SK1652002A3

SK1652002A3 - Pyrimidine-2,4,6-trione metalloproteinase inhibitors

Info

Publication number: SK1652002A3
Application number: SK165-2002A
Authority: SK
Inventors: Julian Blagg
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2002-09-10
Also published as: PL353871A1; NO20020662L; MA26812A1; US6579982B1; KR20020047119A; EP1202974A1; BR0013081A; NZ516562A; ZA200201070B; EP1202974B1; UY26285A1; KR20040073608A; HUP0202501A2; PA8498701A1; CA2381551A1; JP2003507371A; AR025091A1; YU6602A; CN1156454C; HRP20020129A2

Description

Oblasť techniky ’b·· Predkladaný vynález sa týka inhibítorov pyrimidín-2,4,6« trión metaloproteinázy a farmaceutických preparátov a spôsobov liečby a zápalových, nádorových a ďalších ochorení.

Doterajší stav techniky u: ... Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sú inhibítormi zinkových metaloendopeptidáz, predovšetkým tých, ktoré patria do podrodín matrixových metaloproteináz (taktiež nazývaných MMP alebo matrixíny) a reprolyzínov z rodiny metzincínov (Rawlings et al., Methods in Enzymology, 248, 183-228 (1995) a Stocker et al., Protein Science, 4, 823840 (1995)).

MP podrodina enzýmov obsahuje v súčasnosti sedemnásť členov (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20). MMP enzýmy sú najviac známe pre ich úlohu v obrate proteínov extracelulárnej matrix, čím hrajú dôležitú úlohu v normálnych fyziologických postupoch, ako sú napríklad reprodukcie, vývoj a diferenciácie. MMP enzýmy sú naviac exprimované v mnohých patologických situáciách, v ktorých sa vyskytuje abnormálny obrat spojivového tkaniva. Napríklad bolo preukázané, že MMP13, enzým s výraznou aktivitou degradujúci kolagén typu II (hlavný kolagén v chrupavke, je zvýšene exprimovaný i

v chrupavke pri artróze (Mitchell et al., J Clin Invest., 97, 761 (1996)). Ďalšie MMP enzýmy (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP9, MMP-12) sú taktiež zvýšene exprimované v chrupavke pri artróze a je očakávané, že inhibícia niektorých z týchto MMP enzýmov zníži alebo zablokuje urýchlený úbytok chrupavky typický pre ochorenie kĺbov, ako je napríklad artróza alebo reumatoidná artritída.

Cicavčie reprolyzíny sú známe pod skratkou ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase) (Wolfberg et al., J Celí Biol., 131, 275-278 (1995)) a obsahujú naviac k doméne podobné metaloproteinázam aj dezintegrínovú doménu. Do dnešnej doby bolo identifikovaných 23 odlišných enzýmov ADAM.

Enzým ADAM-17, taktiež známy ako enzým konvertujúci tumor nekrotizujúci faktor-alfa (TACE), je najznámejším enzýmom ADAM. Enzým ADAM-17 (TACE) je zodpovedný za štiepenie tumor nekrotizujúceho faktoru-alfa (TNF-α, taktiež známy ako kachektín) naviazaného na bunku. TNF-α zohráva úlohu v mnohých infekčných a autoimúnnych ochoreniach (W Friers, FEBS Lettesr, 285, 199 (1991)). Ďalej bolo preukázané, že TNF-α je hlavným mediátorom zápalovej odpovede v sepse a v septickom šoku (Spooner et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 62 Sll (1992)). Existujú dve formy TNF-a, typ II membránový proteín s relatívnou molekulovou hmotnosťou 26000 (26 kD) a rozpustná 17 kD forma tvorená proteínom naviazaným k bunke špecifickým proteolytickým štiepením. Rozpustná 17 kD forma TNF-α je uvoľňovaná bunkou a je združená so škodlivými účinkami TNF-α. Forma TNF-α je taktiež schopná účinkovať na miestach vzdialených od miesta syntézy. Inhibítory TACE teda zabraňujú tvorbe TNF-α a zabraňujú škodlivým účinkom rozpustného faktoru.

Vybrané zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu sú účinnými inhibítormi agrekanázy, enzýmu dôležitého pri degradácii agrekanu chrupavky. Agrekanáza patrí pravdepodobne taktiež medzi enzýmy ADAM (Tortorella et al., Science 284, 1664 (1999)). Úbytok agrekanu z chrupavkovej matrix je dôležitým faktorom v progresii ochorení kĺbov, ako sú napríklad artróza a reumatoidná artritis a agrekanáza pravdepodobne spomaľuje alebo blokuje stratu chrupavky u týchto ochorení. Iné enzýmy ADAM, ktoré sú exprimované v patologických situáciách, zahŕňajú enzým ADAM TS-1 (Kuno, et al., J Biol Chem 272, 556-562 (1997)) a enzýmy ADAM 10, 12 a 15 (Jwu et al., Biochem, Biophys Comm, 235, 437-442, (1997)). Ako sa zvyšujú znalosti týkajúce sa expresie, patologických substrátov a ochorení združených s enzýmami ADAM, bude Ocenený plný význam úlohy inhibície tejto triedy enzýmov.

Je známe, že v rôznych patologických situáciách sú exprimované rôzne kombinácie enzýmov MMP a ADAM. U jednotlivých ochorení môžu byť preto preferované, inhibítory so špecifickými selektivitami pre jednotlivé enzýmy ADAM a/alebo MMP. Reumatoidná artritis je napríklad zápalové ochorenie kĺbov charakterizované vysokými hladinami TNF a stratou zložiek kĺbovej matrix. V tomto prípade môže byť prednostnou liečbou liečba zlúčeninou, ktorá inhibuje enzýmy TACE a agrekanázu, rovnako tak ako enzýmy MMP, ako je napríklad M-MP-13. Na druhej strane u menej zápalových ochorení, ako je napríklad artróza, môžu byť preferované zlúčeniny, ktoré inhibujú enzýmy MMP degradujúce matrix, ako sú napríklad enzýmy MMP-13, ale nie však TACE.

Vynálezcovia taktiež objavili, že je možné identifikovať inhibítory definované vzorcom I s diferenciálnymi metaloproteinázami a aktivitou reprolyzínu (prednostne inhibičná aktivita voči MMP-13). Jedna skupina prednostných inhibítorov definovaných vzorcom I, ktorú boli vynálezcovia schopní identifikovať, zahŕňajú inhibítory, ktoré selektívne inhibujú enzým MMP-13 prednostne pred enzýmom MMP-1.

Inhibítory matrixových metaloproteináz a reprolyzínu sú dobre známe v literatúre. Publikácia PCT WO 98/58925 publikovaná 30. decembra 1998 sa špecificky týka inhibítorov MMP na báze pyrimidín-2,4,6-triónu. Publikácia European Patent Publication 606,046 publikovaná 13. júla 1994 sa týka určitých heterocyklických inhibítorov MMP. Patent United States Patent 5,861,510 vydaný 19. januára 1999 sa týka cyklických arylsulfonylaminohydroxyámových kyselín, ktoré sú užitočné ako inhibítory MMP. Publikácia PCT WO 98/34918 publikovaná 13. augusta sa týka heterocyklických hydoxyámových kyselín zahŕňajúcich určité dialkyl substituované zlúčeniny, ktoré sú užitočné ako inhibítory MMP. Publikácie PCT WO 96/27583 a WO 98/07697 publikované

7. marca 1996 a 26. februára 1998 sa týkajú arylsulfonylhydroxyámových kyselín. Publikácia PCT WO 98/03516 publikovaná 29. januára 1998 sa týka fosfinátov s aktivitou MMP. Publikácia PCT 98/33768 publikovaná

6. augusta 1998 sa týka N-nesubstituovaných arylsulfonylaminohydroxyamínových kyselín. Publikácie PCT Publication WO 98/08825 a WO 9808815, obe publikované 5. marca 1998, sa týkajú určitých heterocyklických inhibítorov MMP. Patentové prihlášky United States Patent 60/096232 a 60/096256, obe zaregistrované 12. augusta 1998, sa taktiež týkajú MMP na báze heterocyklickej hydroxyámovej kyseliny a inhibítorov TACE. Každá z vyššie uvedených publikácií je týmto začlenená ako referencia celým svojim obsahom.

Opis vynálezu

Predkladaný vynález sa týka zlúčenín definovaných vzorcom .

^XN-M^X_Ar1_Y_Z

A.

(D

R³ kde

R¹ je vodík, (C1-C4) perfluoroalkyl, (Ci-C₈) alkyl alebo (C₃-C₈) cykloalkyl, kde spomenutý (Ci-C₈) alkyl alebo (C₃-C₈) cykloalkyl môžu voliteľne obsahovať jeden až tri heteroatómy nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej kyslík, >NR⁵ a šíru, kde spomenutý (C]-C8) alkyl alebo (C3-C8) cykloalkyl môžu byť voliteľne substituované jedným až dvomi substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej (C1-C4) alkyl, (C6-Ci0) aryl, (C2-Ci0) heteroaryl, OH, NH2, (C1-C4) alkylamino, di[(C!-C4) alkyljamino, (C3-C8) cykloalkylamino, (C3-C8) cykloalkylamino (C!-C4) alkylamino, (Ci-C8) alkoxy, -CONH2, -CONHR⁴, -NOC(R⁴)2T(C₃-C₈) cykloalkyl, kde spomenutý (C₃-C₈) cykloalkyl môže voliteľne obsahovať jeden alebo dva heteroatômy nezávisle vybrané z >NR⁵, kyslíka a síry;

3

R a R sú nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík alebo (C1-C4) alkyl, kde spomenutý (C1-C4) alkyl môže voliteľne obsahovať jeden heteroatóm vybraný zo skupiny obsahujúcej kyslík, >NR⁵ alebo síru, a spomenutý (Cj-C4) alkyl môže byť voliteľne substituovaný (Cô-Cio) arylom, (C2-Cio) heteroarylom, OH, NH2, (Ci-C4) alkylamino, di[(CiC4) alkyljamino, (C3-C8) cykloalkylamino, (C3-C8) alkylamino (Ci-C4) alkylamino, (Cj-C4) alkoxy, CON(R⁴)2 a (C₃-C₈) cykloalkylom; kde spomenutý (C₃-C₈) cykloalkyl môže obsahovať jeden alebo dva heteroatômy nezávisle vybrané z >NR⁵, kyslíka a síry;

X je vybrané zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru, >SO₂, >S=O, >NR⁴, .CH2O-, -OCH2, -CH2S-, -CH2(S=O)-, CH2SO2-, -SCH2-, -SOCH2-, -SO2CH2-, -N(R⁴)CH2-, CH₂N(R⁴)-, -N(R⁴)SO₂- a -SO₂N(R⁴)R⁴ kdekoľvek sa vyskytuje, je nezávisle vybraný zo skupiny obsahujúcej vodík a (Ci-C₄) alkyl;

R⁵ kdekoľvek sa vyskytuje, je nezávisle vybraný zo skupiny obsahujúcej vodík a (Ci-C₄) alkyl, (C₆-Cio) aryl, (C₂-C₁₀) heteroaryl, OH, CONH₂, CONHR⁴, CON(R⁴)₂ a (C₃-C₈) cykloalkyl;

Y je vybrané zo skupiny obsahujúcej väzbu, kyslík, síru, >SO₂, >S=O, >NH_> .CH₂-, .CHO₂-, -OCH₂, CH₂S-, -CH₂(S=O)-, -CH₂SO₂-, -SCH₂-, -SOCH₂-, 6

SO.₂CH₂-, -nhch₂-, -ch₂nh-, -ch₂ch₂-, -ch=ch-, -NHSO₂- a -SO₂NH-;

Ar je (C₆-Cio) aryl alebo (C₂-Cio) heteroaryl; a

Z je (C₆-Cio) aryl, (C₃-C₈) cykloalkyl, (C₃-C₈) cykloalkyl (C1-C4) alkyl alebo (C₂-C₁₀) heteroaryl; kde jeden alebo dva kruhové uhlíkové atómy spomenutých (C₃-C₈) cykloalkylu alebo (C₃-C₈) cykloalkyl(Ci-C₄) cykloalkylu môžu byť voliteľne nahradené heteroatómami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru a NR⁵;

Ar¹ a Z môžu byť voliteľne substituované na akomkoľvek z kruhových uhlíkových atómov schopných tvorby ďalšej väzby jedným až tromi substituentami nezávisle vybranými z F, Cl, Br, CN, OH, (C1-C4) alkyl, (C1-C4) perfluoroalkyl, (C1-C4) perfluoroalkoxy, (C1-C4) alkoxy, a (C₃-C₈) cykloalkyloxy alebo ich farmaceutický prijateľné soli.

Predkladaný vynález sa taktiež týka farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí alebo zlúčenín definovaných vzorcom I. Kyseliny, ktoré sú používané na prípravu farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí vyššie uvedených zásaditých zlúčenín sú také soli, ktoré tvoria netoxické kyslé adičné soli, t.z. soli obsahujúce farmakologicky prijateľné anióny, ako sú napríklad hydrochloridové, hydrobromidové, hydrojodidové, nitrátové, sulfátové, bisulfátové, fosfátové, kyslé fosfátové, acetátové, laktátové, citrátové, kyslé citrátové, taratrátové, bitartarátové, sukcinátové, maleátové, fumarátové, glukonátové, sacharátové, benzoátové, metánsulfonátové, etánsulfonátové, benzénsulfonátové, p-toluénsulfonátové a pamoátové [t.z. 1,1'metylén-bis-(2-hydroxy-3-naftoátové)] soli.

Vynález sa taktiež týka zásaditých adičných solí definovaných vzorcom I. Chemické zásady, ktoré môžu byť použité ako Činidlá na prípravu farmaceutický prijateľných zásaditých solí týchto zlúčenín definovaných vzorcom I, ktoré sú kyslé svojim charakterom, sú také zlúčeniny, ktoré tvoria netoxické zásadité soli s takýmito zlúčeninami. Také netoxické zásadité soli zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na zlúčeniny odvodené od farmakologicky prijateľných katiónov, ako sú napríklad katióny alkalických kovov (napríklad draselné a sodné) a katióny kovov alkalických zemín (napríklad kalciové a horečnaté) amónne alebo amínové adičné soli rozpustné vo vode, ako sú napríklad N-metylglukamín-(meglumín), a nižšie alkanolamónium a ďalšie zásadité soli farmaceutický prijateľných organických amínov.

Výraz „väzba“, ako je tu použitý v skupine Y znamená, že skupiny Ar¹ a Z sú priamo pripojené prostredníctvom väzby uhlík-uhlík, takže vytvárajú previsnuté arylové kruhy, akó je napríklad difenyl.

Výraz „alkyl“, ako je tu používaný zahŕňa, ak nie je uvedené inak, nasýtené monovalentné uhľovodíkové radikály majúce nevetvené, vetvené alebo cyklické skupiny alebo ich kombinácie. Alkylové skupiny, kdekoľvek sa vyskytujú, môžu byť voliteľne substituované vhodným substituentom.

