CZ430199A3

CZ430199A3 - Krystalický roxifiban

Info

Publication number: CZ430199A3
Application number: CZ19994301A
Authority: CZ
Inventors: Michael B. Maurin; Philip Ma; David J. Meloni; Jaan A. Pesti; Lucius T. Rossano; Randall K. Ward; Jianguo Yin; Lin-Hua Zhang
Original assignee: Dupont Pharmaceutical Company
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2000-05-17

Abstract

Silný glykoproteinový Ilb/IIIa antagonist destiček, roxifiban, se připravuje v krystalické formě. Krystalický roxifiban existuje ve dvou polymoríhích formách, označovanýchjako forma 1 a forma 2. Tyto polymoríhí formyjsou charakterizovány rentgenovou práškovou difrakcí a uhlíkovou NMRv pevném stavu. Jsou rovněž popsány farmaceutické prostředky a způsoby léčby a prevence nemocí zprostředkovaných agregací destiček.

Description

Oblast techniky

Silný glykoproteinový Ilb/IIIa antagonist destiček, roxifiban, se připravuje v krystalické formě. Krystalický roxifiban existuje ve dvou polymorfnich formách, označovaných jako forma 1 a forma 2. Tyto polymorfní formy jsou charakterizovány rentgenovou práškovou difrakcí a uhlíkovou NMR v pevném stavu. Jsou rovněž popsány farmaceutické prostředky a způsoby léčby a prevence nemocí zprostředkovaných agregací destiček.

Dosavadní stav techniky

Předkládaný vynález se týká krystalických forem silného glykoproteinového Ilb/IIIa antagonistu destiček známého jako rofixiban. Rofixiban je acetátová sůl methylesterové proléčivé formy silného glykoproteinového Ilb/IIIa antagonistu. Je to nepeptidová isoxazolinová sloučenina strukturního vzorce:

Roxifiban je znám pod svým chemickým jménem, acetátová sůl methyl-N³-[2-{3-(4-formamidinofenyl)-isoxazolin-5(R)-yl}-acetyl]-N²-(n-butyloxykarbonyl)-2,3-(S)-diaminopropionátu. Roxifiban je obsažen v popisu a nárocích přihlášky

PCT/US94/13155 (mezinárodní publikace č. WO 95/14683), podaná 14.11.1994, uváděná zde jako odkaz. Tato mezinárodní patentová přihláška nárokuje prioritu US č. 08/157598, podáno 24.11.1994 a US č. 08/337920, podáno 10.11.1994, uváděné zde

jako odkaz. Příprava soli trifluoroctové kyseliny proléčivé báze roxifibanu je popsána v příkladu 314B PCT/US94/13155.

Bylo zjištěno,že aktivní složka roxifibanu inhibuje vazbu rozpustných adhezivních proteinů, jako je fibrinogen, von Willebrandův faktor, fibronektin a vitronektin k destičkám glykoproteinového Ilb/IIIa komplexu. V důsledku toho je sloučenina schopná inhibovat a aktivovat agregaci destiček indukovanou známými endogenními antagonisty destiček. Roxifiban je proto užitečný pro léčbu nebo prevenci thromboembolických chorob, zahrnující tvorbu thrombu nebo embolu, zhoubnou agregaci destiček, reokluzi následující thrombolýzu, reperfuzní zranění, restenózu, aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu a nestabilní angínu. Další nemoci, které zahrnují buněčnou adhezi mohou být rovněž léčeny podáním roxifibanu. Takové nemoci zahrnují například revmatickou artritidu, astma, alergii, respirační syndrom dospělých, odmítnutí transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktní dermatitidu, osteoporózu, osteoartritidu, nádorové metastázy, diabetickou retinopatii, zánětlivé stavy a zánětlivé nemoci tlustého střeva.

Léčba nebo prevence shora uvedených chorob se dosáhne tím, že se člověku nebo zvířeti podá, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeutické množství roxifibanu. Sloučenina se může podávat enterálně nebo parenterálně v pevných nebo kapalných dávkových formách. Obvykle dávka obsahuje od okolo 0,001 mg/kg do okolo 10 mg/kg tělesné hmotnosti na den, výhodně od okolo 0,005 do okolo 1 mg/kg tělesné hmotnosti na den.

Syntézu roxifibanu a jeho získávání jako v podstatě čistý krystalický produkt popsali Zhang a kol., Tetrahedron Letters, 37(26), 4455-58 (1996); Zhang a kol., J. Org. Chem. 62(8), 24,69 (1997). Dosud nebyla známa existence roxifibanu v stabilních krystalických polymorfních formách. Pro

přípravu, čištění a formulaci roxifibanu je výhodné získávat léčivo v krystalické formě. Proto existuje potřeba pro stabilní krystalické formy léčiva a pro spolehlivé a reprodukovatelné postupy jeho přípravy.

Podstata vynálezu

V jednom aspektu se předkládaný vynález týká krystalického roxifibanu. Příbuzný aspekt spočívá v krystalických polymorfech roxifibanu, označených jako forma 1 a forma 2. Polymorfní forma 1 je charakterizována a odlišuje se od polymorfní formy 2 uhlíkovým NMR v pevném stavu a práškovou rentgenovou difrakční analýzou.

Další aspekty předkládaného vynálezu zahrnují farmaceutické prostředky krystalického roxifibanu a jeho polymorfní formy 1 a formy 2. Krystalické proléčivé produkty podle vynálezu mohou být formulovány do konvenčních pevných farmaceutických dávkových forem nebo se mohou použít k přípravě kapalných dávkových forem kombinací terapeuticky účinného množství krystalického proléčiva s farmaceuticky přijatelným nosičem. V dalším aspektu předkládaný vynález zahrnuje způsob inhibice vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček, který zahrnuje podání množství krystalického roxifibanu, které je dostatečné, aby glykoprotein Ilb/IIIa byl kontaktován s účinným množstvím aktivní léčivé substance. Ve zvláštních aspektech zahrnuje předkládaný vynález metody léčby nebo prevence různých thromboembolických chorob a dalších chorob zahrnující buněčnou adhezi, které zahrnují podání účinného množství farmaceutického prostředku zahrnujícího nové krystalické formy podle vynálezu.

Vynález je ilustrován odkazy na přiložené obrázky popsané dále.

Obrázek 1 je -^c CP/MAS NMR spektrum polymorfní • ·

krystalické formy 1 roxifibanu v pevném stavu.

Obrázek 2 je ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfní krystalické formy 2 roxifibanu v pevném stavu.

Obrázek 3 ukazuje práškové rentgenové difraktogramy polymorfní krystalické formy 1 a formy 2 roxifibanu.

Obrázek 4 je standardní křivka grafického znázornění poměrů ¹³C CP/MAS NMR spektra směsí polymorfní formy 1 a formy 2 roxifibanu vůči molárnímu zlomku polymorfní formy 1 v takové směsi.

V prvním provedení předkládaný vynález poskytuje krystalický roxifiban v podstatně čisté formě.

Ve výhodnějším provedení, čistota krystalického roxifibanu je vyšší než 90 procent.

Ve druhém provedení předkládaný vynález poskytuje polymorfní formu 1 krystalického roxifibanu v podstatně čisté formě.

Ve výhodnějším provedení, čistota krystalického roxifibanu formy 1 je -vyšší než 90 procent.

V dalším výhodném provedení je polymorfní forma 1 charakterizována ¹³C CP/MAS NMR spektrem v pevném stavu majícím dvojité píky při 63 a 66 ppm.

Ve výhodnějším provedení ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfní formy 1 v pevném stavu má dvojité píky při 19 a 21 ppm.

V dalším výhodném provedení má polymorfní forma 1 krystalického roxifibanu v pevném stavu ¹³C CP/MAS NMR spektrum v podstatě ve shodě se spektrem ukázaným na obrázku

l.

• ·

- 5 V dalším výhodném provedení polymorfní forma 1 je charakterizována práškovým rentgenogramem zahrnující hodnoty 2 0 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,5 ± 0,2, 14,7 + 0,2,

19,3 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 22,5 + 0,2, 23,2 ± 0,2, 25,2 ± 0,2,

27,5 + 0,2 a 32,2 + 0,2.

Ve výhodnějším provedení je práškový rentgenogram polymorfní formy 1 podstatně zbaven píku při 20 13,6 + 0,2.

V dalším výhodném provedení je polymorfní forma 1 charakterizována práškovým rentgenogramem podstatně v souladu s rentgenogramem uvedeným na obrázku 3.

