SK130295A3

SK130295A3 - Oxotocin antagonist

Info

Publication number: SK130295A3
Application number: SK1302-95A
Authority: SK
Inventors: George Flouret; Laird Wilson
Original assignee: Univ Northwestern
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1996-02-07
Also published as: FI953646A; ZA941160B; CN1121709A; AU6663094A; IL108685A; CN1041634C; IL108685A0; NO954260L; KR960701897A; BR9405914A; PL177055B1; EP0695309A1; HUT74945A; BR1101113A; DE69419910T2; ATE182898T1; GR3031432T3; ES2134351T3; RU2120944C1; NO954260D0

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka novej zlúčeniny, ktorá je vysoko aktívna ako oxytocínový antagonista a ktorá vykazuje slabý antagonizmus pre vazopresín.

Doterajší stav techniky predčasného s výraznými

Predčasný pôrod je hlavnou príčinou prenatálnej morbidity a mortality v Spojených štátoch. Súčasné metódy inhibície pôrodu nie sú vždy úspešné a sú často spojené vedíajšími účinkami. Pretože maternica je cieľový orgán pre oxytocín, a pretože oxytocín sa považuje za dôležitý faktor, pôsobiaci pri predčasnom pôrode, mohol by vývoj potentného oxytocínového antagonistu viesť k úspešnej inhibícii predčasného pôrodu s malými vedľajšími účinkami.

Štruktúrne sú oxytocín (OT) a antidiuretický hormón (ADH), tiež nazývané vazopresín, podobné. Ich štruktúry sú kvôli porovnaniu uvedené ďalej:

2 3 4 5 6 7 89

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂

I I s-s

OXYTOCÍN (OT)

123456789

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂

I I s-s

VAZOPRESÍN (ADH)

V literatúre sú uvádzané rôzne informácie o syntéze antagonistov ADH na použitie pri liečení hypertenzie a syntéze antagonistov oxytocínu. V 1960, Law H. D. a V. DuVigneaud, J. Am. Chem. Soc., 82, 4579, popísali prvú syntézu oxytocínového antagonistu (2-0-metyltyrozín-0T). V roku 1967, Chán, Fear a DuVigneaud, Endocrinology,. 81, 1267 popísali syntézu 1-Lpenicilamín-oxytocínu a 1-deaminopenicilamín-oxytocínu. Toto bola prvá štúdia pre preukázanie in vivo inhibičného účinku oxytocínového antagonistu na maternicové sťahy a odpoveď na oxytocín u anestetizovaných krýs.

V roku 1980, Sawyer a spol., Endocrinology, 106: 81 popísali syntézu oxytocínového antagonistu, ktorá spája dva dôležité rysy antagonistu Lawa a DuVigneauda a antagonistov podlá Chana a spol. Nový antagonista bol (1-deamino-penicilamín, 2-0-metyltyrozín) oxytocín. Nový antagonista má pA₂ 7,8 ako bolo stanovené oxytocickou bioskúškou. pA₂ je negatívny logaritmus molárnej koncentrácie antagonistu, ktorý redukuje odpoveď na antagonistu o 1/2. Toto je definované Schildom, British J. Pharmacology, 2, 189 (1947).

V roku 1983, Manning a spol., J. Med. Chem., 26: 1607 - 161 popisuje syntézu mnohých antagonistov ADH. Zdá sa, že jeden z týchto antagonistov má potenciálnu antioxytocínovú aktivitu [ β,p-pentametylén-p-merkaptopropiónová kyselina¹, D-Phe²,Ile⁴] arginínvazopresín s pA₂ 8,2 alebo inak povedané, 2,5 krát potentnejšiu ako antagonista popísaný Sawyerom a spol., v roku 1980 (pozri str. 1610, tabuľka I, zlúčenina č. 1). Tento oxytocínový antagonista môže byt nazvaný [Pmp^x,D-Phe ,Phe ,Ile , Arg⁸] oxytocín. Príbuzný oxytocínový antagonista [Pmp¹,D-Trp², Phe³,íle⁴, Arg⁸] oxytocín bol popísaný Wilsonom a Flouretom, Abstract for Society for the Study of Reproduction Meeting, July 14 - 17, 1986.

