SK138999A3

SK138999A3 - Method for inactivating pathogens, especially viruses, in a biological material

Info

Publication number: SK138999A3
Application number: SK1389-99A
Authority: SK
Inventors: Hans-Peter Schwarz; Gerold Zerlauth; Peter Turecek
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2000-06-12
Also published as: EP0973543A1; DE59810716D1; DK0973543T3; EP0973543B1; PT973543E; AU6711898A; ES2214701T3; JP2001519790A; NO994821L; AU739845B2; ATA59497A; BR9807938A; CA2285976A1; HUP0000825A1; WO1998044941A1; NO994821D0; AT405608B; HUP0000825A3

Description

Predložený vynález sa týka spôsobu inaktivácie patogénov v biologickom materiáli inkubáciou s chemickým prostriedkom a prípravkov týmto spôsobom získaných.

Doterajší stav techniky

Biologicky materiál pochádza z organizmov prípadne telesných kvapalín alebo mikroorganizmov.

Pretože biologicky materiál môže byť kontaminovaný patogénmi, ako napríklad infekčnými molekulami alebo mikroorganizmami a vírusmi, prípadne pyrogénmi, boli už vyvinuté rôzne spôsoby inaktivácie prípadne zníženie kontaminácie patogénov prípadne pyrogénov.

Takéto spôsoby zahrňujú fyzikálne a/alebo chemické ošetrenie, ako napríklad rôzne filtračné metódy (napríklad nano, dia- alebo ultrafiltrácia), ošetrenie teplom, ošetrenie kyselinami alebo lúhmi, ošetrenie detergentami a/alebo organickými rozpúšťadlami a rovnako ošetrenie ÚV-svetlom alebo laserom. Podľa stavu techniky boli tiež navrhované rôzne kombinácie týchto spôsobov na inaktiváciu prípadne zníženie kontaminácie patogénov.

ZEP 0 197 554 je napríklad známy spôsob na depyrogenáciu a inaktiváciu vírusov v biologickom alebo, farmaceutickom produkte, ktorý zahrňuje ošetrenie prostriedkom na inaktiváciu vírusov a depyrogenáciu, ako je napríklad amfifilná substancia a/alebo rozpúšťadlo na pevnej fáze, na ktorej je produkt adsorbovaný. Po tomto ošetrení sa prostriedok na inaktiváciu vírusov a depyrogenáciu oddelí od pevnej fázy, adsorbovaný produkt sa premyje a následne eluuje z pevnej fázy.

ZEP 0 131 740 je známe ošetrenie prípravku obsahujúceho proteín v roztoku s organickými rozpúšťadlami ako di-a/alebo trilalkylfosfáty, prípadne v prítomnosti detergentu (ošetrenie rozpúšťadlo/detergent), pričom sa môže

31310/H získať proteínový prípravok neobsahujúci lipidové vírusy.

Z AT-PS 402 151 je známe ošetrenie teplom, pri ktorom sa do preparátu vo vodnom roztoku pridá pred zahriatím tenzid v koncentrácii najmenej 1 % hmotnostné.

Ďalší spôsob na redukciu prípadne supresiu nežiadúcich aktivít v biologických alebo farmaceutických produktoch je známy z EP 0 083 999. Tento spôsob je založený na predĺženom kontakte s roztokom alebo suspenziou amfifilu, ktorý nepôsobí denaturačne. Depyrogenovaný produkt sa na odstránenie amfifilu spracuje pomocou iónomeniča.

Nevýhodou mnohých týchto spôsobov známych podľa stavu techniky je častý výskyt straty aktivity labilných proteínov obsiahnutých v ošetrovaných prípravkoch, napríklad krvných proteínov. Obzvlášť pri uskutočňovaní chromatografického čistiaceho procesu dochádza k inaktivácii proteínov v relatívne vysokej miere. Odbúravanie proteínov môže viesť tiež k aktivácii. Tak je napríklad známe, že faktor VII pri chromatografickom čistení na základe autokatalytických procesov sa môže veľmi ľahko aktivovať na nežiadúci faktor Vila, pretože je veľmi labilný.

Ďalšia nevýhoda spočíva vo vysokej časovej a aparátovej náročnosti mnohých spôsobov, čo veľmi obmedzuje ich uskutočniteľnosť a ich použitie v prevádzkovej mierke je často nevhodné.

Predložený vynález si kladie za úlohu, dať k dispozícii spôsob, šetrný pre proteíny, obzvlášť pre labilné krvné proteíny, k účinnej inaktivácii patogénov v biologickom materiáli, ktorý je možné ľahko preniesť do prevádzkovej mierky a môže sa uskutočňovať ekonomicky. Obzvlášť sa má týmto spôsobom inaktivácie patogénov ďalekosiahle zabrániť odbúraniu a možnej aktivácii citlivých proteínov.

Podstata vynálezu

Vyššie uvedená úloha bola vyriešená tak, že bol daný k dispozícii spôsob inaktivácie patogénov, obzvlášť vírusov, v biologickom materiáli inkubáciou s chemickým prostriedkom, pri ktorom sa inkubácia uskutočňuje v prítomnosti eluotrópnej soli zodpovedajúcej koncentrácii chloridu sodného

31310/H najmenej 200 mmol/l, s výhodou najmenej 300 mmol/l.

Inaktivácia patogénov v roztoku ponúka oproti ošetreniu adsorbenta niektoré výhody. Tak je napríklad prevádzkovateľnosť takéhoto spôsobu v homogénnom, jednofázovom systéme ľahšia a validácia inaktivácie je lepšie uskutočniteľná. Rovnako sa zdá, že lepšia prístupnosť patogénov v relatívne homogénnej fáze zvyšuje účinnosť procesného kroku.