Ve druhém provedení předkládaný vynález popisuje farmaceutický prostředek připravený kombinací účinného množství polymorfní formy l s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Ve výhodném provedení je farmaceutický prostředek v pevné nebo v kapalné formě.

V ještě výhodnějším provedení obsahuje farmaceutický prostředek okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny na j ednotkovou dávku.

Ve třetím provedení popisuje předkládaný vynález farmaceutický prostředek v pevné jednotkové dávkové formě, která obsahuje terapeuticky účinné množství polymorfní formy 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

Ve výhodném provedení je farmaceutický prostředek ve formě kapsle, tablety, prášku nebo granule a obsahuje okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny.

Ve čtvrtém provedení předkládaný vynález popisuje způsob inhibice vazby rozpustného adhezivního proteinu ke • · glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček, který zahrnuje poskytnutí polymorfní formy 1, v množství, které je dostatečné k tomu, aby vedlo ke kontaktu glykoproteinového Ilb/IIIa komplexu destiček s účinným inhibičním množstvím aktivní léčivé substance.

Ve výhodném provedení je rozpustný adhezivní protein fibrinogen, von Willebrandův faktor, fibronektin nebo vitronektin.

V dalším výhodném provedení je sloučenina poskytnuta lidskému nebo zvířecímu subjektu k inhibici vazby rozpustného adheživního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vivo.

V dalším výhodném provedení je sloučenina poskytnuta do mimotšlního zařízení k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vitro.

V pátém provedení předkládaný vynález popisuje způsob léčby nebo prevence thromoembolických chorob, zahrnujících tvorbu thrombu nebo embolu, zhoubnou agregaci destiček, reokluzi následující thrombolýzu, reperfuzní zranění, restenózu, aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu a nestabilní angínu, zahrnující podání hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky účinného množství polymorfní formy 1.

Ve výhodném provedení se sloučenina podá v dávce od okolo 0,001 do okolo 10 mg/kg tělesné hmotnosti denně.

V dalším výhodném provedení se sloučenina podá v dávce od okolo 0,005 do okolo 1 mg/kg tělesné hmotnosti denně.

Ve výhodnějším provedení se sloučenina podá pro léčbu • · · · · · • · · · · · · · « · « · · • i · · · · • · · · *

999 9999999

999

9 nebo prevenci infarktu myokardu nebo mrtvice.

V šestém provedení, předkládaný vynález poskytuje způsob léčby nebo prevenci chorob zahrnujících revmatickou artritidu, astma, alergii, respirační syndrom dospělých, odmítnutí transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktní dermatitidu, osteoporózu, osteoartritidu, nádorové metastázy, diabetickou retinopatii, zánětlivé stavy a zánětlivé nemoci tlustého střeva, zahrnující podání hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky nebo profylakticky účinného množství polymorfní formy 1.

V sedmém provedení, předkládaný vynález popisuje polymorfní formu 1 krystalického roxifibanu připravenou rekrystalizací roxifibanu ze směsného rozpouštědlového systému.

V osmém provedení předkládaný vynález poskytuje polymorfní formu 2 krystalického roxifibanu v podstatně čisté formě.

Ve výhodnějším provedení, čistota krystalického roxifibanu formy 2 je vyšší než 90 procent.

V dalším výhodném provedení je polymorfní forma 2 charakterizována ¹³C CP/MAS NMR spektrem v pevném stavu mající jeden pík při 66 ppm a žádný podstatný pík při 63 ppm.

Ve výhodnějším provedení ¹³C CP/MAS NMR spektrum polymorfní formy 2 v pevném stavu má jeden pík při 19 ppm a žádný podstatný pík při 21 ppm.

V dalším výhodném provedení má polymorfní forma 2 krystalického roxifibanu ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pqdstatě ve shodě se spektrem ukázaným na obrázku 2.

• Β * · · » · · · • -J · · · · · ······ • · « · · » · ·· ··· ······· ·* ··

V dalším výhodném provedení polymorfní forma 2 je charakterizována práškovým rentgenogramem zahrnující 2Θ hodnoty 6,4 + 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,4 ± 0,2, 13,6 ± 0,2, 18,8 ± 0,2, 20,7 ± 0,2, 22,6 ± 0,2, 23,1 ± 0,2, 25,1 ± 0,2, 26,1 ± 0,2, 27,3 + 0,2 a 28,5 + 0,2.

V dalším výhodném provedení je polymorfní forma 2 charakterizována práškovým rentgenogramem podstatně v souladu s rentgenogramem uvedeným na obrázku 3.

V devátém provedení předkládaný vynález popisuje farmaceutický prostředek připravený kombinací účinného množství polymorfní formy 2 s farmaceuticky přijatelným nosičem.

V ještě výhodnějším provedení obsahuje farmaceutický prostředek okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny na jednotkovou dávku.

V desátém provedení popisuje předkládaný vynález farmaceutický prostředek v pevné jednotkové dávkové formě, která obsahuje terapeuticky účinné množství polymorfní formy 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.

V jedenáctém provedení předkládaný vynález popisuje způsob inhibice vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproternovému Ilb/IIIa komplexu destiček, který zahrnuje poskytnutí polymorfní formy 2, v množství, které je

• 0 · 0 0 0 dostatečné k tomu, aby vedlo ke kontaktu glykoproteinového

Ilb/IIIa komplexu destiček s účinným inhibičním množstvím aktivní léčivé substance.

V dalším výhodném provedení je sloučenina poskytnuta lidskému nebo zvířecímu subjektu k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vivo.

V dalším výhodném provedení je sloučenina poskytnuta do mimotělního zařízení k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vitro.

Ve dvanáctém provedení předkládaný vynález popisuje způsob léčby nebo prevence thromoembolických chorob, zahrnujících tvorbu thrombu nebo embolu, zhoubnou agregaci destiček, reokluzi následující thrombolýzu, reperfuzní zranění, restenózu, aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu a nestabilní angínu, zahrnující podání hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky účinného množství polymorfní formy 2.

Ve výhodnějším provedení se sloučenina podá pro léčbu nebo prevenci infarktu myokardu nebo mrtvice.

• · • · ·· ·

Ve třináctém provedení, předkládaný vynález poskytuje způsob léčby nebo prevenci chorob zahrnujících revmatickou artritidu, astma, alergii, respirační syndrom dospělých, odmítnutí transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktní dermatitidu, osteoporózu, osteoartritidu, nádorové metastázy, diabetickou retinopatii, zánětlivé stavy a zánětlivé nemoci tlustého střeva, zahrnující podání hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky nebo profylakticky účinného množství polymorfní formy 2.

Ve čtrnáctém provedení, předkládaný vynález popisuje polymorfní formu 2 krystalického roxifibanu připravenou rekrystalizací roxifibanu ze směsného rozpouštědlového systému.

Roxifiban je acetátová sůl methylesterového léčiva opticky čistého enantiomeru terapeuticky aktivní isoxazolinové sloučeniny struktury:

Přípravy trifluoracetátové soli methylesteru aktivní léčivé substance II je popsána v příkladu 314B přihlášky PCT/US94/13155. Jak bude oceněno odborníkem v organické syntéze, postup zde popsaný může být adaptován pro přípravu roxifibanu substitucí trifluoroctové kyseliny kyselinou octovou ve finálním stupni.

Alternativní způsob přípravy krystalického roxifibanu je popsán ve shora uvedených referenčních publikacích Zhanga a kol. Tato syntéza začíná reakcí 4-kyanobenzaldehydu s fl » • flfl flfl i flflfl flflflfl hydroxyaminsulfátem za získání 4-kyanobenzaldoximu, za použití metody, kterou popsali Kawase a Kakugawa, J. Chem.

Soc., Perkin Trans I, 1979, str. 643. Reakce je ilustrována následující rovnicí:

fl fl flflfl ^N0 ΛJ/

CHO + (H₂NOH)₂· H₂SO₄ ^NC“<\ //

C=NOH

Reakce 4-kyanobenzaldoximu s N-chlorsukcinimidem v přítomnosti triethylaminu generuje aktivní nitriloxidový meziprodukt, který dále kondenzuje s isobutylvinylacetátem za získání racemické směsi sloučeniny představované následujícím vzorcem:

(III)

Enzymatická hydrolýza racemické směsi sloučeniny III s opticky čisté R představována lipazou produkuje ísoxazolmovou kyselinu v konfiguraci. Tato isoxazolinová kyselina je vzorcem:

Ύ° (IV)

Enzymatická reakce se může provést za použití komerčně dostupného lipázového preparátu jako je lipáza PS30, dostupná od Amano Enzyme. Reakce se může provést ve fosfátovém pufru pH 7,5.

