SK166699A3

SK166699A3 - Crystalline roxifiban

Info

Publication number: SK166699A3
Application number: SK1666-99A
Authority: SK
Inventors: Michael B Maurin; Philip Ma; David J Meloni; Jaan A Pesti; Lucius T Rossano; Randall K Ward; Jianguo Yin; Lin-Hua Zhang
Original assignee: Du Pont Pharm Co
Priority date: 1997-06-16
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2001-09-11
Also published as: JP2002504153A; WO1998057939A1; CN1259940A; AR023840A2; AR016070A1; AU751198B2; PL337612A1; US6306886B1; AU8071998A; NZ502077A; KR20010013790A; NO996182L; CA2294047A1; HUP0004755A3; NO996182D0; HUP0004755A2; EA200000028A1; IL132618A0; EE9900573A; EP0991630A1

Description

Kryštalický roxifiban

Oblasť techniky

Silný glykoproteínový Ilb/IIIa antagonista doštičiek, roxifiban, sa pripravuje v kryštalickej forme. Kryštalický roxifiban existuje v dvoch polymorfných formách, označovaných ako forma 1 a forma 2. Tieto polymorfné formy sú charakterizované rôntgenovou práškovou difrakciou a uhlíkovou NMR v pevnom stave. Sú rovnako opísané farmaceutické prostriedky a spôsoby liečby a prevencie chorôb sprostredkovaných agregáciou doštičiek.

Doterajší stav techniky

Predkladaný vynález sa týka kryštalických foriem silného glykoprotexnového Ilb/IIIa antagonistu doštičiek známeho ako rofixiban. Rofixiban je acetátová soľ metylesterovej proliečivej formy silného glykoprotexnového Ilb/ Hla antagonistu. Je to nepeptidová izoxazolxnová zlúčenina štruktúrneho vzorca:

Roxifiban je známy pod svojim chemickým názvom, acetátová soľ metyl-N³-[2-{3-(4-formamidinofenyl)-izoxazolxn-5(R)yl} acetyl ] -N²- (n-butyloxykarbonyl) -2,3- (S) -diaminopropionátu. Roxifiban je obsiahnutý v opise a nárokoch prihlášky PCT/US94/ 13155 (medzinárodná publikácia č. WO 95/14683), podaná 14.11. 1994, uvádzaná tu ako odkaz. Táto medzinárodná patentová prihláška nárokuje prioritu US č. 08/157598, podané 24.11.1994 a US č. 08/337920, podané 10.11.1994, uvádzané tu ako odkaz.

Príprava soli trifluóroctovej kyseliny proliečivej bázy roxifibanu je opísaná v príklade 314B PCT/US94/13155.

Bolo zistené, že aktívna zložka roxifibanu inhibuje väzbu rozpustných adhezívnych proteínov, ako je fibrinogén, von Willebrandov faktor, fibronektín a vitronektín k doštičkám glykoproteínového Ilb/IIIa komplexu. V dôsledku toho je zlúčenina schopná inhibovať a aktivovať agregáciu doštičiek indukovanú známymi endogénnymi antagonistami doštičiek. Roxifiban je preto užitočný pre liečbu alebo prevenciu tromboembolických chorôb, zahŕňajúcich tvorbu trombu alebo embolu, zhubnú agregáciu doštičiek, reoklúziu nasledujúcu trombolýzu, reperfúzne zranenia, restenózu, aterosklerózu, mŕtvicu, infarkt myokardu a nestabilnú angínu. Ďalšie ochorenia, ktoré zahŕňajú bunkovú adhéziu môžu byť rovnako liečené podaním roxifibanu. Také ochorenia zahŕňajú napríklad reumatickú artritídu, astmu, alergiu, respiračný syndróm dospelých, odmietnutie transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktnú dermatitídu, osteoporózu, osteoartritídu, nádorové metastázy, diabetickú retinopatiu, zápalové stavy a zápalové ochorenia tlstého čreva.

Liečba alebo prevencia hore uvedených chorôb sa dosiahne tým, že sa človeku alebo zvierati podá, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeutické množstvo roxifibanu. Zlúčenina sa môže podávať enterálne alebo parenterálne v pevných alebo kvapalných dávkových formách. Zvyčajne dávka obsahuje od asi 0,001 mg/kg do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti na deň, výhodne od asi 0,005 do asi 1 mg/kg telesnej hmotnosti na deň.

Syntézu roxifibanu a jeho získavanie ako v podstate čistý kryštalický produkt opísali Zhang a kol., Tetrahedron Letters, 37(26), 4455-58 (1996); Zhang a kol., J. Org. Chem. 62(8), 24,69 (1997). Dosial nebola známa existencia roxifibanu v stabilných kryštalických polymorfných formách. Na

A.

prípravu, čistenie a formuláciu roxifibanu je výhodné získavať liečivo v kryštalickej forme. Preto existuje potreba stabilnej kryštalickej formy liečiva a spoľahlivých a reprodukovateľných postupov jeho prípravy.

Podstata vynálezu

V jednom aspekte sa predkladaný vynález týka kryštalického roxifibanu. Príbuzný aspekt spočíva v kryštalických polymorfoch roxifibanu, označených ako forma 1 a forma 2. Polymorfná forma 1 je charakterizovaná a odlišuje sa od polymorfnej formy 2 uhlíkovým NMR v pevnom stave a práškovou rôntgenovou difrakčnou analýzou.

Ďalšie aspekty predkladaného vynálezu zahŕňajú farmaceutické prostriedky kryštalického roxifibanu a jeho polymorfné formy 1 a formy 2. Kryštalické proliečivé produkty podľa vynálezu môžu byť formulované do konvenčných pevných farmaceutických dávkových foriem alebo sa môžu použiť na prípravu kvapalných dávkových foriem kombináciou terapeuticky účinného množstva kryštalického proliečiva s farmaceutický prijateľným nosičom. V dalšom aspekte predkladaný vynález zahŕňa spôsob inhibície väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek, ktorý zahŕňa podanie množstva kryštalického roxifibanu, ktoré je dostatočné, aby glykoproteín Ilb/IIIa bol kontaktovaný s účinným množstvom aktívnej liečivej substancie.

V osobitných aspektoch zahŕňa predkladaný vynález metódy liečby alebo prevencie rôznych tromboembolických chorôb a ďalších chorôb zahŕňajúcich bunkovú adhéziu, ktoré zahŕňajú podanie účinného množstva farmaceutického prostriedku zahŕňajúceho nové kryštalické formy podľa vynálezu.

Vynález je ilustrovaný odkazmi na priložené obrázky opísané ďalej.

Obrázok 1 je ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfnej kryštalickej formy 1 roxifibanu v pevnom stave.

Obrázok 2 je ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfnej kryštalickej formy 2 roxifibanu v pevnom stave.

Obrázok 3 ukazuje práškové róntgenové difraktogramy polymorfnej kryštalickej formy 1 a formy 2 roxifibanu.

Obrázok 4 je štandardná krivka grafického znázornenia pomerov ¹³C CP/MAS NMR spektra zmesi polymorfnej formy 1 a formy 2 roxifibanu voči molárnemu zlomku polymorfnej formy 1 v takej zmesi.

V prvom rozpracovaní predkladaný vynález poskytuje kryštalický roxifiban v podstatne čistej forme.

Vo výhodnejšom rozpracovaní, čistota kryštalického roxifibanu je vyššia ako 90 percent.

V druhom rozpracovaní predkladaný vynález poskytuje polymorfnú formu 1 kryštalického roxifibanu v podstatne čistej forme.

Vo výhodnejšom rozpracovaní, čistota kryštalického roxifibanu formy 1 je vyššia než 90 percent.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je polymorfná forma 1 charakterizovaná ¹³C CP/MAS NMR spektrom v pevnom stave majú com dvojité piky pri 63 a 66 ppm.

Vo výhodnejšom rozpracovaní ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfnej formy 1 v pevnom stave má dvojité piky pri 19 a 21 ppm.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní má polymorfná forma 1 kryštalického roxifibanu v pevnom stave ¹³C CP/MAS NMR spektrum v podstate v zhode so spektrom ukázaným na obrázku 1.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní polymorfná forma 1 je charakterizovaná práškovým rôntgenogramom zahŕňajúcim hodnoty 2Θ 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,5 ± 0,2, 14,7 ± 0,2, 19,3 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 22,5 ± 0,2, 23,2 ± 0,2, 25,2 + 0,2, 27,5 ± 0,2 a 32,2 ± 0,2.