Výraz „alkenyl“, ako je tu používaný zahŕňa, ak nie je uvedené inak, uhľovodíkové radikály obsahujúce aspoň jednu olefínovú väzbu a majúce nevetvené, vetvené alebo cyklické skupiny alebo ich kombinácie.

Výraz „alkynyl“, ako je tu používaný zahŕňa, ak nie je. uvedené inak, uhľovodíkové radikály obsahujúce aspoň jednu trojitú väzbu medzi uhlíkovými atómami a majúce nevetvené, vetvené alebo cyklické skupiny alebo ich kombinácie.

Výraz „alkoxy“, ako je tu používaný, zahŕňa O-alkylové skupiny, kde „alkyl“ je rovnaký, ako je definované vyššie.

Výraz „halo“, ako je tu používaný, zahŕňa, ak nie je uvedené inak, fluór, chlór, bróm alebo jód, prednostne fluór alebo chlór.

Výraz „aryl“, ako je tu používaný, zahŕňa, ak nie je uvedené, inak, organický radikál odvodený z aromatického uhľovodíku odstránením jedného alebo viacerých vodíkových atómov, ako sú napríklad fenyl alebo naftyl, voliteľne substituovaný 1 až 3 vhodnými substituentami, ako sú napríklad fluór, chlór, kyano, nitro, trifluorometyl, (Ci-C₆) alkoxy, (C₆C₁₀) aryloxy, (C₃-Cg) cykloalkyloxy, trifluorometoxy, difluorometoxy alebo (Cj-Cô) alkyl.

Výraz „heteroaryl“, ako je tu používaný, zahŕňa, ak nie je uvedené inak, organický radikál odvodený od aromatickej heterocyklickej zlúčeniny odstránením jedného alebo viacerých vodíkových atómov, ako sú napríklad pyridyl, furyl, pyrolyl, tienyl, izotiazolyl, imidazolyl, benzimidazolyl, tetrazolyl, pyrazinyl, pyrimidyl, chinolyl, izochinolyl, benzofuryl, izobenzofuryl, benzotienyl, pyrazolyl, indolyl, izoindolyl, purinyl, karbazolyl, tiazolyl, oxazolyl, benztiazolyl alebo benzoxazolyl voliteľne substituovaný 1 až 3 vhodnými substituentami, ako je definované nižšie, ako sú fluoro, chloro, trifluorometyl, (Ci-C₆) alkoxy, (C₆-Ci₀) aryloxy, (C₃-Cg) cykloalkyloxy, trifluorometoxy, difluorometoxy alebo (Cj-Cô) alkyl.

„Vhodný substituent“ znamená chemicky a farmaceutický prijateľnú funkčnú skupinu, t.z. skupinu, ktorá neruší inhibičnú aktivitu vynájdených zlúčenín. Také vhodné substituenty môžu byť rutinne vybrané osobami znalými v odbore. Ilustratívne príklady vhodných substituentov zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na halogénové skupiny, perfluoroalkylové skupiny, perfluoroalkoxy skupiny, alkylové skupiny, hydroxy skupiny, oxo skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, alkoxy skupiny, arylové alebo heteroarylové skupiny, aryloxy alebo heteroaryloxy skupiny, karboxy skupiny, amino skupiny, alkylové a dialkylamino skupiny, karbamoylové skupiny, alkylkarbonylové skupiny, alkoxykarbonylové skupiny, alkylaminokarbonylové skupiny, dialkylaminokarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, aryloxykarbonylové skupiny, alkylsulfonylové skupiny, arylsulfonylové skupiny a podobne.

Niektoré zlúčeniny definované vzorcom I obsahujú čhírálne centrá, a preto existujú v rôznych énäntiomérnych formách. Tento vynález sa týka všetkých optických izomérov, enantiomérov, diastereomérov a stereoizomérov zlúčenín definovaných vzorcom I a ich zmesí. Zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu taktiež existujú v rôznych tautomérnych formách. Vynález sa taktiež týka všetkých tautomérov definovaných vzorcom I.

Prednostné zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, sú také zlúčeniny, kde R² a R³ sú každý vodík. Ďalšie prednostné zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, zahŕňajú zlúčeniny, kde X je kyslík, -OCH₂-, -CH₂O-, prednostnejšie kde X je kyslík, prednostnejšie kde Y je väzba, kyslík, síra, CH₂, >SO₂, OCH₂ alebo CH₂O, prednostnejšie kde Y je kyslík.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú také zlúčeniny definované vzorcom I, kde X je síra, >SO₂, -SCH₂, CH₂S, CH₂SO₂-, -SO₂CH₂-, prednostnejšie kde Y je väzba, kyslík, síra, CH₂, >SO₂, -OCH₂-, -CH₂O-, najprednostnejšie kde Y je kyslík.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú také zlúčeniny definované vzorcom I, kde X je >NR⁴, -CH2NR⁴ alebo -NR4CH₂, prednostnejšie kde Y je väzba, kyslík, síra, CH₂, >SO₂, -OCH₂, -CH₂O-, prednostnejšie kde Y je -OCH₂-, -CH₂O-, najprednostnejšie kde Y je kyslík.’

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú také zlúčeniny definované vzorcom I, kde X je -N(R⁴)SO2- alebo -SO2N(R⁴), výhodnejšie kde Y je väzba, kyslík, síra, CH2, >SO₂, -OCH₂-, CH₂O-, prednostnejšie kde Y je kyslík, -OCH₂-, najprednostnejšie kde Y je kyslík.

Ďalšie prednostné zlúčeniny sú také zlúčeniny, kde Ar¹ je voliteľne substituovaný fenyl.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú také zlúčeniny definované vzorcom I, kde Zje (C₆-Ci₀) aryl, prednostne fenyl, voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentami, prednostne žiadnym, jedným alebo dvomi substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej F, Cl, Br, -CN, OH, (C1-C4) alkyl, (C1-C4) perfluoralkyl, (C1-C4) perfluoralkoxyl, (C1-C4) alkoxy a (C₃-C₈) cykloalkoxy.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú také zlúčeniny definované vzorcom I, kde Zje (C₃-C₈) cykloalkyl (t.z. (C₃-C₈) cykloalkyl alebo (C₃-C₈) cykloalkyloxy-(Ci-C₄) alkyl), kde jeden alebo dva kruhové uhlíkové atómy spomenutého (C₃-C₈) cykloalkylu môžu byť voliteľne nahradené heteroatómami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru alebo NR⁵, kde R⁵ je vybrané zo skupiny obsahujúce vodík, (C1-C4) alkyl, (C6-C10) aryl, (C2-Ci0) heteroaryl, OH, CONH2, CONHR⁴, -CONHR⁴, -NOC(R⁴)2 a (C₃-C₈) cykloalkyl. Také prednostné skupiny zahŕňajú cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, N-metyl-3azetidinyl, piperazinyl, piperidinyl, l,3-oxazolidin-4-on-5-yl, 1,3-oxazolidin-2,4-dion-5-yl, 4,5-dihydro-1,2-oxazolidin-3-on4- yl, l,3-tiazolidin-4-on-5-yl, l,3-tiazolidin-2,4-dion-5-yl, 1,3imidazolidin-4-on-5-yl, 1,3-imidazolidin-2,4-dion-5-yl, 1,2pyrzolidin-3-on-4-yl, tetrahydro-1,3-oxazin-4-on-5-yl, tetrahydro-l,3-oxazin-2,4-dion-5-yl, morfolinyl, morfolin-3-on2-yl, morfolin-3,5-dion-2-yl, 2,3-dihydro-l,4-oxazin-3-on-2-yl, tetrahydro-1,3-tiazin-4-on-5-y 1, tetrahydro-l,3-tiazin-2,4-dion5- yl, tiomorfolinyl, tiomorfolin-3-on-2-yl, tiomorfolin-3,5-dion2-yl, 2,3-dihydro-1,4-tiazin-3-on-2-yl, hexahydro-1,2-diazin-3οη-4-yl, 4,5-dihydro-2H-pyridazin-3-on-4-yl, hexahydro-1,3diazin-2,4-dion-5-yl, piperazin-2-on-3-yl, tetrahydro-1,3,4tiadiazin-5-on-6-yl, 5,6-dihydro-l,3,4-tiadiazin-5-on-6-yl, l,3,4-oxadiazin-5-on-6-yl, 5,6-dihydro-1,2,4-oxadiazin-5-on-6yl, 1,2,4-oxadiazin-3,5-dion-6-yl a 1,2,4-triazin-6-on-5-yl, prednostne cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, N-metyl-3-azetidinyl, piperazinyl, piperidinyl, N-metylpiperidinyl a morfolinyl, prednostnejšie cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, tetrahydrofuranyl a tetrahydropyranyl, najprednostnejšie cyklopropyl, tetrahydrofuranyl a tetrahydropyranyl.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny definované vzorcom I, kde Zje (C3-C₈)cykloalkyl (Ci-C₄)alkyl, kde jeden alebo dva kruhové uhlíkové atómy spomenutého (C3C₈)cykloalkyl (Ci-C₄)álkylu môžu byť voliteľne nahradené heteroatómami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru alebo >NR⁵, kde R⁵ je vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík, (Cj-C4) alkyl, (Cô-Cio) aryl, (C2-C10) heteroaryl, OH, -CONH2, -CONHR⁴, -NOC(R⁴)2, a (C₃-C₈) cykloalkyl. Prednostné cykloalkylové a heterocykloalkylové kruhy sú rovnaké, ako je opísané vyššie. Prednostnými alkylmi spomenutého (C₃-C₈)cykloalkyl (Ci-C₄)alkylu sú metylén a etylén.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny definované vzorcom I, kde Zje (C₂-C₁₀) heteroaryl, prednostne pyridyl, furyl, pyroyl, tienyl, izotiazolyl, imidazolyl, benzimidazolyl, tetrazolyl, pyrazinyl, pyrimidyl, chinolyl, izochinolyl, benzofuryl, izobenzofuryl, benzotienyl, pyrazolyl, indolyl, izoindolyl, purinyl, karbazolyl, izoxazolyl, tiazolyl, oxazolyl, benztiazolyl alebo benzoxazolyl, prednostnejšie pyridyl, pyrimidyl alebo pyrazolyl, najprednostnejšie pyridyl; kde každý spomenutý (C₂-Ci₀) heteroaryl môže byť voliteľne substituovaný 1 až 3 vhodnými substituentami, ako sú napríklad fluoro, chloro, trifluorometyl, (Ci-C₆) alkoxy, (C₆-Ci₀) aryloxy, trifluorometoxy, difluorometoxy alebo (Ci-Cô) alkyl.

Ďalšie prednostné zlúčeniny vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny, kde Ar¹ je fenyl alebo (C₂-Ci₀) heteroaryl, prednostne pyridyl, furyl, pyroyl, tienyl, izotiazolyl, imidazolyl, benzimidazolyl, tetrazolyl, pyrazinyl, pyrimidyl, chinolyl, izochinolyl, benzofuryl, izobenzofuryl, benzotienyl, pyrazolyl, indolyl, izoindolyl, purinyl, karbazolyl, izoxazolyl, tiazolyl, oxazolyl, benztiazolyl alebo benzoxazolyl, prednostnejšie fenyl, pyridinyl, pyrazinyl, pyrimidyl, pyrimidyl, najprednostnejšie pyridyl alebo fenyl voliteľne substituovaný 1 až 3 vhodnými substituentami, ako sú napríklad fluoro, chloro, trifluorometyl, (Ci-Cg) alkoxy, (Cô-Cjo) aryloxy, trifluorometoxy, difluorometoxy alebo (Cj-C₆) alkyl.

Ďalšie prednostné zlúčeniny vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny, kde Ar¹ a Z sú substituované akýmikoľvek kruhovými atómami uhlíka schopnými tvorby ďalšej väzby jedným alebo viacerými substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej F, Cl, Br, -CN, OH, (C1-C4) alkyl, (C1-C4) perfluoroalkyl, (C1-C4) perfluoroalkoxy, (C!-C₄) alkoxy a (C₃C₈) alkyloxy.

Najprednostnejšie zlúčeniny vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny definované vzorcom I, kde X je kyslík, Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂-, -CH₂O-; R¹ je vodík alebo (C1-C4) alkyl, kde spomenutý (C1-C4) alkyl môže voliteľne obsahovať jeden až dva heteroatómi nezávisle vybrané z kyslíka a >NR⁵, kde spomenutý (C1-C4) alkyl môže byť taktiež voliteľne substituovaný jedným až tromi substituentami (prednostne žiadnym, jedným alebo dvomi substituentami) nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej (CJ-C4) alkyl, OH, NH2, (CiC4) alkylamino, di[(Ci-C4) alkyl] amino, (C1-C4) alkoxy, CONH2, -CONHR⁴ a NOC(R⁴)2; a R² a R³ sú nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík a (C1-C4) alkyl.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny definované vzorcom I, kde R¹ je (C1-C4) alkyl voliteľne obsahujúci jeden až tri heteroatómi (prednostne dva heteroatómi oddelené aspoň jedným uhlíkovým atómom, prednostne kde spomenutým heteroatómom je -NH- alebo O, najprednostnejšie O), kde spomenutý (Cj-C₄) alkyl je substituovaný OH, NH₂, (C1-C4) alkylamino, di [(C1-C4) alkyl] amino, (C1-C4) alkoxy alebo NOC(R⁴)₂, prednostne di[(C!-C4) alkyl] amino.

Ďalšie formy vynálezu zahŕňajú tie zlúčeniny definované vzorcom I, kde aspoň jeden z R² alebo R³ je (C1-C4) alkyl, voliteľne substituovaný jedným heteroatómom (prednostne je spomenutým heteroatómom -NH- alebo -0-, najprednostnejšie 0-), kde spomenutý (C1-C4) alkyl je substituovaný jednou alebo dvomi skupinami nezávisle vybranými z (Cô-Cio) arylu alebo (C₂-Cio) heteroarylu.

v

Ďalšie prednostné zlúčeniny zahŕňajú tie zlúčeniny, kde:

R¹ je metyl; R² a R³ sú každý vodík; X je kyslík; Y je kyslík; a Z je (C₆-C₁₀) aryl;

R¹ je n-butyl; R² a R³ sú každý vodík; X je kyslík; Y je kyslík; a Z je (C₆-C₁₀) aryl;

R¹ je metyl; R² a R³ sú každý vodík; X.je kyslík; Y je kyslík; a Z je (C₆-Ci₀) aryl;

R¹ je n-butyl; R² a R³ sú každý vodík; X je kyslík; Y je kyslík; a Z je (C₆-C_I0) aryl;

v

Špecifické prednostné zlúčeniny definované vzorcom I sú vybrané zo skupiny obsahujúcej:

5-Metyl-5-(4-fenoxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4fluorofenoxy)-feno xy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-n-Butyl-5-(4-fenoxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-n-Butyl-5-(4-(4'-fluorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-fenyl-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(3-fenyl-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión; a

5-Metyl-5-(4-benzyloxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

alebo ich farmaceutický prijateľné soli.