Nehydrolyzovaný isobutylester vzorce III, mající

• φ φ φφφ φφφ φ φ «φ φφ konfiguraci S se může racemizovat s katalytickým množstvím terč.butoxidu draselného. Opakováním kombinovaného postupu enzymatické hydrolýzy a epimerizace báze se může v dobrém výtěžku získat opticky čistá isoxazolinová kyselina.

Opticky čistá isoxazolinová kyselina vzorce IV se kopuluje s methylesterem Ν-α-butoxykarbonyl-l,2-diaminopropionové kyseliny za získání opticky čistého meziproduktu vzorce:

O

Opticky čistá aminokyselina N-a-butoxykarbonyl-l,2-diaminopropionové kyseliny je komerčně dostupná (například od Beacham) a může být přeměněna na svůj methylester reakcí s methanolem v přítomnosti thionylchloridu.

Sloučenina V se převede na imidátový meziprodukt Pinnerovou reakcí (Allen a kol., J. Am. Chem. Soc. (1958) 80, 591; Zhang a kol., Tetrahedron Letters, (1996) 37 (26), 4455-58). Imidátový meziprodukt může reagovat s octanem amonným za získání žádané acetátové soli, roxifibanu I v dobrém výtěžku. Z reakčního prostředí se může získat krystalický roxifiban v dobrém výtěžku.

Bylo zjištěno, že podle tohoto postupu se získá směs dvou krystalických polymorfů roxifibanu, označovaných jako forma 1 a forma 2.

Rekrystalizace roxifibanu ze zředěných roztoků v methanolu dává polymorfní formu 1. Rekrystalizační roztok výhodně obsahuje více než okolo 20 ml methanolu na gram roxifibanu, výhodně více než okolo 25 ml methanolu na gram • · ♦

• 9 · *	·· 9·
•	• 9	9 9 · 9
9 ·	• 9 ·	«·· 999
9	• 9	• 9
« · ·	•9· 999«	«9 99

roxifibanu. Při vyšších koncentracích roxifibanu vede rekrystalizace z methanolu často ke směsi polymorfní formy 1 a formy 2. Tvorba polymorfní formy 1 je podporována relativně rychlým ochlazením methanolového roztoku. Výhodně se zředěný methanolový roztok roxifibanu zahřeje na teplotu okolo 50 °C až okolo 65 °C za účelem úplného rozpuštění sloučeniny. Tento roztok se potom ochladí na <35 °C ke krystalizací produktu, kterým je zejména forma 1.

Polymorfní forma 1 může být produkována přidáním antirozpouštědel, jako je methylacetát, do zředěného methanolového roztoku sloučeniny. Alternativně, přidání horkého xylenového roztoku do zahřátého roztoku roxifibanu v methanolu, následované rychlou destilací methanolu z roztoku, vede ke krystalickému produktu, kterým je převážně polymorfní forma 1. Postup, kterým se získá krystalická polymorfní forma 1 roxifibanu v podstatně čisté formě je popsán v příkladu 2 dále.

Tvorba polymorfní formy 2 je podporována relativně pomalým ochlazováním rekrystalizačního roztoku. Výhodně se roztok obsahující méně než okolo 20 ml rozpouštědla na gram roxifibanu, výhodně méně než okolo 10 mg rozpouštědla na gram roxifibanu zahřívá na teplotu od okolo 50 °C do okolo 65 °C za účelem úplného rozpuštění sloučeniny. Tento roztok se potom ochladí na <35 °C ke krystalizací produktu, kterým je zejména forma 2.

Polymorfní forma 2 se může získat v dobrém výtěžku a vysoké čistotě pomalým ochlazením koncentrovaného roxifibanu ve směsném rozpouštědle methanol-kyselina octová-acetonitril. Výhodné směsný rozpouštědlový systém obsahuje methanol-kyselina octová-acetonitril v objemovém poměru okolo 10:1,5:10.

Polymorfní forma 1 a forma 2 krystalického roxifibanu

• 4 ·	4 <4	«0
0	0	0	4 0	4 4·
4	0	4 4	4 0	0 00 0
9	0	•	0 4	0
99		0 0 4	440 9904	44

může být snadno odlišena práškovým rentgenogramem a uhlíkovou NMR v pevném stavu. Rentgenogramy polymorfní formy 1 a polymorfní formy 2 jsou uvedeny na obrázku 3. Hlavní píky v difraktogramu pro polymorfní formu 1 se vyskytují při hodnotách 2Θ okolo 6,4, 9,6, 12,5, 14,7, 19,3, 21,5, 22,5, 23,2, 25,2, 27,5 a 32,2. Relativní intenzity píků se mohou lišit, v závislosti na technice přípravy vzorku, postupu upevnění vzorku a použitém zařízení. Použití různých zařízení a variace ostatních faktorů ovlivnit hodnoty 2Θ tak, že se stanovené píky liší o plus minus 0,2.

Oblast diafraktogramu, která je nejužitečnější pro odlišení polymorfní formy 1 a polymorfní formy 2 je okolo

13,6 °. Polymorfní forma 2 vykazuje silný pík při tomto úhlu, zatímco difraktogram polymorfní formy 1 je v této oblasti poměrně plochý.

Analýza uhlíkovou NMR v pevném stavu je rovněž užitečný postup pro polymorfní charakterizaci krystalického roxifibanu. ¹³C NMR spektra v pevném stavu, za použití technik CP/MAS, potvrzuje existenci polymorfní formy 1 a formy 2 roxifibanu. Jak je ukázáno ve spektru na obrázku 1, polymorfní forma 1 má nízko-symetrickou strukturu, jak je evidentní z obsazení n-butylové skupiny v jedné ze dvou krystalograficky neekvivalentních poloh. Na rozdíl, jak je uvedeno ve spektru na obrázku 2, n-butylová skupina polymorfní formy 2 spočívá v jedné definované strukturální poloze. Tak, spektrum polymorfní formy 1 je charakterizováno dvojitými píky při 63 a 66 ppm a při 19 a 21 ppm. Spektrum polymorfní formy 2 vykazuje jednotlivé píky při 66 a 19 ppm.

Postup ¹³C NMR v pevném stavu může být použit pro kvantitativní analýzu směsí polymorfní formy 1 a formy 2. Poměr oblasti píku 63 ppm k oblasti píku při 66 dobře koreluje s molárním poměrem polymorfní formy 1 k formě 2. Dále, poměr oblasti píku 21 ppm k oblasti píku při 19 ppm • · · · · · » · · * · * «« 999 999 9999 ·* *«

- 15 také koreluje dobře k molárnímu poměru formy 1:formě 2. Pro analýzu se může připravit a použít standardní křivka připravená regresní analýzou poměrů získaných ze směsí polymorfů. Taková kalibrační křivka je ilustrována na obrázku 4 výkresů.

I když se pro kvantitativní analýzu polymorfnich směsí může použít postup využívající uhlíkovou NMR v pevném stavu, vynález není omezen na jakoukoliv zvláštní metodu analýzy pro identifikaci žádaného polymorfů.

Studie izothermální mikrokalorimetrie a fázové rozpustnosti ukazují, že thermodynamické stability dvou forem roxifibanu jsou velmi podobné. Má se za to, že polymorfní forma 2 je stabilnější při teplotách pod 132 °C, zatímco polymorfní forma 1 je nepatrně stabilnější při teplotách nad 132 °C. Tyto diference jsou malé a produkt polymorfní formy 1 je polymorficky stabilní při následujícím skladování po dobu 19 měsíců při teplotě místnosti. Spontánní konverze polymorfní formy 1 na polymorfní formu 2 nebyla pozorována. Rozpustnosti ve vodě krystalické polymorfní formy 1 a formy 2 roxifibanu jsou velmi blízké a nebyly pozorovány žádné biologické rozdíly mezi těmito dvěma polymorfními formami.