V roku 1981, Melin a spol., Endocrinology, 88, 173, vyvinuli oxytocín antagonistu pre inhibíciu predčasného pôrodu. Syntetizovali 1-deamino, etyloxytocín, ktorý mal pA₂ 7,2. Tiež preukázali, že táto zlúčenina inhibuje maternicové stahy u krýs in vivo a u ludí in vitro a in vivo (Akerland a spol., Obstet. and Gynecol. 62, 309, 1983). V roku 1985 Akerland a spol., Obstet. and Gynecol. Scand., 64, 499, popísali syntézu 1-deamino [D-Tyr(OEt)², Thr⁴, Orn⁸] vazopresínu s pA₂ 8,3. Túto zlúčeninu testovali in vitro na tkanive ludskej maternice a preukázali, že inhibuje maternocové sťahy.

US patent č. 4597901 popisuje triedu vazopresín antagonistov, v ktorých cysteín-1 je prítomný ako v oxytocíne, tak vazopresíne a je nahradený kyselinou β,β-cyklopentametylénβ-merkaptopropiónovou.

Iné aminokyseliny vazopresínu sú substituované. Výsledná trieda zlúčenín sú vazopresín antagonisti s biologickou aktivitou manifestovanou vodnou diurézou.

Podstata vynálezu

Predložený vynález zahrňuje oxytocínového antagonistu, ktorý je analógom oxytocínu. V zlúčenine podlá vynálezu je cysteín-1 oxytocínu nahradený kyselinou β,β-(3-tiapentametylén)-βmerkaptopropiónovou. Naviac je L-tyrozín-2 nahradený D-tryptofánom a penicilamín nahrádza 1-cysteín v polohe 6 a L-arginín nahrádza v polohe 8 L-leucín. Výsledná zlúčenina [(S) Pmp¹,D-Trp², Pen⁶,Arg⁸joxytocín je pokladaná za novú a boli u nej nájdené významné vlastnosti. Je vysoko aktívnym oxytocínovým antagonistom. Súčasne, i keď je štruktúrne podobná vazopresínu a vazopresínovým antagonistom popísaným v literatúre, vykazuje nová zlúčenina minimálny ADH antagonizmus. Ak sa tieto dva antagonizmy vyjadria ako pomer, má zlúčenina pódia vynálezu velmi vysoký pomer anti-oxytocín/anti-ADH aktivity. Táto kombinácia vlastností je vysoko výhodná pre terapeutické použitie. Účinné anti-oxytocínové pôsobenie môže byť dosiahnuté s minimálnymi anti-ADH vedlajšími účinkami. Zlúčenina podlá predloženého vynálezu je preto vhodná na inhibíciu sťahov maternicového svalu v odpovedi na telesný oxytocín a môže byť použitá na potlačenie predčasného pôrodu.

Oxytocínový antagonista podľa predloženého vynálezu má vzorec

23456789 (S)Pmp-D-Trp-Ile-Gln-Asn-Pen-Pro-Arg-Gly-NH₂

I -I s-s kde Pmp je kyselina β,β-(3-tiapentametylén)-βmerkaptopropiónová, D-Trp je D forma tryptofánu a íle, Gin, Asn, Pen (Pen = penicilamín), Pro, Arg sú L formy izoleucínu, glutamínu, asparagínu, prolínu a arginínu.

Významné vlastnosti novej zlúčeniny podľa vynálezu sú preukázané biostúdiami, ktoré budú popísané ďalej.

Oxytocínová bioštúdia

Protokol použitý pre postup pre oxytocínovú bioštúdiu je odvodený od postupov popísaných v článku Sawyera a spol., Endocrinology, 106, 81 (1980), ktorý je naopak založený na publikáciách Munsicka, Brit. J. Pharmacol., 3, 328 (1960) a Holtona, Brit. J. Pharmacol., 3, 328 (1948). Výpočty pK₂ boli popísané Schildom, British J. Pharmacology, 2, 189 (1947). Hlavný rozdiel v postupe podľa vynálezu od postupov popísaných je ten, že plocha pod kontrakciou je integrovaná, zatiaľ čo väčšina iných techník vypočítava amplitúdu. Integrácia poskytuje ovela konzistentnejsie a spoľahlivejšie výsledky, hoci pK₂ hodnoty sú približne rádovo nižšie ako tie, ktoré sú uvádzané za použitia amplitúdy kontrakcie ako konečného bodu.