Vo výhodnejšom rozpracovaní je práškový rôntgenogram polymorfnej formy 1 podstatne zbavený piku pri 2Θ 13,6 ± 0,2.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je polymorfná forma 1 charakterizovaná práškovým rôntgenogramom podstatne v súladu s rôntgenogramom uvedeným na obrázku 3.

V druhom rozpracovaní predkladaný vynález opisuje farmaceutický prostriedok pripravený kombináciou účinného množstva polymorfnej formy 1 s farmaceutický prijateľným nosičom.

Vo výhodnom rozpracovaní je farmaceutický prostriedok v pevnej alebo v kvapalnej forme.

V ešte výhodnejšom rozpracovaní obsahuje farmaceutický prostriedok asi 0,1 mg až asi 25 mg zlúčeniny na jednotkovú dávku.

V treťom rozpracovaní opisuje predkladaný vynález farmaceutický prostriedok v pevnej jednotkovej dávkovej forme, ktorá obsahuje terapeuticky účinné množstvo polymorfnej formy 1 a farmaceutický prijateľný nosič.

Vo výhodnom rozpracovaní je farmaceutický prostriedok vo forme kapsuly, tablety, prášku alebo granuly a obsahuje asi 0,1 mg až asi 25 mg zlúčeniny.

V štvrtom rozpracovaní predkladaný vynález opisuje spôsob inhibície väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/llla komplexu doštičiek, ktorý zahŕňa poskytnutie polymorfnej formy 1, v množstve, ktoré je dostatočné na to, aby viedlo ku kontaktu glykoproteínového Ilb/IIIa komplexu doštičiek s účinným inhibičným množstvom aktívnej liečivej substancie.

Vo výhodnom rozpracovaní je rozpustný adhezívny proteín fibrinogén, von Willebrandov faktor, fibronektín alebo vitronektín.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je zlúčenina poskytnutá ľudskému alebo zvieraciemu subjektu na inhibíciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vi vo.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je zlúčenina poskytnutá do mimotelového zariadenia na inhibíciu väzby rozpustného adhe živného proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vitro.

V piatom rozpracovaní predkladaný vynález opisuje spôsob liečby alebo prevencie tromoembolických chorôb, zahŕňajúcich tvorbu trombu alebo embolu, zhubnú agregáciu doštičiek, reoklúziu nasledujúcu trombolýzu, reperfúzne zranenia, restenózu, aterosklerózu, mŕtvicu, infarkt myokardu a nestabilnú angínu, zahŕňajúci podanie hostiteľovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky účinného množstva polymorfnej formy 1.

Vo výhodnom rozpracovaní sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,001 do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti denne.

V dalšom výhodnom rozpracovaní sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,005 do asi 1 mg/kg telesnej hmotnosti denne.

Vo výhodnejšom rozpracovaní sa zlúčenina podá pre liečbu alebo prevenciu infarktu myokardu alebo mŕtvice.

V šiestom rozpracovaní, predkladaný vynález poskytuje spôsob liečby alebo prevencie chorôb zahŕňajúcich reumatickú artritídu, astmu, alergiu, respiračný syndróm dospelých, odmietnutie transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktnú dermatitídu, osteoporózu, osteoartritídu, nádorové metastázy, diabetickú retinopatiu, zápalové stavy a zápalové choroby tlstého čreva, zahŕňajúce podanie hostiteíovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva polymorfnej formy 1.

V siedmom rozpracovaní, predkladaný vynález opisuje polymorfnú formu 1 kryštalického roxifibanu pripravenú rekryštalizáciou roxifibanu zo zmesového rozpúštadlového systému.

V osmom rozpracovaní predkladaný vynález poskytuje polymorfnú formu 2 kryštalického roxifibanu v podstatne čistej forme.

Vo výhodnejšom rozpracovaní, čistota kryštalického roxifibanu formy 2 je vyššia ako 90 percent.

V dalšom výhodnom rozpracovaní je polymorfná forma 2 charakterizovaná ¹³C CP/MAS NMR spektrom v pevnom stave majúci jeden pik pri 66 ppm a žiadny podstatný pík pri 63 ppm.

Vo výhodnejšom rozpracovaní ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfnej formy 2 v pevnom stave má jeden pik pri 19 ppm a žiadny podstatný pik pri 21 ppm.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní má polymorfná forma 2 kryštalického roxifibanu ¹³C CP/MAS NMR spektrum v podstate v zhode so spektrom ukázaným na obrázku 2.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní polymorfná forma 2 je charakterizovaná práškovým róntgenogramom zahŕňajúcim 2Θ hodnoty 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,4 ± 0,2, 13,6 ± 0,2, 18,8 ± 0, 2, 20,7 ± 0,2, 22,6 ± 0,2, 23,1 ± 0,2, 25,1 ± 0,2, 26,1 ± 0, 2, 27,3 ± 0,2 a 28,5 ± 0,2.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je polymorfná forma 2 charakterizovaná práškovým róntgenogramom podstatne v súladu s róntgenogramom uvedeným na obrázku 3.

V deviatom rozpracovaní predkladaný vynález opisuje farmaceutický prostriedok pripravený kombináciou účinného množstva polymorfnej formy 2 s farmaceutický prijateíným nosičom.

V desiatom rozpracovaní opisuje predkladaný vynález farmaceutický prostriedok v pevnej jednotkovej dávkovej forme ktorá obsahuje terapeuticky účinné množstvo polymorfnej formy 2 a farmaceutický prijatelný nosič.

V jedenástom rozpracovaní predkladaný vynález opisuje spôsob inhibície väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek, ktorý zahŕňa poskytnutie polymorfnej formy 2, v množstve, ktoré je dostatočné na to, aby viedlo ku kontaktu glykoproteínového Ilb/IIIa komplexu doštičiek s účinným inhibičným množstvom aktívnej liečivej substancie.

Vo výhodnom rozpracovaní je rozpustný adhezívny proteín fibrinogén, von Willebrandov faktor, fibronektín alebo vitronektin.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je zlúčenina poskytnutá ľudskému alebo zvieraciemu subjektu na inhibíciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vivo.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní je zlúčenina poskytnutá do mimotelového zariadenia na inhibíciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vitro.

V dvanástom rozpracovaní predkladaný vynález opisuje spôsob liečby alebo prevencie tromoembolických chorôb, zahŕňajúcich tvorbu trombu alebo embolu, zhubnú agregáciu doštičiek, reoklúziu nasledujúcu trombolýzu, reperfúzne zranenia, restenózu, aterosklerózu, mŕtvicu, infarkt myokardu a nestabilnú angínu, zahŕňajúci podanie hostiteľovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky účinného množstva polymorfnej formy 2.

V ďalšom výhodnom rozpracovaní sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,005 do asi 1 mg/kg telesnej hmotnosti denne.

V trinástom rozpracovaní, predkladaný vynález poskytuje spôsob liečby alebo prevencie chorôb zahŕňajúcich revmatickú artritídu, astmu, alergiu, respiračný syndróm dospelých, odmietnutie transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktnú dermatitídu, osteoporózu, osteoartritídu nádorové metastázy, diabetickú retinopatiu, zápalové stavy a zápalové choroby tlstého čreva, zahŕňajúci podanie hostiteľovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, tera peuticky alebo profylaktický účinného množstva polymorfnej formy 2.

V štrnástom rozpracovaní, predkladaný vynález opisuje polymorfnú formu 2 kryštalického roxifibanu pripravenú rekryštalizáciou roxifibanu zo zmesového rozpúštadlového systému.

Roxifiban je acetátová sol metylesterového liečiva opticky čistého enantioméru terapeuticky aktívnej izoxazolínovej zlúčeniny štruktúry:

Príprava trifluóracetátovej soli metylesteru aktívnej liečivej substancie II je opísaná v príklade 314B prihlášky PCT/US94/13155. Ako bude ocenené odborníkom v organickej syntéze, postup tu opísaný môže byt adaptovaný pre prípravu roxifibanu substitúciou trifluóroctovej kyseliny kyselinou octovou vo finálnom stupni.