Jednotkové buněčné parametry a atomové koordináty krystalických polymorfů formy 1 a formy 2 se mohou stanovit technikami využívající rentgenogramu monokrystalu, pokud je vhodně velký krystal k dispozici. Pokud formy 1 nebo 2 roxifibanu tvoří destičkové nebo jehlové krystaly, nemohou nikdy dosáhnout velikosti dostatečné pro jednotlivý difrakční obrazec. Obecně, analýza dvou forem v monokrystalových studiích ukázala, že krystaly jsou buď zdvojené nebo aglomerované. V tomto případě může být použita ke stanovení jednotkových buněk transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a synchrotronní práškový rentgenogram.

·· · « ·· »· ·· ♦ ··· «··♦ ♦ * · · ··· · · · · · · « · * · · « · «·· ··· » · · » · · · r» ♦ »· ··· ···· »♦ ··

Výraz směsný rozpouštědlový systém jak se zde používá zahrnuje rozpouštědlový systém obsahující směs dvou nebo více rozpouštědel. Výhodné rozpouštědlové systémy podle vynálezu jsou rozpouštědlové systémy zahrnující kyselinu octovou, acetonitril a aceton nebo kyselinu octovou, anisol a aceton.

Předkládaný vynález popisuje polymorfy v podstatně čisté formě. Výraz podstatně čisté formě znamená, že sloučenina má čistotu vyšší než 90 procent, včetně 90, 91,

92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 a 100 procent.

Krystalické formy roxifibanu popsané v popise mohou být formulovány do farmaceutických prostředků a použity při terapeutických a profylaktických metodách, jak je popsáno ve shora uvedené mezinárodní přihlášce PCT/US94/13155. Například vedle použití při léčbě thromboembolických chorob a ostatních nemocí buněčné adheze, nové krystalické roxifibanové produkty podle vynálezu mohou být použity při chirurgii periferních artérií (arteriální štěpy, endarterektomie karotidy) a v kardiovaskulární chirurgii, při nichž dochází k manipulaci s tepnami nebo orgány a/nebo interakci destiček s umělými povrchy, které vedou k agregaci destiček a konzumpci a agregované destičky mohou vytvářet thromby a thromboemboly. Sloučeniny podle vynálezu je možno podávat chirurgicky ošetřovaným pacientům, aby se předcházelo tvorbě thrombů a thromboembolů.

Takové krystalické sloučeniny se mohou použít v mimotělních zařízeních k inhibici interakce destičkového glykoproteinu Ilb/IIIa na destičkových membránách s fibrinogenními nebo jinými buněčnými adhezivními proteiny absorbované na povrchu mimotělového oběhu.

Krystalické formy roxifibanu podle vynálezu je možno podávat v takových orálních dávkovačích formách, jako

9 ·

jsou tablety a kapsle (včetně těchto forem s prodlouženým nebo odloženým uvolňováním), pilule, prášky, granule, elixíry, tinktury, suspenze, sirupy a emulze. Podobně je lze také podávat intravenózní cestou (v podobě bolu nebo infuze), intraperitoneální, subkutánní nebo intramuskulární cestou, vždy za použití dávkovačích forem, které jsou dobře známy odborníkům ve farmaceutickém oboru. Mohou být podávny samotné, ale obvykle jsou podávány s farmaceutickými nosiči, vybranými s ohledem na cestu podání a standardní farmaceutickou praxi.

Pokud je roxifiban rozpuštěn, pak ztrácí svoji krystalickou formu; nicméně může být použit pro přípravu kapalných formulací, ve kterých je léčivo rozpuštěno nebo suspendováno. Dále, krystalický roxifiban může být vpraven do pevných formulací, jako jsou tablety, kapsle, suspenze apod. Terapeuticky účinné množství krystalického roxifibanu je kombinováno s farmaceuticky přijatelným nosičem za vzniku farmaceutických prostředků podle vynálezu. Pod označením terapeuticky účinné množství se rozumí množství, které je při podání samotné nebo v kombinaci s přídavným terapeutickým činidlem schopno předejít nemoci nebo stavu nebo rozvoji choroby nebo stavu.

Dávkové formy (farmaceutické prostředky) vhodné pro podání mohou obvykle obsahovat od okolo 0,05 do okolo 50 mg krystalického roxifibanu na jednotkovou dávku. V těchto farmaceutických prostředcích bude krystalický roxifiban obvykle přítomný v množství od okolo 0,1-95 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku.

Když se například má krystalický roxifiban podávat orálně ve formě tablety nebo kapsle, kombinuje se s orálními netoxickými inertními vhodnými nosičovými materiály, jako je laktóza, škrob, sacharóza, glukóza, methylcelulóza, stearát hořečnatý, dikalciumfosfát, síran vápenatý, mannitol,

4 · *· *·

9 4 9 99*· 9 99

999 9 9999

9 9 9 9 · 9 <99

9 9 9 9 9 9

9« 999 999 9499 94 44

- 18 444 sorbitol apod. Jako nosičové materiály vhodné pro kapalné orální prostředky je možno uvést orální netoxické farmaceuticky vhodné inertní nosičové materiály, jako je ethanol, glycerol, voda apod. Pokud je to žádoucí nebo nutné, mohou se navíc přidávat vhodná pojivá, mazadla, bubřidla a barvící činidla. Jako vhodná pojivá je možno uvést škrob, želatinu, přírodní cukry, jako je glukóza nebo β-laktóza, škrobová sladidla, přírodní a syntetické pryskyřice, jako je klovatina, tragant nebo alginát sodný, karboxymethylcelulóza, polyethylenglykol, vosky apod. Mazadla používaná v těchto dávkovačích formách zahrnuji oleát sodný, stearát sodný, stearát hořečnatý, benzoát sodný, octan sodný, chlorid sodný apod. Jako neomezující příklady bubřidel (dezintegračních přísad) je možno uvést škrob, methylcelulózu, agar, bentonit, xanthanovou pryskyřici apod.

Krystalické roxifibanové sloučeniny podle vynálezu mohou být také formulovány do prostředků pro intranasální nebo topické použití, za použití dodávacích systémů dobře známých odborníkům. Alternativně pro dodávání léčiva mohou být použity iontoforézní náplasti na kůži.

Krystalický roxifiban je také možno podávat ve formě liposomálních dávkovačích systémů zahrnujících malé jednovrstvé vesikuly, velké jednovrstvé vesikuly a vícevrstvé vesikuly. Liposomy se mohou vytvářet z různých fosfolipidů, jako je cholesterol, stearylamin a fosfatidylcholiny.

Krystalický roxifiban je také možno kombinovat s rozpustnými polymery, jakožto nosiči léčiv pro zacílení na požadované místo účinku, Jako takové polymery je možné uvést polyvinylpyrrolidon, pyranový kopolymer, polyhydroxypropylmethakrylamid-fenol, polyhydroxyethylaspartamidfenol nebo polyethylenoxid-polylysin substituovaný zbytky kyseliny palmitové. Dále je také možné sloučeniny podle vynálezu kombinovat s třídou biodegradovatelných polymerů, která je

·· ·	* ··	··
•	•	•	φ ·	• · ·
•	•	• ·	9 · ·	9· 9
Φ ··	«	• 9 99	9 · ·«· ····	9 9 W

užitečná pro dosažení regulovaného uvolňování léčiva. Jako neomezující příklady vhodných biodegradovatelných polymerů je možno uvést kyselinu polymléčnou, kyselinu polyglykolovou, kopolymery kyseliny mléčné a glykolové, poly-epsilon-kaprolakton, kyselinu polyhydroxymáselnou, polyorthoestery, polyacetaly, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a zesítované nebo amfipatické blokové kopolymery hydrogelů.

Želatinové kapsle krystalického roxifibanu mohou obsahovat sloučeninu a práškové nosiče, jako je laktóza, škrob, deriváty celulózy, stearát hořečnatý, kyselina stearová apod. Podobných ředidel se také může používat při výrobě lisovaných tablet. Jak tablety, tak kapsle je možno vyrábět jako formy s prodlouženým uvolňováním, které jsou vhodné pro kontinuální uvolňování léčiva v průběhu několika hodin. Lisované tablety mohou být potaženy cukernými povlaky nebo vhodnými filmy pro zamaskování nepříjemné chuti a pro ochranu tablet před vnější atmosférou nebo enterickými povlaky za účelem dosažení selektivního rozpadu v gastrointestinálním traktu. Jako vhodné nosiče pro parenterální roztoky je možno uvést vodu, vhodné oleje, roztok chloridu sodného, roztok dextrózy (glukózy) a podobné cukerné roztoky a dále také glykoly, jako je propylenglykol nebo polyethylenglykoly. Roztoky pro parenterální roztoky se připraví rozpuštěním krystalického roxifibanu v nosiči, a je-li to nezbytné, přidáním pufrových substancí.