Metóda:

1. Na skúšku sa použijú 1,5 cm kúsky zvieracej maternice z nedotknutých krýs (Holtzman) v prirodzenom estre.

2. Pufor/kúpel pre štúdiu: Použitý pufor je Munsinks. Tento pufor obsahuje 0,5 mM Mg⁺⁺, ktorý znižuje pA₂ hodnotenie, ale výsledky sú uvedené kvôli lepšej korelácii s in vivo dátami (Sawyer a spol., 1980). Pufor je plynovaný kontinuálne 95 % kyslíka, 5 % oxidu uhličitého, čo poskytuje pH 7,4. Teplota kúpela pre štúdiu je 37 C. Pre štúdiu sa použije 10 ml kúpe!, ktorý obsahuje vodný plášť na udržanie teploty a výstupné a vstupné hroty na prívod a odstránenie pufra.

3. Polygraf/prevádzač: Kúsky deložného tkaniva použité v štúdii sa na jednom konci ukotvia a napoja na zariadenie Statham Strain Gauge Force Transducer na opačnom konci, ktorý je naopak pripojený k zariadeniu Grass Polygraph Model 79 na sledovanie sťahov.

4. Štúdiový protokol:

(a) Tkanivo sa ekvilibruje v kúpeli pre štúdiu na jednu hodinu s premývaním novým pufrom každých pätnásť minút. Po celú dobu je tkanivo zaťažené zaťažením 1 gram.

(b) Tkanivo sa na začiatku stimuluje oxytocínom pri 10 nM kvôli aklimatizácii tkaniva a so 4 mM KC1 kvôli stanoveniu maximálnej sťahovej odozvy.

(c) Krivka odozvy kumulatívnej dávky je potom poskytnutá s oxytocínom a koncentrácia oxytocínu rovná približne 80 % sa použije na hodnotenie pA₂ antagonistu.

(d) Tkanivo sa vystaví oxytocínu (Calbiochemical, San Diego, Kalifornia) na jednu minútu a premyje sa. Pred prídavkom ďalšej dávky agonistu alebo antagonistu sa dodržiava trojminútový interval. Ak je testovaný antagonista, podá sa tento päť minút pred agonistom. Agonista sa podáva jednu minútu. Všetky odozvy sú integrované za použitia zariadenia 7P10 Grass Integrátor. Toto je hlavný rozdiel medzi predloženým protokolom a inými protokolmi známymi z literatúry, ktoré zvyčajne merajú amplitúdu sťahov ako odozvu. Jedna koncentrácia oxytocínu, rovnajúca sa 80 % maximálnej odozvy, sa použije pre test antagonistu. Použijú sa tri rôzne koncentrácie antagonistu, dve, ktoré budú redukovať odozvu na antagonistu menšiu ako 50 % a jedna, ktorá bude redukovať odozvu väčšiu ako 50 % (ideálny by bol tento vzťah 25%, 50 % a 75 %). Toto sa opakuje trikrát pre každú dávku antagonistu po tri štúdie.

(e) Výpočty pA₂: Pomery dávka - odozva (DR) sa vypočítajú pre antagonistu a zobrazí sa Schildov graf vynesením log (DR-1) proti log koncentrácie antagonistu. Vynesená krivka sa vypočíta pomocou štvorcovej regresnej analýzy, pA₂ je koncentrácia antagonistu v bode, kde regresná čiara pretína 0 bod log (DR-1) súradnice. pA₂ je prevrátený log koncentrácie antagonistu, ktorá bude znižovať odozvu na agonistu na polovicu.

Ako analóg oxytocínu môže byt nová zlúčenina podľa vynálezu nazvaná ako [(SjPmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]oxytocín. Ak zlúčenina bola testovaná vo vyššie popísanej štúdii na kompetitívny antagonizmus s oxytocínom, bola ako priemer z desiatich skúšok hodnota pA₂zistená ako väčšia než 8,86.