Alternatívny spôsob prípravy kryštalického roxifibanu je opísaný v hore uvedených referenčných publikáciách Zhanga a kol. Táto syntéza začína reakciou 4-kyanobenzaldehydu s hydroxyamínsulfátom za získania 4-kyanobenzaldoxímu, pri použití metódy, ktorú opísali Kavasa a Kakugawa, J. Chem. Soc., Perkin Trans I, 1979, str. 643. Reakcia je ilustrovaná nasledujúcou schémou:

^NC“4 /V-CHO + (H₂NOH)₂. H₂SO₄ -- ^NC“C λ™

Reakcia 4-kyanobenzaldoxímu s N-chlórsukcínimidom v prítomnosti trietylamínu generuje aktívny nitriloxidový medziprodukt, ktorý ďalej kondenzuje s izobutylvinylacetátom za získania racemickej zmesi zlúčeniny predstavovanej nasledujúcim vzorcom:

Enzymatická hydrolýza racemickej zmesi zlúčeniny III s lipázou produkuje izoxazolínovú kyselinu v opticky čistej R konfigurácii. Táto izoxazolinová kyselina je predstavovaná vzorcom:

Enzymatická reakcia sa môže vykonať pri použití komer čne dostupného lipázového preparátu ako je lipáza PS30, dostupná od Amano Enzýme. Reakcia sa môže uskutočniť vo fosfáto vom tlmivom roztoku pH 7,5.

Nehydrolyzovaný izobutylester vzorca III, majúci konfiguráciu S sa môže racemizovať s katalytickým množstvom terc.butoxidu draselného. Opakovaním kombinovaného postupu enzymatickej hydrolýzy a epimerizácie bázy sa môže v dobrom výťažku získať opticky čistá izoxazolínová kyselina.

Opticky čistá izoxazolínová kyselina vzorca IV sa kopuluje s metylesterom Ν-α-butoxykarbonyl-l, 2-diaminopropiónovej kyseliny za získania opticky čistého medziproduktu vzorca:

O

Opticky čistá aminokyselina N-a-butoxykarbonyl-1,2diaminopropiónovej kyseliny je komerčne dostupná (napríklad od Beacham) a môže byt premenená na svoj metylester reakciou s metanolom v prítomnosti tionylchloridu.

Zlúčenina V sa premení na imidátový medziprodukt Pinnerovou reakciou (Alien a kol., J. Am. Chem. Soc. (1958)

80, 591; Zhang a kol., Tetrahedron Letters, (1996) 37 (26),

4455-58). Imidátový medziprodukt môže reagovať s octanom amónnym za získania žiadanej acetátovej soli, roxifibanu I v dobrom výťažku. Z reakčného prostredia sa môže získať kryštalický roxifiban v dobrom výťažku.

Bolo zistené, že podlá tohto postupu sa získa zmes dvoch kryštalických polymorfov roxifibanu, označovaných ako forma 1 a forma 2.

Rekryštalizácia roxifibanu zo zriedených roztokov v metanole dáva polymorfnú formu 1. Rekryštalizačný roztok výhodne obsahuje viac ako asi 20 ml metanolu na gram roxifibanu, výhodne viac ako asi 25 ml metanolu na gram roxifibanu. Pri vyšších koncentráciách roxifibanu vedie rekryštalizácia z metanolu často k zmesi polymorfnej formy 1 a formy 2. Tvorba polymorfnej formy 1 je podporovaná relatívne rýchlym ochladením metanolového roztoku. Výhodne sa zriedený metanolový roztok roxifibanu zahreje na teplotu asi 50’C až asi 65’C za účelom úplného rozpustenia zlúčeniny. Tento roztok sa potom ochladí na <35°c až ku kryštalizácii produktu, ktorým je najmä forma 1.

Polymorfná forma 1 môže byť produkovaná pridaním antirozpúšťadiel, ako je metylacetát, do zriedeného metanolového roztoku zlúčeniny. Alternatívne, pridanie horúceho xylénového roztoku do zahriateho roztoku roxifibanu v metanole, nasledované rýchlou destiláciou metanolu z roztoku, vedie ku kryštalickému produktu, ktorým je prevážne polymorfná forma 1. Postup, ktorým sa získa kryštalická polymorfná forma 1 roxifibanu v podstatne čistej forme je opísaný v príklade 2 ďalej.

Tvorba polymorfnej formy 2 je podporovaná relatívne pomalým ochladzovaním rekryštalizačného roztoku. Výhodne sa roztok obsahujúci menej než asi 20 ml rozpúšťadla na gram roxifibanu, výhodne menej než asi 10 mg rozpúšťadla na gram roxifibanu zahrieva na teplotu od asi 50’C do asi 65’C za účelom úplného rozpustenia zlúčeniny. Tento roztok sa potom ochladí na <35C ku kryštalizácii produktu, ktorým je najmä forma 2.

Polymorfná forma 2 sa môže získať v dobrom výťažku a vysokej čistote pomalým ochladením koncentrovaného roxifibanu v zmesovom rozpúšťadle metanol-kyselina octová-acetonitril. Výhodne zmesový rozpúšťadlový systém obsahuje metanol-kyselina octová-acetonitril v objemovom pomere asi 10:1,5:10.

Polymorfná forma 1 a forma 2 kryštalického roxifibanu môže byt lahko odlíšená práškovým rôntgenogramom a uhlíkovou NMR v pevnom stave. Rôntgenogramy polymorfnej formy 1 a polymorfnej formy 2 sú uvedené na obrázku 3. Hlavné piky v difraktograme pre polymorfnú formu 1 sa vyskytujú pri hodnotách 2Θ asi 6,4, 9,6, 12,5, 14,7, 19,3, 21,5, 22,5, 23,2, 25,2,

27,5 a 32,2. Relatívne intenzity pikov sa môžu líšiť, v závislosti od techniky prípravy vzorky, postupu upevnenia vzorky a použitého zariadenia. Použitie rôznych zariadení a variácia ostatných faktorov môžu ovplyvniť hodnoty 2Θ tak, že sa stanovené piky líšia o plus mínus 0,2.

Oblasť diafraktogramu, ktorá je najužitečnejšia pre odlíšenie polymorfnej formy 1 a polymorfnej formy 2 je okolo 13,6°. Polymorfná forma 2 vykazuje silný pik pri tomto uhlu, zatial čo difraktogram polymorfnej formy 1 je v tejto oblasti pomerne plochý.

Analýza uhlíkovou NMR v pevnom stave je rovnako užitočný postup pre polymorfnú charakterizáciu kryštalického roxifibanu. ¹³C NMR spektrá v pevnom stave, pri použití techník CP/MAS, potvrdzuje existenciu polymorfnej formy l a formy 2 roxifibanu. Ako je ukázané v spektre na obrázku 1, polymorfná forma 1 má nízko-symetrickú štruktúru, ako je evidentné z obsadenia n-butylovej skupiny v jednej z dvoch kryštalograficky neekvivalentných polôh. Na rozdiel, ako je uvedené v spektre na obrázku 2, n-butylová skupina polymorfnej formy 2 spočíva v jednej definovanej štrukturálnej polohe. Tak, spektrum polymorfnej formy 1 je charakterizované dvojitými pikmi pri 63 a 66 ppm a pri 19 a 21 ppm. Spektrum polymorfnej formy 2 vykazuje jednotlivé piky pri 66 a 19 ppm.

Postup ¹³C NMR v pevnom stave môže byt použitý pre kvantitatívnu analýzu zmesí polymorfnej formy 1 a formy 2. Pomer oblasti piku 63 ppm k oblasti piku pri 66 dobre koreluje s molárnym pomerom polymorfnej formy 1 k forme 2. Ďalej, pomer oblasti piku 21 ppm k oblasti piku pri 19 ppm tiež koreluje dobre s molárnym pomerom formy 1 : forme 2. Pre analýzu sa môže pripraviť a použiť štandardná krivka pripravená regresnou analýzou pomerov získaných zo zmesí polymorfov.

Taká kalibračná krivka je ilustrovaná na obrázku 4 výkresov.

I keď sa na kvantitatívnu analýzu polymorfných zmesí môže použiť postup využívajúci uhlíkovú NMR v pevnom stave, vynález nie je obmedzený na akúkoľvek osobitnú metódu analýzy pre identifikáciu žiadaného polymorfu.

Štúdie izotermálnej mikrokalorimetrie a fázovej rozpustnosti ukazujú, že termodynamické stability dvoch foriem roxifibanu sú veľmi podobné. Predpokladá sa, že polymorfná forma 2 je stabilnejšia pri teplotách pod 132’C, zatiaľ čo polymorfná forma 1 je nepatrne stabilnejšia pri teplotách nad 132’C. Tieto diferencie sú malé a produkt polymorfnej formy je polymorficky stabilný pri nasledujúcom skladovaní počas 19 mesiacov pri teplote miestnosti. Spontánna konverzia polymorfnej formy 1 na polymorfnú formu 2 nebola pozorovaná. Rozpustnosti vo vode kryštalickej polymorfnej formy 1 a formy roxifibanu sú veľmi blízke a neboli pozorované žiadne biologické rozdiely medzi týmito dvoma polymorfnými formami.