Biologicky materiál obsahuje s výhodou humánny proteín a je obzvlášť plazmou alebo frakciou plazmy alebo pochádza z bunkovej kultúry. S výhodou obsahuje biologický materiál krvný faktor, ako faktor XII, XI, VIII, V, proteín závislý od Wollebrandoveho faktora alebo fibrinogénu, obzvlášť od vitamínu K, ako faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, proteín C, proteín S prípadne proteín Z.

Proteíny sa môžu vyskytovať ako jednotlivé faktory, s výhodou vo vyčistenej forme, alebo ako komplexné zmesi. Pri jednej obzvlášť výhodnej forme uskutočnenia obsahuje biologický materiál najmenej jeden faktor protrombínového komplexu a je obzvlášť materiál obsahujúci frakciu obsahujúcu protrombínový komplex alebo faktor VII, napríklad sa vychádza zo zodpovedajúceho zvyšku (kryozvyšok) po kryoprecipitácii plazmy.

Prípravok podľa vynálezu je s výhodou prípravok s aktivitou FE1B (Factor Eight Inhibítor Bypassing-Activity), teda prípravok, ktorý je vhodný na ošetrenie pacientov s inhibítorom faktoru VIII.

Materiál pochádzajúci z bunkovej kultúry je s výhodou materiál obsahujúci rekombinantne vyrobené krvné faktory, medzi nimi faktory vnútorného alebo vonkajšieho zrážania, fibrinolýzy, trombolýzy alebo ich inhibítorov, obzvlášť krvných faktorov závislých od vitamínu K. Ako bunky prichádzajú do úvahy bežné bunky pre expresiu rekombinantných proteínov, s výhodou bunky cicavcov, ako napríklad Vera-, CHO- alebo BHK-bunky. Zodpovedajúce proteíny sa môžu priamo zo surového bunkového extraktu podrobiť spôsobu podľa vynálezu na inaktivácíu prípadne sa vyskytujúcich patogénov, môže sa ale tiež jednať o predčistenú bunkovú frakciu.

Chemický prostriedok je napríklad detergent (amfifil, tenzid), ktorý je s výhodou obsiahnutý v množstve najmenej 1 %, výhodnejšie viac ako 5 %,

31310/H najvýhodnejšie viac ako 10 %; podľa vynálezu sa ale tiež môžu použiť iné chemické prostriedky, obzvlášť také, pri ktorých je už napríklad známy virocidný, baktericídny alebo depyrogenačný účinok, prípadne zmesi najrôznejších chemických prostriedkov.

Výber je však limitovaný tým, aby nebola podstatne ovplyvnená nativita biologického materiálu. Pre ekonomicky spôsob sa volia chemikálie, ktoré zachovávajú biologickú aktivitu materiálu viac ako 50 %, vzťahujúc na aktivitu pred inkubáciou, s výhodou najmenej 70 % , obzvlášť viac ako 85 %. Zachovanie biologickej aktivity znamená, že proteíny obsiahnuté v biologickom materiáli môžu vykonávať im prirodzene pripísané funkcie prípadne rôzne funkcie. Táto biologická aktivita sa potom môže podľa druhu proteinu zisťovať a udávať, napríklad pomocou štandardizovaného chromogénneho testu alebo stanovením antigénov.

Pripadne sa chemický prostriedok po inkubácii oddelí,

Ako detergent sa všeobecne rozumie syntetická, organická substancia aktívna na hraničných plochách.

S výhodou sa pre spôsob podľa vynálezu použije neiónový detergent. Neiónové tenzidy ako polyéter, obzvlášť alkylfenolpolyglykoléter sú medzi iným produkty etoxylácie mastných kyselín, amidov mastných kyselín, mastných amínov, mastných alkoholov, aminoxidov, esterov mastných kyselín polyalkoholov a esterov cukrov.

Takýto tenzid nepôsobí na proteíny denaturačne a s výhodou sa vyberie zo skupiny polysorbátov a tritonu. Ako polysorbát sa napríklad používa Tween®.

Pokiaľ sa detergenty použijú ako chemické prostriedky potom sa tieto detergenty podľa výhodnej formy uskutočnenia vynálezu použijú bez prídavku ďalších prostriedkov, obzvlášť bez prídavku toxických organických látok alebo rozpúšťadiel, ako napríklad TNBP. Tým sa minimalizuje riziko kontaminácie.

Biologický materiál sa spôsobom podľa vynálezu inkubuje chemickým prostriedkom. Inkubácia znamená uviesť do kontaktu biologický materiál s roztokom, suspenziou alebo emulziou chemického prostriedku po dostatočne dlhú dobu potrebnú na inaktiváciu prípadne prítomných patogénov prípadne pyrogénov pri určitej teplote. Uvedenie do kontaktu sa môže napríklad

31310/H uskutočniť jednoduchým ponechaním zmesi po definovanú dobu.

Inkubácia sa podľa predloženého vynálezu uskutočňuje v prítomnosti eluotrópnej soli. Ako „eluotrópna soľ sa ďalej rozumie soľ v zmesi s chemickým prostriedkom alebo soľ v komplexnom prípravku, s vlastnosťou vylúhovať absorbované látky z pevných adsorbentov alebo adsorbentov napojených kvapalinou alebo gélovitých adsorbentov a/alebo vytlačiť. S výhodou sa v prípade eluotrópnych solí jedná o desorpčný prostriedok, aký sa používa pre chromatografické procesy. Adsorbovaná látka je podľa toho dostatočne rozpustná v prítomnosti eluotrópnej soli, to znamená, že sa s výhodou volia podmienky, za ktorých nedochádza ku zrazeniu biologického materiálu.