Jako vhodné stabilizátory je možno uvést antioxidanty, jako je hydrogensiřičitan sodný, siřičitan sodný a kyselina askorbová, kterých se může používat jednotlivě nebo ve směsích. Také se používá kyseliny citrónové a jejích solí a sodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA). Parenterální roztoky kromě toho mohou obsahovat konzervační látky, jako je benzalkoniumchlorid, methyl- nebo propylparaben a chlorbutanol.

··· ··« ·· · ·· ·

Vhodné farmaceutické nosiče jsou popsány v publikaci Remington¹s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., což je standardní příručka v tomto oboru. Užitečné farmaceutické dávkovači formy sloučenin podle tohoto vynálezu jsou ilustrovány dále.

Kapsle

Kapsle ve velkém měřítku se vyrobí tak, že se standardní dvoudílné tvrdé želatinové kasie naplní vždy 2 mg krystalického roxifibanu, 150 mg laktózy, 50 mg celulózy a 6 mg stearátu hořečnatého.

Měkké želatinové kapsle

Směs účinné přísady a jedlého oleje, jako například sojového oleje, bavlníkového oleje nebo olivového oleje, se se pomocí objemového čerpadla vstřikuje do želatiny. Tak se získají měkké želatinové kapsle, z nichž každá obsahuje 2 mg roxifibanu. Vzniklé kapsle se opláchnou a usuší.

Tablety

Tablety ve velkém množství se připraví konvenčním způsobem tak, že každá obsahuje 2 mg krystalického roxifibanu, 0,2 mg koloidního oxidu křemičitého, 5 mg stearátu hořečnatého, 275 mg mikrokrystalické celulózy, 11 mg škrobu a 98,8 mg laktózy. Pro zvýšení přijatelnosti pro pacienta a pro časový odklad absorpce se tablety mohou opatřit vhodnými povlaky.

Injekční prostředek

Parenterální prostředek vhodný pro injekční podávání se připraví rozmícháním 0,2 % hmotnostního krystalického roxifibanu v 10% (objemově) propylenglykolu ve vodě. Vzniklý ·♦ * roztok se isotonizuje chloridem sodným a steriluje.

Suspenze

Vyrobí se vodná suspenze pro orální podávání, která v 5 ml obsahuje 2 mg jemně rozděleného krystalického roxifibanu, 200 mg sodné karboxymethylcelulózy, 5 mg benzoátu sodného, 1,0 g sorbitolu podle US lékopisu a 0,025 ml vánilinu.

Analytické metody

Difrakce rentgenového záření prášku

Data difrakce rentgenového záření v prášku se získají na automatickém difraktometru Philips Model 3720. Vzorky se zpracují dávkovým způsobem s vícepolohovým měničem vzorku, model PW 1775. Difraktometr je opatřen proměnlivou štěrbinou (Θ-kompenzační štěrbina), scintilačním čítačem a grafitovým monochromátorem. Radiace je CuKa (40 kV, 30 mA). Data se sbírají při teplotě místnosti od 2 do 60 stupňů 2Θ; velikost kroku je 0,02 stupňů; odečítací čas 0,5 sec. na stupeň.

Vzorky se připraví na skleněných držácích jako tenká vrstva práškového materiálu bez rozpouštědla.

Uhlíková NMR v pevném stavu

Spektra ¹³C NMR v pevném stavu se získají na zařízení Varian VXR-200S NMR pracující při 50,3 MHZ pro ¹³C použitím techniky CP/MAS. Pro sejmutí spektra se použije vzorek přibližně 200 mg. Všechna měření se provádějí při teplotě okolí. Chemické posuny se zapíší na TMS stupnici za použití hexamethylbenzenu jako sekundární reference. Přiřazení rezonance v pevném stavu se provedou za použití přerušované dekuplážní pulsní sekvence v kombinaci s experimenty v roztoku, provedenými na zařízení Varian

ΦΦ · φ φ * · φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ

Unity 400 pracující při 100 MHz.

Přiřazení počátku signálních multiplicit ve spektru vyžaduje další ¹³C CP/MAS NMR experimenty, které se provedou při nižší statické síle pole. Toto se provede na 100-MHz spektrometru s ¹³C rezonanční frekvencí 25,2 MHz.

Synchrotronní difrakce rentgenového záření v prášku

Jednotkové buněčné parametry dvou polymorfů roxifibanu se stanoví kombinací transmisní elektronové mikroskopie (TEM) a synchrotronní difrakce rentgenového záření v prášku. TEM zahrnuje mikroskop JEM-2000X (při 200 kV akcelerované voltáže), opatřený kamerou Gatan 1024x1024 CCD k charakterizaci materiálu. Synchrotronní rentgenogramy v prášku se seberou na Huberově difraktometru při linii svazku paprsků DND-5BMB. Aby se dosáhlo nejvyššího možného rozlišení a nejvyššího poměru signál/šum, použije se Si(lll) analyzátor a štěrbiny seřazené po 1x8 mm ve spojení se scintilačním čítačem

Příklady provedení vynálezu

Vynález je dále blíže popsán následujícími příklady, které mají pouze ilustrativní charakter a které v žádném případě neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Syntéza krystalického roxifibanu

4-Kyanobenzaldoxim. Roztok methanolu (272,1 1),

4-kyanobenzaldehydu (50 kg, 381,3 mol) a hydroxylaminsulfátu (36,1 kg, 219,7 mol) se míchá při 55 až 60 °C po dobu 3 hodin a potom se přidá voda (272 1). Směs se ochladí na 0 až 5 °c a při této teplotě se udržuje 30 minut. Filtrační koláč se

• · ·	• ··	··
•	•	«	• ·	• · *
•	•	• ·	• · ·	Itt
•	• ··	• • ··	• · ·*« ·»1·	• ··

promyje směsným rozpouštědlem studeného methanolu a vody (poměr 2/3, 735 1) a vodou (750,0 1) a suší se ve vakuu (60 až 70 °C) do konstantní hmotnosti: 54,1 kg, výtěžek 97 %; teplota tání 174 až 176 °C; ¹H NMR δ 7,82 (2H) , 7,88 (2H) , 88,26 (1H) , 12,00 (1H) . Analýza vypočteno pro CgHg^O: C, 65,75; H, 4,14; N, 19,17. Nalezeno C, 65,73; H, 4,26; N, 19,14.

(-) -Isobutyl 2-[3-(4-kyanfenyl)-4,5-dihydro-5izoxazolyl]acetát III. K roztoku DMF (262,0 1),

4-kyanobenzaldoximu (46 kg, 342,1 mol) a N-chlorsukcinimidu (54 kg, 389,4 mol) se přidá isobutylvinylacetát (95 kg, 665,7 mol). Roztok se ochladí na 2 až 6 °C a během 4 hodin se přidá pomalu triethylamin (40 kg, 388,6 mol). Reakční směs se míchá při téže teplotě další 1 hodinu. Potom se přidá voda (330,0 1) a kyselina chlorovodíková (1 N, 49 1). Surový produkt se sebere filtrací, promyje se vodou (555,0 1) a znovu se rozpustí v toluenu (500,0 1, 40 °C) . Organická vrstva se promyje vodou (291,0 1) a suší se azeotropickou destilací (odstranění okolo 250 1 toluenu). Přidá se heptan a reakční směs se ochladí na 0 až 5 °C po dobu 3 hodin. Produkt se sebere filtrací a promyje se směsí toluen/heptan (150 1, poměr 1/2). Produkt se suší ve vakuu při 55 až 60 °C do konstantní hmotnosti: 81,8 kg, 90% výtěžek, teplota tání 98 až 100 °C; ¹H NMR (CDClg) δ 0,96 (6H) , 1,96 (1H) , 2,70 (1H) , 2,92 (1H), 3,15 (1H), 3,56 (1H), 3,90 (2H), 5,20 (1H), 7,70 (2H), 7,80 (2H). Analýza vypočteno pro ^C16^H18^N2°3 ^{: C}' ⁶⁷'¹²<· H, 6,34; N, 9,78. Nalezeno: C, 67,06; H, 6,20; N, 9,76.