Ďalšie zlúčeniny vynálezu zahŕňajú:

5-Mety 1-5-(4-(4'-chlorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín- 2,4,6 trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-kyanofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-trifluorometylfenoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Mety 1-5-(4-(4'-metoxy fenoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(3 '-chlorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín- 2,4,6 trión;

5-Metyl-5-(4-(3 '-fluorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(3 '-trifluorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(3 '-chloro fény lmetoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Mety 1-5-(4-(4 '-fluoro fény lmetoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Mety 1-5-(4-(4 '-fluoro-2'-chloro-fenylmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-fluoro-2 '-fluoro-fenylmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-fluoro-2'-mety l-fenylmetoxy)-fenoxy) pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4 '-fluoro2 '-trifluorometyl-fenylmetoxy)fenoxy)-pyrimidín -2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-fluoro-2'-cyklopropyl-fenylmetoxy)fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(pyridin-2-yl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(4 '-fluoro-pyridin-2-yl)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-chloro-pyridin-2-yl)-fenoxy)-pyrimidín

2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(pyridin-4-yl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Mety 1-5-(4-(pyridin-3-y l)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(pyrimidín-2-yl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(pyrimidín-4-yl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(pyrazin-3-yl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(pyrazin-4-yl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

l,5-Dimetyl-5-(4-(4 '-fluoro fény lmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

1-Etyl, 5-metyl-5-(4-(4fluorofenylmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

- (2-metoxy etyl)-5-mety 1-5 -(4-(4 '-fluoro fenylmetoxy) fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

1-(2-dimety lamino-etyl)-5-metyl-5-(4-(4'-fluoro fenylmetoxy )-fenoxy )-pyrimidín-2,4,6-trión;

l-Cyklopropylmetyl-5-metyl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Dimetylaminometyl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-(2-Dimetylamino-etyl)-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-(2-metoxyetyl)-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fenoxy) pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Cyklopropylmetyl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Etyl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fenoxy )-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Trifluoromety 1-5-(4-(4 '-fluorofeny lmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Izopropyl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Izobutyryl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Mety 1-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fény ltio)-pyrimidín₄2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-'ŕluorofenylmetoxy)-fenylsulfonyl)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-fluorofenylmetoxy)-fenylsulfoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5 - (4-(4'-fluoro fenylmetoxy)-fenylamino)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(N-metyl-N-4-(4'-fluorofenylmetoxy)fenylamino)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-(4-(4'-fluorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-(4-(4'-chlorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-fluorofenyl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(4-(4'-chlorofenyl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5 - (4-(4'-fluoro fenyl)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5 -(3-(4 '-chlorofeny l)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-Metyl-5-(5-(4'-fluorofenoxy)-2-pyridyloxy)-pyrimidín

2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(2-(4'-fluoro fenoxy)-5-pyridyloxy)-pyrimidín

2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(2-(4'-fluorofenoxy)-6-pyrazinyloxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(2-(4'-fluorofenoxy)-6-pyrimidyloxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(cyklopropylmetoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Metyl-5-(4-(cyklobutylmetoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-Mety 1-5-(4-(cyklopenty lmetoxy)-fenoxy)-pyrimi dín2,4,6-trión;

5-Mety 1-5-(4-(3 '-tetrahy drofurany lmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión; .......

5-Metyl-5-(4-(4 '-tetrahy dropy rany lmetoxy)-fenoxy )pyrimidín-2,4,6-trión a

5-Metyl-5-(4-(N-metyl-3-azetidinylmetoxy)-fenoxy)pyrimidín-2,4,6-trión;

alebo ich farmaceutický prijateľné soli.

Predkladaný vynález sa taktiež týka farmaceutického preparátu na liečbu ochorení vybraných zo skupiny obsahujúcej artritis (vrátane artrózy a reumatoidnej artritídy), nešpecifické črevné zápaly, Crohnovu chorobu, emfyzém, akútny syndróm respiračnej úzkosti, astmu, chronickú obštrukčnú pľúcnu chorobu, Alzheimerovu chorobu, toxicitu spôsobenú orgánovou transplantáciou, kachexiu, alergické reakcie, alergickú kontaktnú hypersenzitivitu, nádorové ochorenia (ako sú napríklad nádorová invázia, nádorové metastázy, solídne nádory zahŕňajúce rakovinu hrubého čreva, nádory prsníka, pľúc a prostaty a hematopoetické malignity zahrňujúce leukémiu a lymfómy), tkanivovú ulceráciu, restenózu, periodontálnu chorobu, epidermolýzis bulosa, osteoporózu, uvoľnenie umelých klbnych implantátov, aterosklerózu (zahrňujúcu ruptúru aterosklerotického plátu), aortálne aneuryzmá (zahrňujúce aneurysma abdominálnej aorty a mozgové aneuryzmá), kongestívne zlyhanie srdca, infarkt myokardu, mozgovú mŕtvicu, mozgovou ischémiu, trauma hlavy, poranenia miechy, neurodegeneratívne ochorenia (akútne a chronické), autoimúnne ochorenia, Huntingtonovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, migrénu, depresiu, periférnu neuropatiu, bolesti, mozgovú amyloidovú angiopatiu, nootropické alebo kognitívne zlepšenie, amyotrofickú laterálnu sklerózu, roztrúsenú sklerózu, okulárnu angiogenézu, korneálne poranenie, makulárnu degeneráciu, abnormálne hojenie rán, popáleniny, diabetes, korneálne zjazvenie, skleritis, AIDS, sepsu, septický šok a ďalšie ochorenia charakterizované metaloproteinázovou aktivitou a ďalšie ochorenia charakterizované reprolyzínovou aktivitou u cicavcov vrátane človeka obsahujúce množstvo zlúčeniny definovanej vzorcom I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli účinné pri liečbe týchto ochorení a farmaceutický prijateľný nosič.

Predkladaný vynález sa taktiež týka farmaceutického preparátu na inhibíciu

a) matrix metaloproteináz alebo iných metaloproteináz zohrávajúcich úlohu pri degradácii matrix alebo

b) cicavčieho reprolyzínu (ako je . napríklad agrekanáza, alebo enzýmy ADAM TS-1, 10, 12, 15 a 17, najprednostnejšie agrekanáza alebo enzým ADAM-17) u cicavca vrátane človeka obsahujúceho účinné množstvo zlúčeniny definovanej vzorcom I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli.

Predkladaný vynález sa taktiež týka spôsobu liečby ochorení vybraných zo skupiny obsahujúcej artritis (vrátane artrózy a reumatoidnej artritídy), nešpecifické črevné zápaly, Crohnovu chorobu, emfyzém, akútny syndróm respiračnej úzkosti, astmu, chronickú obštrukčnú pľúcnu chorobu, Alzheimerovu chorobu, toxicitu spôsobenú orgánovou transplantáciou, kachexiu, alergické reakcie, alergickú kontaktnú hypersenzitivitu, nádorové ochorenia (ako sú napríklad nádorová invázia, nádorové metastázy, solídne nádory zahŕňajúce rakovinu hrubého čreva, nádory prsníka, pľúc a prostaty a hematopoetické malignity zahrňujúce leukémiu a lymfómy), tkanivovú ulceráciu, restenózu, periodontálnu chorobu, epidermolýzis bulosa, osteoporózu, uvoľnenie umelých kĺbnych implantátov, aterosklerózu (zahrňujúcu ruptúru aterosklerotického plátu), aortálne aneuryzmá (zahrňujúce aneurysma abdominálnej aorty a mozgové aneuryzmá), kongestívne zlyhanie srdca, infarkt myokardu, mozgovú mŕtvicu, mozgovou ischémiu, trauma hlavy, poranenia miechy, neurodegeneratívne ochorenia (akútne a chronické), autoimúnne ochorenia, Huntingtonovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, migrénu, depresiu, periférnu neuropatiu, bolesti, mozgovú amyloidovú angiopatiu,'nootropické alebo kognitívne zlepšenie, amyotrofickú laterálnu sklerózu, roztrúsenú sklerózu, okulárnu angiogenézu, korneálne poranenie, makulárnu degeneráciu, abnormálne hojenie rán, popáleniny, diabetes, korneálne zjazvenie, skleritis, AIDS·, sepsu, septický šok a ďalšie ochorenia charakterizované metaloproteinázovou aktivitou a ďalšie ochorenia charakterizované reprolyzínovou aktivitou u cicavcov vrátane človeka obsahujúce množstvo zlúčeniny definovanej vzorcom I alebo jej farmaceutický prijateľnej soli účinné pri liečbe týchto ochorení.

Výraz „liečenie“, ako je tu používaný, sa týka zvrátenia, zmiernenia, inhibície progresie alebo prevencie poruchy alebo ochorení, ku ktorým sa tento termín vzťahuje alebo jedného či viacerých príznakov takejto poruchy či ochorení. Termín „liečba“, ako je tu používaný, sa týka vlastného liečenia, ako je definované v predchádzajúcom odstavci.

Predkladaný vynález sa taktiež týka spôsobu inhibície a) matrix metaloproteináz zohrávajúcich úlohu pri degradácii matrix alebo b) cicavčieho reprolyzínu (ako je napríklad agrekanáza alebo enzýmy ADAM TS-1, 10, 12, 15 a 17, prednostne agrekanáza alebo enzým ADAM-17) u cicavca vrátane človeka obsahujúce účinné množstvo zlúčeniny definovanej vzorcom I alebo jej farmaceutický prijateľné soli.

Predmetný vynález taktiež zahŕňa iztopovo značené zlúčeniny, ktoré sú identické so zlúčeninami citovanými vo vzorci I, ale s tým, že jeden alebo viacero atómov sú nahradené atómom majúcim atómovú hmotnosť alebo hmotové číslo odlišné od atómovej hmotnosti alebo hmotového čísla bežne nachádzaného v prírode. Príklady izotopov, ktoré môžu byť inkorporované do zlúčenín vynálezu zahŕňajú izotopy vodíka, uhlíka, dusíka, kyslíka, fosforu, fluóru a chlóru, ako sú napríklad ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³¹P, ³¹P, ³⁵S, ¹⁸F a ³⁶C1. Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, ich prolieky a, , farmaceutický prijateľné soli spomenutých, zlúčenín alebo spomenutých proliekov, ktoré obsahujú vyššie spomenuté izotopy a/alebo iné izotopy ďalších atómov sú v rozsahu tohto vynálezu. Určité izotopovo značené zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, napríklad tie zlúčeniny, v ktorých sú inkorporované rádioaktívne izotopy, ako napríklad ³H a ¹⁴C, sú užitočné pri analýzach tkanivovej distribúcie liekov a/alebo substrátu. Tritiované, t.z. ³H a uhlík14, t.z. ¹⁴C, izotopy sú predovšetkým preferované pre jednoduchosť ich prípravy a detekovatelnosť. Ďalej náhrada ťažšími izotopmi, ako sú napríklad deutérium, t.z. H môže viesť k určitým terapeutickým výhodám v dôsledku väčšej metabolickej stability, napríklad zvýšeného polčasu in vivo alebo zníženého dávkovania, a taktiež môžu byť za určitých okolností preferované. Izotopovo značené zlúčeniny, ktoré sú definované vzorcom I tohto vynálezu a ich prolieky môžu byť vo všeobecnosti pripravené uskutočnením postupov uvedených v schémach a/alebo v príkladoch vyhotovenia vynálezu a prípravách uvedených nižšie substitúciou ľahko dostupného izotopovo označeného činidla za neizotopovo značené činidlo.

Vynález taktiež zahŕňa farmaceutické preparáty obsahujúce prolieky zlúčenín definovaných vzorcom I. Tento vynález taktiež zahŕňa spôsoby liečby alebo prevencie ochorení, ktoré môžu byť liečené alebo im môže byť zabránené inhibíciou matrix metaloproteináz alebo inhibíciou cicavčieho reprolyzínu, pričom tieto spôsoby zahŕňajú podanie proliekov zlúčenín definovaných vzorcom I. Zlúčeniny definované vzorcom I majúce voľné amino, amido, hydroxy, sulfónamidové alebo karboxylové skupiny, môžu byť premenené na prolieky. Prolieky zahŕňajú zlúčeniny, kde aminokyselinové rezíduum, alebo polypeptidový reťazec dvoch alebo viacerých (napríklad dvoch, troch alebo štyroch) aminokyselinových rezíduí, ktoré sú kovalentne pripojené prostredníctvom peptidovej väzby k voľným amido, amino, hydroxy alebo karboxylovým skupinám zlúčenín definovaných vzorcom I. Aminokyselinové rezíduá zahŕňajú 20 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín bežne označovaných trojpísmenovými symbolmi, a taktiež obsahujúcich 4-hydroxyprolín, hydroxylyzín, demozín, izodemozín, 3-metylhistidín, norvalín, beta-alanín, gamaaminomaslovú kyselinu,- citrulín, homocysteín, homoserín, ornitín a metionín sulfón. Prolieky taktiež zahŕňajú zlúčeniny, kde karbonáty, karbamáty, amidy a alkylové estery sú kovalentne naviazané k vyššie uvedeným substituentom definovaným vzorcom I prostredníctvom karbonylového uhlíkového vedľajšieho reťazca prolieku.

Osoba bežne znalá v odbore ocení, že zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, sú užitočné pri liečbe širokého spektra ochorení. Osoba bežne znalá v odbore taktiež ocení, že pri použití zlúčenín, ktoré sú predmetom vynálezu, pri liečbe špecifických ochorení, môžu byť tieto zlúčeniny kombinované s rôznymi existujúcimi terapeutickými látkami používanými pre toto ochorenie.

Pri liečbe reumatoidnej artritídy môžu byť zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, kombinované s látkami, ako sú napríklad inhibítory TNF-α, ako sú napríklad monoklonálne protilátky anti-TNF (ako napríklad Remicade®) a TNF receptorové imunoglobulínové molekuly (ako je napríklad Enbrel®, nízka dávka metotrexátu, lefumidu, hydroxychlorochínu, d-penicilamínu, auranofínu alebo parenterálneho či perorálneho zlata.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu byť taktiež použité v kombinácii s existujúcimi terapeutickými látkami pri liečbe osteoartritídy. Vhodné látky, ktoré majú byť použité v kombinácii, zahŕňajú štandardné nesteroidné protizápalové látky (odtiaľ NSAIDs), ako sú piroxikam, diklofenak, propiónové kyseliny, ako je napríklad naproxem, flurbiprofen, fenoprofen, ketoprofen, ibuprofén, fenamáty, ako sú napríklad kyselina mefenamová, indometacín, sulindak, apazon, pyrazolóny, ako je napríklad fenylbutazón, salicyláty, ako je napríklad aspirín, inhibítory COX-2, ako je celecoxib, valdecoxib, paracoxib a rofecoxib, analgetiká LTD-4, LTB-4 a 5-LO inhibítory, inhibítory p38 kinázy a intraartikulárne liečebné postupy, ako je napríklad použitie kortikosteroidov a hyaluronových kyselín, ako je napríklad hyalgan a synvisc.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu byť taktiež použité v kombinácii s protinádorovými látkami, ako sú napríklad endostatín a angiostatín alebo cytotoxické látky, ako sú napríklad adriamycín, daunomycín, cis-platina, etoposid, taxol, taxotere a alkaloidy, ako je napríklad vinkristín a antimetabolity, ako je napríklad metotrexát.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu byť taktiež použité v kombinácii s kardiovaskulárnymi látkami, ako sú napríklad blokátory kalciových kanálov, látky znižujúce hladiny lipidov, ako sú napríklad statíny, fibráty, betablokátory, inhibítory ACE, antagonisty receptoru pre angiotenzín 2 a inhibítory agregácie doštičiek.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu byť taktirž použité v kombinácii s látkami pôsobiacimi na CNS, ako sú napríklad antidepresíva (ako napríklad sertalín), antiparkinsoniká (ako napríklad .deprenyl, L-dopa, Requip, Mirapex, inhibítory MAO, ako napríklad selegilín a rasagilín, inhibítory comP, ako napríklad Tasmar, inhibítory A-2, inhibítory spätného vychytávania dopamínu, antagonisty NMDA, agonisty nikotínu, inhibítory NK-1, agonisty dopamínu a inhibítory neuronálnej syntézy oxidu dusnatého) a lieky proti Alzheimerovej chorobe, ako napríklad donezepil, tacrin, inhibítory COX-2, propentofylín alebo metryfonát.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu byť taktiež použité v kombinácii s látkami pôsobiacimi proti osteoporóze, ako sú napríklad roloxifén, droloxifén, lasofoxifén alebo fosamax, a imunosupresívnymi látkami, ako sú napríklad FK-506 a rapamycín.

