산(1 mmol), DMF(1.5 ml), HOBT(165 mg, 1 mmol) 및 디이소프로필카르보디이미드(155 ㎕, 1 mmol)의 용액을 수지에 첨가함으로써 수행하였다. 커플링을 대략 30 분 동안 그대로 방치한 후, DMF(5 × 10 ml)으로 세척하고, 소량의 수지를 취해 카이저 시험(Kaiser Test)[이. 카이저 등(1970), Anal. Biochem. 34, 595(1970)]을 이용하여 커플링의 완결을 확인하였다. 보호 해제는 전술한 바와 같이 수행하였다. 이와 같은 방식으로, Fmoc-Asp(PE)-OH(323 mg, 0.50 mmol), Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol) 및 5-페닐발레린산(178 ml, 1 mmol)을 연속적으로 수지에 커플링시켰다. 페닐발레린산은 카이저 시험에 의한 양성 결과를 얻기 위해 2쌍이 필요하다.
펩티드를 수지로부터 플루오로아세트산(7.9 ml)과 트리에틸실란(0.395 ml)의 혼합물을 사용하여 절단하였다. 2 시간이 경과한 후, 수지를 디클로로메탄(대략 150 ml)으로 세척하고, 형성된 용액을 증발 건조시켰다. 형성된 고형분을 에테르(25 ml)와 물(25 ml) 사이에 분배시킨 후, 에테르를 물(2 × 25 ml)로 추출시켰다. 수상을 혼합하여 동결 건조시켰다.
미정제 생성물은 20% 아세토니트릴/물 10 ml 중의 미정제 생성물을 적재한 분취용 PR-HPLC(Vydac 218 TP1022 칼럼, 250 mm × 22 mm)를 사용하여 정제하였다. 용출은 유속 12 ml/분으로 0.1% TFA를 함유한 아세토니트릴-물의 구배를 사용하여 수행하였다. 생성물을 함유한 분획물들을 혼합하고, 동결 건조시킴으로써 Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(식 중, Ⅱ는 화학식 Ⅱ의 L-아미노산의 잔기이고, n= 1이며, X= 카르보닐이고, R1= R2= -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3임)을 백색 고체(83 mg)로서 얻었다.
생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(Vydac C18 칼럼, 218TP54, 4.6 mm × 250 mm, 0.1% TFA를 함유한 아세토니트릴/물을 사용하여 용출시킴, 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 30 분에 걸쳐 수행함, 유속 1.0 ml/분)에 의하면, 순도가 94%이었고, 체류 시간은 23.39 분이었다.
질량 분광 분석에 의하면, m/e(ES+)가 1220.7(MH+)이었다.
아미노산 분석(1% 페놀을 함유한 6 N HCl의 용액을 사용하여 130℃에서 24 시간에 걸쳐 가수분해를 수행함)에 의하면, Ala 5.82, Val 0.98 및 Asp 1.19를 나타내었다.
Fmoc-Pip-OH를 N-Fmoc-L-메티오닌인 경우에 대한 문헌[이. 아더톤 및 알. 씨. 쉐퍼드("Solid phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, page 51)]에서 설명한 것과 유사한 방법에 의해 얻었다: Fmoc-Pip-OH: NMR(DMSO-d6) 1.3(m, 2H), 1.7(m, 2H), 2.5(m, 2H), 2.9(t, 2H), 3.7(m, 1H), 4.2(t,1H), 4.4(d, 2H), 7.4(m, 4H), 7.7(d, 2H), 7.9(d, 2H); 질량 분광 분석 m/e(ES+) 352.2(MH+).
실시예 2
Phv-Ⅱ-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH 2 (서열 번호:2)의 제조
(화학식 Ⅱ: n = 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)
합성은 Fmoc-Lys(Boc)-OH(468 mg, 1 mmol), Fmoc-Ala-OH(311 mg), Fmoc-Ala-OH(311 mg, 1 mmol), Fmoc-Asp(PE)-OH(323 mg, 0.5 mmol) 및 5-페닐발레린산(178 mg, 1 mmol)을 연속적으로 Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-Resin(수동 커플링을 사용하여 얻은 것임)에 커플링(수동에 의함)시킴으로써, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 펩티드를 수지로부터 절단시키고, 미정제 생성물을 실시예 1에서 설명한 것들과 유사한 조건을 사용하여 정제하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면, 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(30 분에 걸쳐 수행되는 20% 내지 50% 아세토니트릴 구배, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 16.4 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 1277.8(MH+).
아미노산 분석; Asp 1.07, Lys 1.05, Ala 4.9, Val 0.92.
실시예 3
Phv-Ala-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH 2 (서열 번호: 3)의 제조
(화학식 Ⅱ: n =1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CON(CH2CH2OCH3)2)
3.1 N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸]-L-아스파라긴의 제조
(a) N-메틸모르폴린(2 g), 히드록시벤조트리아졸(4 g), 비스(2-메톡시에틸)아민(3.5 g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(3.8 g)을 디메틸포름아미드(15 ml) 중의 N-(벤질옥시카르보닐)이미노디아세트산(2.7 g)에 첨가하고, 이 혼합물을 16 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 물과 디클로로메탄 사이에 분배시켰다. 유기 추출물을 물로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음 증발시켰다. 그 잔류물을 클로로포름에서 10% 메탄올/클로로포름으로 증가하는 구배를 사용하는 실리카 상의 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, N-(벤조일옥시카르보닐)이미노디-[N,N-비스(2-메톡시에틸)]아세트아미드를 검(2.3 g)으로서 얻었다; NMR(d6-DMSO): 3.1-3.4(회전이성질체(rotamer)에 의한 4개의 단일 피크, 12H), 3.5(m, 16H), 4.2(s, 4H), 5.05(s, 2H), 7.3(m, 5H).