Druh a koncentrácia soli, prípadne prípravku sa všeobecne volia podľa použitého adsorbentu. Elučný účinok soli závisí napríklad od polarity rozpúšťadla, stúpa teda napríklad v poradí etanol - acetón - metanol - voda. Adsorbent môže byť pevnou fázou, obzvlášť matrica vhodná pre ionomeničovú chromatografiu. V prípravku obsahujúcom eluotrópnu soľ môžu byť obsiahnuté ešte ďalšie prísady, napríklad ďalšie soli. S výhodou sa v prípade prípravkov jedná o vodné prípravky s pH hodnotou v rozmedzí medzi 6,0 až 8,0, výhodnejšie okolo 7,0.

Pri výhodnej forme uskutočnenia sa ako eluotrópna soľ použije chlorid sodný, ale i iné soli alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, medzi nimi chlorid vápenatý. Ako eluotrópne soli sa môžu použiť i tak zvané chaotropy, ako napríklad močovina, rodanidy alebo guanidín. Koncentrácia soli je najmenej > 200 mmol/l, s výhodou > 300 mmol/l. Horná hranica použitej koncentrácie závisí obzvlášť od rozpustnosti danej soli a pre chlorid sodný je

I napríklad okolo 2 mol/l. Chaotropné látky, ako napríklad močovina, sa môžu dokonca napríklad použiť v koncentrácii až do 8 mol/l.

Inkubácia biologického materiálu chemickými prostriedkami sa uskutočňuje po dobu dostatočne dlhú na inaktiváciu prípadne prítomných patogénov, s výhodou po dobu medzi 10 minút a 10 hodín, najvýhodnejšie medzi 1 hodinou a 5 hodinami. Doba potrebná na spôsob podľa vynálezu sa môže zistiť pomocou modelových vírusov ako HIV, Sindbis-, FSME- alebo vírusov hepatitídy predbežným pokusom.

31310/H

Tiež voľba teploty ovplyvňuje použitú dobu. Pri spôsobe podľa vynálezu sa s výhodou inkubuje pri teplote miestnosti, napríklad v rozmedzí teplôt medzi 15 až 45 °C, obzvlášť medzi 20 a 30 °C.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa biologický materiál s výhodou adsorbuje na pevný nosič, vyčistí sa a inkubácia sa uskutoční bezprostredne po elúcii vyčisteného materiálu, pričom eluát sa ešte ďalej spracováva, napríklad centrifugáciou, filtráciou alebo inými fýzikálnymi metódami.

Pevný nosič je s výhodou materiál vhodný pre chromatografiu, obzvlášť nosič vhodný na ionomeničovú chromatografiu, hydrofóbnu chromatografiu alebo afinitnú chromatografiu. Napríklad sa používajú materiály ako Sepharose®, Superdex®, Sephadex®, Spherodex®, Toyopearl®, alebo anorganické materiály ako hydroxylapatit.

Ako inonomeniče sa môžu používať inonomeničové materiály, ako napríklad DEAE-Sephacel®, DEAE-Sepharose® CL6B, DEAE-Sepharose® Fast Flow, QAE- Sephadex®, Q-Sepharose® Fast Flow, Q-Sepharose® High Performance, DEAE-Tris-Acryl, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D (dodávaný firmou Sepracor), DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Fractogel® EMD-TMAE alebo iné Fractogelové materiály.

Ako príklady hydrofóbnych chromatografických materiálov možno napríklad uviesť Butyl-Sepharose®, Octyl-Sepharose® , Phenyl-Sepharose®, Fractogel® TSK-butyl, t-Butyl-HlC Support alebo TSK-Gel Butyl Toyopearl®.

Biologický materiál sa môže priamo z komplexnej zmesi adsorbovať na nosič a čistiť, inaktivačnému kroku môžu ale predchádzať alebo po ňom nasledovať tiež ďalšie kroky na čistenie materiálu, pričom v rámci predloženého

I vynálezu je výhodné ďalšie chromatografické čistenie.

Spôsobom podľa vynálezu sa patogény inaktivujú. Ako patogény sa rozumejú tiež produkty degradácie napríklad vírusov, obzvlášť tiež izolované génom alebo jeho fragmentárni.

Patogény môžu byť patogénmi obklopené lipidy, ako napríklad HepatitisB-Virus, alebo nelipidické patogény, ako napríklad Hepatitis-A-Virus.

Spôsoby inaktivácie vírusov sa dnes označujú za účinné, ak po použití spôsobu na vzorku biologického materiálu, ktorý bol zmiešaný s vysokou

31310/H dávkou testovaného vírusu, napríklad Hl-vírusu alebo Sindbis-vírusu ako modelového vírusu pre vírusy Hepatitis nemožno vo vzorke preukázať žiadne vírusy a titer vírusu bol tak redukovaný pod hranicu dokázateľnosti. Dôkaz a kvantifikácia nukleových kyselín sa môže napríklad uskutočňovať pomocou metódy PCR, ako sa popisuje v AT-PS 401 062 alebo priamou titráciou.