Detailní opis vynálezu

Nasledujúca reakčná schéma ilustruje prípravu zlúčenín, ktoré sú predmetom vynálezu. Ak nie je indikované inak sú X, Y, Ar¹, Z, R¹, R² a R³ v reakčných schémach a v diskusii, ktorá nasleduje, definované rovnako, ako je uvedené vyššie.

Schéma 1

íl R’ 1 _L.X/X—Ar—Y—Z

Ľ^O

IV

R³

Schéma 2

R³

I

Schéma 3

I

R³ I

Schéma 4

X

Schéma 1 sa týka prípravy zlúčenín, definovaných vzorcom I v dvojkrokovej syntéze zo zlúčenín definovaných vzorcom V. Čo sa týka schémy 1, je zlúčenina definovaná vzorcom I pripravená zo zlúčeniny definovanej vzorcom IV, kde L¹ a L² sú odstupujúce skupiny, ako sú napríklad metoxy, etoxy, benzyloxy alebo chloro, prednostne etoxy, reakciou s derivátom urey definovaným vzorcom III:

R\ /^H

J, v prítomnosti silnej zásady v polárnom rozpúšťadle. Vhodné zásady zahŕňajú metoxid sodný, etoxid sodný a metoxid horečnatý, prednostne etoxid sodný. Vhodné rozpúšťadlá zahŕňajú. alkoholy (ako je napríklad etanol) alebo tetrahydrofurán, prednostne absolútny etanol. Vyššie uvedená reakcia je provedená pri teplote od zhruba 20°C až zhruba 90°C, prednostne od zhruba 50°C až zhruba 65°C po dobu zhruba 15 minút až zhruba 16 hodín.

Zlúčenina definovaná vzorcom IV je pripravená zo zlúčeniny definovanej vzorcom V, kde L³ je odstupujúca skupina, ako je napríklad halo, p-tolylsulfonyloxy (OTs) alebo metylsulfonyloxy (OMs), prednostne halo, najprednostnejšie chloro alebo bromo, reakciou so zlúčeninou definovanou vzorcom HX-Ar'-Y-Z v prítomnosti zásady v polárnom rozpúšťadle. Vhodné rozpúšťadlá zahŕňajú dimetylformamid (DMF), alkoholy (ako je napríklad etanol) alebo tetrahydrofurán, prednostne etanol. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote zhruba 20°C až zhruba 90°, prednostne zhruba 50°C až zhruba 65°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami.

Zlúčeniny definované vzorcom V môžu byť pripravené spôsobmi dobre známymi v odbore, ako sú napríklad spôsoby opísané v PCT patentovej publikácii WO 98/58925 alebo metódy zhrnuté v publikácii The Organic Chemistry of Drug Synthesis, D. Lednicer a LA Mitscher, Zväzok 1, strany 167 až 277 a referencie tu uvedené. Každá z vyššie uvedených publikácií a aplikácií je týmto inkorporovaná v celom svojom rozsahu.

Zlúčeniny definované vzorcom III sú komerčne dostupné alebo môžu byť pripravené spôsobmi dobre známymi osobám znalým v odbore.

Zlúčeniny definované vzorcom HX-Ar’-Y-Z sú komerčne dostupné alebo môžu byť pripravené spôsobmi dobre známymi osobám znalých v odbore.

Schéma 2 sa týka prípravy zlúčenín definovaných vzorcom I v trojkrokovej syntéze zo zlúčenín definovaných vzorcom VI alebo VII. Čo sa týka schémy 2, je zlúčenina definovaná vzorcom I pripravená zo zlúčeniny definovanej vzorcom IX reakciou s vhodnou zásadou a vhodnou alkylačnou látkou definovanou vzorcom R^!L⁴ v prítomnosti rozpúšťadla. Vhodné zásady zahŕňajú hydrid sodný, karbonát draselný, karbonát sodný, trietylamín, pyridín alebo trietanolamín; najprednostnejšie hydrid sodný. Vhodné alkylačné látky zahŕňajú látky, kde L⁴ je halo, p-tolylsulfonyloxy (OTs) alebo metylsulfonyloxy (OMs), prednostne halo, najprednostnejšie chloro alebo bromo; alebo alkylačné látky zahŕňajú taktiež zlúčeniny, ako sú Eshenmoserove soli; epoxidy alebo vhodne substituované elektrofilné azidíny. Vhodné rozpúšťadlá závisia od použitej zásady, ale môžu byť zvolené z Ν,Νdimetylformamidu, tetrahydrofuránu, acetonitrilu a vody. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote od zhruba 0°C do zhruba 30°C, prednostne ód zhruba 20°C do zhruba 25°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami.

Zlúčenina definovaná vzorcom IX môže byť pripravená zo zlúčeniny definovanej vzorcom VIII reakciou s ureou definovanou vzorcom ^R\ z^HN

I.

R' v prítomnosti silnej zásady v polárnom rozpúšťadle. Vhodné zásady zahŕňaj,ú metoxid sodný, etoxid sodný a metoxid horečnatý, prednostne etoxid sodný. Vhodné rozpúšťadlá zahŕňajú alkoholy (ako je napríklad etanol) alebo tetrahydrofurán, prednostne absolútny etanol. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote od zhruba 20°C až zhruba 90°C, prednostne od zhruba 50°C až zhruba 65°C po dobu zhruba 15 minút až zhruba 16 hodín.

Zlúčenina definovaná vzorcom VIII môže byť pripravená zo zlúčeniny definovanej vzorcom VI, kde L³ je odstupujúca skupina, ako je napríklad halo, p-tolylsulfonyloxy (OTs) alebo metylsulfonyloxy (OMs), prednostne halo, najprednostnejšie chloro, reakciou so zlúčeninou definovanou vzorcom HX-Ar^YZ v prítomnosti zásady v polárnom rozpúšťadle. Vhodné rozpúšťadlá zahŕňajú metoxid sodný, etoxid sodný, uhličitan draselný a hydrid sodný, prednostne etoxid sodný. Vhodné rozpúšťadlá zahŕňajú dimetylformamid (DMF), alkoholy (ako je napríklad etanol) alebo tetrahydrofurán, prednostne etanol. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote zhruba 20°C až zhruba 90°, prednostne zhruba 50°C až zhruba 70°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami, prednostne zhruba 3 hodiny. Reakcie tohto typu sú ďalej ilustrované spôsobom JB Niederla a RT Rotha, J Amer Chem Soc 62, 1154 (1940).

Zlúčenina definovaná vzorcom VIII môže byť pripravená zo zlúčeniny definovanej vzorcom VII v prítomnosti vhodného katalyzátora, prednostne ródium (II) acetátu podľa- postupu opísaného M Campbellem et al., Aust J Chem. 45, 2061 (1992).

Zlúčeniny definované vzorcom VI a VII sú komerčne dostupné alebo je ich možné ľahko získať z dostupných výčhodzích materiálov podľa spôsobu dobre známeho osobám znalým v odbore. Zlúčeniny definované vzorcom VII môžu byť napríklad pripravené podľa spôsobu DW Peace et al., Synthesis, 658 (1971).

Schéma 3 sa týka prípravy zlúčenín definovaných vzorcom I, predovšetkým zlúčenín, kde X je kyslík alebo OCH₂~. Čo sa týka schémy 3, môže byť zlúčenina definovaná vzorcom I získaná alkyláciou zlúčeniny definovanej vzorcom XI vhodným fenolom definovaným vzorcom HOAr’-Y-Z podľa spôsobu O. Mitsonubuho (Synthesis 1 (1981)) alebo alkyláciou vhodnou alkylačnou látkou definovanou vzorcom L³CH₂Ar¹-YZ, kde L³ je odstupujúca skupina, ako napríklad halo, p36 tolylsulfonyloxy (OTs) alebo metylsulfonyloxy (OMs), prednostne halo, najprednostnejšie chloro alebo bromo, vo vhodnom rozpúšťadle, ako sú napríklad Ν,Ν-dimetylformamid, tetrahydrofurán, acetonitril v prítomnosti vhodnej zásady, ako sú napríklad hydrid sodný, uhličitan draselný, trietylamín, pyridín alebo trietanolamín. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote zhruba 0°C až zhruba 50°, prednostne zhruba 20°C až zhruba 65°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami.

Zlúčeniny definované vzorcom XI môžu byť pripravené zo zlúčenín definovaných vzorcom X podľa spôsobu JA Vida et al., J Med Chem, 17, 732 (1974).

Zlúčeniny definované vzorcom X môžu byť pripravené zo zlúčeniny definovanej vzorcom XII reakciou s vhodnou zásadou, v prítomnosti vhodnej alkylačnej látky R^⁴ a rozpúšťadla, ako je to opísané v Biehl et al., J Het Chem 23, 9 (1986). Vhodné zásady zahŕňajú hydrid sodný, uhličitan draselný, trietylamín, pyridín, trietanolamín; najprednostnejšie trietanolamín. Vhodné alkylačné látky zahŕňajú látky, kde L⁴ je halo, ptolylsulfonyloxy (OTs) alebo metylsulfonyloxy (OMs), 'prednostne halo, najprednostnejšie chlór ô alebo bromo; alebo alkylačné látky zahŕňajú taktiež zlúčeniny, ako sú Eshenmoserove soli; epoxidy alebo vhodne substituované elektrofilné azidíny. Vhodné rozpúšťadlá závisia od použitej zásady, ale môžu byť zvolené z N,N-dimetylformamidu, tetrahydrofuránu, acetonitrilu a vody. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote od zhruba 0°C do zhruba 30°C, prednostne od zhruba 20°C do zhruba 25°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami.

Zlúčeniny definované vzorcom XII sú komerčne dostupné alebo môžu byť pripravené spôsobmi zhrnutými v publikácii The Organic Chemistry of Drug Synthesis, D Lednicer a LA Mitschner, Zväzok 1, strany 167 až 277 a v odkazoch tu citovaných.

Schéma 4 sa týka prípravy zlúčenín definovaných vzorcom I, kde X je síra alebo -CH₂- alebo ich oxidované deriváty >SO₂₎ >SO, -SO₂CH₂-, -SOCH₂-. Čo sa týka schémy 4, môže byť taká zlúčenina definovaná vzorcom I získaná alkyláciou pyrimidín-2,4,6-triónového kruhu zlúčeniny definovanej vzorcom XIV, (kde R a R sú vodík) s vhodnou o Q o alkylačnou látkou L R , kde L je odstupujúca skupina, ako sú napríklad halo, p-tolylsulfonyloxy (OTs) alebo metylsulfonyloxy (OMs), prednostne halo, najprednostnejšie chloro alebo bromo vo vhodnom rozpúšťadle, ako sú napríklad dimetylformamid (DMF), tetrahydrofurán, acetonitril v prítomnosti vhodnej zásady, ako sú napríklad hydrid sodný, uhličitan draselný, trietylamín, pyridín alebo trietanolamín. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote zhruba 20°C až zhruba 70°, prednostne zhruba 20°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami.

Zlúčeniny definované vzorcom XIV môžu byť pripravené alkyláciou zlúčeniny definovanej vzorcom X s vhodným disulfidom definovaným vzorcom (SAr¹-Y-Z)2 alebo (SCH2Ar¹Y-Z)2 vo vhodnom rozpúšťadle, ako sú napríklad N,Ndimetylformamid, tetrahydrofurán, acetonitril v prítomnosti vhodnej zásady, ako sú napríklad hydrid sodný, uhličitan draselný, trietylamín, pyridín .. alebo trietanolamín. Vyššie uvedená reakcia je uskutočnená pri teplote zhruba 20°C až zhruba 70°, prednostne zhruba 20°C po dobu medzi zhruba 15 minútami až zhruba 16 hodinami.

Disulfidy (SAr¹-Y-Z)₂ alebo (SCH₂Ar’-Y-Z)₂ môžu byť pripravené zo zodpovedajúcich tiolov HSAr’-Y-Z alebo HSCH₂Ar¹-Y-Z oxidatívnymi spôsobmi dobre známymi osobám znalým v odbore.

Zlúčeniny definované vzorcom X sú komerčne dostupné alebo môžu byť pripravené spôsobmi dobre známymi osobám znalým v odbore.

Zlúčeniny definované vzorcom I, ktoré sú svojim charakterom zásadité, sú schopné tvoriť celý rad rôznych solí s rôznymi anorganickými a organickými kyselinami. Aj keď také soli musí byť farmaceutický prijateľné pre podanie zvieratám, je často žiadúce v praxi iniciálne izolovať zlúčeninu definovanú vzorcom I z reakčnej zmesi ako farmaceutický neprijateľnú soľ, a potom ju jednoducho konvertovať späť na voľnú bázu tejto zlúčeniny reakciou s alkalickým činidlom a následne konvertovať voľnú bázu na farmaceutický prijateľnú kyslú adičnú soľ. Kyslé adičné soli východzích zlúčenín tohto vynálezu sú ľahko pripravené reakciou východzej zlúčeniny s významne ekvivalentným množstvom zvolenej minerálnej alebo organickej kyseliny vo vodnom solventnom médiu alebo vo vhodnom organickom rozpúšťadle, ako sú napríklad metanol alebo etanol. Po dôkladnom odparení rozpúšťadla je získaná požadovaná pevná soľ.

Kyseliny, ktoré sú používané na prípravu farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí východzích zlúčenín tohto vynálezu, sú tie kyseliny, ktoré tvoria netoxické adičné soli, t.z. soli obsahujúce farmakologicky prijateľné anióny, ako sú napríklad hydrochloridová, hydrobromidové, hydrojodidové, nitrátové, sulfátové alebo bisulfátové, fosfátové alebo kyslé fosfátové, acetátové, laktátové, citrátové alebo kyslé citrátové, tartarátové alebo bitartarátové, sukcinátové, maleátové, fumarátové, glukonátové, sacharátové, benzoátové, metánsulfonátové a pamoátové [t.z. 1,1 '-metylén-bis-(2hydroxy-3-naftoátové)] soli.