Jednotkové bunkové parametre a atómové koordináty kryštalických polymorfov formy 1 a formy 2 sa môžu stanoviť technikami využívajúcimi rôntgenogram monokryštálu, pokiaľ je vhodne velký kryštál k dispozícii. Pokiaľ formy 1 alebo 2 roxifibanu tvoria doštičkové alebo ihlové kryštály, nemôžu nikdy dosiahnuť veľkosť dostatočnú pre jednotlivý difrakčný obrazec. Všeobecne, analýza dvoch foriem v monokryštálových štúdiách ukázala, že kryštály sú buď zdvojené alebo aglomerované. V tomto prípade môže byt na stanovenie jednotkových buniek použitá transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) a synchrotrónny práškový rôntgenogram.

Výraz zmesový rozpúšťadlový systém ako sa tu používa zahŕňa rozpúšťadlový systém obsahujúci zmes dvoch alebo viacerých rozpúšťadiel. Výhodné rozpúšťadlové systémy podľa vynálezu sú rozpúšťadlové systémy zahŕňajúce kyselinu octovú, acetonitril a acetón alebo kyselinu octovú, anizol a acetón.

Predkladaný vynález opisuje polymorfy v podstatne čistej forme. Výraz podstatne čistej forme znamená, že zlúčenina má čistotu vyššiu ako 90 percent, vrátane 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 a 100 percent.

Kryštalické formy roxifibanu opísané v opise môžu byt formulované do farmaceutických prostriedkov a použité pri terapeutických a profylaktických metódach, ako je opísané v hore uvedenej medzinárodnej prihláške PCT/US94/13155. Napríklad popri použití pri liečbe tromboembolických chorôb a ostatných chorôb bunkovej adhézie, môžu byť nové kryštalické roxifibanové produkty podľa vynálezu použité pri chirurgii periférnych artérií (arteriálne štepy, endarterektómia karotidy) a v kardiovaskulárnej chirurgii, pri ktorých dochádza k manipulácii s tepnami alebo orgánmi a/alebo interakci doštičiek s umelými povrchmi, ktoré vedú k agregácii doštičiek a konzumpcii a agregované doštičky môžu vytvárať tromby a tromboemboly. Zlúčeniny podľa vynálezu je možné podávať chirurgicky ošetrovaným pacientom, aby sa predchádzalo tvorbe trombov a tromboembolov.

Také kryštalické zlúčeniny sa môžu použit v mimoteíových zariadeniach na inhibiciu interakcie doštičkového glykoproteínu Ilb/IIIa na dostičkových membránach s fibrinogénnymi alebo inými bunkovými adhezivnymi proteínmi absor, bovanými na povrchu mimotelového obehu.

• Kryštalické formy roxifibanu podlá vynálezu je možné podávať v takých orálnych dávkovacích formách, ako sú tablety a kapsuly (vrátane týchto foriem s predĺženým alebo odloženým uvoíňovaním), pilulky, prášky, granuly, elixíry, tinktúry, suspenzie, sirupy a emulzie. Podobne sa dajú tiež podávať intravenóznou cestou (v podobe bolu alebo infúzie), intraperitoneálne, subkutánne alebo intramuskulárnou cestou, vždy pri použití dávkovacích foriem, ktoré sú dobre známe odborníkom vo farmaceutickom odbore. Môžu byt podávané samotné, ale zvyčajne sú podávané s farmaceutickými nosičmi, vybranými s ohíadom na cestu podania a štandardnú farmaceutickú prax.

Pokiaí je roxifiban rozpustený, potom stráca svoju kryštalickú formu; môže však byť použitý na prípravu kvapalných formulácií, v ktorých je liečivo rozpustené alebo suspendované. Ďalej môže byt kryštalický roxifiban vpravený do pevných formulácií, ako sú tablety, kapsuly, suspenzie apod. Terapeuticky účinné množstvo kryštalického roxifibanu je kombinované s farmaceutický prijateíným nosičom za vzniku ¹ farmaceutických prostriedkov podía vynálezu. Pod označením terapeuticky účinné množstvo sa rozumie množstvo, ktoré je pri podaní samotné alebo v kombinácii s prídavným terapeutickým činidlom schopné predísť chorobe alebo stavu alebo rozvoju choroby alebo stavu.

Dávkové formy (farmaceutické prostriedky) vhodné pre podanie môžu zvyčajne obsahovať od asi 0,05 do asi 50 mg kryštalického roxifibanu na jednotkovú dávku, v týchto farmaceutických prostriedkoch bude kryštalický roxifiban zvyčajne prítomný v množstve od asi 0,1-95 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť prostriedku.

Keď sa napríklad má kryštalický roxifiban podávať orálne vo forme tablety alebo kapsuly, kombinuje sa s orálnymi netoxickými inertnými vhodnými nosičovými materiálmi, ako je laktóza, škrob, sacharóza, glukóza, metylcelulóza, stearát horečnatý, dikalciumfosfát, síran vápenatý, manitol, sorbitol apod. Ako nosičové materiály vhodné pre kvapalné orálne prostriedky je možné uviesť orálne netoxické farmaceutický vhodné inertné nosičové materiály, ako je etanol, glycerol, voda apod. Pokial je to žiadúce alebo nutné, môžu sa navyše pridávať vhodné spojivá, mazadlá, napúčacie látky a farbiace činidlá. Ako vhodné spojivá je možné uviesť škrob, želatínu, prírodné cukry, ako je glukóza alebo β-laktóza, škrobové sladidlá, prírodné a syntetické živice, ako je živica, tragant alebo alginát sodný, karboxymetylcelulóza, polyetylénglykol, vosky apod. Mazadlá používané v týchto dávkovacích formách zahŕňajú oleát sodný, stearát sodný, stearát horečnatý, benzoát sodný, octan sodný, chlorid sodný apod.

Ako neobmedzujúce príklady napúčacích látok (dezintegračných prísad) je možné uviesť škrob, metylcelulózu, agar, bentonit, xantánovú živicu apod.

Kryštalické roxifibanové zlúčeniny podlá vynálezu môžu byt tiež formulované do prostriedkov pre intranazálne alebo topické použitie, pri použití dodávacích systémov dobre známych odborníkom. Alternatívne pre dodávanie liečiva môžu byt použité ionoforézne náplasti na kožu.

Kryštalický roxifiban je tiež možné podávať vo forme lipozomálnych dávkovacích systémov zahŕňajúcich malé jednovrstvové vezikuly, velké jednovrstvové vezikuly a viacvrstvové vezikuly. Lipozómy sa môžu vytvárať z rôznych fosfolipidov, ako je cholesterol, stearylamín a fosfatidylcholíny.

Kryštalický roxifiban je tiež možné kombinovať s rozpustnými polymérmi, ako nosičmi liečiv na zacielenie na požadované miesto účinku. Ako také polyméry je možné uviesť polyvinylpyrolidón, pyránový kopolymér, polyhydroxypropylmetakrylamidfenol, polyhydroxyetylaspartamidfenol alebo polyetylénoxid-polylyzín substituovaný zvyškami kyseliny palmitovej. Ďalej je tiež možné zlúčeniny podía vynálezu kombinovať s triedou biodegradovateíných polymérov, ktorá je užitočná pre dosiahnutie regulovaného uvoíňovania liečiva. Ako neobmedzujúce príklady vhodných biodegradovateíných polymérov je možné uviesť kyselinu polymliečnu, kyselinu polyglykolovú, kopolyméry kyseliny mliečnej a glykolovej, polyepsilon-kaprolaktón, kyselinu polyhydroxymaslovú, polyortoestery, polyacetaly, polydihydropyrány, polykyanoakryláty a zositované alebo amfipatické blokové kopolyméry hydrogélov.