(b) 카본 상의 10% 팔라듐(0.2 g) 및 시클로헥센(2 ml)을 에탄올(20 ml) 중의 N-(벤질옥시카르보닐)이미노디-[N,N-비스(2-메톡시에틸)]아세트아미드(3.5 g)에 첨가하고, 이 혼합물을 질소 하에 4 시간 동안 55℃에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 냉각시키고, 여과한 다음 증발시켰다. N-메틸모르폴린(1.4 g), 히드록시벤조트리아졸(1.85 g), N-tert-부틸옥시카르보닐-L-아스파르트산 α-벤질 에스테르(2.4 g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(1.6 g)을 교반하면서 디메틸포름아미드(15 ml) 중의 잔류물의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 16 시간 동안 교반한 후, 물(5 ml) 중의 2% 아세트산에 첨가하고, 디에틸 에테르(2 × 50 ml)로 추출시켰다. 유기 추출물을 합쳐서 중탄산나트륨 용액으로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음 증발시킴으로써, N2-tert-부톡시카르보닐-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸)-L-아스파라긴 α-벤질에스테르를 검(4.1 g)으로서 얻었다; NMR(d6-DMSO): 1.4(s, 9H), 2.6(m, 2H), 3.2(회전이성질체에 의한 중합된 단일 피크, 12H), 3.4(m, 16H), 4.0-4.4(m, 5H), 5.1(s, 2H), 6.8(d, 1H), 7.4(s, 5H).
(c) N2-tert-부틸옥시카르보닐-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸]-L-아스파라긴 α-벤질에스테르(4 g)를 출발 물질로서 사용한다는 것을 제외하고는, 실시예 1의 (c) 부분에서 설명한 것과 유사한 절차를 사용하여 N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸]-L-아스파라긴(이후, FMoc-Asp(TE)-OH로서 언급함)을 검(3 g)으로서 얻었다; NMR(CDCl3): 2.8(m, 1H), 3.1(m, 1H), 3.3(회전이성질체에 의한 중첩된 단일 피크, 12H), 3.6(m, 16H), 4.2-4.8(m, 8H), 6.4(d, 1H), 7.4(m, 4H), 7.6(d, 2H), 7.8(d, 2H).
3.2 Phv-Ala-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2의 제조
(화학식 Ⅱ: n =1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CON(CH2CH2OCH3)2)
합성은 수지를 보호 해제시키고, 연속적으로 Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, (2S)-[(3R)-3-(N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피온산(Fmoc-Ⅲa-OH), Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, 및 5-페닐발레린산와 적합한 커플링 단계(이들 단계는 모두 수동으로 수행함)에서 커플링시킨 다음 보호 해제함으로써, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 30 분에 걸쳐 수행함, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 21.88 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 1395.8(MH+)
아미노산 분석; Asp 1.04, Thr 0.93, Ala 3.12, Arg 0.92.
Fmoc-Papa-OH를 N-Fmoc-L-메티오닌에 대해 문헌[이. 아더톤 및 알. 씨. 쉐퍼드("Solid phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, page 51)]에서 설명한 것과 유사한 방법에 의해 얻었다:
Fmoc-Papa-OH: NMR(DMSO-d6) 3.5(s, 2H), 4.25(t, 1H), 7.1(d, 2H), 7.4(m, 6H), 7.75(d, 2H), 7.9(d,2H), 9.6(s, 1H); 질량 분광 분석 m/e(ES-) 372.1(M-H-).
(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-플루오레닐메틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피온산(Fmoc-Ⅲa-OH)은 다음과 같이 하여 얻었다:
(ⅰ) Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe의 합성
N-메틸모르폴린(5.6 g), L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드(3.9 g), HOBt(4.6 g) 및 1-(3-메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(5.3 g)을 무수 DMF(50 ml) 중의 Boc-(D)-메티오닌(7 g, 0.028 mol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 동안 교반하였다. 용매를 증발에 의해 제거하고, 그 잔류물을 디클로로메탄(100 ml)과 5% 수성 아세트산 (50 ml) 사이에 분배시켰다. HOBt를 결정화되도록 방치한 다음, 여과에 의해 제거하고, 유기 층을 분리하여 수성 중탄산나트륨으로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 증발시켰다. 이 잔류물(8.5 g)을 디클로로메탄과 에테르(0% 내지 100% 에테르)의 혼합물을 용출제로 사용하여 소결 깔대기에서 섬광 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 함유한 분획물을 혼합하고, 증발시킴으로써, 방치함에 따라 결정화되는 검으로서 Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(7.2 g)을 얻었다; NMR(CDCl3): 1.4(d, 1H), 1.45(s, 3H), 1.95(m, 1H), 2.1(s, 3H), 2.1(m, 1H), 2.6(m, 2H), 3.75(s, 3H), 4.3(bs, 1H), 4.6(m, 1H), 5.3(m, 1H), 6.9(bs, 1H).
(ⅱ) 메틸(2S)-2-[(3R)-3-(N-[tert-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피오네이트의 합성
주의: 이 합성 순서는 무수 용매를 비롯한 무수 조건 하에서 수행하여야 한다. 그렇지 못할 경우, 에피머화가 발생할 수 있다. 메틸 요오다이드(10 ml)를 DMF(20 ml)와 디클로로메탄(20 ml)의 혼합물 중의 Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(8 g)에 첨가하고, 이 혼합물을 16 시간 동안 방치시킨 후, 증발 건조시켰다. 디클로로메탄(2 × 50 ml)을 더 첨가하고, 증발시켜 잔류하는 메틸 요오다이드를 제거한 다음, 그 잔류물을 DMF(300 ml)와 디클로로메탄(300 ml)의 혼합물 중에 용해시켰다. 이 혼합물을 ∼5℃로 냉각시키고, 나트륨 히드라이드(미네랄 오일 중의 80% 현탁액 0.76 g)을 일부 첨가하고, 이 혼합물을 ∼5℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 포화된 수성 염화암모늄(50 ml)을 첨가하고, 이 혼합물을 증발 건조시킨 후, 물과 에테르 사이에 분배시켰다. 에테르 추출물을 염수로 세척시키고, 건조시킨 다음, 증발시켜 검을 생성시켰다. 이어서, 이 검을 소결 깔대기 상의 섬광 크로마토그래피(25% 에틸 아세테이트:헥산에서 100% 에틸아세테이트로 증가하는 구배를 사용함)에 의해 정제시킴으로써, 메틸 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[tert-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피오네이트를 방치함에 따라 결정화되는 검(4.2 g)으로서 얻었다; NMR(CDCl3): 1.4(s, 9H), 1.4(d, 3H), 1.8(m, 1H), 2.6(m, 1H), 3.4(m, 2H), 3.7(m, 3H), 4.2(m, 1H), 4.9(q, 1H), 5.2(bs, 1H).