ADH-bioštúdie

Vyššie uvedená zlúčenina bola tiež testovaná na antagonizmus k vazopresínu. Anti-ADH aktivita mohla byť stanovená meraním zmeny v maternicovom výstupe spôsobenej ADH za prítomnosti a neprítomnosti antagonistu. Vhodná ADH-štúdia je popísaná v práci Sawyera a spol., Endocrinology, 63, 694 (1958). Pri teste touto metódou bolo zistené, že zlúčenina [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]oxytocín vykazuje veľmi nízku aktivitu ako antagonista vazopresínu. Pomer oxytocínového antagonizmu k ADH antagonizmu bol veľmi vysoký, nad 1866 v porovnaní s 200 pre kompozície popísané v rodičovských prihláškach.

Pre svoju oxytocín antagonistickú aktivitu s minimálnym vazopresín antagonizmom zlúčenina podľa vynálezu bude vhodná na liečenie symptómov, vyžadujúcich oxytocín antagonistu u ľudí a zvierat. Môže byť použitá na inhibíciu maternicových sťahov a straty mlieka, ako i na inhibíciu predčasného pôrodu. I keď štruktúra zlúčeniny je zložená ako z oxytocínu, tak vazopresínu, vykazuje nielen zvýšenú anti-oxytocínovú aktivitu, ale tiež silne zvýšenú anti-ADH aktivitu. Táto zlúčenina by tiež mohla byť použitá na inhibíciu dysmenorrhey alebo slúžiť ako ántidotum pri nadmernej stimulácii maternicových sťahov počas vyvolania pôrodu oxytocínom alebo na liečenie hypertenzie.

Zlúčenina podľa vynálezu môže byť podávaná ženám rôznymi známymi spôsobmi podania. Pre nemocničné použitie bude vhodným spôsobom podania intravenózna infúzia. Avšak môže byť zlúčenina tiež podávaná intraperitoneálne, subkutánne alebo intramuskulárne. Orálne podanie môže byt tiež uskutočniteľné. Ak je to žiaduce, môžu byt tabletky alebo kapsule poskytnuté s enterickým poťahom, chrániacim zlúčeninu pred deštrukciou v žalúdku a umožňujúcim jej uvoľnenie v intestinálnom trakte. Sublinguálne podanie poskytnutím vhodnej dávky tejto zlúčeniny v tabletkovaných triturátoch umiestnených pod jazyk môže byt tiež uskutočniteľné. Toto je spôsob, ktorým sa podáva hormón oxytocín na vyvolanie straty mlieka z pŕs laktujúcej matky.

V tejto liečbe sa používa účinné, ale netoxické množstvo zlúčeniny. Dávkový režim pre ochranné alebo liečebné symptómy pre zlúčeninu podľa vynálezu je vybraný podľa mnohých rôznych faktorov, zahrňujúcich typ, vek, hmotnosť, pohlavie a medikálny stav ženy, vážnosť symptómov a spôsob podania zlúčeniny. Ošetrujúci lekár stanoví a predpíše účinné množstvo oxytocín antagonistu podľa spôsobu podania na prevenciu alebo zastavenie stavu, ktorý je inhibovaný. Napríklad sa rozmedzie účinnej dávky pohybuje od 0,01 do 100 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti na deň pri podaní intravenóznym spôsobom, v sterilnom normálnom salinickom roztoku.

Zlúčenina podľa vynálezu môže byť pripravená novou metódou.

Náhrada tryptofánu v peptidoch musela byť vylúčená, pretože Trp-peptidy sú citlivé ku kyselinám. Bodanzsky a spol., J. Med. Chem., 23, 1258 - 1261 (1980) a Sawyer a spol., Endocrinology,

106, 81 (1980) vyrobili [Trp⁸Joxytocín oveľa ťažšími nepriamymi metódami, za účelom vylúčenia spracovania Trp-peptidu v kyslom prostredí. Spôsoby popísané v US prihláškach č. 07/289780 a 07/433644 sú tu zahrnuté ako referencie.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad I