Želatínové kapsuly kryštalického roxifibanu môžu obsahovať zlúčeninu a práškové nosiče, ako je laktóza, škrob, deriváty celulózy, stearát horečnatý, kyselina stearová apod. Podobné riedidlá sa tiež môžu používať pri výrobe lisovaných tabliet. Ako tablety, tak kapsuly je možné vyrábať ako formy s predĺženým uvoľňovaním, ktoré sú vhodné pre kontinuálne uvoíňovanie liečiva počas niekoľkých hodín. Lisované tablety môžu byť potiahnuté cukrovými povlakmi alebo vhodnými filmami na zamaskovanie nepríjemnej chuti a na ochranu tabliet pred vonkajšou atmosférou alebo enterickými povlakmi za účelom dosiahnutia selektívneho rozpadu v gastrointestinálnom trakte. Ako vhodné nosiče pre parenterálne roztoky je možné uviesť vodu, vhodné oleje, roztok chloridu sodného, roztok dextrózy (glukózy) a podobné cukrové roztoky a ďalej tiež glykoly, ako je propylénglykol alebo polyetylénglykoly. Roztoky pre parenterálne roztoky sa pripravia rozpustením kryštalického roxifibanu v nosiči, a keď je to nezbytné, pridaním tlmivých substancií. Ako vhodné stabilizátory je možné uviesť antioxidanty ako je hydrogensiričitan sodný, siričitan sodný a kyselina askorbová, ktoré sa môžu používať jednotlivo alebo v zmesiach.

Tiež sa používa kyselina citrónová a jej soli a sodné soli etyléndiamíntetraoctovej kyseliny (EDTA). Parenterálne roztoky okrem toho môžu obsahovať konzervačné látky, ako je benzalkóniumchlorid, metyl- alebo propylparabén a chlórbutanol.

Vhodné farmaceutické nosiče sú opísané v publikácii • Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., čo je štandardná príručka v tomto odbore. Užitočné farmaceutické dávkovacie formy zlúčenín podľa tohto vynálezu sú ilustrované dalej.

Kapsuly

Kapsuly sa vo veľkom meradle vyrobia tak, že sa štandardné dvojdielne tvrdé želatínové kapsuly naplnia vždy 2 mg kryštalického roxifibanu, 150 mg laktózy, 50 mg celulózy a 6 mg stearátu horečnatého.

Mäkké želatínové kapsuly

Zmes účinnej prísady a jedlého oleja, ako napríklad sójového oleja, bavlníkového oleja alebo olivového oleja, sa pomocou objemového čerpadla vstrekuje do želatíny. Tak sa získajú mäkké želatínové kapsuly, z ktorých každá obsahuje 2 mg roxifibanu. Vzniknuté kapsuly sa opláchnu a usušia.

»

Tablety

Tablety sa vo veľkom množstve pripravia konvenčným spôsobom tak, že každá obsahuje 2 mg kryštalického roxifibanu, 0,2 mg koloidného oxidu kremičitého, 5 mg stearátu horečnatého, 275 mg mikrokryštalickej celulózy, 11 mg škrobu a 98,8 mg laktózy. Na zvýšenie prijateľnosti pre pacienta a pre časový odklad absorpcie sa tablety môžu opatriť vhodnými povlakmi.

Injekčný prostriedok

Parenterálny prostriedok vhodný pre injekčné podávanie sa pripraví rozmiešaním 0,2 % hmotnostného kryštalického roxifibanu v 10% (objemovo) propylénglykole vo vode. Vzniknutý roztok sa izotonizuje chloridom sodným a sterilizuje.

Suspenzia

Vyrobí sa vodná suspenzia pre orálne podávanie, ktorá v 5 ml obsahuje 2 mg jemne rozdeleného kryštalického roxifibanu, 200 mg sodnej karboxymetylcelulózy, 5 mg benzoátu sodného, 1,0 g sorbitolu podlá US liekopisu a 0,025 ml vanilínu.

Analytické metódy

Difrakcia rôntgenového žiarenia prášku

Údaje difrakcie rôntgenového žiarenia v prášku sa získajú na automatickom difraktometri Philips Model 3720. Vzorky sa spracujú dávkovým spôsobom s viacpolohovým meničom vzorky, model PW 1775. Difraktometer je opatrený premenlivou štrbinou (©-kompenzačná štrbina), scintilačným počítačom a grafitovým monochromátorom. Radiácia je CuKa (40 kV, 30 mA). Údaje sa zberajú pri teplote miestnosti od 2 do 60 stupňov 2Θ; velkosť kroku je 0,02 stupňov; odčítací čas 0,5 sec. na stupeň. Vzorky sa pripravujú na sklenených držiakoch ako tenká vrstva práškového materiálu bez rozpúšťadla.

Uhlíková NMR v pevnom stave

Spektrá ¹³C NMR v pevnom stave sa získajú na zariadení Varian VXR-200S NMR pracujúcom pri 50,3 MHZ pre ¹³C použitím techniky CP/MAS. Na snímanie spektra sa použije vzorka približne 200 mg. Všetky merania sa uskutočňujú pri teplote okolia. Chemické posuny sa zapíšu na TMS stupnicu pri použití hexametylbenzénu ako sekundárnej referencie. Priradenie rezonancie v pevnom stave sa vykonajú pri použití prerušovanej dekuplážnej pulznej sekvencie v kombinácii s experimentmi v roztoku, uskutočnenými na zariadení Varian Unity 400 pracujúcom pri 100 MHz.

Priradenie počiatku signálnych multiplicít v spektre vyžaduje ďalšie ¹³C CP/MAS NMR experimenty, ktoré sa vykonajú pri nižšej statickej sile pole. Toto sa urobí na 100-MHz spektrometri s ¹³C rezonančnou frekvenciou 25,2 MHz.

Synchrotrónna difrakcia rôntgenového žiarenia v prášku

Jednotkové bunkové parametre dvoch polymorfov roxifibanu sa stanovia kombináciou transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) a synchrotrónnej difrakcie rôntgenového žiarenia v prášku. TEM zahŕňa mikroskop JEM-2000X (pri 200 kV akcelerovanej voltáže), opatrený kamerou Gatan 1024x1024 CCD na charakterizáciu materiálu. Synchrotrónne rôntgenogramy v prášku sa zoberú na Huberovom difraktometri pri línii zväzku lúčov DND-5BMB. Aby sa dosiahlo najvyššie možné rozlíšenie a najvyšší pomer signál/šum, použije sa Si(111) analyzátor a štrbiny zoradené po 1x8 mm v spojení so scintilačným počítačom.

Vynález je ďalej bližšie opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré majú iba ilustratívny charakter a ktoré v žiadnom prípade neobmedzujú rozsah vynálezu.

Príklady rozpracovania vynálezu

Príklad 1

Syntéza kryštalického roxifibanu

4-Kyanobenzaldoxím. Roztok metanolu (272,1 1), 4kyanobenzaldehydu (50 kg, 381,3 mol) a hydroxylaminsulfátu (36,1 kg, 219,7 mol) sa mieša pri 55 až 60“C počas 3 hodín a potom sa pridá voda (272 1). Zmes sa ochladí na 0 až 5C a pri tejto teplote sa udržuje 30 minút. Filtračný koláč sa premyje zmesovým rozpúšťadlom studeného metanolu a vody (pomer 2/3, 735 1) a vodou (750,0 1) a suší sa vo vákue (60 až 70°C) do konštantnej hmotnosti: 54,1 kg, výťažok 97 %; teplota topenia 174 až 176’C; ¹H NMR δ 7,82 (2H), 7,88 (2H), 88,26 (1H), 12,00 (1H). Analýza vypočítané pre CqH₆N₂O: C, 65,75;

H, 4,14; N, 19,17. Nájdené C, 65,73; H, 4,26; N, 19,14.

(-)-Izobutyl 2-[3-(4-kyanofenyl)-4,5-dihydro-5-izoxazolyl]acetát III. K roztoku DMF (262,0 1), 4-kyanobenzaldoxímu (46 kg, 342,1 mol) a N-chlórsukcínimidu (54 kg,

389,4 mol) sa pridá izobutylvinylacetát (95 kg, 665,7 mol). Roztok sa ochladí na 2 až 6°C a počas 4 hodín sa pridá pomaly trietylamín (40 kg, 388,6 mol). Reakčná zmes sa mieša pri rovnakej teplote ďalšiu 1 hodinu. Potom sa pridá voda (330,0 1) a kyselina chlorovodíková (1 N, 49 1). Surový produkt sa zoberie filtráciou, premyje sa vodou (555,0 1) a opäť sa rozpustí v toluéne (500,0 1, 40°C). Organická vrstva sa premyje vodou (291,0 1) a suší sa azeotropickou destiláciou (odstránenie asi 250 1 toluénu). Pridá sa heptán a reakčná zmes sa ochladí na 0 až 5°C počas 3 hodín. Produkt sa zoberie filtráciou a premyje sa zmesou toluén/heptán (150 1, pomer 1/2). Produkt sa suší vo vákue pri 55 až 60°C do konštantnej hmotnosti: 81,8 kg, 90% výťažok, teplota topenia 98 až 100’C; ¹H NMR (CDC1₃) δ 0,96 (6H), 1,96 (1H), 2,70 (1H), 2,92 (1H), 3,15 (1H), 3,56 (1H), 3,90 (2H), 5,20 (1H), 7,70 (2H), 7,80 (2Η). Analýza vypočítané pre ^ci6^Hi8^N2°3^{: c}' ⁶⁷f¹²» H, 6,34;

N, 9,78. Nájdené: C, 67,06; H, 6,20; N, 9,76.