Ako miera inaktivácie je známy tak zvaný redukčný faktor, ktorý sa po jedinom pridaní testovaného vírusu vypočíta z dekadického logaritmu kvocientov počiatočného a konečného titru vírusu. Podľa európskej smernice EC 111/8115/89-EN Komisia európskeho spoločenstva je ďalej známy tak zvaný celkový redukčný faktor. Vypočíta sa zo súčtu redukčných faktorov jednotlivých subsekvenčných inaktivačných opatrení.

S výhodou sa uskutoční tiež ďalší nezávislý krok na inaktiváciu prípadne redukciu kontaminácie patogénmi. Tu prichádzajú do úvahy všetky podľa stavu techniky známe spôsoby na minimalizáciu infekčného rizika.

Obzvlášť sa ako ďalší krok na inaktiváciu prípadne redukciu kontaminácie uskutoční filtrácia a/alebo ošetrenie teplom.

Ako filtrácia sa s výhodou uskutoční nanofiltrácia. Výhodné ošetrenie teplom sa uskutoční na pevnom biologickom materiáli, napríklad na lyofilizáte s riadeným obsahom vody, napríklad obsahom vody medzi 5 a 8 % a teplote medzi 50 a 80 °C, ako sa popisuje v EP 0 159 311.

Pri jednej výhodnej forme uskutočnení sa uskutočňuje dvojstupňové ošetrenie sdetergentom ako chemickým prostriedkom. Pritom sa v prvom kroku použije detergent v množstve najmenej 1 %, s výhodou najmenej 5 %, najvýhodnejšie najmenej 10 %. V druhom stupni sa použije ďalší detergent v množstve najmenej 10 %, s výhodou najmenej 12 %,'najvýhodnejšie najmenej 14 %. Použitý detergent môže byť pre oba dva stupne rovnaký, môžu sa ale tiež použiť rozdielne detergenty. Celkom všeobecne možno kombináciou krokov na inaktiváciu vírusov silne redukovať prípadne vylúčiť riziko vírusovej infekcie po podaní príslušného preparátu.

Podľa predloženého vynálezu sa dáva k dispozícii tiež chromatograficky čistený prípravok, obsahujúci autodynamicky aktivovateľný krvný faktor s podielom aktivovaného krvného faktora menej než 50 %, vzťahujúc na obsah

31310/H aktivovaného a neaktivovaného krvného faktora, s výhodou menej než 40 %, výhodnejšie menej než 30 %, ešte výhodnejšie menej než 20 %, ešte viac výhodnejšie menej než 10 %, najvýhodnejšie menej než 1 %, a s obsahom detergentu.

Obzvlášť sa jedná o prípravok obsahujúci protrombínový komplex s aktivitou faktora Vila menej než 50 %, vzťahujúc na obsah aktivovaného a neaktivovaného faktora VII, s výhodou menej než 10 % a najvýhodnejšie menej než 1 %. Obsah detergentu v prípravku podľa vynálezu pritom zodpovedá farmaceutický prijateľnému množstvu, s výhodou medzi 1 % a hranicou dokázateľnosti detergentu.

Ako autodynamicky aktivovateľný krvný faktor sa podľa predloženého vynálezu rozumie krvný faktor, ktorý je aktivovateľný autokatalyticky, kontaktom na povrchu alebo pomocou procesu, ako napríklad chromatografického procesu. Obzvlášť je taký krvný faktor vybraný zo skupiny faktor VII, faktor XI a prekallikreín.

V ďalšej výhodnej forme uskutočnenia neobsahuje prípravok inhibítory serínproteázy, ako napríklad inhibítory trombínu, prípadne kofaktory, ako napríklad heparín. V špeciálnej forme uskutočnenia je neprítomnosť substancií tohto druhu daná už počas chromatografického procesu.

Preto sa predložený vynález týka tiež zodpovedajúcich prípravkov, ktoré sa môžu získať spôsobom podľa vynálezu.

V prípravkoch podľa vynálezu môžu byť obsiahnuté tiež ďalšie prísady, napríklad stabilizačné pôsobiace substancie ako aminokyseliny.

Nasledujúcimi príkladmi má byť predložený vynález ešte bližšie _f I vysvetlený, bez toho aby sa však na tieto príklady obmedzoval.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Ošetrenie aktivovaného protrombínového komplexu FEIBA detergentom v prítomnosti TWEEN®-80 mg DEAE-Sephadex® A-50 firmy Pharmacia sa po dobu 15 minút pri teplote miestnosti inkubuje na napučiavanie s 1 ml roztoku 30 g/l chloridu

31310/H sodného vo vode. Potom sa gél oddelí centrifugáciou od napučaného zvyšku. Následne sa päťkrát uskutoční premytie gélu vždy 1 ml pufru (9 g/l Na2HPO₄. 2H2O, 7 g/l NaCI, pH 7,0) a ďalšie dve premytia pufrom (7 g/l citrátu trojsodného . 2 H₂O, 7 g/l NaCI) a rovnako resuspendácia a centrifugácia.

ml čerstvo zamrazenej ľudskej citrátovej plazmy sa roztaví pri 0 až +4 °C a vzniknutý kryoprecipitát sa oddelí centrifugáciou pri teplote +2 °C. Vzniknutý „kryozvyšok“ sa inkubuje premytým DEAE-Sephadex®, pričom sa generuje FEIBA a spolu s faktormi protrombínového komplexu a inertným proteínom sa adsorbuje na gél. Potom sa koadsorbovaný inertný proteín odstráni z DEAE-gélu premytím pufrom (9 g/l Na2HPO₄.2H₂O, 7 g/l NaCI).