(ⅲ) (2S)-2-[(3R)-3-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피온산(Fmoc-Ⅲa-OH)의 합성
메틸 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[tert-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피오네이트(4 g)을 아세톤(60 ml), 물(40 ml) 및 진한 염산(24 ml) 의 혼합물 중에 3 시간 동안 환류시킨 후, 이 혼합물을 증발 건조시켰다. 물을 첨가하고, 반복하여 증발시켰다. 잔류물을 물(15 ml) 중에 용해시키고, 과량의 고체 중탄산나트륨을 첨가하였다. 아세톤(30 ml) 중의 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카르보네이트(5.2 g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 16 시간 동안 교반한 후, 용매를 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 물과 에테르 사이에 분배시켰다. 수층을 분리하고, 염산을 사용하여 그 pH를 ∼3으로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 추출시켰다. 유기층을 물로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 증발시켜 에테르를 사용하여 분쇄시킴에 따라 결정화되는 백색 포말을 생성시킴으로써, (2S)-2[(3R)-3-(N-[9-플루오레닐메틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피온산(4.2 g)을 mp가 191℃ 내지 193℃(분해)인 백색 고체로서 얻었다; NMR(CDCl3): 1.4(d, 3H), 2.0(m, 1H), 2.6(m, 1H), 3.4(m, 2H), 4.2(t, 1H), 4.4(m, 3H), 4.9(m, 1H), 5.8(bs, 1H), 7.4(m, 4H), 7.6(d, 2H), 7.7(d, 2H).
실시예 4
Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH 2 (서열 번호: 4)의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CON(CH2CH2OCH3)2)
합성은 적당한 커플링 단계에서 Fmoc-Asp(PE)-OH 대신 Fmoc-Asp(TE)-OH를 사용하여, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면, 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(30 분에 걸쳐 수행되는 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 23.9 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 1274.7(MH+).
아미노산 분석; Asp 1.03, Ala 5.94, Val 0.98.
실시예 5
Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅲa-Ala-Ⅱ-Ala-Papa-NH 2 (서열 번호: 5)의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)
합성은 연속적으로 Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(PE)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ⅲa-OH, Fmoc-Ala-OH(2회), Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 5-페닐발레린산을 커플링시키고, 보호 해제(수동에 의함)시킨 다음, 수지로부터 절단하고, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제시킴으로써, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면, 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(30 분에 걸쳐 수행되는 20% 내지 50% 아세토니트릴 구배, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 20.45 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 656.4(M+2H++).
아미노산 분석; Arg 1.06, (Ala+Ⅲa) 4.85, Asp 1.09.
실시예 6
Phv-Ⅱ-Arg-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH 2 (서열 번호: 6)의 제조
(화학식 Ⅱ: n =1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2COCN[(CH2CH2O)3CH3]2)
6.1 N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스[N,N-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)카르바모일메틸]-L-아스파라긴
(a) 부분에서 비스(2-메톡시에틸)아민 대신 적당한 양의 비스(2-2[-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)아민을 사용한다는 것을 제외하고는, FMoc-Asp(TE)-OH를 제조하기 위한 실시예 3.1에서 설명한 것과 유사한 절차를 사용함으로써, 오일로서 N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스[N,N-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)카르바모일메틸]-L-아스파라긴(이후, FMoc-Asp(TPE)-OH로서 언급됨)을 얻었다; NMR(CDCl3): 2.9(m, 1H), 3.1(m, 1H), 3.4(m, 12H), 3.6(m, 48H), 4.2-4.6(m, 8H), 7.4(m, 4H), 7.6(m, 2H), 7.8(d, 2H).
다음과 같은 중간 물질들은 (a) 단계와 (b) 단계를 수행함으로써 각각 얻었다: N-(벤질옥시카르보닐)이미노디-[N,N-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)]-아세트아미드; NMR(CDCl3): 3.4(m, 12H), 3.6(m, 48H), 4.3(s, 2H), 4.4(s, 2H), 5.05(s, 2H), 7.3(s, 5H). N2-tert-부틸옥시카르보닐-N4,N4-비스[N,N-비스(2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸)카르바모일메틸]-L-아스파라긴 α-벤질에스테르; NMR(CDCl3): 1.9(s, 9H), 2.7(m, 1H), 3.05(m, 1H), 3.4(m, 12H), 3.6(m, 48H), 4.4(m, 5H), 5.2(s, 2H), 5.9(bd, 1H), 7.4(m, 5H).
6.2 Phv-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)
합성은 연속적으로 Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ⅲa-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TPE)-OH, Fmoc-Ala-OH(2회), Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 5-페닐발레린산을 커플링시키고, 보호 해제(수동에 의함)시킨 다음, 수지로부터 절단하고, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제시킴으로써, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면, 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(30 분에 걸쳐 수행되는 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 23.61 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 1748.0(MH+).
아미노산 분석; Arg 1.01, Ala 3.18, Ⅲa 1.05, Asp 0.97, Thr 0.78.