Syntéza [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁶ Joxytocínu

Syntéza derivátov kyseliny β-merkaptopropiónovej

Tetrahydrotiopyrán-4-ón sa nechá reagovať s trietylfosfonoacetátom metódou popísanou Wadsworthom a Emmonsom (Wadsworth W.S. Jr., Emmons W.D. (1971) v Organic Synthesis (Baumgarten, H. vyd.) Col. Vol. V., str. 547 - 549, John Wiley and Sons, NY) za poskytnutia etyl-4-tetrahydrotiopyranylidén (TPE) acetátu. Michaelovou adíciou 4-metylbenzylmerkaptánu metódou podlá Yima a Huffmana (Yim, N.C.F. a Huffman W.F. (1983) Int. J. Pept. Prot. Res. 21, 568 - 570) a zmydelnením sa získa tetrahydrotiopyranyl-4-(4-metyl-benzyltio)-4-octová kyselina alebo (S)Pmp(S-Meb). Pozri obr. 1.

Používané skratky plne zodpovedajú odporučeniam IUPAC - IUB Commission on Biochemical Nomenclature (J. Bio. Chem. 264, 688

- 673 (1989)). Ak nie je uvedené, sú aminokyseliny v L-konfigurácii. Iné použité skratky sú:

OT : oxytocín;

Pmp : β , β-ρθηύ3ΐηθύγ1έη-β-ΐΐΐθ^3ρύορΓορίόηονό kyselina, (S)Pmp : β,β-(3-tiapentapentametylén)-β-merkaptopropiónová kyselina Bo : terc. butoxykarbonyl,

Meb : 4-metylbenzyl,

Tos : p-toluén-sulfonyl,

ΟΝρ : 4-nitrofenyl ester,

DCM : dichlórmetán,

TFA : kyselina trifluóroctová,

EtOH : etanol,

DIEA : diizopropyletylamín,

DMF : Dimetylformamid,

DCC : dicyklohexylkarbodiimid,

HOBt : l-hydroxybenzotriazol,

MeOH : metanol,

CHL : chloroform,

Ac₂O : acetanhydrid,

TEA : trietylamín,

MeCN : acetonitril,

BuOH : n-butanol,

AcOH : kyselina octová,

Pyr : pyridín,

Et20 : etyléter,

HPLC : vysokotlaková kvapalinová chromatografia, TLC : chromatografia na tenkej vrstve,

PITC : fenylizotiokyanát,

PTC : fenyltiokarbamyl,

UV : ultrafialový,

OR : optická otáčavosť.

Syntéza peptidu

Všetky chránené prekurzory antagonistov boli syntetizované manuálne metódou v pevnej fáze (SP - solid phase) (Merrifield R.B. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 - 2154). Nasledovala Boe

- aminokyselinová stratégia syntézy (Stewart J.

(1984) v Solid Phase Peptide Synthesis, str.

Chemical Co., Rockford, IL). Všetky polohy 1 tiolovú skupinu chránenú 4-metylbenzylovou kondenzácia bola sledovaná pomocou ninhydrinového testu (Kaiser

E., Colescot R.L., Bossinger C.D. a Cook P.I. (1970) Anál. Biochem. 34, 595 - 598). Chránené peptidy boli zo živice odstránené amonolýzou (Manning M. (1968) J. Am. Chem. Soc. 90,

M. a Yuong J. D. 1 - 176, Pierce analógu PmP mali skupinou. Úplná

1348 - 1349). Chránené peptidy boli zbavené chrániacich skupín na funkciách bočného reťazca redukciou pomocou Na/kvapalný amoniak (DuVigneaud V., Ressler C., Swan J.M., Roberts C.W., Katsoyannis

Chem. Soc. 75, 4879 S. a Shinonishi Y. - 1413) a boli

4880) alebo 1965) Bull. cyklizované

P.G. a Gordon S. (1953) J. Am. kap. HF-anizolom (Sekakibara Chem. Soc. Jpn. 38, 1412 disulfyhydropeptidy vo velmi zriedenom roztoku (Manning M., Lammek B. a Kolodziejczyk A.M. (1981) J. Med. Chem. 24, 701 - 706) na cyklické disulfidy oxidáciou hexakyanoželezitanom draselným (Hope D.B., Murti V.V.S. a DuVigneaud V. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1563 - 1566). Volné peptidy boli zbavené malých množstiev vedľajších produktov a solí gelovou filtráciou (Porath J. a Flodin P. (1959) Náture (Londýn) 183, 1657 - 1659) na Sephadexe G-15 (Manning M., Wuu T.C. a Baxter J.W.M. (1968), J. Chromatogr. 38, 396 - 398) a preparatívnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) (Flouret G., Brieher W., Mahana K. a Wilson L. Jr. (1991), J. Med. Chem. 34, 642 - 646). bola sledovaná analýzy (Bidlingmeier