Gélový proteínový komplex vlhký pufrom sa teraz suspenduje s 1,5 ml roztoku 150 mg/ml TWEEN®-80 a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny pri teplote 26 °C. Ošetreným roztokom vyššieho iónového škrobu sa proteín spoločne s faktormi protrombínového komplexu a prípadne prítomnými patogénmi desorbuje. Následne sa suspenzia zriedi prídavkom 6,5 ml vody a jednu hodinu sa readsorbuje pri teplote miestnosti, pričom sa proteínová frakcia novo readsorbuje, zatiaľ čo zložky inaktivovaného patogénu zostávajú v roztoku spoločne s detergentom. Gél/proteínový komplex sa potom päťkrát premyje vždy 1 ml roztoku 7 g/l chloridu sodného vo vode do odstránenia detergentu.

Na elúciu sa gél spracuje za miešania s 0,7 ml roztoku 30 g/l chloridu sodného vo vode. Eluát sa potom dialyzuje proti destilovanej vode, zamrazí sa a lyofilizuje. Po rekonštitúcii lyofilizátu sa stanoví aktivita FEIB podľa AT-B 350 726.

Ako kontrola slúži rovnako vyrobený prípravok FEIBA, avšak bez ošetrenia detergentom.

Analýza získaného preparátu ukázala špecifickú aktivitu 3,2 E FElBA/mg proteínu pri obsahu proteínu 16,6 mg/ml po rekonštitúcii lyofilizátu a je porovnateľná s variantom spôsobu bez ošetrenia detergentom, keď bola dosiahnutá špecifická aktivita 2,8 E/mg proteínu pri koncentrácii proteínu 16,5 mg/ml.

31310/H

Príklad 2

Ošetrenie detergentom pri desorpcii FEIBA s predĺženou inkubačnou dobou

Analogicky ako v príklade 1 sa adsorbuje frakcia protrombínového komplexu na DEAE-Sephadex®, premyje sa do odstránenia inertného proteínu, následne sa desorbuje pomocou roztoku TWEEN®-80/chlorid sodný. Proteínová frakcia sa ale viac ako 2 až 3 hodiny udržuje v desorbovanom stave za inak zachovaných podmienok. Následne sa produkt spracuje na konečný produkt rovnakým spôsobom, aký sa popisuje v príklade 1.

Analýza tejto násady udáva špecifickú aktivitu 2,5 E FElBA/mg proteínu pri obsahu proteínu 16,6 mg/ml pri 2 hodinách inkubácie v prítomnosti TWEEN®-80 a špecifickú aktivitu 2,3 E FElBA/mg proteínu pri obsahu proteínu

17,4 mg/ml pri 3 hodinách inkubácie s detergentom.

Tým je možné ukázať, že ani predĺžená doba kontaktu s detergentom nie je spojená so žiadnou podstatnou inaktiváciou účinnej látky alebo redukciou výťažku.

Príklad 3

Ošetrenie FEIBA detergentom s reabsorpciou na iný gél

Feiba sa vyrobí rovnako, ako sa popisuje v príklade 1. Po ošetrení a desorpcii s detergentom sa získaný roztok prevedie do zásobníka, do ktorého bolo predložené 15 mg DEAE-Sephadex® A50 firmy Pharmacia, ktorý bol vopred inkubovaný v roztoku 30 g/l chloridu sodného do bobtnania a následne päťkrát premyť vždy 1 ml pufru (9 g/l Na2HPO₄, 2 H2O, 7 g/l NaCI, pH 7,0) a ďalej dvakrát premytý pufrom (7 g/l citrátu trojsodného . 2 H2O, 7 g/l NaCI) a vždy resuspendovaný a centrifugovaný. Po jednohodinovej absorpcii zriedeného proteínového komplexu na oddelenie detergentu sa uskutoční spracovanie spôsobom popísaným v príklade 1. Takto získaný konečný produkt má v porovnaní s FEIBA vyrobenou jednou zo štandardných variant, to znamená bez spracovávania s detergentom, výťažok 95 % a v špecifickej aktivite je porovnateľný.

31310/H

Príklad 4

Ošetrenie aktivovaného protrombínového komplexu FEIBA detergentom v prítomnosti TWEEN®-90 pri zvýšenej teplote.

mg DEAE-Sephadex® A-50 firmy Pharmacia sa po dobu 15 minút pri teplote miestnosti inkubuje na napučiavanie s 1 ml roztoku 30 g/l chloridu sodného vo vode. Potom sa gél oddelí centrifugáciou od napučaného zvyšku. Následne sa päťkrát uskutoční premytie gélu vždy 1 ml pufru (9 g/l Na₂HPO_4l 2 H₂O, 7 g/l NaCI, pH 7,0) a ďalšie dve premytia pufrom (7 g/l citrátu trojsodného . 2 H₂0,7 g/l NaCI) a rovnako resuspendácia a centrifugácia.

ml čerstvo zamrazenej ľudskej citrátovej plazmy sa roztaví pri 0 až + 4 °C a vzniknutý kryoprecipitát sa oddelí centrifugáciou pri teplote + 2 °C. Vzniknutý „kryozvyšok“ sa inkubuje premytým DEAE-Sephadex®, pričom sa generuje FEIBA a spolu s faktormi protrombínového komplexu a inertným proteínom sa adsorbuje na gél. Potom sa koadsorbovaný inertný proteín odstráni z DEAE-gélu premytím pufrom (9 g/l Na₂HPO₄.2H₂0,7 g/l NaCI).