실시예 7
Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Pro-Arg-Gly-Papa-NH 2 (서열 번호: 7)의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CON(CH2CH2OCH3)2)
합성은 연속적으로 Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(TE)-OH, Fmoc-Ala-OH(3회) 및 5-페닐발레릴산을 커플링시키고, 보호 해제(수동화에 의해)시킨 다음, 수지로부터 절단하고, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제시킴으로써, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면, 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(30 분에 걸쳐 수행되는 20% 내지 50% 아세토니트릴 구배, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 16.07 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 1395.7(MH+).
아미노산 분석; Arg 1.01, Ala 3.06, Asp 1.02, Thr 0.92, Pro 0.92, Gly 1.05.
실시예 8
Phv-Ⅱ-Arg-Ala-His-Val-Ⅲa-Ala-Papa-NH 2 (서열 번호: 8)의 제조
(화학식 Ⅱ: n =1; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2COCN(CH2CH2OCH3)2)
8.1 N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸]-L-글루타민
(b) 부분에서 N-tert-부틸옥시카르보닐-L-아스파르트산 α-벤질 에스테르 대신 적당한 양의 N-tert-부틸옥시카르보닐-L-글루탐산 α-벤질에스테르를 사용한다는 것을 제외하고는, FMoc-Asp(TE)-OH를 제조하기 위한 실시예 3.1에서 설명한 것과 유사한 절차를 사용함으로써, N2-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸]-L-글루타민(이후, FMoc-Glu(TE)-OH로서 언급됨)을 오일로서 얻었다; NMR(CDCl3): 2.0-2.4(m, 4H), 3.3(m, 12H), 3.5(m, 16H), 4.2-4.6(m, 8H), 7.4(m, 4H), 7.6(m, 2H), 7.8(d, 2H).
다음과 같은 중간 물질은 (b) 단계를 수행함으로써 얻었다: N2-tert-부틸옥시카르보닐-N4,N4-비스[N,N-비스(2-메톡시에틸)카르바모일메틸]-L-글루타민 α-벤질에스테르; NMR(CDCl3): 1.4(s, 9H), 2.0(m, 1H), 2.2(m, 1H), 2.4(m, 2H), 3.3(s, 12H), 3.5(m, 16H), 4.1-4.5(m, 5H), 5.2(m, 2H), 7.3(s, 5H).
8.2 Phv-Ⅱ-Arg-Ala-His-Val-IIIa-Ala-Papa-NH2의 제조
(화학식 Ⅱ: n= 2; X= 카르보닐; R1= R2= -CH2CON(CH2CH2OCH3)2)
합성은 연속적으로 Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ⅲa-OH, Fmoc-Val-0H, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(TE)-OH 및 5-페닐발레린산을 커플링시키고, 보호 해제(수동에 의함)시킨 다음, 수지로부터 절단하고, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제시킴으로써, 실시예 1.2에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 생성물은 HPLC, 질량 분광 분석 및 아미노산 분석에 의하면, 다음과 같은 특징을 나타내었다.
RP-HPLC(30 분에 걸쳐 수행되는 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배, 유속 1.0 ml/분); 체류 시간 = 22.23 분.
질량 분광 분석; m/e(ES+) = 1472.2(MH+).
아미노산 분석; Arg 0.95, Ala 2.17, His 0.98, Glu 0.99, Val 0.92, Ⅲa 0.96.
실시예 9
본 발명의 화합물은 종래의 약학 조성물의 형태로서 치료적 또는 예방적 용도로 사람과 같은 항온 동물에 투여 할 수 있다. 상기 약학 조성물의 형태의 전형적인 예로는 다음과 같은 주사 가능한 용액을 들 수 있다.
주사 가능한 용액
활성 성분 0.01 mg 내지 100 mg을 수성 주사 부형제 2 ml 중에 용해시켜 활성 성분의 농도 0.01 mg/ml 내지 100 mg/ml를 얻었다. 수성 주사 부형제는 약학적으로 허용 가능한 완충제(예를 들면 인산 염 또는 아세트산 염)를 사용하여 pH 5 내지 8로 완충되어 있고, 등장성을 달성하기 위해 첨가된 약학적으로 허용 가눙한 등장 조절제(예를 들면 염화나트륨 또는 덱스트로오스)를 포함한다. 또한, 이 부형제는 임의로 기타 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들면 가용화제(예를 들면 DMSO, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 폴리프로필렌), 방부제 및 항산화제를 포함할 수도 있다. 전형적으로, 활성 성분은 전술한 실시예의 화합물일 수 있고, 편리하게는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염으로서 존재할 수 있었다.
유의: ---
(1) 화학식 Ⅳ의 기를 함유한 펩티드인 경우, (S)-2-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-6-옥소-1,7-디아자스피로[4.4]논-7-일]프로피온산(Fmoc-Ⅳ-OH)는 다음과 같이 제조하여 얻을 수 있다:
(ⅰ) (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤린의 합성
THF(20 ㎖)중의 N-벤질옥시카르보닐프롤린 메틸 에스테르(13 g)를 -78℃에서 질소 하에 THF(100 ㎖)중의 리튬 디이소프로필아미드(27.5 ㎖, 헥산/THF중의 2M)에 적가하였다. 이 혼합물을 30 분 동안 교반한 후, 알릴 요오드화물(5.5 ㎖)을 적가한 다음, 혼합물을 30 분 동안 더 교반한 후 실온으로 가온하였다. 이어서, 이 혼합물을 수성 염화암모늄(200 ㎖)에 첨가하고, 에테르(2 × 200 ㎖)로 추출시켰다. 에테르 층을 증발시키고, 잔류물을 헥산에서 20% 에틸 아세테이트:헥산으로 증가하는 구배를 사용하여 실리카 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적당하게 분획물을 증발 건조시킴으로써 메틸 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤리네이트(9g)를 오일로서 얻었다.