(R)-2-[3—(4-kyanof enyl) -4,5-dihydro-5-izooxazolyl ] octová kyselina. Suspenzia H₂0 (597,0 1), NaH₂PO₄-H₂O (60,0 kg), vodného NaOH (33%, 36 1), Tritonu X-100 (3,2 kg), zlúčeniny III (40,0 kg, 139,7 mol) a lipázy PS30 (4,0 kg, obsah enzýmov 8 %) sa pomaly zahrieva na 40°C a udržuje sa pri teplote v rozsahu 40 až 43’C, kým rozpustenie nie je úplné (cca 16 hodín). pH reakčnej zmesi sa udržuje medzi 7,4 a 8,0 a upravuje sa pridávaním 33% vodného NaOH. Po dokončení reakcie sa vsádzka ochladí a pH reakčnej zmesi sa upraví na 8,0 až 8,2 pridaním vodného NaOH (33 %, 11,0 1). Surový nezreagovaný s-ester sa zoberie filtráciou cez vrstvu Celitu (20 kg) a premyje sa vodou (70 1). Surový ester sa recykluje cez racemizačný Stupeň. ³H NMR (CDC1₃) δ 0,95 (6H), 1,8 (1H), 2,69 (1H), 2,91 (1H), 3,14 (1H), 3,54 (1H), 3,91 (2H), 5,13-5,23 (1H), 7,68-7,78 (4H).

Potom sa upraví pH roztoku filtrátu (cca 800 1) a izopropylacetátu (20 1) pomocou koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (cca 57 kg) na 2,8 až 3,2. Surový produkt kyseliny IV sa zrazí, zoberie sa filtráciou a premyje sa vodou (70 1). Tento surový produkt sa kryštalizuje z horúceho etanolu (525,0 1) a získa sa opticky čistá zlúčenina IV. Izoxazolín IV sa zoberie filtráciou, premyje sa etanolom (76,0 1) a suší sa do konštantnej hmotnosti: 12,3 kg, 77% výťažok založený na množstve IV v III; teplota topenia 198 až 200’C; ^H NMR δ 2,70 (2H), 3,20 (1H), 3,59 (1H), 5,00-5,10 (1H), 7,78-7,91 (4H), 12,44 (1H). Analýza vypočítané pre ^C12^H10^N2°3^{: C}·

62,61; H, 4,38; N, 12,17. Nájdené: C, 62,39; H, 4,49; N, 11,98.

Racemizácia s-esteru na III. Roztok toluénu (414,0 1) a surového s-esteru (cca 120 kg mokrého koláča) sa zahrieva na 50’C a filtruje sa pre odstránenie Celitu (cca 40 kg).

Filtračný koláč sa premyje toluénom (72,0 1). Organické vrstvy sa spoja a premyjú sa soľným roztokom (108,0 1). Po odstránení vodnej vrstvy sa organická vrstva suší azeotropickou destiláciou do konštantného bodu varu (111°C). Vsádzka sa ochladí na 40°C a pridá sa terc.butoxid draselný v terc.butylalkohole (1 N, 1,6 1). Reakčná zmes sa mieša (200 otáčok za minútu) pri 40C, kým racemizácia nie je kompletná. Vsádzka sa ochladí na 20 až 25°C a pridá sa voda. Reakčná zmes sa neutralizuje pridaním vodnej kyseliny chlorovodíkovej (IN, 1,6 1). Vodná spodná vrstva sa odstráni a organická vrstva sa koncentruje destiláciou. Reakcia sa ochladí na 60“C a potom sa odstráni cca 380,0 1 toluénu. K tomuto roztoku sa pridá heptán (115 1) a reakčná zmes sa udržuje pri 50°C počas 1 hodiny. Zmes sa ochladí na 0 až 5“C a udržuje sa 2 hodiny. Produkt IV sa zoberie filtráciou a premyje sa zmesovým rozpúšťadlom toluénu a heptánu (pomer 1/2, 70 1). Produkt III sa suší vo vákue (50 až 55’C do konštantnej hmotnosti: 17,3 kg, výťažok 87 %.

(R)-Metyl-3-[[[3-(4-kyanofenyl)-4,5-dihydro-5-izoxazolyl]acetyl]amino]-N-(butoxykarbonyl)-L-alanín V. Roztok acetonitrilu (402,0 1), kyseliny IV (12,0 kg, 52,10 mol), amínu (22,4 kg, 57,30 mol) a tionylchloridu (6,8 kg, 57,30 mol) sa mieša pri 0 až 5°C počas 1 hodiny. K tomuto roztoku sa pridá pri teplote 20’C počas 90 minút diizopropyletylamín (22,2 kg, 172,00 mol). Po reakcii sa pridá voda (612,0 1). Surový produkt V sa vyzráža. Tento surový produkt V sa zoberie filtráciou a premyje sa vodou (96,0 1). Vlhký koláč sa rozpustí v horúcom metanole (50 až 60’C) a nerozpustné častice sa zoberú filtráciou. Roztok sa chladí pri teplote 0 až 5’C počas 3 hodín a produkt sa zoberie filtráciou a premyje sa metanolom (75,0 1). Produkt sa suší vo vákue (55 až 60’C) do konštantnej hmotnosti: 18,3 kg, 82% výťažok, teplota topenia 154 až 156’C; ^XH NMR δ 0,92 (3H), 1,37 (2H), 1,59 (2H), 1,67 (1H), 2,58 (1H), 2,71 (1H), 3,22 (1H), 3,51 (1H), 3,67 (2H), 3,77 (3H), 4,06 (2H), 4,44 (1H), 5,14 (1H), 5,70 (1Η), 6,38 (1H), 7,70 (2H), 7,77 (2H). Analýza vypočítané pre ^C12^H10^N2°6^{; C}' ⁶²,61; ^H' ⁴<^{38; N}» 12,17. Nájdené C, 62,39; H, 4,49; N, 11,98.

(R)-Metyl-3-[[[3-[4-(aminoiminometyl)fenyl]-4,5-dihydro-5-izoxazol ] acetyl ] amino ] -N- (butoxykarbonyl) -L-alanín monoacetát I. Roztok metylacetátu (55,8 1), metanolu (4,8 1), HCI (9,6 kg) a zlúčeniny 4 (12,0 kg, 27,88 mol) sa ochladí na teplotu -20°C a mieša sa pri 0,211 - 0,352 kg/cm² (HCI) pri teplote 10°C počas 27 hodín. Po skončení reakcie sa HCI odstráni vo vákue a pridajú sa metylacetát (21,5 1) a metanol (63,2 1). Zvyšná HCI sa neutralizuje amoniakom (2,5 kg) pri teplote 10’C. Vzniknutý chlorid amónny sa odstráni filtráciou. Filtračný koláč sa premyje metylacetátom a metanolom (20,0 1). K filtrátu sa pridá octan amónny (6 kg) a reakčná zmes sa mieša pri teplote miestnosti cez noc. Surový produkt sa zoberie filtráciou a získa sa DMP 754: 10,4 kg, 74% výťažok.

Príklad 2

Polymorfná forma 1 kryštalického roxifibanu

Kaša roxifibanu (1,38 kg, 2,73 mol) v acetonitriie (5,5 1) sa pridá k ladovej kyseline octovej (2,77 1, 48,4 mol). Táto kaša sa zahrieva na 80C a všetky pevné látky sa rozpustia. Roztok sa potom ochladí na 40 až 45°C a počas 30 minút sa pridá acetón (12,5 1). Vzniknutá kaša sa mieša pri 20 až 25°C počas 1 hodiny a potom sa ochladí na 0 až 5’C na 1 hodinu. Pevné látky sa filtrujú, premyjú s 10% metanolom v acetóne (11 1) a sušia sa vo vákue pri 65°C. Tak sa získa 1,26 kg (91 %) polymorfná formy 1 kryštalického roxifibanu.