Tie zlúčeniny definované vzorcom I, ktoré sú svojim charakterom kyslé, sú schopné tvoriť bázické soli s rôznymi farmakologicky prijateľnými katiónmi. Príklady takých solí zahŕňajú soli alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín a predovšetkým, sodné a draselné soli. Tieto soli sú pripravené konvenčnými technikami. Chemické zásady, ktoré sú použité ako činidlá na prípravu farmaceutický prijateľných zásaditých solí, ktoré sú predmetom vynálezu, sú tie zásady, ktoré tvoria netoxické zásadité soli s tu opísanými kyslými zlúčeninami definovanými vzorcom I. Tieto netoxické zásadité soli zahŕňajú tie soli, ktoré sú odvodené od farmakologicky prijateľných katiónov, ako sú soli sodné, draselné, kalciové a horečnaté atď. Tieto soli môžu byť ľahko pripravené reakciou zodpovedajúcich kyslých zlúčenín, a potom odparením výsledného roztoku do sucha, prednostne pri zníženom tlaku.

Alternatívne môžu byť taktiež pripravené zmiešaním nižších alkanólických roztokov kyslých zlúčenín a požadovaného alkoxidu alkalického kovu, a potom odparením výsledného roztoku do sucha rovnakým spôsobom ako predtým. V každom prípade sú prednostne použité stoichiometrické množstvá činidiel, aby sa zabezpečilo ukončenie reakcie maximálnymi výťažkami produktu.

(

Biologické stanovenia

V nasledujúcich in vitro testoch je preukázaná schopnosť zlúčenín definovaných vzorcom I alebo ich farmaceutický prijateľných solí (odtiaľ taktiež nazývaných ako zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu) inhibovať metaloproteinázy alebo cicavčí reprolyzín a následne je demonštrovaná ich účinnosť pri liečbe ochorení charakterizovaných aktivitou metaloproteinázy alebo cicavčieho reprolyzínu (ako je napríklad tvorba tumor nekrotizujúceho faktora).

Stanovenie MMP

Selektívne inhibítory kolagenázy 3 (matrix \

metaloproteináza 13), ako sú tu použité, sa týkajú látok, ktoré vykazujú aspoň lOOnásobnú selektivitu, čo sa týka inhibície aktivity enzýmu kolagenázy 3 voči enzýmu kolagenázy 1 s účinnosťou menej ako 100 nM, ako je definované podľa výsledkov IC₅₀ z MMP-13/MMP-1 fluorescenčných stanovení opísaných nižšie. Selektívne inhibítory kolagenázy 3 môžu byť identifikované vyšetrením inhibítorov, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu v MMP-13/MMP-1 fluorescenčných stanoveniach opísaných nižšie a výberom tých látok s pomermi IC₅o inhibície MMP-13/MMP-1 100 alebo vyššími a účinnosťou nižšou ako je 100 nM.

Neselektívne inhibítory kolagenázy, ako sú tu použité, sa týkajú látok, ktoré vykazujú nižšiu ako lOOnásobnú selektivitu, čo sa týka inhibície aktivity enzýmu kolagenázy 3 voči enzýmu kolagenázy 1 s účinnosťou viac ako 100 nM, ako je definované podľa výsledkov IC₅₀ z MMP-13/MMP-1 fluorescenčných stanovení opísaných nižšie.

Schopnosť inhibítorov kolagenázy inhibovať aktivitu kolagenázy je dobre známa v odbore. Na identifikáciu matrix metaloproteinázových inhibítorov môžu byť použité nasledujúce testy.

Inhibície ľudskej kolagenázv ÍMMP-1)

Ľudská rekombinantná kolagenáza je aktivovaná trypsínom. Množstvo trypsínu je optimalizované pre každú šaržu kolagenázy 1, ale typická reakcia používa nasledujúci pomer: 5 ug trypsínu na 100 ug kolagenázy. Trypsín a kolagenáza sú inkubované pri izbovej teplote po dobu 10 minút a potom je pridaný päťnásobný nadbytok (50 mg/10 mg trypsínu) inhibítora trypsínu zo sójových bôbov.

Zásobné roztoky (10 mM) inhibítorov sú pripravené v dimetylsulfoxide a potom sú nariedené s použitím nasledujúcej schémy:

mM - 120 uM - 12 uM - 1,2 uM - 0,12 uM

Do príslušných jamiek 96jamkové mikrofluorescenčnej doštičky je v triplete pridaných 25 mikrolitrov každej z koncentrácií. Finálna koncentrácia inhibítora bude riedenie 1:4 po pridaní enzýmu a substrátu. Pozitívne kontroly (enzým, bez inhibítora) sú umiestnené v jamkách D7-D12 a negatívne kontroly (žiadny enzým, žiadny inhibítor) sú umiestnené v jamkách D1-D6.

Kolagenáza 1 je nariedená do 240 ng/ml a potom je pridaných 25 ul do príslušných jamiek mikrofluorescenčnej doštičky. Finálna koncentrácia kolagenázy v stanovení je 60 ng/ml.

Substrát (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys (NMA)-NH₂) je pripravený ako 5 mM zásobný roztok v dimetylsulfoxide a potom je nariedený 20 uM v testovacom pufri. Test je začatý pridaním 50 ul substrátu na jamku mikrofluorescenčnej doštičky za vzniku finálnej koncentrácie 10 uM.

Fluorescencia (360 nM excitácia, 460 nm emisia) je odčítaná v čase 0 a potom po 20 minútových intervaloch. Stanovenie je uskutočnené pri izbovej teplote a prebieha typicky 3 hodiny.

Potom je zostavený graf fluorescencia verzus čas pre blank aj pre kolagenázu obsahujúce vzorky (údaje z tripletov sú priemerované). Časový bod, ktorý poskytuje dobrý signál (aspoň päťnásobok oproti blanku), a ktorý je na lineárnej časti krivky (obvykle okolo 120 minút) je zvolený, aby sa určili hodnoty IC₅₀. Čas nula je použitý ako blank pre každú zlúčeninu v každej koncentrácii a tieto hodnoty sú odčítané od údajov v 120: minúte. Údaje sú zostavené do grafu ako inhibítor koncentrácie verzus % kontrol (inhibítor fluorescencie vydelený samotnou fluorescenciou kolagenázy x 100). Hodnoty IC₅₀ sú určené z koncentrácie inhibítora, ktorý dáva signál, ktorý je 50% kontroly.

Pokiaľ sú hodnoty IC₅₀ zaznamenané ako nižšie než 0,03 uM, sú potom inhibítory testované pri koncentráciách 0,3 uM, 0,03 uM a 0,003 uM.

Inhibícia gelatinázy (MMP-2)

Ľudská rekombinantná 72 kD gelatináza (MMP-2, gelatináza A) je aktivovaná po dobu 16-18 hodín s lmM p43 aminofeny lortuťnatým acetátom (z čerstvo pripraveného 100 mM zásobného roztoku v 0,2N NaOH) pri teplote 4 °C a miernom premiešavaní.

mM zásobné roztoky inhibítorov v dimetylsulfoxidu sú sériovo nariedené v testovacom pufre (50 mM TRIS, pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 20 uM ZnC12 a 0,02% BRIJ-35 (vol/vol) s použitím nasledujúcej schémy:

mM - 120 uM - 12 uM - 1,2 uM - 0,12 uM.

Ďalšie nariedenia sú pripravené podľa nevyhnutnosti pri dodržaní rovnakej schémy. V každom teste sú uskutočnené stanovenia pre minimálne 4 koncentrácie inhibítora pre každú zlúčeninu. Potom je do jamiek 96-jamkovej mikrofluorescenčnej doštičky s dnom v tvare písmena U pridaných v triplete 25 ul inhibítora s každou koncentráciou. Vo finálnom teste je objem 100 ul, finálne koncentrácie inhibítora sú výsledkom ďalšieho riedenia 1:4 (t.z. 30 uM - 3 uM - 0,3 uM - 0,03 uM, atď.). V triplete sú taktiež pripravené blank (žiadny enzým, žiadny inhibítor) a pozitívna enzýmová kontrola (s enzýmom, žiadny inhibítor).

Aktivovaný enzým je nariedený na 100 ng/ml v testovacom pufri, do príslušných jamiek mikrodostičiek je pridaných 25 ul na jamku. Finálna koncentrácia v teste je 25 ng/ml (0,34 nM).

mM dimetylsulfoxidového zásobného roztoku substrátu (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) je nariedených 20 uM v testovacom pufri na 20 uM. Test je začatý pridaním 50 ul nariedeného substrátu za vzniku finálnej koncentrácie substrátu 10 uM. V čase 0 je odčítaná okamžite fluorescencia (320 excitácia, 390 emisia) a následné odčítania sú uskutočňované každých 15 minút pri izbovej teplote pomocou zariadenia PerSpective Biosystems Cytofluor Multi-Well Plate Reader s prírastkom pri 90 jednotkách.

Je zostrojený graf hodnoty fluorescencie enzýmu a blanku verzus čas. Pre stanovenie hodnôt IC₅₀ je zvolený včasný časový bod na lineárnej časti tejto krivky. Nulový časový bod je pre každú zlúčeninu odčítaný od neskoršieho časového bodu a údaje sú potom vyjadrené ako percento enzýmovej kontroly (inhibítor fluorescencie vydelený fluorescenciou pozitívnej enzýmovej kontroly x 100). Údaje sú vyjadrené v grafe ako koncentrácia inhibítora verzus percento enzýmovej kontroly. Hodnoty IC50 sú definované ako koncentrácia inhibítora, ktorá dáva signál, ktorý je 50% pozitívnej enzýmovej kontroly.

Inhibícia aktivity stromelvzínu ÍMMP-3

Ľudský rekombinantný stromelyzín (MMP-3, stromelyzín

1) je aktivovaný po dobu 20-22 hodín s 2 mM paminofenylortuťnatým acetátom (z čerstvo pripraveného 100 mM zásobného roztoku v 0,2N NaOH) pri teplote 37 °C.

mM zásobné roztoky inhibítorov v dimetylsulfoxide sú sériovo nariedené v testovacom pufri (50 mM TRIS, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ a 0,02% BRIJ-35 (vol/vol) s použitím nasledujúcej schémy:

mM - 120 uM - 12 uM - 1,2 uM - 0,12 uM.

v

Ďalšie nariedenia sú pripravené podľa nevyhnutnosti pri dodržaní rovnakej schémy. V každom teste sú uskutočnené stanovenia pre minimálne 4 koncentrácie inhibítora pre každú

5’ zlúčeninu. Potom je do jamiek 96-jamkovej mikrofluorescenčnej doštičky s dnom v tvare písmena U pridaných v triplete 25 ul inhibítora s každou koncentráciou. Vo finálnom teste je objem 100 ul, finálna koncentrácia inhibítora sú výsledkom ďalšieho riedenia 1:4 (t.z. 30 uM - 3 uM - 0,3 uM - 0,03 uM, atď.). V triplete sú taktiež pripravené blank (žiadny enzým, žiadny inhibítor) a pozitívna enzýmová kontrola (s enzýmom, žiadny inhibítor).

Aktivovaný enzým je nariedený na 200 ng/ml v testovacom pufri, do príslušných jamiek mikrodoštičiek je pridaných 25 ul na jamku. Finálna koncentrácia v teste je 50 ng/ml (0,875 nM).

mM dimetylsulfoxidového zásobného roztoku substrátu (Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys-(Dnp)-NH₂) je nariedených v testovacom pufri na 6 uM. Test je začatý pridaním 50 ul nariedeného substrátu za vzniku finálnej koncentrácie substrátu 3 uM. V čase 0 je odčítaná okamžite fluorescencia (320 excitácia, 390 emisia) a následné odčítania sú uskutočňované každých 15 minút pri izbovej teplote pomocou zariadenia PerSpective Biosystems Cytofluor Multi-Well Plate Reader s prírastkom pri 90 jednotkách.

Je zostrojený graf hodnoty fluorescencie enzýmu a blanku verzus čas. Pre stanovenie hodnôt IC₅₀ je zvolený včasný časový bod na lineárnej časti tejto krivky. Nulový časový bod je pre každú zlúčeninu odčítaný od neskoršieho časového bodu a údaje sú potom vyjadrené ako percento enzýmovej kontroly (inhibítor fluorescencie .vydelený fluorescenciou pozitívnej enzýmovej kontroly x 100). Údaje sú vyjadrené v grafe ako koncentrácia inhibítora verzus percento enzýmovej kontroly. Hodnoty IC₅₀ sú definované ako koncentrácia inhibítora, ktorá dáva signál, ktorý je 50% pozitívnej enzýmovej kontroly.

Inhibícia ľudskej 93 kD gelatinázv (MMP-9)

Inhibícia 92 kD gelatinázovej (MMP-9) aktivity je testovaná s použitím substrátu Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-AlaArg-NH₂ (10 uM) v podobných podmienkach, ako je opísané vyššie pre inhibíciu ľudskej kolagenázy (MMP-1).

Ľudská rekombinantná 92 kD gelatinázovej (MMP-9) je aktivovaná po dobu 2 hodín s 1 mM p-aminofenylortuťnatým acetátom (z čerstvo pripraveného 100 mM zásobného roztoku v 0,2N NaOH) pri teplote 37 °C.

mM zásobné roztoky inhibítorov v dimetylsulfoxide sú sériovo nariedené v testovacom pufri (50 mM TRIS, pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 20 uM ZnCl₂ a 0,02% BRIJ-35 (vol/vol) s použitím nasledujúcej schémy:

mM - 120 uM - 12 uM - 1,2 uM - 0,12 uM.

Aktivovaný enzým je nariedený na 100 ng/ml v testovacom pufri, do príslušných jamiek mikrodoštičiek je pridaných 25 ul na jamku. Finálna koncentrácia v teste je 25 ng/ml (0,27 nM).

mM dimetylsulfoxidového zásobného roztoku substrátu (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) je nariedených v testovacom pufri na 20 uM. Test je začatý pridaním 50 ul nariedeného substrátu za vzniku finálnej koncentrácie substrátu 10 uM. V čase 0 je odčítaná okamžite fluorescencia (320 excitácia, 390 emisia) a následné odčítania sú uskutočňované každých 15 minút pri izbovej teplote pomocou zariadenia PerSpective Biosystems Cytofluor Multi-Well Plate Reader s prírastkom pri 90 jednotkách.

Je zostrojený graf hodnoty fluorescencie enzýmu a blanku verzus čas. Pre stanovenie hodnôt IC₅o je zvolený včasný časový bod na lineárnej časti tejto krivky. Nulový časový bod je pre každú zlúčeninu odčítaný od neskoršieho časového bodu a údaje sú potom vyjadrené ako percento enzýmovej kontroly (inhibítor fluorescencie vydelený fluorescenciou pozitívnej enzýmovej r _Λ kontroly x 100). Údaje sú vyjadrené v grafe ako koncentrácia inhibítora verzus percento enzýmovej kontroly. Hodnoty IC50 sú definované ako koncentrácia inhibítora, ktorá dáva signál, ktorý je 50% pozitívnej enzýmovej kontroly.