이 물질 8.5g을 메탄올(40 ㎖)에 용해시키고, 물(20 ㎖)중의 수산화나트륨(4.5 g)을 첨가한 다음, 혼합물을 60분 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물의 pH를 진한 염산을 사용하여 7로 조정하고, 메탄올을 증발시켜 제거하였다. 혼합물의 pH를 3으로 조정하고, 혼합물을 에테르(2 × 50 ㎖)로 추출하였다. 혼합된 에테르 추출물을 증발시켜 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤린을 검으로서 얻었다: NMR(d6-DMSO (373K)): 1.9(m, 2H), 2.1(m, 2H), 2.6(q, 1H), 2.9(q, 1H), 3.4(m, 1H), 3.6(m, 1H), 5.0(m, 4H), 5.75(m, 1H), 7.3(m, 5H).
(ⅱ) [(RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)]프롤릴-(S)-알라닌 메틸 에스테르의 합성
HOBT(7.7 g), N-메틸모르폴린(6.6 g), L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드(4.5 g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드(5.7 g)을 DMF(30㎖)중의 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤린(6.5 g)에 첨가하고, 이 혼합물을 18 시간 동안 교반한 다음, 증발시켰다. 이 잔류물을 물과 에테르 사이에 분배시키고, 여과하여 HOBt를 제거한 다음, 유기층을 분리하였다. 이 유기층을 증발시키고, 잔류물을 헥산중의 20% 에틸 아세테이트에서 헥산중의 50% 에틸 아세테이트로 증가하는 구배를 사용하여 실리카 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적합한 분획물을 혼합하고, 증발 건조시킴으로써, [(RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤릴]-(S)-알라닌 메틸 에스테르(7g)을 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성질체의 혼합물에 의한 것임) 1.25 및 1.3(2d, 3H), 1.75(m, 2H), 2.2(m, 2H), 2.65(m, 1H), 2.9(m, 1H), 3.4(m, 1H), 3.65(2s, 3H), 3.7(m, 1H), 4.3(2q, 1H), 5.0(m, 4H), 5.7(m, 1H), 7.3(m, 5H), 7.4 및 7.5(bs, 1H).
(ⅲ) 메틸 (S)-2-(1-벤질옥시카르보닐-6-옥소-1,7-디아자스피로[4.4]논-7-일)프로피오네이트 (CbZ-Ⅳ-OMe)의 합성
오스뮴 테트록시드(4% 수용액 1.5 ㎖)를 메탄올(30 ㎖) 및 물(20 ㎖)의 혼합물중의 [(RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)]프롤릴-(S)-알라닌 메틸 에스테르(1.45 g)에 첨가하였다. 이 혼합물을 아르곤 하에서 10분 동안 교반한 후, 나트륨 페리오데이트(2.45g)를 조금씩 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간 동안 교반한 후, 물(100㎖)을 첨가하고, 이 혼합물을 에틸 아세테이트(2 × 70 ㎖)로 추출시켰다. 혼합된 추출물을 증발 건조시켜 검 1.4 g을 얻었다. 이 검을 디클로로메탄(30 ㎖)에 용해시키고, 트리에틸실란(0.65 g) 및 트리플루오로아세트산(4 g)을 적가하였다. 이 혼합물을 3 시간 동안 교반하고, 증발시킨 다음, 잔류물을 수성 중탄산 나트륨과 에테르 사이에 분배시켰다. 에테르 추출물을 분리하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 헥산중의 25% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸 아세테이트로 증가하는 구배를 사용하여 실리카 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적합한 분획물을 혼합하고, 증발 건조시킴으로써, 메틸 (S)-2-(1-벤질옥시카르보닐-6-옥소-1,7-디아자스피로[4.4]논-7-일)프로피오네이트(0.8 g)을 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성질체의 혼합물에 의한 것임) 1.25 및 1.35(2d, 3H), 1.95(m, 6H), 3.1-3.5(m, 4H), 3.6 및 3.65(2s, 3H), 4.5 및 4.65(2q, 1H), 5.05(m, 2H), 7.25(m, 5H)
(ⅳ) (S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)프로피온산(H-Ⅳ-OH)의 합성
탄산칼륨(2.5 g)을 메탄올(40 ㎖) 및 물(40 ㎖)의 혼합물중의 메틸 (S)-2-(1-벤질옥시카르보닐-6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)프로피오네이트 (3.3 g)에 첨가하고, 이 혼합물을 10 시간 동안 실온에서 교반하였다. pH를 진한 염산을 사용하여 ∼5로 조정하고, 혼합물을 증발 건조시켰다. 잔류물을 물(40 ㎖)에 용해시키고, pH를 진한 염산을 사용하여 3으로 조정하였다. 이어서, 혼합물을 디클로로메탄(2 × 50 ㎖)으로 추출하였다. 혼합된 추출물을 건조(MgSO4) 및 증발시켜 포말(2.8 g)을 형성시켰다. 이 포말을 메탄올(20 ㎖)에 용해시키고 시클로헥산(0.7 g)을 첨가한 후 10% Pd/C(0.5 g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 환류시키고, 냉각시키고 여과시킨 다음, 여과물을 증발시킴으로써, (S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7일)프로피온산(1.9 g)을 포말로서 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성질체의 혼합물에 의한 것임) 1.25 및 1.3(2s, 3H), 1.8(m, 4H), 2.0(m, 2H), 3.0(m, 2H), 3.3(m, 2H), 4.5(m, 1H).