Podlá postupu opísaného hore bola vykonaná rôntgenová difrakčná analýza prášku tohto materiálu. Difraktogram je uvedený na obrázku 1. Difraktogram vykazuje hodnoty 2Θ

6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,5 ± 0,2, 14,7 ± 0,2, 19,3 ± 0,2,

21,5 + 0,2, 22,5 ± 0,2, 23,2 ± 0,2, 25,2 ± 0,2, 27,5 ± 0,2 a 32,2 ± 0,2. Bola rovnako uskutočnená ¹³C CP/MAS NMR analýza látky v pevnom stave, ako je uvedené hore. Vzniknuté spektrum je uvedené na obrázku 1. Spektrum vykazuje dvojité piky pri 19/21 ppm a 63/66 ppm, ktoré sú charakteristické pre polymorfnú formu 1. Tento materiál bol určený ako podstatne čistá polymorfná forma roxifibanu, pričom nebola nájdená žiadna polymorfná forma 2.

Príklad 3

Roztok roxifibanu (2,0 g, 3,9 mmol) sa pripraví rozpustením v metanole (15 ml) a kyseline octovej (3 ml) pri spätnom toku. Nerozpustné látky sa odstránia filtráciou cez Celit; všetok roxifiban, ktorý kryštalizuje na filtračných časticiach sa premyje 5 ml horúceho metanolu. Filtrát sa opát zahreje k spätnému toku a ako náhle sa všetky pevné látky rozpustia, pridá sa počas 10 minút acetonitril (20 ml). Roztok sa zahrieva ďalších 10 minút, aby sa opät rozpustili všetky pevné látky, čo je zrejmé počas pridania acetonitrilu a potom sa roztok pomaly ochladí na teplotu okolia. Ako náhle začne ochladzovanie, roztok sa očkuje stopami kryštálov formy 2, kým je suspenzia zakalená. Po 2 hodinách sa suspenzia opät zahreje a 30 ml destilátu sa odstráni, pričom objem sa udržuje pridaním acetonitrilu. Objem sa ďalej zriedi ďalšími 8 ml acetonitrilu a kaša sa ochladí na 15°C počas 100 minút. Kryštály sa filtrujú, premyjú sa 15 ml acetonitrilu a sušením vo vákue sa získa roxifiban (1,82 g, 91% výťažok) ako biela pevná látka. Difrakčnou rôntgenovou analýzou prášku sa stanoví, že ide o formu 2 a stopy alebo žiadnu formu 1.

Príklad 4

Rekryštalizácia sa vykoná spôsobom, ktorý je podobný príkladu 3 s výnimkou toho, že výmena rozpúšťadla je úplná a spätný tok sa udržuje cez noc. Následné spracovanie pokračuje ako v príklade 3 na izoláciu roxifibanu (1,83 g, 91% výťažok) vo forme bielej pevnej látky. Difrakčná rontgenová analýza prášku stanoví, že ide o formu 2 a stopy alebo žiadnu formu 1

Príklad 5

Do 100 ml banky s guľatým dnom sa vloží forma 1 roxifibanu (3,6 g, 6,1 mmol), 30 ml metanolu a octan amónny (0,47 g, 6,1 mmol). Zmes sa jemne zahrieva pod spätným tokom za intenzívneho miešania a suspenzia sa mieša pri spätnom toku 6 hodín. Zmes sa potom pomaly ochladí počas 4 hodín na teplotu izby. Pevné látky sa filtrujú a premyjú sa 20 ml zmesi rozpúšťadiel metanolu a acetonitrilu (1/1, obj./obj). Pevné látky sa sušia vo vákue a získa sa roxifiban (3,1 g,

86% výťažok) ako biele ihličky. Difrakčnou rôntgenovou analýzou prášku sa stanoví, že ide o formu 2 a stopy alebo žiadnu formu 1.

Príklad 6

Do trojlitrovej banky s guľatým dnom sa vloží roxifiban (108,0 g, 0,182 mmol, zmes formy 1 a formy 2), octan amónny (15,2 g, 0,182 mmol) a 1100 ml metanolu. Zmes sa zahrieva pri spätnom toku a vzniknutá suspenzia sa mieša 4 hodiny. Zmes sa potom ochladí počas 5 hodín na 10’C. Pevné látky sa zoberú a premyjú sa 400 ml rozpúšťadlovej zmesi metanolu a acetonitrilu (1/1, obj./obj.). Pevné látky sa sušia vo vákue a získa sa roxifiban (101,0 g, 93,5% výťažok) vo forme bielych ihličiek. Difrakčná rontgenová analýza prášku stanoví, že ide o formu 2 roxifibanu a stopy alebo žiadnu formu 1.

Príklad 7

Synchrotrónne práškové difrakcie sa zoberú na vzorkách formy 1 a 2 roxifibanu, aby sa stanovili jednotkové bunkové parametre dvoch foriem. Uskutoční sa deväť skúšok, pri použití identických optík: SI (111) monochromátorové kryštály a Si(111) analyzačný kryštál a Sollerove štrbiny. Použijú sa vlnové dĺžky 0,49617 A a 1,00006 A. Vzorky sa pripravia následovne:

Príprava vzorky

Forma 1 v 1,0 mm kapiláre Forma 1 v 1,5 mm kapiláre Forma 2 v 1,0 mm kapiláre Forma 2 v 1,5 mm kapiláre Forma 1 nemletá na doske Forma 1 mletá na doske Forma 2 nemletá na doske Forma 2 mletá na doske Forma 1 a 2 mletá na doske vlnová dĺžka 0,49617 A

1,00006 A

II

Stanovenie jednotkovej bunky formy 1:

Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) preukázala, že bunková forma má nízku symetriu, nech monoklonnú alebo trojklonnú, s dvoma z troch bunkových os, ktoré sú okolo 5 a 9-10 A, a uhlom 81”. Synchrotrónne modely ukázali, že tretia osa je oveía dlhšia (asi 27-28 A). Objem molekuly je asi 643 A³, čo je kompatibilný s dvoma molekulami na bunku. Parametre bunky boli upresnené s CELLREF a čísla boli použité v LeBailovom postupe v GSAS. Upravené parametre trojklonnej jednotkovej bunky, s priestorovou skupinou PI a Z=2 poskytli finálnu jednotkovú bunku stanovenú pre polymorfnú formu 1.

Forma 1	a	b c	a	β
Hodnota:	5,02349	28,07480 9,29536	98,533	98,498
Sigma:	0,00047	0,00228 0,00092	0,006	0,009
	gama	V
Hodnota:	92,244	1279,712
Sigma:	0,008	0,208
Stanovenie	i jednotkovej bunky formy 2:

Výsledky transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) ukázali, že hodnoty a, c a β formy 1 a 2 sú podobné. Piky vo vzorke formy 2 nemohli byt zaznamenané, pokiaľ jeden z bunkových okrajov nebol zdvojený. To vyžadovalo, aby štyri molekuly patrili bunke a ako taká, by bunka mala byt pravdepodobne monoklonná s priestorovou skupinou P21. Dlhá osa bola predpokladaná ako b, TEM difrakciou vzorky sa zistilo, že projekcia 5-9 A má uhol 81*. Úprava uhlov alfa a gama na 90°, pri súčasnej úprave uhlov a, c a β poskytuje bunku, ktorá je konzistentná s formou 2. Parametre buniek boli rafinované s CELLREF a čísla boli použité v LeBailovom postupu v GSAS na

stanovenie	finálnej jednotkovej	bunky pre	polymorfnú	formu 2.
Forma 1	a b	c	a	β
Hodnota:	4,99190 54,77106	9,37211	90,000	99,154
Sigma:	0,00175 0,02405	0,0035	0,000	0,037
	gama V
Hodnota:	90,000 2529,806
Sigma:	0,000 1,461

Ή /666- V)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kryštalický roxifiban.
2. Kryštalický roxifiban podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je v podstate v čistej forme.
3. Roxifiban podľa nároku 2, vyznačuj úci sa t ý m, že jeho čistota je vyššia ako 90 %.
4. Polymorfná forma 1 kryštalického roxifibanu.
5. Roxifiban podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m, že je v podstate v čistej forme.
6. Roxifiban podľa nároku 5, vyznačuj úci sa t ý m, že jeho čistota je vyššia ako 90 %.
7. Polymorfná forma 1 podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že je charakterizovaná ¹³C CP/MAS NMR spektrom v pevnom stave majúcom dvojité piky pri 63 a 66 ppm.
8. Polymorfná forma 1 podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pevnom stave má dvojité piky pri 19 a 21 ppm.
9. Polymorfná forma 1 podľa nároku 4, v y z n a čujúca sa tým, že má ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pevnom stave v podstate v zhode so spektrom uvedeným na obrázku 1.
10. Polymorfná forma 1 podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že je charakterizovaná práškovým rôntgenogramom zahŕňajúcim hodnoty 2Θ 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2,