Inhibícia MMP-13

Ľudská rekombinantná MMP-13 je aktivovaná po dobu

1,5 hodiny s 2 mM ΑΡΜΑ (p-aminofenylortuťnatý acetát) pri teplote 37 °C a nariedená v testovacom pufri (50 mM TRIS, pH

7,5, 200 mM NaCI, 5 mM CaCl₂, 20 uM ZnCl₂ a 0,02% brij). Do každej jamky 96-jamkové mikrofluorescenčnej doštičky je pridaných 25 ul nariedeného enzýmu. Enzým je potom pre stanovenie nariedený 1:4 pridaním inhibítoru a substrátu pri vzniku finálnej koncentrácie 100 mg/ml.

mM zásobné roztoky inhibítorov sú pripravené v dimetylsulfoxide a potom nariedené v testovacom pufri pomocou riediacej schémy ako pre inhibíciu ľudskej kolagenázy (MMP-1). Do mikrofluorescenčnej doštičky je v triplete pridaných 25 mikrolitrov každej koncentrácie. Finálne koncentrácie v teste sú 30 uM, 3 uM, 0,3 uM a 0,03 uM. Pre inhibíciu ľudskej kolagenázy (MMP-1) je pripravený substrát (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH₂) a 50 ul je pridaných do každej jamky za vzniku finálnej koncentrácie 10 uM. V čase 0 je odčítaná fluorescencia (360 excitácia, 450 emisia) a následné odčítania sú uskutočňované každých 5 minút po dobu 1 hodiny.

Pozitívne kontroly obsahujú enzým a substrát bez inhibítoru, a blanky obsahujú iba substrát.

Hodnoty IC₅o sú určené ako inhibície ľudskej kolagenázy (MMP-1). Pokiaľ sú hodnoty IC₅o zaznamenané ako nižšie než 0,03 uM, sú potom inhibítory testované vo finálnej koncentrácii 0,3 uM, 0,03 uM, 0,003 uM a 0,0003 uM.

Testovanie kolagénneho filmu MMP-13

Krysí kolagén typu I je označený radionuklidom ¹⁴C anhydridom kyseliny octovej (TE Cawston a AJ Barret, Anál Biochem 99, 340-345 (1979)) a použitý na prípravu

96jamkových doštičiek obsahujúcich rádionuklidom označené kolagénové filmy (Barbara Jophnson-Wint, Anál. Biochem. 104, 175-181 (1980)). Pokiaľ je pridaný do jamky roztok obsahujúci kolagenázu, štiepi enzým nerozpustný kolagén, ktorý sa rozvíja a je teda solubilizovaný. Aktivita kolagenázy je priamo proporcionálne množstvo solubilizovaného kolagénu, určené pomerom rádioaktivity uvoľnenej do supernatantu, ako môže byť merané štandardným scintilačným počítačom. Inhibítory kolagenázy sú preto zlúčeniny, ktoré redukujú uvoľnené rádioaktívne počty s ohľadom na kontroly bez prítomného inhibítora. Jedna špecifická forma tohto testu je opísaná detailnejšie nižšie.

Na určenie selektivity zlúčenín pre MMP-13 verzus MMP-1 s použitím kolagénu ako substrátu je použitý nasledujúci postup. Rekombinantná ľudská proMMP-1 je aktivovaná podľa postupov opísaných vyššie. Aktivované MMP-13 alebo MMP-1 sú nariedené do 0,6 ug/ml pomocou pufra (50 mM TRIS, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 1 uM ZnCl₂, 0,05% BRIJ-35, 0,02% azid sodný).

Sú pripravené zásobné roztoky testovanej zlúčeniny (10 nM) v dimetylsulfoxide. Riedenia testovaných zlúčenín v Tris pufri (vyššie) sú pripravené na 0,2,’ 2,0, 20, 200, 2000 a 20000 nM.

100 ul príslušného riedenia lieku a 100 ul nariedeného enzýmu sú napipetované do jamiek 96jamkovej doštičky obsahujúcej kolagénové filmy označené ^I4C-kolagénom. Finálna koncentrácia enzýmu je 0,3 ug/ml, zatiaľ čo finálna koncentrácia lieku je 0,1, 1,0, 10, 100, 1000 nM. Každá koncentrácia lieku a kontroly je analyzovaná v triplete. Tripletové kontroly taktiež prebiehajú v podmienkach, v ktorých nie je prítomný žiadny enzým, a s enzýmom pri absencii zlúčeniny.

Doštičky sú inkubované pri teplote 37 °C počas takej doby, pri ktorej dôjde k solubilizácii 30-50% dostupného kolagénu, ako je určené spočítaním ďalších kontrolných jamiek v rôznych časových bodoch. Vo väčšine prípadov je vyžadovaných okolo 9 hodín inkubácie. Pri pokročení testu je odobratý supernatant z každej z jamiek a je spočítaný scintilačným počítačom. Pozadie je odčítané (určené odpočtom v jamkách bez enzýmu) od každej vzorky a percento uvoľnenia je odčítané vo vzťahu k jamkám iba s enzýmom a bez inhibítora. Hodnoty tripletu pre každý bod sú spriemerované a údaje sú uvedené do grafu ako percento uvoľnenia verzus lieková koncentrácia. Hodnoty IC₅₀ sú určené z bodu, v ktorom je získaných 50% inhibície uvoľnenia rádioaktívneho kolagénu. Aby sa určila identita aktívnych kolagenáz v médiu určenom pre chrupavku, boli uskutočnené testy s použitím kolagénu ako substrátu, média určeného pre chrupavku a inhibítorov rôzneho výberu. Médium určené pre chrupavku bolo stiahnuté v dobe, kedy sa objavila degradácia kolagénu a predstavuje teda kolagenázy zodpovedné za štiepenie kolagénu. Testy boli uskutočnené s tou výnimkou, že namiesto použitia rekombinantného enzýmu MMP-13 alebo rekombinantného enzýmu MMP-1 bolo enzýmovým zdrojom médium určené pre chrupavku.

Degradácia chrupavkového kolagénu z bovinnei nosnej chrupavky indukovaná IL-1

Tento test používa bovinné nosné chrupavkové explantáty, ktoré sú bežne používané na testovanie účinnosti rôznych zlúčenín ·.··. inhibovať degradáciu proteoglykánu indukovanú IL-1 alebo degradáciu kolagénu indukovanú IL-1. Bovinná nosná chrupavka je tkanivo, ktoré je veľmi podobné r

kĺbovej chrupavke, t.z. chondrocyty sú obklopené matrix, ktoré je primárne z kolagénu typu II a z agrekánu. Tkanivo je používané, pretože

1) je veľmi podobné kĺbovej chrupavke,

2) je ľahko dostupné,

3) je relatívne homogénne a

4) degraduje s predikovateľnou kinetikou po stimulácii

IL-1.

Na testovanie zlúčenín boli použité dva varianty tohto testu. Oba varianty dávajú podobné výsledky. Tieto dva varianty sú opísané nižšie.

Variant 1

Tri čiastky bovinnej nosnej chrupavky (približne 2 mm v priemere x 1,5 mm dlhé) sú umiestnené do každej jamky 24jamkovej doštičky na tkanivovej kultúre. Jeden ml média bez séra je potom pridaný do každej jamky. Zlúčeniny sú pripravené ako 10 mM zásobné roztoky v DMSO a potom sú nariedené približne v médiu bez séra do finálnej koncentrácie napríklad 50, 500 a 5000 nM. Každá koncentrácia je testovaná v triplete.

Ľudský rekombinantný IL-la (5 ng/ml) (IL-1) je pridaný do tripletových kontrolných jamiek a do každej jamky obsahujúcej liek. Sú pripravené také tripletové kontrolné jamky, v ktorých nie sú ani liek, ani IL-1. Je odstránené médium a je pridané čerstvé médium a čerstvé médium obsahujúce IL-1 a príslušné liekové koncentrácie v dňoch 6, 12, 18 alebo každé 34 dni, pokiaľ je to nutné. V každom časovom bode sú odstránené médiá uložené pri teplote -20 °C pre neskoršiu analýzu. Ak je chrupavka v jamkách s iba IL-1 takmer kompletne resorbovaná (okolo 21. dňa), je experiment ukončený. Médium je odstránené a uložené. Alikvóty (100 ul) z každej jamky v každom časovom bode sú zobraté spoločne, natrávené papaínom a potom analyzované na obsah hydroxyprolínu. Pozadie hydroxyprolínu (priemer jamiek bez 11-1 a bez lieku) je odčítané od každého údajového bodu a pre každý triplet je vypočítaný priemer. Údaje sú potom exprimované ako percento priemernej hodnoty samotného IL-1 a vynesené do grafu. Hodnota IC₅₀ je potom určená z tohto grafu.

Variant 2

Experimentálny postup je rovnaký, ako je uvedené v Variante A až do 12. dňa. Dvanásty deň je upravené médium z každej jamky odstránené a zamrazené. Do každej jamky je pridaný jeden ml fosfátového pufra (PBS) obsahujúceho 0,5 ug/ml trypsínu a v inkubácii je pokračované po ďalších 48 hodín pri teplote 37 °C. Po 48 hodinách inkubácie v trypsíne je roztok BS odstránený. Alikvóty (50 ul) roztoku PBS/trypsín a predchádzajúce dva časové body (dni 6 a 12) sú zobraté spoločne, hydrolyzované a je určený obsah hydroxyprolínu. Pozadie hydroxyprolínu (priemer jamiek bez 11-1 a bez lieku) je odčítané od každého údajového bodu a pre každý triplet je z

vypočítaný priemer. Údaje sú potom exprimované ako percento priemernej hodnoty samotného IL-1 a vynesené do grafu. Hodnota IC₅o je potom určená z tohto grafu. V tomto variante je časový priebeh experimentu výrazne skrátený. Pridanie trypsínu na <48 hodín po 12 dňoch stimulácie IL-1 pravdepodobne uvoľňuje akýkoľvek kolagén typu II, ktorý bol poškodený aktivitou kolagenázy, ale nebol uvoľnený z chrupavkovej matrix. V neprítomnosti IL-1 stimulácie, produkuje reakcia s trypsínom iba slabé pozadie degradácie kolagénu v cbrupavkových explantátoch.

Inhibícia tvorby TNF

Schopnosť zlúčenín alebo ich farmaceutický prijateľných solí inhibovať tvorbu TNF a následne demonštrovať ich účinnosť pri liečbe ochorení, v ktorých hrajú úlohu TNF, je uvedené v nasledujúcom in vitro teste.

Test na ľudských monocytoch

Ľudské mononukleárne bunky boli izolované z antikoagulovanej ľudskej krvi s použitím jednokrokovej reparačnej techniky Ficoll-hypaque. Mononukleárne bunky boli premyté trikrát v Hanksovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS) s divalentnými katiónmi a resuspendované do denzity 2 x 10⁶/ml HBSS obsahujúceho 1% BSA. Diferenciálne odpočty určené s použitím Abbott Celí Dyn 3500 analyzátora ukázali, že monocyty boli v rozmedzí 17-24% zo všetkých buniek v týchto preparátoch.

180 ul bunečnej suspenzie bolo rozdelených na alikvóty do 96jamkových doštičiek s plochým dnom (Costar). Pridaním zlúčenín a LPS (100 ng/ml finálna koncentrácia) vznikol finálny objem 200 ul. Všetky testy boli uskutočnené v triplete. Po 4 hodinách inkubácie pri teplote 37 °C v humidifikovanom CO₂inkubátore boli doštičky odstránené a centrifúgované (10 minút pri približne 250 x g) a supernatanty boli odstránené a analyzované na TNFa s použitím R+D ELISA kitu.

Stanovenie agrekanázy

Primárne prasačie chondrocyty z kĺbovej chrupavky sú izolované sekvenčným natrávením trypsínom a kolagenázou cez noc a sú umiestnené v množstve 2x10⁵ buniek na jamku do 48jamkových doštičiek s 5 uCi/ml ³⁵S (1000 Ci/mmol) síry v doštičkách potiahnutých kolagénom typu I. Bunkám je umožnené inkorporovať značku do svojej proteoglykánovej matrix (približne 1 týždeň) pri teplote 37 °C pod atmosférou 5% CO₂.

Noc pred začatím testu sú monovrstvy chondrocytov premyté dvakrát v DMEM/1% PSF/G a potom sú inkubované v čerstvom DMEM/1% FBS cez noc.

Nasledujúce ráno sú chondrocyty premyté jedenkrát v DMEM/1% PSF/G. Po finálnom premytí je zmes usadená v inkubátore, zatiaľčo sa uskutočňujú riedenia.

Médiá a riedenia môžu byť pripravené, ako je opísané v Tabuľke nižšie.

Kontrolné médiá	Samotné DMEM (kontrolné médiá)
IL-1 médiá	DMEM + IL-1 (5 ng/ml)
Riedenia lieku	Pripravte zásobné roztoky všetkých zlúčenín v DMSO s koncentráciou 10 mM Pripravte 100 uM zásobné roztoky všetkých zlúčenín v DMEM v 96jamkovej doštičke. Skladujte cez noc v mrazničke Ďalší deň uskutočnite sériové riedenia v DMEM s IL- 1 do 5 uM, 500 nM a 50 nM Ašpirujte finálne premytia z jamiek a pridajte 50 ul zlúčeniny z vyššie uvedených riedení do 450 ul média s IL-1 v príslušných jamkách 48jamkových doštičiek. Finálne koncentrácie zlúčeniny sa rovnajú 500 nM, 50 nM a 5 nM. Všetky vzorky sú skompletizované na každej doštičke v triplete s kontrolnými vzorky a so vzorkami s iba IL-1

Doštičky sú označené a iba vnútro 24 jamiek doštičky je použité. Na jednej z doštičiek je niekoľko stĺpcov označených ako IL-1 (žiadny liek) a kontrola (žiadny IL-1, žiadny liek). Tieto kontrolné stĺpce sú periodicky odčítané, aby sa monitorovalo uvoľňovanie 35S proteoglykánu. Do jamiek sú pridané kontrolné a IL-1 média (450 ul) nasledované zlúčeninou (50 ul) tak, aby sa začal test. Doštičky sú inkubované pri teplote 37 °C s 5% CO₂ atmosférou.

Pri 40-50% uvoľnení (ak je CPM z IL-1 média 4-5 krát vyššie ako v kontrolnom médiu), ako je určené kvapalným scintilačným odčítaním (LSC) vzoriek média, je test ukončený (9-12 hodín). Médium je odstránené zo všetkých jamiek a je umiestnené do scintilačných skúmaviek. Je pridaná scintilačná látka a sú získané rádioaktívne odčítania (LSC). K solubilizácii bunečných vrstiev je pridaných do každé jamky 500 ul pufra s papaínom (0,2 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT a 1 mg/ml papanínu). Doštičky s tráviacim roztokom sú inkubované pri teplote 60 °C cez noc. Bunečná vrstva je odstránená z doštičiek nasledujúci deň a je umiestnená do scintilačných skúmaviek. Potom je pridaná scintilačná látka a vzorky sú odčítané (LSC).