(V) (S)-2-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-6-옥소-1,7-디아자스피로-[4,4]-논-7-일]프로피온산(Fmoc-Ⅳ-OH)의 합성
과량의 고체 중탄산나트륨을 물(2 ㎖)중의 (S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)프로피온산(0.42 g)에 첨가한 후, 아세톤(3 ㎖)중의 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카르보네이트(0.7 g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 18 시간 동안 교반하였다. 이어서, 그 혼합물을 물(10 ㎖)에 첨가하고, 에테르(10 ㎖)로 추출한 다음, 수성층을 분리하였다(에테르 추출물은 버렸다). 수성층의 pH를 진한 염산을 사용하여 ∼3으로 조정한 후 디클로로메탄(2×10 ㎖)으로 추출하였다. 혼합된 추출물을 분리하고, 건조(MgSO4)시킨 후 증발시킴으로써, (S)-2-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일]프로피온산(0.62 g)을 백색 포말로서 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성질체의 혼합물에 의한 것임) 1.3(2d, 3H), 1.6-2.0(m, 6H), 3.05(m, 1H), 3.2-3.45(m, 3H), 4.2-4.4(m, 1H), 4.5(m, 1H), 6.2(s, 2H), 7.35(m, 4H), 7.8(m, 4H).
(2) 화학식 Ⅴa의 기를 함유한 펩티드인 경우, (3S)-3-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세트산(Fmoc-Ⅴa-OH)는 다음과 같이 제조하여 얻을 수 있었다:
(ⅰ) (3S)-아미노-ε-카프로락탐(25 g) 및 트리에틸아민(19.7 g)을 THF(100 ml) 중에 용해시키고, 5℃로 냉각시켰다. THF(30 ml) 중의 벤질 클로로포르메이트(33 g)을 30 분에 걸쳐 적가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반한 후, 물(500 ml)에 부어 넣었다. 이 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출시켰다(3 × 100 ml). 추출물을 합쳐서 MgSO4로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 에테르(40 ml)로 분쇄시키고, 여과시킴으로써, (S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-ε-카프로락탐 20 g을 백색 고체로서 얻었다; NMR(d6-DMSO) 1.1-2(m, 6H), 2.9-3.2(m, 2H), 4.1-4.25(m, 1H), 5.0(s, 2H), 7.25-7.4(m, 5H), 7.75(t, 1H).
(ⅱ) DMF(100 ml) 중의 나트륨 히드라이드(2 g)의 혼합물을 아르곤의 스트림 하에서 0℃로 냉각시켰다. (3S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-ε-카프로락탐(10 g)을, 반응 온도를 5℃ 이하로 유지할 수 있는 정도의 속도로 20 분에 걸쳐 적가하였다. 교반을 0℃에서 40 분 동안 더 계속 수행한 후, tert-부틸 브로모 아세테이트(8.2 g)을 10 분에 걸쳐 적가하였다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 1 시간 동안 교반하고, 실온에서 18 시간 동안 더 교반하였다. 반응 혼합물을 물(600 ml) 중에 부어 넣고, 에틸 아세테이트(6 × 75 ml)로 추출시켰다. 혼합된 추출물을 물(3 × 100 ml)로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 증발시켰다. 잔류물을, 20% 에틸 아세테이트/디클로로메탄을 용출제로 사용하여 실리카 상의 MPLC에 의해 정제시킴으로써, tert-부틸(3S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(15 g)을 투명한 오일로서 얻었다; NMR(d6-DMSO): 1.4(s, 9H), 1.5-1.9(m, 6H), 3.5-3.65(m, 1H), 3.9-4.15(m, 2H), 4.4(m, 1H), 5.0(s, 2H), 7.1(d, 1H), 7.35(m, 5H); 질량 분광 분석: m/e(ES+) 377(MH+).
(ⅲ) tert-부틸 (3S)-3-벤조일옥시카르보닐아미노-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(15 g)을 에탄올(150 ml)중에 용해시키고, 아르곤으로 퍼지시켰다. 카본상의 10% 팔라듐(1.5 g)을 첨가하고, 플라스크를 비운 다음, 밸룬(ballow)으로부터 수소를 충전시켰다. 이 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 반응 혼합물을 아르곤으로 퍼지시키고, 규조토를 통해 여과시켰다. 이 여과액을 증발시킴으로써, tert-부틸 (3S)-3-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(7.7 g)를 점성 오일로서 얻었다; NMR(CDCl3): 1.45(s, 9H), 1.55-2.05(m, 6H), 3.2-3.3(d, 1H), 3.55-3.75(2개의 중첩된 이중 피크, 2H), 3.95-4.25(q, 2H); 질량 분광 분석: m/e(ES+) 243.2(MH+).
(ⅳ) THF( 50 ml) 중의 tert-부틸(3S)-3-아미노-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(7 g)의 용액을 물(30 ml) 중의 탄산나트륨(3 g)의 용액에 첨가하였다. THF(100 ml) 중의 N-플루오레닐메톡시카르보닐옥시)숙신이미드(9.7 g)의 용액을 교반하면서 30 분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 더 교반하였다. 물(200 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(3 × 100 ml)로 추출시켰다. 혼합한 추출물을 염수(100 ml)로 세척시키고, MgSO4로 건조시킨 다음, 증발시켰다. 잔류물을 처음 디클로로메탄에서 서서히 15% 에틸 아세테이트/디클로로메탄으로 증가시켜 용출시키는 실리카 상의 MPLC에 의해 정제함으로써, tert-부틸(3S)-3-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(10.9 g)을 투명한 오일로서 얻었다; NMR(d6-DMSO): 1.45(s, 9H), 1.5-2.15(m, 6H), 3.1-3.25(m, 1H), 3.6-3.75(m, 1H), 4.0-4.5(m, 5H), 6.25(d, 1H), 7.25-7.45(m, 4H), 7.6(d, 2H), 7.75(d, 2H); 질량 분광 분석: m/e(ES+) 465.2(MH+).