(R) - 2- [3- (4-kyanofenyl) -4,5-dihydro-5-isooxazolyl] octová kyselina. Suspenze H2O (597,0 1), NaK^PC^-E^O (60,0 kg), vodného NaOH (33%, 36 1), Tritonu X-100 (3,2 kg), sloučeniny III (40,0 kg, 139,7 mol) a lipázy PS30 (4,0 kg, obsah enzymů 8 %) se pomalu zahřívá na 40 °C a udržuje se při teplotě v rozsahu 40 až 43 °C dokud rozpuštění není úplné (cca 16 hodin). pH reakční směsi se udržuje mezi 7,4 a 8,0 a • 00 ·· 00

0 0 · · * · • · 0 0 0 0

0 0 000 000

0 0 0

000 0000 00 00 • 0 ·

0 00 • 0 ·

0 0 0 • · ·

000 upravuje se přidáváním 33% vodného NaOH. Po dokončení reakce se vsázka ochladí a pH reakční směsi se upraví na 8,0 až 8,2 přidáním vodného NaOH (33 %, 11,0 1). Surový nezreagovaný s-ester se sebere filtrací přes vrstvu Celitu (20 kg) a promyje se vodou (70 1). Surový ester se recykluje přes racemizační stupeň. ¹H NMR (CDC1₃) δ 0,95 (6H), 1,8 (1H),

2,69 (1H), 2,91 (1H), 3,14 (1H), 3,54 (1H), 3,91 (2H), 5,13-5,23 (1H), 7,68-7,78 (4H).

Potom se upraví pH roztoku filtrátu (cca 800 1) a isopropylacetátu (20 1) pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové (cca 57 kg) na 2,8 až 3,2. Surový produkt kyseliny IV se srazí, sebere se filtrací a promyje se vodou (70 1). Tento surový produkt se krystaluje z horkého ethanolu (525,0 1) a získá se opticky čistá sloučenina IV. Isoxazolin IV se sebere filtrací, promyje se ethanolem (76,0 1) a suší se do konstantní hmotnosti: 12,3 kg, 77% výtěžek založen na množství IV v III; teplota tání 198 až 200 °C; ¹H NMR δ 2,70 (2H), 3,20 (1H) , 3,59 (1H) , 5,00-5,10 (1H) , 7,78-7,91 (4H) , 12,44 (1H). Analýza vypočteno pro C₁₂ ^H1O^N2°3^{: C/} 62,61; H, 4,38; N, 12,17. Nalezeno: C, 62,39; H, 4,49; N, 11,98.

Racemizace S-esteru na III. Roztok toluenu (414,0 1) a surového s-esteru (cca 120 kg mokrého koláče) se zahřívá na 50 °C a filtruje se k odstranění Celitu (cca 40 kg). Filtrační koláč se promyje toluenem (72,0 1). Organické vrstvy se spojí a promyjí se solankou (108,0 1). Po odstranění vodné vrstvy se organická vrstva suší azeotropickou destilací do konstantního bodu varu (111 °C). Vsázka se ochladí na 40 °C a přidá se terc.butoxid draselný v terč.butylakoholu (1 N, 1,6 1). Reakční směs se míchá (200 otáček za minutu) při 40 °C dokud racemizace není kompletní. Vsázka se ochladí na 20 až 25 °C a přidá se voda. Reakční směs se neutralizuje přidáním vodné kyseliny chlorovodíkové (1 N, 1,6 1) . Vodná spodní vrstva se odstraní a organická vrstva se koncentruje destilací. Reakce se ochladí na 60 °C a potom se odstraní cca 380,0 1 toluenu. K tomuto roztoku se přidá heptan (115 1) a

reakční směs se udržuje při 50 °C po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí na 0 až 5 °C a udržuje se 2 hodiny. Produkt IV se sebere filtrací a promyje se směsným rozpouštědlem toluenu a heptanu (poměr 1/2, 70 1). Produkt III se suší ve vakuu (50 až 55 °C do konstantní hmotnosti: 17,3 kg, výtěžek 87 %.

(R)-Methyl-3-[ [ [3-(4-kyanofenyl)-4,5-dihydro-5-isoxazolyl] acetyl] amino] -N- (butoxykarbonyl) -L-alanin V. Roztok acetonitrilu (402,0 1), kyseliny IV (12,0 kg, 52,10 mol), aminu (22,4 kg, 57,30 mol) a thionylchloridu (6,8 kg, 57,30 mol) se míchá při 0 až 5 °C po dobu 1 hodiny. K tomuto roztoku se přidá při teplotě 20 °C během 90 minut diisopropylethylamin (22,2 kg, 172,00 mol). Po reakci se přidá voda (612,0 1). Surový produkt V se vysráží. Tento surový produkt V se sebere filtrací a promyje se vodou (96,0 1). Vlhký koláč se rozpustí v horkém methanolu (50 až 60 °C) a nerozpustné částice se seberou filtrací. Roztok se chladí při teplotě 0 až 5 °C po dobu 3 hodin a produkt se sebere filtrací a promyje se methanolem (75,0 1). Produkt se suší ve vakuu (55 až 60 °C) do konstantní hmotnosti: 18,3 kg, 82%

výtěžek, teplota	tání 154	až 156 °C; ^T	H NMR δ 0,92 (3H), 1,37
(2H), 1,59 (2H),	1,67	(1H)	, 2,58 (1H),	2,71	(1H)	, 3,22 (1H),
3,51 (1H), 3,67	(2H) ,	3,77	(3H), 4,06	(2H) ,	4,44	(1H), 5,14
(1H), 5,70 (1H),	6,38	(1H)	, 7,70 (2H),	7,77	(2H)	. Analýza
vypočteno pro C₁₂ ^hioⁿ2	°6'	C, 62,61; H,	4,38;	N,	12,17.

Nalezeno C, 62,39; H, 4,49; N, 11,98.

(R)-Methyl-3- [ [ [3-[4- (aminoiminomethyl)fenyl]-4,5-dihydro-5-isoxazol]acetyl]amino]-N-(butoxykarbonyl)-L-alanin monoacetát I. Roztok methylacetátu (55,8 1), methanolu (4,8 1) , HCI (9,6 kg) a sloučeniny 4 (12,0 kg, 27,88 mol) se ochladí na teplotu -20 °C a míchá se při 0,211 - 0,352 kg/cm²(HCI) při teplotě 10 °C po dobu 27 hodin. Po skončení reakce se HCI odstraní ve vakuu a přidají se methylacetát (21,5 1) a methanol (63,2 1). Zbylá HCI se neutralizuje amoniakem (2,5 kg) při teplotě 10 °C. Vzniklý chlorid amonný se odstraní

filtrací. Filtrační koláč se promyje methylacetátem a methanolem (20,0 1). K filtrátu se přidá octan amonný (6 kg) a reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc.

Surový produkt se sebere filtrací a získá se DMP 754: 10,4 kg, 74% výtěžek.

Příklad 2

Polymorfní forma 1 krystalického roxifibanu

Kaše roxifibanu (1,38 kg, 2,73 mol) v acetonitrilu (5,5 1) se přidá k ledové kyselině octové (2,77 1, 48,4 mol). Tato kaše se zahřívá na 80 °C a všechny pevné látky se rozpustí. Roztok se potom ochladí na 40 až 45 °C a v průběhu 30 minut se přidá aceton (12,5 1). Vzniklá kaše se míchá při 20 až 25 °C po dobu 1 hodiny a potom se ochladí na 0 až 5 °C na 1 hodinu. Pevné látky se filtrují, promyjí se 10% methanolem v acetonu (11 1) a suší se ve vakuu při 65 °C. Tak se získá 1,26 kg (91 %) polymorfní formy 1 krystalického roxifibanu.

Byla provedena rentgenová difrakční analýza prášku tohoto materiálu podle postupu popsaném shora. Difraktogram je uveden na obrázku 1. Difraktogram vykazuje hodnoty 2Θ 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,5 ± 0,2, 14,7 ± 0,2, 19,3 ± 0,2, 21,5 + 0,2, 22,5 + 0,2, 23,2 + 0,2, 25,2 + 0,2, 27,5 + 0,2 a 32,2 + 0,2. Byla rovněž provedena ¹³C CP/MAS NMR analýza látky v pevném stavu jak je uvedeno shora. Vzniklé spektrum je uvedeno na obrázku 1. Spektrum vykazuje dvojité píky při 19/21 ppm a 63/66 ppm, které jsou charakteristické pro polymorfní formu 1. Tento materiál byl určen jako podstatně čistá polymorfní forma roxifibanu, přičemž nebyla nalezena žádná polymorfní forma 2.