Gélový proteínový komplex vlhký pufrom sa teraz suspenduje s 1,5 ml roztoku 1 mg/ml TWEEN®-80 a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, pričom sa proteínová frakcia a nešpecifické adsorbované nečistoty desorbujú. Následne sa gél oddelí filtráciou. Proteínový roztok sa teraz ďalším prídavkom TWEEN®-80 doplní na koncentráciu detergentu 150 mg/ml a následne sa inkubuje za miešania na inaktiváciu pripadne prítomných patogénov buď jednu hodinu pri teplote 26 °C alebo 1 hodinu pri teplote 40 °C. Následne sa zriedi prídavkom 6,5 ml vody a gél sa readsorbuje na pripravený čerstvo premytý DEAE-Sephadex® A-50. Následne sa päťkrát premyje vždy 1 ml roztoku 7 g/l chloridu sodného vo vode do odstránenia detergentu a nakoniec sa prípravok spracuje ďalej rovnako ako sa popisuje v príklade 1.

Analýza oboch variant ošetrenia pri 26 °C a pri 40 °C ukázala porovnateľnú špecifickú aktivitu prípravku FEIBA so štandardným variantom bez inaktivácie vírusu. Výťažky sú vždy 75 % štandardného variantu.

Príklad 5

Ošetrenie protrombínového komplexu FEIBA detergentom v prítomnosti

31310/H

TWEEN®-80 (toho času podľa názoru prihľašovateľky najlepšia cesta na uskutočnenie vynálezu) ml čerstvo zmrazenej ľudskej citrátovej plazmy sa roztaví pri 0 až +4 °C a vzniknutý kryoprecipitát sa oddelí centrifugáciou pri teplote + 2 °C. Vzniknutý „kryozvyšok sa zmieša s 2 IE heparínu/ml. Potom sa proteiny protrombínového komplexu adsorbujú pomocou DEAE-Sephadex® A-50 firmy Pharmacia v koncentrácii 0,5 mg/ml. Gél-proteínový komplex sa oddelí z roztoku a premyje sa pufrom 1 (4 g/l citrátu trojsodného . 2H₂O, 7 g/l NaCl, 9 g/l Na₂HPO₄ . 2H₂O, 500 IE heparín/1, pH 7,5) a následne pufrom 2 (4 g/l citrátu trojsodného . 2H₂O, 7 g/l NaCl, 500 IE heparín/l, pH 7,5).

Premytý gél sa teraz suspenduje na inaktiváciu patogénov s 1,5 ml roztoku obsahujúceho 150 mg TWEEN® -80/ml a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny pri teplote 26 °C. Týmto ošetrením sa proteínová frakcia spoločne s prípadne prítomnými patogénmi alebo fragmentárni patogénov desorbuje a v priebehu inkubácie sdetergentom sa patogény inaktivujú. Následne sa suspenzia rovnako ako v príklade 1 zriedi prídavkom 6 ml vody a jednu hodinu sa proteínová frakcia i s účinnými látkami readsorbuje pri teplote miestnosti na iónomeničovej matrici. Následne sa päťkrát premyje vždy 1 ml pufru (4 g/l citrátu trojsodného . 2 H₂O, 7 g/l NaCl, 500 IE heparín/l, pH 7,5) do odstránenia detergentu a eluuje sa roztokom 1 g/l citrátu trojsodného . 2 H₂O, 30 g/l NaCl, 1000 IE heparínu, pH 7,0. Do eluátu sa pridá 1 IE heparínu/ml. Roztok obsahujúci protrombínový komplex sa prepufruje proti pufru obsahujúcemu 4 g/l citrátu trojsodného . 2 H₂O, 8 g/l NaCl, pH 7,0 a lyofilizuje sa. V rekonštruovanom lyofilizovanom protrombínovom komplexe sa testuje obsah proteinu a obsah komplexných faktorov protrombínu; výsledky sú uvedené v Tabuľke 1.

Ako kontrola sa vyrobí násada bez ošetrenia pomocou TWEEN®. Výsledky analýzy sú uvedené rovnako v Tabuľke 1.

Tabuľka 1

Porovnanie aktivít faktorov protrombínového komplexu po uskutočnení spôsobu podľa vynálezu a bez tohto spôsobu

31310/H

Zloženie	Kontrola	Prípravok podľa vynálezu
Proteín (mg/1)	14,7	14,4
Protrombín (E/ml)	22,1	19,7
Faktor VII (E/ml)	0,9	1,0
Faktor IX (E/ml)	21,0	22,2
Faktor X (E/ml)	23,2	22,1
Proteín C (E/ml)	26,5	27,9

Ukazuje sa, že ošetrením detergentom nedošlo k žiadnej podstatnej zmene zloženia protrombínového komplexu.

Príklad 6

Ošetrenie detergentom faktoru VII TWEEN®-80 v porovnaní s inaktiváciou vírusu faktora VI konvenčným spôsobom