Je určené percento uvoľnenej rádioaktivity z celkového množstva prítomného v každej jamke. Percento inhibície zlúčeninou je určené na vzorkách IL-1 ako 0% inhibície (100% z celkovej rádioaktivity)

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, ktoré boli testované, majú hodnoty IC₅o v aspoň jednej z vyššie uvedených analýz menej ako 100 uM, prednostne menej ako 100 nM. Určité prednostné skupiny zlúčenín majú diferenciálnu selektivitu voči rôznym enzýmom MMP alebo ADAM. Jedna skupina prednostných zlúčenín má selektívnu aktivitu voči enzýmu MMP-13 oproti MMP-1.

Na podanie cicavcom, vrátane človeka, s cieľom inhibície matrix metaloproteináz alebo cicavčieho reprolyzínu môže byť použitý celý rad konvenčných spôsobov zahrňujúcich podanie perorálne, parenterálne (napríklad intravenózne, intramuskulárne alebo subkutánne), bukálne, análne a topické. Vo všeobecnosti môžu byť podávané zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu (odtiaľ nazývané taktiež ako aktívne zlúčeniny) v dávkach medzi 0,1 a 25 mg/kg telesnej hmotnosti jedinca, ktorý má byť liečený, na deň, prednostne od zhruba 0,3 do 5 mg/kg. Aktívna zlúčenina bude podávaná prednostne perorálne alebo parenterálne. Budú však nevyhnutné niektoré odchýlky v dávkovaní v závislosti od ochorenia jedinca, ktorý má byť liečený. Osoba zodpovedná za podávanie určí v každom prípade príslušnú dávku pre individuálneho jedinca.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu byť podávané v celom rade dávkovacích foriem, terapeuticky účinné zlúčeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu sú vo všeobecnosti prítomné v takých dávkovacích formách v koncentráciách v rozmedzí do zhruba 5,0% do zhruba 70% hmotnostné.

Pre perorálne podanie môžu byť použité tablety obsahujúce rôzne excipientné látky, ako sú napríklad mikrokryštalická celulóza, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dikalcium fosfát a glycín, spolu s rôznymi dezintegračnými látkami, ako sú napríklad škrob (a prednostne kukuričný, zemiakový alebo tapiokový škrob), kyselina algínová a určité komplexné silikáty, spolu s granulačnými väzbovými látkami, ako sú napríklad polyvinylpyrolidón, sacharóza, želatína a akácie. Naviac sú pre tabletovacie účely veľmi užitočné lubrikačné látky, ako sú napríklad magnézium stearát, laurýlsulfát sodný a mastenec. Pevné látky podobného typu môžu byť taktiež použité ako plniace látky v želatínových kapsuliach, prednostné materiály v tomto spojení taktiež zahŕňajú laktózu alebo mliečny cukor, rovnako ako polyetylén glykoly s vysokou molekulovou hmotnosťou. Ak sú požadované vodné suspenzie a/alebo elixíry na perorálne podanie, môže byť aktívna zložka skombinovaná s rôznymi sladiacimi alebo do.ehucujúcimi látkami, farbivami a pokiaľ je to. požadované taktiež emulzifikujúcimi a/alebo suspendujúcimi látkami, spolu s takými dilučnými látkami, ako sú napríklad voda, etanol, propylén glykol, glyceín a ich rôzne kombinácie. V prípade živočíchov sú tieto látky obsiahnuté s výhodou v ich strave alebo v pitnej vode v koncentrácii 5-5000 ppm, prednostne 25 až 500 ppm.

Na parenterálne podanie (intramuskulárne, intraperitoneálne, subkutánne a intravenózne použitie) je zvyčajne pripravený sterilný injekčný roztok s aktívnou zložkou. Môžu byť použité roztoky terapeutickej zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu v sezamovom oleji alebo v arašidovom oleji alebo vo vodnom propylén glykole. Vodné roztoky by mali byť vhodne upravené a pufrované, prednostne pri hodnote pH väčšej ako 8 pokiaľ je to možné a tekutou riadiacou látkou sú udržiavané izotonické. Tieto vodné roztoky sú vhodné na intravenózne injekčné účely. Olejové roztoky sú vhodné na intraartikulárne, intramuskulárne a subkutánne injekčné účely. Príprava všetkých týchto roztokov v sterilných podmienkach je ľahko uskutočnená štandardnými farmaceutickými technikami dobre známymi osobám znalým odbore. V prípade živočíchov môžu byť zlúčeniny podané intramuskulárne alebo subkutánne v dávkach zhruba 0,1 äž 50 mg/kg/deň, s výhodou 0,2 až 10 mg/kg/deň podaných v jednej dávke alebo až v troch rozdelených dávkach.

Aktívne zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, môžu byť taktiež formulované do rektálnych preparátov, ako sú čipky alebo retenčné náplavy, napríklad obsahujúce konvenčný čipkový základ, ako sú napríklad kakaové maslo alebo iné glyceridy.

Pre intranazálne podanie . alebo,,..inhalačné podanie sú aktívne zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, pohodlne dopravované vo forme roztoku alebo suspenzie v nádobke so sprejovou pumpou, ktorá je stláčaná alebo pumpovaná pacientom alebo vo forme aerosólového spreja v stlačenej nádobke alebo vo forme nebulizátora s použitím vhodnej poháňacej látky, napríklad dichlorodifluorometánu, trichlorofluorometánu, dichlorotetrafluoroetánu, oxidu uhličitého alebo iného vhodného plynu. V prípade stlačeného aerosólu môže byť dávkovacia jednotka určená pomocou ventilu odmeriavaceho určité množstvo. Stlačená nádobka alebo nebulizátor môžu obsahovať roztok alebo suspenziu s aktívnou zlúčeninou. Kapsule a náplne (vyrobené napríklad zo želatíny) pre použitie v inhalačnom zariadení alebo insuflátore môžu byť formulované tak, aby obsahovali zmes prášku zlúčeniny, ktorá je predmetom vynálezu a vhodnú práškovú bázu, ako sú napríklad laktóza alebo škrob.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Nasledujúce Príklady vyhotovenia vynálezu ilustrujú preparát zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu. Body topenia sú neupravené. NMR údaje sú uvedené v dieloch na milión (Ô) a vzťahujú sa na deutériový signál zo vzorkového rozpúšťadla (deutériochloroform, ak nie je špecifikované inak). Komerčné činidlá boli použité bez ďalšej purifikácie. THF znamená tetrahydrofurán. DMF znamená Ν,Ν-dimetylformamid. Chromatografia znamená stĺpcovú chromatografiu uskutočnenú s použitím 32-63 mm silikagélu a pod tlakom dusíku (blesková chromatografia). Izbová alebo okolitá teplota znamená 20 25 °C. Všetky nevodné reakcie boli uskutočnené pod dusíkovou atmosférou kvôli pohodliu a kvôli maximalizácii výťažkov. Koncentrácia pri zníženom tlaku alebo vo vákuu znamená, že bola použitá rotačná odparka. Príklad 1

5-Metyl, 5-(4'fenoxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión.

Do absolútneho alkoholu (25 ml) bol opatrne pridaný sodík (190 mg, 8,26 mM) a roztok bol premiešavaný, až sa stal homogénny. Bola pridaná urea (620 mg, 10,32 mM) a zmes bola premiešavaná po dobu 30 minút. Po kvapkách bol pridaný roztok dietyl-2-metyl-2-(4'-fenoxy-fenoxy) malonátu (1,48 g, 4,13 mM) v absolútnom etanole (25 ml) a výsledná zmes bola zahrievaná pod spätným chladením (6 hodín). Reakčná zmes bola ochladená na izbovú teplotu, odparená do sucha a rozdelená na etylacetát (100 ml) a vodu (100 ml). Vodná vrstva bola separovaná, okyslená na pH 1 vodným IN HCI a extrahovaná etylacetátom (3x100 ml). Skombinované oragnické extrakty boli vysušené síranom horečnatým (MgSO₄), prefiltrované odparené do sucha. Výsledný vodný prášok bol kryštalizovaný z horúceho metylénchloridu za vzniku cieľovej zlúčeniny v forme bieleho kryštalického materiálu (310 mg, viď Tabuľka 1 s analytickými údajmi).

Príklady 2 až 9

Príklady 2 až 9 boli uskutočnené podobným postupom, ktorý je opísaným vyššie, s výnimkou toho, že dietyl-2-metyl-2(4'-fenoxy-fenoxy) malonát bol nahradený vhodne substituovaným malonátom. V tabuľke, ktorá nasleduje je Me metyl, Bu je n-butyl, Ex No je Príklad číslo, a m/z váha molekulárneho iónu s nízkym rozlíšením.

Tabulka 1

Ex. No.	Štruktúra	m/z	NMR údaje j (400 MHz)	Bod I topenia °C
1	sA cÄrJ I H	Ie An n v ’	3252	δ (d⁶-acetone); 1.95 (s,3H); 2.85 (s, br, 2H); 6.85-7.00 (m, 6H); 7.05 (m,1H); 7.30-7.35 (m, 2H).	182
2-	N oAx I H	k»0	367.3	δ (d⁶-acetone); 0.95 (t, 3H); 1.40 (m, 2H); 1.55 (m, 2H);225 (m, 2H); 2.85 (s, br. 2H); 6.82-7.00 (m, 6H);7.05 (m. 1H); 7.10-7.15 (m, 2H).	59-60
3	-A ο<γ H	e οο,χζ	3432	δ (cŕ-acetone); 1.95 (s,3H);2.85(s.br, 2H); 6.85-7.00 (m. 6H), 7.10-7.15 9m. 2H).	187-9
4	sA cAtX l H	Í0y^ . Ϊϊ_ 0 0	385.2	δ (d'-acetone); 0.95 (t 3H); 1.40 (m, 2H); .1.55 (m. 2H);225 (m. 2H); 2.85(s, br. 2H); 6.82-7.00 (m. 6H), 7.10-7.15 (m. 2H).	183
5	A O^N- - I H	Me \ \|) x_ou^	309.3	δ (ď-acetone); 1.97 (s, 3H); 2.90 (s. br, 2H); 6.75-6.78 (dd. 1 H); 7.061-7.067 (m, 1H); 727-7.46 (m. 5H); 7.57-7.59 (d, 2H).	175

P 5?	Štruktúra	m/z	NMR údaje (400 MHz)	Bod topenia °C
6	0 H. Λ N 1 H	Me	309.3	δ (d⁶-acetone); 1.95 (s, 3H); 6.86-6.89 (dd, 1 H); 727-7.62 (m,8H).	200-202
7	O X^M 0^74 H		339.1	δ (d^e-acetone); 1.88 (s. 3H); 5.03 (5.2H), 6.77-6.91 (m, 4H); 7.30-7.45 (m, 5H).

Preparát 1

Dietyl-2-n-butyl, 2-(4'fenoxy-fenoxy)malonát

Do absolútneho alkoholu (25 ml) bol pomaly a opatrne pridaný sodík (112 mg) a roztok bol premiešavaný, až sa stal homogénny. Pomaly bol pridaný 4-fenoxyfenol (910 mg) (Aldrich Chemical Company) a výsledná zmes bola P^rebliešavaná (30 minút, izbová teplota). Po kvapkách bol pridaný roztok dietyl-a-bromo-a-n-butyl-malonátu (1,44 g) (viď Preparát 3) v absolútnom etanole (25 ml) a výsledná zmes bola zahrievaná pod spätným chladením (1 hodinu). Reakčná zmes bola ochladená na izbovú teplotu, odparená do sucha a rozdelená na etylacetát (100 ml) a vodu (100 ml). Organická vrstva bola separovaná, premytá vodou (3x100 ml), vysušená (síran horečnatý), prefiltrovaná a odparená za vzniku požadovanej zlúčeniny v forme čistého oleja (1,82 g). \H NMR (CDC1₃): δ = 0,85 - 0,88 (t, 3H), 1,21 - 1,25 (t, 6H), 1,31 - 1,39 (m, 4H), 2,2 - 2,27 (m, 2H), 4,23 - 4,28 (q, 4H), 6,80 - 6,95 (m, 6H), 7,03 7,08 (t, 1H), 7,25 - 7,31 (q, 2H), m/z = 401 (M⁺).

Preparát 2

Dietyl-2-metyl, 2-(4'fenoxy-fenoxy) malonát

Do absolútneho alkoholu (25 ml) bol pomaly a opatrne pridaný sodík (112 mg) a roztok bol premiešavaný, až sa stal homogénny. Pomaly bol pridaný 4-fenoxyfenol (910 mg) , (Aldrich Chemical Company) a výsledná zmes bola premiešavaná (30 minút, izbová teplota). Po kvapkách bol pridaný roztok dietyl-a-bromo-a-n-metyl-malonátu (1,23 g) (Aldrich Chemical Company) v absolútnom etanole (25 ml) a výsledná zmes bola zahrievaná pod spätným chladením (1 hodinu). Reakčná zmes bola ochladená na izbovú teplotu, odparená do sucha a rozdelená na etylacetát (100 ml) a vodu (100 ml). Organická vrstva bola separovaná, premytá vodou (3x100 ml), vysušená (síran horečnatý), prefiltrovaná a odparená za vzniku požadovanej zlúčeniny v forme čistého oleja (1,48 g). 'H NMR (CDC1₃): δ = 1,25 - 1,28 (t, 6H), 1,71 (s, 3H),

4.24 - 4,30 (q, 4H), 6,88 - 6,97 (m, 6H), 7,04 - 7,08 (t, 1H),

7.25 - 7,32 (q, 2H), m/z = 359 (M⁺).

Malonáty zahŕňajúce zlúčeniny obsiahnuté v Tabuľke 2 boli pripravené s použitím analogických postupov, ktoré sú opísané vyššie (preparáty 1 a 2) vychádzajúc z príslušných abromo, a-alkyl malonátu a príslušného fenolu. V tabuľke, ktorá nasleduje je Me metyl a Et je etyl.