Příklad 3

Roztok roxifibanu (2,0 g, 3,9 mmol) se připraví • ·

- 27 • ··· ··· · · · · · ··· · · · ♦ · · • · · · · · · ······ • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· ·· rozpuštěním v methanolu (15 ml) a kyselině octové (3 ml) při zpětném toku. Nerozpustné látky se odstraní filtrací přes Celit; všechen roxifiban, který krystaluje na filtračních částicích se promyje 5 ml horkého methanolu. Filtrát se znovu zahřeje ke zpětnému toku a jakmile se všechny pevné látky rozpustí, přidá se během 10 minut acetonitril (20 ml). Roztok se zahřívá dalších 10 minut, aby se znovu rozpustily všechny pevné látky, což je zřejmé během přidání acetonitrilu a potom se roztok pomalu ochladí na teplotu okolí. Jakmile počne ochlazování, roztok se očkuje stopami krystalů formy 2 dokud je suspenze zakalená. Po 2 hodinách se suspenze znovu zahřeje a 30 ml destilátu se odstraní, přičemž objem se udržuje přidáním acetonitrilu. Objem se dále zředí dalšími 8 ml acetonitrilu a kaše se ochladí na 15 °C v průběhu 100 minut. Krystaly se filtrují, promyjí se 15 ml acetonitrilu a sušením ve vakuu se získá roxifiban (1,82 g, 91% výtěžek) jako bílá pevná látka. Difrakční rentgenovou analýzou prášku se stanoví, že se jedná o formu 2 a stopy nebo žádnou formu 1.

Příklad 4

Rekrystalizace se provede způsobem, který je podobný příkladu 3 s výjimkou, že výměna rozpouštědla je úplná a zpětný tok se udržuje přes noc. Následné zpracování pokračuje jako v příkladu 3 k izolaci roxifibanu (1,83 g, 91% výtěžek) jako bílá pevná látka. Difrakční rentgenová analýza prášku stanoví, že se jedná o formu 2 a stopy nebo žádnou formu 1.

Příklad 5

Do 100 ml baňky s kulatým dnem se vloží forma 1 roxifibanu (3,6 g, 6,1 mmol), 30 ml methanolu a octan amonný (0,47 g, 6,1 mmol). Směs se jemně zahřívá pod zpětným tokem za intenzivního míchání a suspenze se míchá při zpětném toku 6 hodin. Směs se potom pomalu ochladí během 4 hodin na teplotu místnosti. Pevné látky se filtrují a promyjí se 20 ml • · · · směsi rozpouštědel methanolu a acetonitrilu (1/1, obj./obj). Pevné látky se suší ve vakuu a získá se roxifiban (3,1 g, 86% výtěžek) jako bílé jehličky. Difrakční rentgenovou analýzou prášku se stanoví, že se jedná o formu 2 a stopy nebo žádnou formu 1.

Příklad 6

Do 3 1 baňky s kulatým dnem se vloží roxifiban (108,0 g, 0,182 mmol, směs formy 1 a formy 2), octan amonný (15,2 g, 0,182 mmol) a 1100 ml methanolu. Směs se zahřívá při zpětném toku a vzniklá suspenze se míchá 4 hodiny. Směs se potom ochladí v průběhu 5 hodin na 10 °C. Pevné látky se seberou a promyjí se 400 ml rozpouštědlové směsi methanolu a acetonitrilu (1/1, obj./obj.). Pevné látky se suší ve vakuu a získá se roxifiban (101,0 g, 93,5% výtěžek) ve formě bílých jehliček. Difrakční rentgenová analýza prášku stanoví, že se jedná o formu 2 roxifibanu a stopy nebo žádnou formu 1.

Příklad 7

Synchrotronní práškové difrakce se seberou na vzorcích formy 1 a 2 roxifibanu, aby se stanovily jednotkové buněčné parametry dvou forem. Provede se devět zkoušek, za použití identických optik: SI (111) monochromátorové krystaly a Si(lll) analyzační krystal a Sollerovy štěrbiny. Použijí se vlnové délky 0,49617 A a 1,00006 A. Vzorky se připraví následovně:

Příprava vzorku		vlnová '	délka
Forma	1	v 1,0	mm	kapiláře	0,49617	A
Forma	1	v 1,5	mm	kapiláře	II
Forma	2	v 1,0	mm	kapiláře	II
Forma	2	v 1,5	mm	kapiláře	II
Forma	1	nemletá na desce	1,00006	A
Forma	1	mletá	na	desce	H

• · · • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· ··

- 29 Forma 2 nemletá na desce

Forma 2 mletá na desce

Forma 1 a 2 mletá na desce

Stanovení jednotkové buňky formy 1:

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) prokázala, že buněčná forma má nízkou symetrii, aú monoklonnou nebo trojklonnou, se dvěma ze tří buněčných os, které jsou okolo 5 a 9-10 A, a úhlem 81 °. Synchrotronní modely ukázaly, že třetí osa je mnohem delší (okolo 27-28 A). Objem molekuly je okolo 643 A³, což je kompatibilní se dvěma molekulami na buňku. Parametry buňky byly upřesněny s CELLREF a čísla byla použita v LeBailově postupu v GSAS. Upravené parametry trojklonné jednotkové buňky, s prostorovou skupinou Pl a Z=2 poskytly finální jednotkovou buňku stanovenou pro polymorfní formu 1.

Forma 1	a	b c	α	β
Hodnota:	5,02349	28,07480 9,29536	98,533	98,498
Sigma:	0,00047	0,00228 0,00092	0,006	0,009
	gama	V
Hodnota:	92,244	1279,712
Sigma:	0,008	0,208
Stanovení	j ednotkové	buňky formy 2:

Výsledky transmisní elektronové mikroskopie (TEM) ukázaly, že hodnoty a, c a β formy 1 a 2 jsou podobné. Píky ve vzorku formy 2 nemohly být zaznamenány, pokud jeden z buněčných okrajů nebyl zdvojený. To vyžadovalo, aby čtyři molekuly patřily buňce a jako taková, buňka by měla být pravděpodobné monoklonná s prostorovou skupinou P21. Dlouhá osa byla předpokládána jako b, TEM difrakcí vzorku se zjistilo, že projekce 5-9 A má úhel 81 °. Úprava úhlů alfa a

- 30 gama na 90 °, za současné úpravy úhlů a, c a β dává buňku, která je konzistentní s formou 2. Parametry buněk byly rafinovány s CELLREF a čísla byla použita v LeBailově postupu v GSAS ke stanovení finální jednotkové buňky pro polymorfní formu 2.

Forma 1	a	b
Hodnota:	4,99190	54,77106
Sigma:	0,00175	0,02405

c

9,37211

0,0035 a

90,000

0,000 β

99,154

0,037

Hodnota Sigma:

gama

90,000

0,000

2529,806

1,461

V

.. . . ,.Υ Í/UASOÍ • · · · · · · · · φφ φ • ΦΦ φ φφφφφ φ · φ * φ φ φ φφφφφφ φφφ φ · φ φ φφ φφφ φφφ φφφφ «φ φφ