Z humánnej citrátovej plazmy sa oddelia frakcie protrombínového komplexu obsahujúce zrážacie faktory prothrombínu, nepatrné podiely faktora Vil, faktora IX a faktora X, ako sa popisujú v príklade 5. Väčšia časť zrážacieho faktora VII zostávajúceho vo zvyšku po adsorpcii na DEAE-Sephadex® A50 sa teraz získa adsorpciou na hydroxide hlinitom. Do toho sa na 1 I zvyšku po oddelení protrombínového komplexu pridá 10 ml 2 % suspenzie hlinitého hydrogélu a mieša sa po dobu 30 minút pri teplote 4 °C. Následne sa centrifugáciou pri 5000 ot/minúta pri teplote asi 4 °C pomocou Sorvall RC3B Rotor H6000A oddelí komplex hydroxid hlinitý-protein, zvyšok sa odoberie a zrazenina sa suspenduje a po dobu 30 minút mieša 3,5 % objemu zvyšku protrombínového komplexu použitého na adsorpciu v roztoku 4 g/l citrátu trojsodného . 2 H₂O, 7 g/l NaCI, pH 7,5. Tým sa desorbuje inertný proteín z hydroxidu hlinitého. Faktor VII zvyšný na hydroxide hlinitom sa peletuje opätovnou centrifugáciou rovnako, ako sa popisuje vyššie. Zvyšok sa odoberie a zrazenina sa znovu použije na ďalšie spracovanie. Na desorpciu proteínovej frakcie sa komplex hydroxid hlinitý-faktor VII mieša po dobu 30 minút s 1 objemovým % zvyšku protrombínového komplexu použitého na adsorpciu 0,3

31310/H mol/l fosfátového pufru, pH 8,6 (53,4 g Na2HPO₄.2 H2O/I sa roztokom 41,1 g NaH₂PO₄ . H2O/I nastaví na pH 8,6) obsahujúceho 1 % TWEEN®-80. Následne sa na inaktiváciu patogénov pridá detergent TWEEN®-80 na konečnú koncentráciu 15 % a ďalej sa mieša 1 hodinu pri teplote 40 °C. Potom sa roztok ochladí na asi 22 °C a zriedi sa 9 dielmi destilovanej vody. Frakcia faktora Vli sa potom readsorbuje na 1 g/l DEAE-Sephadexd® A50 za miešania po dobu 1 hodiny pri teplote asi 11 °C. Následne sa na sintrovej nuči trojnásobne premyje komplex gél-proteín vždy 100 ml na liter zriedeného roztoku TWEEN®-80 spufrom obsahujúcim 4 g/l citrátu trojsodného. 2H₂O, 7 g/l NaCi, pH 7,5, obsahujúceho 500 IE heparínu/1 až do neprítomnosti detergentu. Elucia frakcie faktoru Vil sa uskutoční miešaním proteínového komplexu ionomeniča a 100 ml/l zriedeného roztoku TWEEN®-80 obsahujúceho roztok 85 g NaCI/l po dobu 30 minút pri teplote 22 °C. V eluáte sa následne kvantitatívne stanovuje obsah faktora Vil chromogénnym testom na faktore VII (Imunochrom-Faktor VII:C, Immuno AG, Wien, merané proti medzinárodnému štandardu protrombínového komplexu), obsah proteínu metódou podľa Bradforda [Anal.Biochem. 72:248254 (1976)] a faktora Vila metódou podľa US 683 682 (merané proti medzinárodnému štandardu faktora Vila). Výsledky uvádza Tabuľka 2.

Na porovnanie sa faktor VII oddelí abdsorpciou na hydroxide hlinitom ako sa popisuje vyššie, od ostatných proteínov protrombínového komplexu a v adsorbovanom stave sa ošetrí podľa EP 0 197 554 agendami inaktivujúcimi víry z EP 0 131 740 s TWEEN®-80 a tri-(N-butyl)-fosfátom (TNBP). K tomu sa komplex alhydrogel-proteín mieša vo vodnom roztoku 1 % TWEEN®-80 a 0,3 tri-(N-butyl)-fosfátu po dobu 18 hodín pri teplote 4 ’C s objemom 50 ml/l zvyšku protrombínového komplexu. Následne sa centrifuguje na oddelenie komplexu hydroxid hlinitý-proteín ako sa popisuje vyššie a premytím 3 x 100 ml roztoku 4 g/l citrátu trojsodného . 2 H2O, 7 g/l NaCi, pH 7,5 sa resuspendáciou zbaví prebytočného TWEEN® -80 a tri-(N-butyl)-fosfátu. Medzi každým premytím sa uskutočňuje peletizácia komplexu hydroxid hlinitý-proteín centrifugáciou. Elúcia sa uskutočňuje za rovnakých podmienok ako v prípade paralelnej násady spôsobom podľa vynálezu. Analogicky sa uskutočňujú rovnako analýzy konečného produktu. Výsledky uvádza Tabuľka 2.

31310/H

Tabuľka 2

Aktivity faktora Vila po uskutočnení spôsobu podľa vynálezu a po uskutočnení spôsobu podľa EP 0 197 554

Zloženie	Prípravok podľa vynálezu	Prípravok podľa EP 0 197 554/EP 0 131 740
Aktivita F VII (E/ml)	3,2	3.8
Koncentrácia proteínu (mg/ml)	0,2	0,5
Špecifická aktivita (E/mg)	15,2	7,6
Aktivita faktora Vila
(E/ml)	2,7	11,9
(VllaA/ll)	0,84	3,13

Ukazuje sa, že pri použití tohto spôsobu bol obsah faktora Vila v porovnaní so spôsobom podľa vynálezu výrazne vyšší, pričom cez komplexné ošetrenie faktora VII sa nezistila žiadna aktivácia. Okrem toho bola pri spôsobe podľa vynálezu špecifická aktivita získaného produktu vyššia než u porovnávacieho prípravku.