12,5 ± 0,2, 14,7 ± 0,2, 19,3 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 22,5 ± 0,2, 23,2 ± 0,2, 25,2 ± 0,2, 27,5 ± 0,2 a 32,2 ± 0,2.
11. Polymorfná forma 1 podlá nároku 10, v y z n a čujúca sa tým, že práškový rôntgenogram neobsahuje v podstate piky pri 2Θ 13,6 ± 0,2.
12. Polymorfná forma 1 podlá nároku 4, vyznačujúca sa tým, že práškový rôntgenogram je v podstate v súlade s rôntgenogramom uvedeným na obrázku 3.
13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že je pripravený kombináciou účinného množstva zlúčeniny podlá nároku 4 s farmaceutický prijatelným nosičom.
14. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že je v kvapalnej alebo pevnej forme.
15. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuje asi 0,1 mg až asi 25 mg zlúčeniny na jednotkovú dávku.
16. Farmaceutický prostriedok v pevnej jednotkovej dávkovej forme, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podlá nároku 4 a farmaceutický prijatelný nosič.
17. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že je vo forme kapsuly, tablety, prášku alebo granuly a obsahuje asi 0,1 mg až asi 25 mg zlúčeniny.
18. Spôsob inhibície väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa poskytnutie zlúčeniny podlá nároku 4, v množstve, ktoré je dostatočné na to, aby viedlo ku kontaktu glykoproteínového Ilb/llla komplexu doštičiek s účinným inhibičným množstvom aktívnej liečivej substancie.
19. Spôsob podlá nároku 18, vyznačujúci sa t ý m, že rozpustný adhezívny proteín je fibrinogén, von Willebrandov faktor, fibronektín alebo vitronektín.
20. Spôsob podlá nároku 18, vyznačujúci sa t ý m, že zlúčenina je poskytnutá ludskému alebo zviereciemu subjektu na inhibíciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vi vo.
21. Spôsob podlá nároku 18, vyznačuj úci sa t ý m, že zlúčenina je poskytnutá do mimotelového zariadenia na inhibíciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vitro.
22. Spôsob liečby alebo prevencie tromboembolických chorôb, zahŕňajúcich tvorbu trombu alebo embolu, zhubnú agregáciu doštičiek, reoklúziu nasledujúcu trombolýzu, reperfúzne zranenia, restenózu, aterosklerózu, mŕtvicu, infarkt myokardu a nestabilnú angínu, vyznačujúci sa tým, že sa podá hostitelovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podlá nároku 4.
23. Spôsob podlá nároku 22,vyznačujúci sa t ý m, že sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,001 do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti denne.
24. Spôsob podľa nároku 22, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,005 do asi 1 mg/kg telesnej hmotnosti denne.
25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zlúčenina podá pre liečbu alebo prevenciu infarktu myokardu alebo mŕtvice.
26. Spôsob liečby alebo prevencie chorôb zahŕňajúcich reumatickú artritídu, astmu, alergiu, respiračný syndróm dospelých, odmietnutie transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktnú dermatitídu, osteoporózu, osteoartritídu, nádorové metastázy, diabetickú retinopatiu, zápalové stavy a zápalové ochorenia tlstého čreva, vyznačujúci sa t ý m, že sa podá hostiteľovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo zlúčeniny podľa nároku 4.
27. Polymorfná forma 1 kryštalického roxifibanu, vyznačujúca sa tým, že sa pripraví rekryštalizáciou roxifibanu zo zmesového rozpúšťadlového systému.
28. Polymorfná forma 2 kryštalického roxifibanu.
29. Roxifiban podľa nároku 28,vyznačujúci satým, žejev podstate v čistej forme.
30. Roxifiban podľa nároku 5, vyznačuj úci sa t ý m, že jeho čistota je vyššia ako 90 %.
31. Polymorfná forma 2 podľa nároku 28, vyznačujúca sa t ý m, že je charakterizovaná ¹³C CP/MAS NMR spektrom v pevnom stave majúcim jeden pik pri 66 pm a žiadny podstatný pik pri 63 ppm.
32. Polymorfná forma 2 podlá nároku 31, vyznačujúca sa tým, že ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pevnom stave má jeden pik pri 19 ppm a žiadny podstatný pik 21 ppm.
33. Polymorfná forma 2 podlá nároku 28, vyznačujúca sa t ý m, že má ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pevnom stave v podstate v zhode so spektrom uvedeným na obrázku 2.
34. Polymorfná forma 2 podlá nároku 28, vyznačujúca sa tým, že je charakterizovaná práškovým rôntgenogramom zahŕňajúcim hodnoty 2Θ 6,4 + 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,4 ± 0,2, 13,6 ± 0,2, 18,8 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 22,6 ± 0,2, 23,1 ± 0,2, 25,1 ± 0,2, 26,1 ± 0,2, 27,3 ± 0,2 a 28,5 ± 0,2.
35. Polymorfná forma 2 podlá nároku 28, vyznačujúca sa tým, že práškový róntgenogram je v podstate v súlade s rôntgenogramom uvedeným na obrázku 3.
36. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že je pripravený kombináciou terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podlá nároku 28 s farmaceutický prijatelným nosičom.
37. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 36, vyznačujúci sa tým, žejev kvapalnej alebo pevnej forme.
38. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 37, vyznačujúci sa tým, že obsahuje asi 0,1 mg až asi 25 mg zlúčeniny na jednotkovú dávku.
39. Farmaceutický prostriedok v pevnej jednotkovej dávkovej forme, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podlá nároku

28 a farmaceutický prijateľný nosič.
40. Farmaceutický prostriedok podía nároku 39, vyznačujúci sa tým, že je vo forme kapsuly, tablety, prášku alebo granuly a obsahuje asi 0,1 mg až asi 25 mg zlúčeniny.
41. Spôsob inhibície väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa poskytnutie zlúčeniny podía nároku 28, v množstve, ktoré je dostatočné na to, aby viedlo ku kontaktu glykoproteínového Ilb/IIIa komplexu doštičiek s účinným inhibičným množstvom aktívnej liečivej substancie.
42. Spôsob podía nároku 41,vyznačujúci sa t ý m, že rozpustný adhezívny proteín je fibrinogén, von Willebrandov faktor, fibronektín alebo vitronektín.
43. Spôsob podía nároku 41, vyznačuj úci sa t ý m, že zlúčenina je poskytnutá íudskému alebo zvieraciemu subjektu na inhibiciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vivo.
44. Spôsob podía nároku 41, vyznačuj úci sa t ý m, že zlúčenina je poskytnutá do mimotelového zariadenia na inhibiciu väzby rozpustného adhezívneho proteínu ku glykoproteínovému Ilb/IIIa komplexu doštičiek in vitro.
45. Spôsob liečby alebo prevencie tromboembolických chorôb, zahŕňajúcich tvorbu trombu alebo embolu, zhubnú agregáciu doštičiek, reoklúziu nasledujúcu trombolýzu, reperfúzne zranenia, restenózu, aterosklerózu, mŕtvicu, infarkt myokardu a nestabilnú angínu, vyznačujúci sa t ý m, že sa podá hostiteíovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podlá nároku 28.
46. Spôsob podlá nároku 45, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,001 do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti denne.
47. Spôsob podlá nároku 45, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zlúčenina podá v dávke od asi 0,005 do asi 1 mg/kg telesnej hmotnosti denne.
48. Spôsob podlá nároku 47, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zlúčenina podá pre liečbu alebo prevenciu infarktu myokardu alebo mŕtvice.
49. Spôsob liečby alebo prevencie chorôb zahŕňajúcich reumatickú artritídu, astmu, alergiu, respiračný syndróm dospelých, odmietnutie transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktnú dermatitídu, osteoporózu, osteoartritídu, nádorové metastázy, diabetickú retinopatiu, zápalové stavy a zápalové ochorenia tlstého čreva, vyznačujúci sa t ý m, že sa podá hostitelovi, v prípade potreby takej liečby alebo prevencie, terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo zlúčeniny podlá nároku 28.
50. Polymorfná forma 2 kryštalického roxifibanu, vyznačujúca sa tým, že sa pripraví rekryštalizáciou roxifibanu zo zmesového rozpúšťadlového systému.