Tabulka 2

Štrúktura	Ή NMR	m/z
0 X EtO'^z><x	le	0^/	γ	Í^V^F	5(d^e-acetone);1,19- 123 (t, 6H); 1.64 (s, 3H);	3772
EtO^X		Y 0	Λ_ο-	v	4.19-424 (q, 4H); 6.90-7.14 (m. 9H).
		JAe			δ (d³ - chloroform);
n		r			0.86-0.88 (t, 3H); 121-123	419.3
X	X	Y		rr^F	(L 6H); 125-1.38 (m, 4H); 2.18-2.22 (m. 2H);.42O -
EtO^		0	A-O	M	425 (q, 4H); 6.80-7.00 (m,
					8H).
n					δ (d⁶-acetone); 1.19-
Jl? Etcr^	4e		£1	123 (V 6H); 1.75 (s, 3H);	343.3
/°\			424-429 (q, 4H); 6.95 - 7.63
EtO	X	x)	u		(m, 9H).
0 X^K EtO'^	4e	n		δ (d⁶-acetone); 1.19122 (t, 6H); 1.72 (s, 3H); 4.23-426 (q, 4H); 6.89 - 7.60	343.3
EtO		%	XX	ΊΑ	(m, 9H).
				M

Preparát 3

Dietyl-a-bromo-a-n-butylmalonát

V metylénchloride (200 ml) bol rozpustený dietyl-nbutylmalonát (32,2 g) a podrobený reakcii s po kvapkách pridávaným roztokom brómu (24,0 g) rozpustenom v metylénchloride (25 ml). Výsledná zmes bola premiešavaná (1 hodinu, izbová teplota), kedy pretrvávalo oranžové zafarbenie. Rozpúšťadlo bolo odstránené vo vákuu a rezíduum bolo destilované vo vysokom vákuu za vzniku požadovanej zlúčeniny v forme čistého oleja (teplota bodu varu 105 °C až 110 °, 36,0 g). ^JH NMR (CDC1₃): δ = 0,89 - 0,92 (t, 3H), 1,25 - 1,29 (t, 6H), 1,35 - 1,37 (m, 4H), 2,2 - 2,26 (m, 2H), 4,23 - 4,29 (q, 4H), m/z = 295 a 297 (M⁺).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlúčenina definovaná vzorcom kde

R¹ je vodík, (C1-C4) perfluoroalkyl, (Ci-C₈) alkyl alebo (C₃-C₈) cykloalkyl, kde spomenutý (Ci-C₈) alkyl alebo (C₃-C₈) cykloalkyl môžu voliteľne obsahovať jeden až tri heteroatómy nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej kyslík, >NR⁵ a síru, kde spomenuté (Ci-C8) alkyl alebo (C3-C8) cykloalkyl môžu byť voliteľne substituované jedným až dvomi substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej (C1-C4) alkyl, (C6-Cio) aryl, (C2-Ci0) heteroaryl, OH, NH2, (C1-C4) alkylamino, di[(Ci-C4) alkyljamino, (C3-C8) cykloalkylamino, (C3-C8) cykloalkylamino (C!-C4) alkylamino, (Ci-C8) alkoxy, -CONH2, -CONHR⁴, -NOC(R⁴)2 a (C₃-C₈) cykloalkyl, kde spomenutý (C₃-C₈) cykloalkyl môže voliteľne obsahovať jeden alebo dva heteroatómy nezávisle vybrané z >NR⁵, kyslíka a síry.

R² a R³ sú nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík alebo (C1-C4) alkyl, kde spomenutý (C1-C4) alkyl môže voliteľne obsahovať jeden heteroatóm vybraný zo skupiny obsahujúcej kyslík, >NR⁵ alebo síru a spomenutý (C1-C4) alkyl môže byť voliteľne substituovaný (Cô-Cio) arylom, (C₂-Cio) heteroarylom, OH, NH₂, (C1-C4) alkylamino, di[(CiC₄) alkyljamino, (C₃-C₈) cykloalkylamino, (C₃-C₈) alkylamino (C!-C₄) alkylamino, (C1-C4) alkoxy, CON(R⁴)₂ a (C₃-C₈) cykloalkylom; kde spomenutý (C₃-C₈) cykloalkyl môže obsahovať jeden alebo dva heteroatómy nezávisle vybrané z >NR⁵, kyslíka a síry;

X je vybrané zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru, >SO₂, >S=O, >NR⁴, .CH2O-, -OCH2j -CH2S-, -CH2(S=O)-, CH2SO2-, -SCH2-, -SOCH2-, -SO2CH2-, -N(R⁴)CH2-, CH₂N(R⁴)-, -N(R⁴)SO₂- a -SO₂N(R⁴)R⁴ kdekoľvek sa vyskytuje, je nezávisle vybraný zo skupiny obsahujúcej vodík a (C1-C4) alkyl;

R⁵ kdekoľvek sa vyskytuje, je nezávisle vybraný zo skupiny obsahujúcej vodík a (C1-C4) alkyl, (Cô-Cjo) aryl, (C₂-C₁₀) heteroaryl, OH, CONH₂, CONHR⁴, CON(R⁴)₂ a (C₃-C₈) cykloalkyl;

Y je vybrané zo skupiny obsahujúcej väzbu, kyslík, síru, >SO₂, >S=O, >NH -CH₂-, -CHO₂-, -OCH₂, CH₂S-, -CH₂(S=O)-, -CH₂SO₂-, -SCH₂-, -SOCH₂-, so₂ch₂-, -nhch₂-, -ch₂nh-, -ch₂ch₂-, -CH=CH-, -NHSO₂- a -SO₂NH-;

Ar je (C₆-C₁₀) aryl alebo (C₂-C_I0) heteroaryl; a

Z je (C₆-C₁₀) aryl, (C₃-C₈) cykloalkyl, (C₃-C₈) cykloalkyl (C1-C4) alkyl alebo (C₂-Ci₀) heteroaryl;

kde jeden alebo dva kruhové uhlíkové atómy spomenutých (C₃-C₈) cykloalkylu alebo (C₃-C₈) cykloalkyl(Ci-C₄) cykloalkylu môžu byť voliteľne nahradené heteroatómy nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru a NR⁵;

Ar¹ a Z môžu byť voliteľne substituované na akomkoľvek z kruhových uhlíkových atómov schopných tvorby ďalšej väzby jedným až tromi substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej F, Cl, Br, CN, OH, (C1-C4) alkyl, (C1-C4) perfluoroalkyl, (C|-C₄) perfluoroalkoxy, (C!-C₄) alkoxy, a (C₃-C₈) cykloalkyloxy;

alebo jej farmaceutický prijateľnej soli.
2. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde R² a R³ sú každý vodík.
3. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde X je kyslík, -CH₂- alebo -CH₂O-.
4. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde X je síra, >SO₂, -SCH₂-, -CH₂-S-, -CH₂SO₂- alebo -SO₂CH₂-.
5. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde X je >NR⁴,

-CH₂N(R⁴)- alebo -N(R⁴)CH₂-.
6. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde X je N(R⁴)SO₂- alebo -SO₂N(R⁴)-.
7. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
8. Zlúčenina podľa patentového nároku 3, kde Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
9. Zlúčenina podľa patentového nároku 4, kde Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
10. Zlúčenina podľa patentového nároku 5, kde Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
11. Zlúčenina podľa patentového nároku 6, kde Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
12. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Y je kyslík, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
13. Zlúčenina podľa patentového nároku 3, kde Y je kyslík, -OCH₂- alebo -CH₂O-.
14. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde X a Y sú každý kyslík.
15. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Ar¹ je fenyl.
16. Zlúčenina podľa patentového nároku 12, kde Ar¹ je fenyl.
17. Zlúčenina podľa patentového nároku 13, kde Ar¹ je fenyl.
18. Zlúčenina podľa patentového nároku 14, kde Ar¹ je fenyl.
19. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Zje (C₆C₁₀) aryl alebo (C₂-Ci₀) heteroaryl.
20. Zlúčenina podľa patentového nároku 3, kde Zje (CôCio) aryl alebo (C₂-Cio) heteroaryl.
21. Zlúčenina podľa patentového nároku 12, kde Zje (C₆Cio) aryl alebo (C₂-Cio) heteroaryl.
22. Zlúčenina podľa patentového nároku 13, kde Zje (C6Cj₀) aryl alebo (C₂-Cio) heteroaryl.
23. Zlúčenina podľa patentového nároku 17, kde Zje (C₆Cjo) aryl alebo (C₂-Cio) heteroaryl.
24. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Zje (C^Cio) aryl.
25. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Zje (C₃C₈) cykloalkyl (Cj-C₄) alkyl, kde jeden alebo dva kruhové uhlíkové atómy spomenutých (C₃-Cg) cykloalkylu alebo (C₃-Cg) cykloalkyl(Ci-C₄) cykloalkylu môžu byť voliteľne nahradené heteroatómy nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej kyslík, síru alebo NR⁵; kde R⁵ je vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík, (Cj-C4) alkyl, (C6-Ci0) aryl, (C2-Cio) heteroaryl, OH, -CONH2, -CONHR⁴, -NOC(R⁴)2 a (C₃-C₈) cyklolalkyl.
26. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Z je (C₂Cio) heteroaryl.
27. Zlúčenina podľa patentového nároku 2, kde Ar¹ a Z sú substituované akýmkoľvek z kruhových uhlíkových atómov schopných tvorby ďalšej väzby jedným až tromi substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej F, Cl, Br, CN, OH, (C1-C4) alkyl, (C1-C4) perfluoroalkyl, (C1-C4) perfluoroalkyloxy, (C1-C4) alkyloxy a (C₃-C₈) cykloalkyloxy.
28. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde X je kyslík, Y je väzba, kyslík, síra, -CH₂-, >SO₂, -OCH₂-, alebo CH₂O-₅ R¹ je vodík alebo (C!-C4) alkyl, kde spomenutý (C1-C4) alkyl môže voliteľne obsahovať jeden alebo dva heteroatómy nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej kyslík a >NR⁵, kde spomenutý (C1-C4) alkyl môže byť voliteľne substituovaný jedným až tromi substituentami nezávisle vybranými zo skupiny obsahujúcej (C1-C4) alkyl, OH, NH2, (C!-C₄) alkylamino, di[(CiC₄) alkyljamino, (C_rC₄) alkyloxy, -CONH₂, -CONH₂, -CÓNHR⁴a -CONR⁴ a R² a R³ sú nezávisle vybrané zo skupiny obsahujúcej vodík a (C1-C4) alkyl.
29. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde R a R sú každý vodík, X je kyslík, Y je kyslík a Z je (C₂-Ci₀) heteroaryl.
30. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde R¹ je metyl, R² a R³ sú každý vodík, X je kyslík, Y je kyslík a Zje (C₆-Cio) aryl.
31. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde R¹ je nbutyl, R² a R³ sú každý vodík, X je kyslík, Y je kyslík a Zje (C₆-Cio) aryl.
32. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde R¹ je metyl, R a R sú každý vodík, X je kyslík, Y je väzba a Z je (C₆-Ciq) aryl.
33. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde R¹ je nbutyl, R a R sú každý vodík, X je kyslík, Y je väzba a Zje (C₆-C₁₀) aryl.
34. Zlúčenina podľa patentového nároku 1, kde spomenutá zlúčenina je vybraná zo skupiny obsahujúcej:

5-metyl-5-(4-fenoxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-metyl-5-(4-(4'-fluorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6trión;

5-n-butyl-5-(4-fenoxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-n-butyl-5-(4-(4'-fluorofenoxy)-fenoxy)-pyrimidín2,4,6-trión;

5-mety l-5-(4-fenyl-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

5-metyl-5-(3-fenyl-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión a

5-metyl-5-(4-benzyloxy-fenoxy)-pyrimidín-2,4,6-trión;

alebo ich farmaceutický prijateľnej soli.
35. Farmaceutický preparát na liečbu ochorení vybraných zo skupiny obsahujúcej artritis, nešpecifické črevné zápaly, Crohnovu nemoc, emfyzém, akútny syndróm respiračnej tiesne, astma, chronickú obštrukčnú pľúcnu chorobu, Alzheimerovu chorobu, toxicitu spôsobenú orgánovou transplantáciou, kachexiu, alergické reakcie, alergickú kontaktnú hypersenzitivitu, nádorové ochorenia, tkanivové ulcerácie, restenózy, periodontálnu chorobu, epidermolýzis bulosa, osteoporózu, uvoľnenia umelých kĺbnych implantátov, aterosklerózu, aortálnu aneuryzmu, kongestívne zlyhanie srdca, infarkt myokardu, mozgovú mŕtvicu, mozgovú ischémiu, traumu hlavy, poranenie miechy, neurodegeneratívne ochorenia, autoimúnne ochorenia, Huntingtonovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, migrénu, depresiu, periférnu neuropatiu, bolesti, mozgovú amyloidovú angiopatiu, nootropické alebo kognitívne' zlepšenie, amyotrofickú laterálnu sklerózu, roztrúsenúsklerózu, okulárnu angiogenézu, korneálne poranenie, makulárnu degeneráciu, abnormálne hojenie rán, popáleniny, diabetes, korneálne zjazvenie, skleritis, AIDS, sepsu, septický šok u cicavca vrátane človeka obsahujúci množstvo zlúčeniny podľa patentového nároku 1 účinné pri liečbe týchto ochorení a farmaceutický prijateľný nosič.
36. Spôsob liečby ochorení vybraných zo skupiny obsahujúcej artritis, nešpecifické črevné zápaly, Crohnovu nemoc, emfyzém, akútny syndróm respiračnej tiesne, astma, chronickú obštrukčnú pľúcnu chorobu, Alzheimerovu chorobu, toxicitu spôsobenú orgánovou transplantáciou, kachexiu, alergické reakcie, alergickú kontaktnú hypersenzitivitu, nádorové ochorenia, tkanivové ulcerácie, restenózy, periodóntálnu chorobu, epidermolýzis bulosa, osteoporózu, uvoľnenia umelých kĺbnych implantátov, aterosklerózu, aortálnu aneuryzmu, kongestívne zlyhanie srdca, infarkt myokardu, mozgovú mŕtvicu, mozgovú ischémiu, traumu hlavy, poranenie miechy, neurodegeneratívne ochorenia, autoimúnne ochorenia, Huntingtonovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, migrénu, depresiu, periférnu neuropatiu, bolesti, mozgovú amyloidovú angiopatiu, nootropické alebo kognitívne zlepšenie, amyotrofickú laterálnu sklerózu, roztrúsenú sklerózu, okulárnu angiogenézu, korneálne poranenie, makulárnu degeneráciu, abnormálne hojenie rán, popáleniny, diabetes, korneálne zjazvenie, skleritis, AIDS, sepsu, septický šok u cicavca vrátane človeka obsahujúci množstvo zlúčeniny podľa patentového nároku 1 účinné pri liečbe týchto ochorení.
37. Farmaceutický preparát pre liečbu ochorení, ktoré môžu byť liečené inhibíciou matrix metaloproteináz u cicavca vrátane človeka, pričom preparát obsahuje množstvo zlúčeniny podľa patentového nároku 1 účinné pri liečbe týchto ochorení a farmaceutický prijateľný nosič.
3 8. Farmaceutický preparát pre liečbu ochorení, ktoré môžu byť liečené inhibíciou cicavčieho reprolyzínu u cicavca vrátane človeka, pričom tento preparát obsahuje množstvo zlúčeniny podľa patentového nároku 1 účinné pri liečbe týchto ochorení a farmaceutický prijateľný nosič.
39. Spôsob inhibície matrix metaloproteináz u cicavca vrátane človeka, pričom tento spôsob zahŕňa podanie spomenutému cicavcovi účinného množstva zlúčeniny podľa patentového nároku 1.
40. Spôsob inhibície cicavčieho reprolyzínu u cicavca vrátane človeka, pričom tento spôsob zahŕňa podanie spomenutému cicavcovi účinného množstva zlúčeniny podľa patentového nároku 1.