(ⅴ) tert-부틸(3S)-3-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(10.9 g)을 디클로로메탄(30 ml) 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(20 ml)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄(100 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 물(4 × 100 ml)로 세척시키고, MgSO4로 건조시킨 다음, 증발시켰다. 잔류물을 25% 에틸아세테이트/디클로로메탄, 이어서 에틸 아세테이트를 용출제로 사용하여 실리카 상의 MPLC에 의해 정제함으로써, 오일을 얻었다. 이소헥산을 사용하는 분쇄에 의해 백색 포말을 생성시키고, 이것을 여과한 다음, 60℃에서 진공 하에 건조시킴으로써, (3S)-3-(9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노)-2-옥소퍼히드로아제핀-1-아세테이트(5.5 g)을 얻었다; NMR(d6-DMSO): 1.4-1.95(m, 1H), 3.15-3.4(m, 1H), 3.55-3.7(m, 1H), 3.9-4.2(m, 2H), 4.25-4.45(m, 2H), 7.15(d, 1H), 7.25-7.45(m, 4H), 7.75(m, 2H), 7.85(d, 2H); 질량 분광 분석: m/e(ES-) 407.1(M-H)-.
서열목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 제네카 리미티드
(B) 스트리트 : 스탠호프 게이트 15
(C) 도시 : 런던
(E) 국가 : 영국
(F) 우편 번호(ZIP) : 더블유1와이 6엘엔
(G) 전화 : 0171 304 5000
(H) 팩스 : 0171 304 5151
(I) 텔렉스 : 0171 834 2042
(ii) 발명의 명칭 : 펩티드 유도체
(iii) 서열의 수 : 8
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC compatible
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatenIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : GB 9611881.5
(B) 출원 일자 : 1996년 6월 7일
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : GB 9622890.3
(B) 출원 일자 : 1996년 11월 2일
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
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(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
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(xi) 서열 : 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
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(xi) 서열 : 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
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(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 8 아미노산
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(xi) 서열 : 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
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(ii) 분자의 타입: 펩티드
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(xi) 서열 : 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
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(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
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(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
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(A) 길이 : 8 아미노산
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(ii) 분자의 타입: 펩티드
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(A) 명칭/키: 펩티드
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(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
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(ix) 특징:
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(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
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(xi) 서열 : 서열 번호 8:

Claims (19)

  1. 하기 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 I
    P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q
    상기 식중에서,
    P는 소수성 잔기이고;
    AA1, AA2, AA3, AA4, AA5, AA6, AA7및 AA8은 L-아미노산 잔기로서, AA1, AA4및 AA7중에 1개, 2개 또는 3개는 하기 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되거나;
    화학식 Ⅱ
    [상기 식 중에서,
    n은 1, 2, 3 또는 4인 정수이고;
    X는 -NH-CO-, -CO- 또는 -0CO-이며;
    R1과 R2는 다음의 (A), (B) 및 (C), 즉 (A) a가 1 또는 2인 정수이고, R3과 R4가 화학식 -[(CH2)bO]m-Ra{여기서, Ra는 메틸 또는 에틸이고, m은 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며, m이 1인 경우 b는 2 또는 3이고, m이 2, 3, 4 및 5인 경우 -(CH2)bO- 단위에서의 b 값은 2 와 3으로부터 각각 선택됨}로 표시된 기로부터 각각 선택되는 것인, 화학식 -(CH)a-CO-N(R3)(R4)로 표시된 기;
    (B) c가 2 또는 3인 정수이고, d가 1, 2 또는 3인 정수이며, R5과 R6이 화학식 -[(CH2)eO]p-Rb{여기서, Rb는 메틸 또는 에틸이고, p는 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며, p가 1인 경우 e는 2 또는 3이고, p가 2, 3, 4 또는 5인 경우 -(CH2)eO- 단위에서의 e 값은 2와 3으로부터 각각 선택됨}로 표시된 기로부터 각각 선택되는 것인, 화학식 -(CH2)cO(CH2)d-CO-N(R5)(R6)로 표시된 기; 및
    (C) 화학식 -[(CH2)fO]d-R7{여기서, R7는 메틸 또는 에틸이고, g는 1, 2, 3, 4 또는 5인 정수이며, g가 1인 경우 f는 2 또는 3이고, g가 2, 3, 4 또는 5인 경우 -(CH2)fO- 단위에서의 f 값은 2와 3으로부터 각각 선택됨}로 표시된 기
    로부터 선택됨];
    또는 AA1, AA2, AA3, AA6, AA7및 AA8은 L-아미노산의 잔기로서, AA1과 AA7중에 1개 또는 2개 모두가 상기 정의한 바와 같이 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되고, AA4가 AA5와 함께 하기 화학식 Ⅲ, 화학식 Ⅲa, 화학식 Ⅳ, 화학식 Ⅳa, 화학식 Ⅴ 또는 화학식 Ⅴa로 표시된 기를 형성하거나;
    화학식 Ⅲ
    화학식 Ⅲa
    화학식 Ⅳ
    화학식 Ⅳa
    화학식 Ⅴ
    화학식 Ⅴa
    [이들 식중에서, Ra, Rb 및 Rz는 수소와 (C1-C4)알킬로부터 각각 선택되고, A는 산소 또는 메틸렌임]
    또는 AA1, AA2, AA3, AA4, AA5및 AA8은 L-아미노산의 잔기로서, AA1과 AA4중에 1개 또는 2개 모두가 상기 정의한 바와 같은 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기로부터 선택되고, AA6가 AA7와 함께 상기 화학식 Ⅲ, 화학식 Ⅲa, 화학식 Ⅳ, 화학식 Ⅳa, 화학식 Ⅴ 및 화학식 Ⅴa로 표시된 기를 형성하고,
    Q는 OH, NH2, NRcRd이며, 이때 Rc는 (C1-C4)알킬, 2-카르바모일시클로펜틸, 2-피리딜메틸, 4-카르바모일시클로헥실, 4-카르바모일시클로헥실메틸, 3-카르바모일페닐, 4-카르바모일페닐, 4-(카르바모일메틸)페닐, 4-(카르복시메틸)페닐, 2-모르폴리노에틸 및 화학식 -A1-G1 [식중, A1은 (C3-C7)알킬렌이거나, 또는 A1은 (1) A2가 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고, B2가 (C1-C4)알킬렌이거나, 또는 A2가 메틸렌이고, B2가 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌인 화학식 -A2-B2-로 표시된 기와 (2) A3이 메틸렌이고, B3이 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이며, C3이 (C1-C3)알킬렌인 화학식 -A3-B3-C3-로 표시된 기로부터 선택되고, G1은 Rp가 수소, 메틸, 에틸 및 프로필로부터 각각 선택되는 화학식 -N=C[N(Rp)2]2로 표시된 기임]로 표시된 기로부터 선택되고, Rd는 수소 또는 (C1-C4)알킬이거나;
    또는 Q는 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-(2-(2-히드록시에톡시)에틸)-1-피페라지닐, 4-아미디노-1-피페라지닐, 1-피페리딜 또는 4-치환된-1-피페리딜[4-치환체는 카르복시, 카르바모일, N-(2-아미노에틸)카르바모일 및 N-(4-아미노부틸)카르바모일로부터 선택됨]이거나;
    또는 Q는 1개 내지 6개의 아미노산 잔기의 서열 또는 이것의 아미드이다.