Claims

31 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Krystalický roxifiban
2. Krystalický roxifiban podle nároku 1, vyznačující se tím, že je v podstatě v čisté formě.
3. Roxifiban podle nároku 2,vyznačující se tím, že jeho čistota je vyšší než 90 %.
4. Polymorfní forma 1 krystalického roxifibanu.
5. Roxifiban podle nároku 4, vyznačující se tím, že je v podstatě v čisté formě.
6. Roxifiban podle nároku 5, vyznačující se tím, že jeho čistota je vyšší než 90 %.
7. Polymorfní forma 1 podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že je charakterizována ¹³C CP/MAS NMR spektrem v pevném stavu majícím dvojité píky při 63 a 66 ppm.
8. Polymorfní forma 1 podle nároku 7, vyznačuj ící se t í m, že ¹^C CP/MAS NMR spektrum v pevném stavu má dvojité píky při 19 a 21 ppm.
9. Polymorfní forma 1 podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že má ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pevném stavu v podstatě ve shodě se spektrem uvedeným na obrázku 1.
10. Polymorfní forma 1 podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že je charakterizována práškovým rentgenogramem zahrnující hodnoty 2Θ 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,5 ± 0,2, 14,7 + 0,2, 19,3 ± 0,2, 21,5 ± 0,2, 22,5 ± 0,2, 23,2 + 0,2, 25,2 + 0,2, 27,5 + 0,2 a 32,2 + 0,2.
11. Polymorfní forma 1 podle nároku 10, vyznačuj ící se t £ m, že práškový rentgenogram neobsahuje v podstatě píky při 2Θ 13,6 + 0,2.
12. Polymorfní forma 1 podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že práškový rentgenogram je v podstatě v souladu s rentgenogramem uvedeným na obrázku 3.
13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že je připravený kombinací účinného množství sloučeniny podle nároku 4 s farmaceuticky přijatelným nosičem.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačuj ícísetím, žejev kapalné nebo pevné formě.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny na jednotkovou dávku.
16. Farmaceutický prostředek v pevné jednotkové dávkové formě vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 4 a farmaceuticky přijatelný nosič.
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že je formě kapsle, tablety, prášku nebo granule a obsahuje okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny.
18. Způsob inhibice vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/lIIa komplexu destiček, vyznačující se tím, že zahrnuje poskytnutí sloučeniny podle nároku 4, v množství, které je dostatečné k tomu, aby vedlo ke kontaktu glykoproteinového Ilb/lIIa komplexu destiček s účinným inhibičním množstvím aktivní léčivé substance.
19. Způsob podle nároku 18,vyznačující se tím, že rozpustný adhezivní protein je fibrinogen, von Willebrandův faktor, fibronektin nebo vitronektin.
20. Způsob podle nároku 18,vyznačující se tím, že sloučenina je poskytnuta lidskému nebo zvířecímu subjektu k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vivo.
21. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že sloučenina je poskytnuta do mimotělního zařízení k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vitro.
22. Způsob léčby nebo prevence thromboembolických chorob, zahrnujících tvorbu thrombu nebo embolu, zhoubnou agregaci destiček, reokluzi následující thrombolýzu, reperfuzní zranění, restenózu, aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu « · a nestabilní angínu, vyznačující se tím, že se podá hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 4.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se sloučenina podá v dávce od okolo 0,001 do okolo 10 mg/kg tělesné hmotnosti denně.
24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se sloučenina podá v dávce od okolo 0,005 do okolo 1 mg/kg tělesné hmotnosti denně.
25. Způsob podle nároku 24,vyznačující se tím, že se sloučenina podá pro léčbu nebo prevenci infarktu myokardu nebo mrtvice.
26. Způsob léčby nebo prevence chorob zahrnujících revmatickou artritidu, astma, alergii, respirační syndrom dospělých, odmítnutí transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktní dermatitidu, osteoporózu, osteoartritidu, nádorové metastázy, diabetickou retinopatii, zánětlivé stavy a zánětlivé nemoci tlustého střeva, vyznačuj ící se t i m, že se podá hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky nebo profylakticky účinného množství sloučeniny podle nároku 4.
27. Polymorfní forma 1 krystalického roxifibanu, vyznačující se tím, že se připraví rekrystalizaci roxifibanu ze směsného rozpouštědlového systému.
28. Polymorfní forma 2 krystalického roxifibanu.
29. Roxifiban podle nároku 28,vyznačující se tím, že je v podstatě v čisté formě.
30. Roxifiban podle nároku 5, vyznačující se tím, že jeho čistota je vyšší než 90 %.
31. Polymorfní forma 2 podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m, že je charakterizována -^c CP/MAS NMR spektrem v pevném stavu majícím jeden pík při 66 pm a žádný podstatný pík při 63 ppm.
32. Polymorfní forma 2 podle nároku 31, vyznačuj ící ··♦ · · 4 · 4 Φ • 4 · · Φ · · ······ • · · Φ Φ · · ·· ··· ··· ···· ·· ·· se t ί m, že -^C CP/MAS NMR spektrum v pevném stavu má jeden pík při 19 ppm a žádný podstatný pík 21 ppm.
33. Polymorfní forma 2 podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m, že má ¹³C CP/MAS NMR spektrum v pevném stavu v podstatě ve shodě se spektrem uvedeným na obrázku 2.
34. Polymorfní forma 2 podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m, že je charakterizována práškovým rentgenogramem zahrnující hodnoty 2Θ 6,4 ± 0,2, 9,6 ± 0,2, 12,4 ± 0,2, 13,6 + 0,2, 18,8 + 0,2, 20,7 + 0,2, 22,6 + 0,2, 23,1 + 0,2, 25,1 ± 0,2, 26,1 ± 0,2, 27,3 ± 0,2 a 28,5 ± 0,2.
35. Polymorfní forma 2 podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m, že práškový rentgenogram je v podstatě v souladu s rentgenogramem uvedeným na obrázku 3.
36. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že je připravený kombinací terapeuticky účinného množství sloučeniny podle nároku 28 s farmaceuticky přijatelným nosičem.
37. Farmaceutický prostředek podle nároku 36, vyznačující se tím, žejev kapalné nebo pevné formě.
38. Farmaceutický prostředek podle nároku 37, vyznačující se tím, že obsahuje okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny na jednotkovou dávku.
39. Farmaceutický prostředek v pevné jednotkové dávkové formě, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 28 a farmaceuticky přijatelný nosič.
40. Farmaceutický prostředek podle nároku 39, vyznačující se tím, že je formě kapsle, tablety, prášku nebo granule a obsahuje okolo 0,1 mg až okolo 25 mg sloučeniny.
41. Způsob inhibice vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček, vyznačující se tím, že zahrnuje poskytnutí sloučeniny podle nároku 28, v množství, které je dostatečné k tomu, aby vedlo ke kontaktu glykoproteinového Ilb/IIIa komplexu destiček s účinným inhibičním množstvím • · 9 · ·· 4 9 4 4 * 4 4 4 »4 · * φ 4 · · * 44 4 · 4 · 4 · * 9 · · 4 4 · 944444

4 4 4 9 4 4 4

94 94· 994 4494 44 4· aktivní léčivé substance.
42. Způsob podle nároku 41,vyznačující se tím, že rozpustný adhezivní protein je fibrinogen, von Willebrandův faktor, fibronektin nebo vitronektin.
43. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že sloučenina je poskytnuta lidskému nebo zvířecímu subjektu k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vivo.
44. Způsob podle nároku 41,vyznačující se tím, že sloučenina je poskytnuta do mimotělního zařízení k inhibici vazby rozpustného adhezivního proteinu ke glykoproteinovému Ilb/IIIa komplexu destiček in vitro.
45. Způsob léčby nebo prevence thromboembolických chorob, zahrnujících tvorbu thrombu nebo embolu, zhoubnou agregaci destiček, reokluzi následující thrombolýzu, reperfuzní zranění, restenózu, aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu a nestabilní angínu, vyznačující se tím, že se podá hostiteli, v případě potřeby takové léčby nebo prevence, terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 28.
46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že se sloučenina podá v dávce od okolo 0,001 do okolo 10 mg/kg tělesné hmotnosti denně.
47. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že se sloučenina podá v dávce od okolo 0,005 do okolo 1 mg/kg tělesné hmotnosti denně.
48. Způsob podle nároku 47,vyznačující se tím, že se sloučenina podá pro léčbu nebo prevenci infarktu myokardu nebo mrtvice.
49. Způsob léčby nebo prevence chorob zahrnujících revmatickou artritidu, astma, alergii, respirační syndrom dospělých, odmítnutí transplantovaného orgánu, septický šok, psoriázu, kontaktní dermatitidu, osteoporózu, osteoartritidu, nádorové metastázy, diabetickou retinopatii, zánětlivé stavy a zánětlivé nemoci tlustého střeva, vyznačuj ící se t i m, že se podá hostiteli, v případě potřeby takové

• · · * · · ·· 9 9 9 • 9 • · · 9 9 9 · • « ♦ 999 9 9 • • · 9 99 • · · ·»· ···· • 9

léčby nebo prevence, terapeuticky nebo profylakticky účinného množství sloučeniny podle nároku 28.
50. Polymorfní forma 2 krystalického roxifibanu, vyznačující se tím, že se připraví rekrystalizací roxifibanu ze směsného rozpouštědlového systému.

1/4 • fl • fl fl » • · • · flfl • fl flflfl* flflflfl fl · flflfl·· • fl · fl · flflflfl·· • flfl · · • flfl flflfl flflflfl flfl flfl

Obrázek 1

2/4

99 9 9 9· 99 99

9 9 99 99 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 « · * 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 999 999 9999 99 99

Obrázek 2