Príklad 7

Semikvantitatívne stanovenie G-vírusu Hepatitis

Z násad pre inaktiváciu patogénov príkladov 1 až 6 boli vždy odoberané vzorky východiskových materiálov, zvyšok po kryoprecipitácii alebo absorpčný zvyšok po oddelení faktorov zrážanlivosti I, IX a X a rovnako zodpovedajúce vyčistené a koncentrované preparáty faktorov zrážanlivosti. 0,5 ml týchto vzoriek sa zriedi 1 + 1 fyziologickým pufrom fosfát-kuchynská soľ a prípadne sa vyskytujúce vírusy sa peletujú ultracentrifugáciou. RNA sa zvirálnych peliet extrahuje metódou RNAzol-Reagens (BIOTECX, Houston, Texas) a rozpustí sa v sterilnej destilovanej vode.

RT-PCR na G-vírus Hepatitis (HGV) nukleových kyselín sa uskutočňuje primérnymi pármi NS5a 1 a NS5a 2 (Linnen, J. a spol., Science 271: 505 - 508 (1996). Sekvencia použitých primerov (získaných od Boehringer Mannheim,

31310/H

Nemecko je pre NS5a 1 : 5 CTCTTTGTGGTAGTAGCCGAGAGAT 3 a pre NS5a 2 5 CGAATGAGTCAGAGGACGGGGTAT 3. Primer sa označí fluorescenčným farbivom a rutinnými postupmi z ktorého získané obvyklé PCRprotokoly fluoreskujúcich amplikónov sa analyzujú na sekvenceri ABI-377 firmy Applied Biosystems. Aby bolo možné vylúčiť prítomnosť RT-PCR-inhibítorov vo vzorkách, boli vzorky dopované C-vírusom-RNA-Mimics Hepatitis a v jednej uskutočnenej Hepatitis C-PCR analyzované podľa EP 0 714 988. Ako vhodné extrakty výhodnotiteľné pre HGV-PCR boli odobrané výhradne extrakty, ktoré nevykazujú žiadnu inhibíciu v HCV-PCR- Ako mierka G-vírusu Hepatitis bola vzatá intenzita fluorescencie. Ukazuje sa, že východiskové materiály použité na frakcionáciu pred inaktiváciou patogénov spôsobom podľa vynálezu vykazujú silne pozitívne signály, to znamená vysokú koncentráciu HGV-amplifikátov nukleových kyselín, zatiaľ čo veluátoch po readsorpcii a oddelení agencií inaktivujúcich vírusy neboli HGV-RNA preukázateľné.

Pri paralelných pokusoch bez uskutočneného ošetrenia detergentami, boli eluáty ako použité východiskové materiály HGV-PCR pozitívne.

Claims

1. Spôsob inaktivácie patogénov, obzvlášť vírusov, v biologickom materiáli inkubáciou s chemickým prostriedkom, vyznačujúci sa tým, že sa inkubácia uskutočňuje v prítomnosti eluotrópnej soli zodpovedajúcej koncentrácii chloridu sodného najmenej 200 mmol/l, s výhodou najmenej 300 mmol/l.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa ako chemický prostriedok použije detergent, ktorý je s výhodou obsiahnutý v množstve najmenej 1 %, výhodnejšie viac ako 5 % a najvýhodnejšie viac ako 10 %.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa ako eluotrópna soľ použije chlorid sodný.

4. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa inkubácia uskutočňuje po dobu medzi 10 minút a 10 hodín, najvýhodnejšie medzi 1 hodinou a 5 hodinami.

5. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa ako biologicky materiál použije plazma alebo frakcia plazmy alebo materiál bunkovej kultúry.

6. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa použije biologický materiál, ktorý obsahuje krvný faktor, obzvlášť proteín závislý od vitamínu K.

7. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že sa použije biologický materiál, ktorý je frakciou obsahujúcou protrombínový * » komplex.

8. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že sa biologický materiál adsorbuje na pevnom nosiči, čistí sa a inkubácia sa uskutočňuje po elúcii vyčisteného materiálu.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa elúcia a inkubácia uskutočňuje zároveň.

10. Spôsob podľa nároku 8 alebo 9, vyznačujúci sa tým, že sa ako pevný nosič použije chromatografický materiál, obzvlášť materiál vhodný na

31310/H iónomeničovú chromatografiu alebo afmitnú chromatografiu.

11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú ďalšie kroky na čistenie materiálu, obzvlášť čistenie chromatografiou.

12. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje ďalší krok na inaktiváciu prípadne zníženie kontaminácie patogénov, obzvlášť filtrácia alebo ošetrenie teplom.

13. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že ako chemický prostriedok použije neiónový detergent vybraný zo skupiny Tween a Triton.

14. Chromatograficky čistený prípravok, obsahujúci autodynamicky aktivovateľný krvný faktor s podielom menej než 50 %, vzťahujúc na obsah aktivovaného a neaktivovaného krvného faktora, s výhodou menej než 40 %, výhodnejšie menej než 30 %, ešte výhodnejšie menej než 20 %, ešte viac výhodnejšie menej než 10 %, najvýhodnejšie menej než 1 %, a s obsahom detergentu.

15. Prípravok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že krvný faktor sa vyberie zo skupiny faktor VII, faktor VII, faktor XI a pre-kallikreín.

16. Prípravok podľa niektorého z nárokov 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že obsahuje protrombínový komplex s aktivitou faktora Vila menej než 50 %, vzťahujúc na obsah aktivovaného a neaktivovaného faktora VII, s výhodou menej než 10 % a najvýhodnejšie menej než 1 %.

17. Prípravok podľa niektorého z nárokov 14 až 15, vyznačujúci sa tým, že prípravok neobsahuje inhibítory serínproteázy prípadne jej kofaktory.

18. Prípravok podľa niektorého z nárokov 14 až 17, ktorý sa pripraví spôsobom podľa niektorého z nárokov 1 až 13.