  2. 제1항에 있어서, AA1, AA2, AA3, AA5, AA6, AA7및 AA8이 L-아미노산 잔기이고, P와 Q가 제1항에 기재된 의미 중에 하나를 가지며, Ⅱ가 제1항에 기재된 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기인 화학식 P-AA1-AA2-AA3-II-AA5-AA6-AA7-AA8-Q의 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, AA1, AA2, AA3, AA5및 AA8이 L-아미노산 잔기이고, P와 Q가 제1항에 기재된 의미 중에 하나를 가지며, Ⅱ가 제1항에 기재된 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기이고, Ⅲa가 제1항에 기재된 화학식 Ⅲa로 표시된 기인 화학식 P-AA1-AA2-AA3-Ⅲa-AA5-Ⅱ-AA8-Q의 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, AA1, AA2, AA3, AA5및 AA8이 L-아미노산 잔기이고, P와 Q가 제1항에 기재된 의미 중에 하나를 가지며, Ⅱ가 제1항에 기재된 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기이고, Ⅲa가 제1항에 기재된 화학식 Ⅲa로 표시된 기인 화학식 P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-Ⅲa-AA8-Q의 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서, AA2, AA3, AA4, AA5및 AA8이 L-아미노산 잔기이고, P와 Q가 제1항에 기재된 의미 중에 하나이며, Ⅱ가 제1항에 기재된 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기이고, Ⅲa가 제1항에 기재된 화학식 Ⅲa로 표시된 기인 화학식 P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-Ⅲa-AA8-Q의 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, p가 5개 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방족, 방향족 또는 혼합된 지방족/방향족의 유기 기 또는 5개 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/헤테로방향족의 유기 기이며, 1개, 2개 또는 3개의 헤테로 원자가 산소, 황 및 질소로부터 선택되는 것인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학식 Ⅱ로 표시된 L-아미노산의 잔기에서, n=1 또는 2이고, X=카르보닐이며, R1과 R2가 둘다 제1항에 기재된 (A)의 기와 동일하거나 또는 제1항에 기재된 (C)의 기와 동일한 것인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제7항에 있어서, 상기 R1과 R2가 둘다 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3이거나, 또는 -CH2CON(CH2CH2OCH3)2이거나 또는 -CH2CON[(CH2CH2O)3CH3]2인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, AA1내지 AA8이
    Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4및 3,3,3-트리플루오로알라닌으로부터 선택된 AA1; Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-트리플루오로알라닌 및 N6-디에틸Lys로부터 선택된 AA2; Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn 및 N3-디에틸Dap으로부터 선택된 AA3; Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His 및 N6-디에틸Lys로부터 선택된 AA4; Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn, Ser 및 N3-디에틸Dap로부터 선택된 AA5; Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His 및 Dap로부터 선택된 AA6; Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic 및 Dic로부터 선택된 AA7; 및 Ala, Gly, Dap, 아자알라닌 및 아자글리신으로부터 선택된 AA8로 이루어진 아미노산의 잔기로부터 선택되는 것인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, Q가 4-카르바모일-1-피페리딜 및 4-(카르바모일메틸)아닐리노로부터 선택되는 것인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 소수성 기 P가 5-페닐발레릴인 것인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 제1항에 있어서, 하기 화학식으로 표시된 화합물 또는 이것의 약학적 허용 가능한 염인 펩티드 유도체, 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염:
    (식 중, Phv는 5-페닐발레릴기임)
  13. 제1항에 있어서, 하기 화학식으로 표시된 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염인 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적 허용 가능한 염.
    (식 중, Phv는 5-페닐발레릴기임)
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
  15. 적절하게 보호된 아미노산 또는 적절하게 보호된 2개 이상의 아미노산의 서열, 화학식 H-II-OH, H-III-OH, H-Ⅲa-OH, H-Ⅳ-OH, H-Ⅳa-OH, H-Ⅴ-OH 또는 H-Ⅴa-OH의 적절하게 보호된 기 및 임의로 화학식 H-Q의 적절하게 보호된 기를 적당한 순서로 연속적으로 커플링시키는 단계, N-말단 아미노기의 임의의 작용기를 변형시켜 소수성기 P를 도입하는 단계, 및 남아 있는 임의의 보호기와 임의의 고체 지지체를 제거하는 단계를 포함하여, 제1항에 기재된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법.
  16. 치료를 요하는 항온 동물에게 제1항에 기재된 화학식 I로 표시된 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여, MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가 면역 질병 또는 염증성 질병을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 류마티스양 관절염 또는 다발성 경화증을 치료하는 방법.
  18. 제1항에 기재된 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염을 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가 면역 질병 또는 염증성 질병의 치료에 사용하기 위한 약제를 제조하는 데 사용하는 방법.
  19. 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 보호되거나 보호 해제된 아미노산 또는 이것의 염:
    화학식 II
    상기 식 중, n, X, R1및 R2는 제1항에 기재된 의미 중에 어느 하나를 갖는다.
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