Synthesis str. 1 - 176, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Pre aminokyselinovú analýzu boli analógy hydrolyzované 6N HCI po 24 hod. pri 110 °C a výsledné aminokyselinové zložky boli derivatizované fenylizotiokyanátom a analyzované metódou Waters Associates Picotag (za použitia Waters Picotag setu ako je uvedené vyššie (Flouret G., Brieher W., Mahan K. a Wilson L. Jr. (1991), J. Med. Chem. 34, 642 - 646). Optické otáčavosti boli merané pomocou zariadenia Rudolph Polarimeter (presnosť ± 0,01°).

Čistota peptidu a aminokyselinovéj pomocou

TLC,

HPLC v Solid Phase Peptidy

Syntéza chránených peptidov v pevnej fáze

Boe - aminokyseliny boli použité na syntézu a na ochranu funkčných skupín vedľajšieho reťazca, Boc-Arg(Tos), Boc-Pen(Meb) a (S)Pmp(Meb). Bola použitá Boc-Gly-živica (0,7 mmól Boc-Gly/g), ktorá bola pripravená na 200 až 400 mesh chlórmetylovanej živice (BioRad), 1 % zosietovania divinylbenzénu, esterifikáciou solou cézia s príslušnou Boe - aminokyselinou (Gisin B.F. (1973) Helv. Chim. Acta 65, 1476 - 1482). Boc-Gly-živica (0,5 - 0,7 mmól/g) boli ručne vsadené do požadovaného počtu kondenzačných cyklov SP metódou syntézy ako bola modifikovaná prv (Flouret G., Brieher W., Mahan K. a Wilson L. Jr. (1991), J. Med. Chem. 34, 642 - 646). V každom cykle bola Boe skupina odstránená 30 % kyselinou trifluóroctovou v DCM a po neutralizácii živice s 10 % DIEA bola vykonaná kondenzácia s trojnásobným prebytkom Boe - aminokyselina a DCC. V príslušných stupňoch bol použitý sestmolárny prebytok Boc-Asn-ONp alebo Boc-Gln-ONp v DMF a prebytok činidla bol odstránený vyzrážaním vodou. Skončenie kondenzačného stupňa bolo sledované pomocou ninhydrínového testu, ktorý zvyčajne poskytne negatívnu odozvu. Ak je test pozitívny, bol kondenzačný stupeň opakovaný, ale ak bol iba slabo pozitívny, bol peptid zakončený acetyláciou s Ac₂0:DIEA:DCM (1:1:8). Nechránený Boc-D-Trp bol zavedený do polohy 2. Boc-skupina potom bola odstránená 30 % TFA v DCM, obsahujúcom 1 % merkaptoetanolu a 10 % anizolu a (S)Pmp(S-Meb) bol zavedený v 3molárnom prebytku v DMF roztoku aktiváciou s DCC a HOBt. Konečný zložený peptid bol odstránený zo živice amonolýzou s MeOH (25 ml) nasýteným amoniakom. Po 3 dňoch bola živica odstránená filtráciou a trikrát extrahovaná horúcim DMF. Metanolický filtrát a DMF extrakty boli spojené a odparené do sucha. Zvyšok bol rozpustený v DMF (2 - 3 ml) a chránený peptidmi bol vyzrážaný zo spojených DMF extraktov spracovaním vodou alebo EtOH:Et₂O, za získania 400 až 600 mg chráneného peptidu. TLC analýza chránených peptidov získaná po amonolýze zvyčajne vykazuje jednu hlavnú zložku s malými množstvami nečistôt, a preto tieto látky môžu byť použité priamo kvôli odstráneniu chrániacich skupín a prípravu volných analógov.

Etyl-4-tetrahydrotiopyranylidénacetát

Tento ester bol pripravený ako je popísané pre prípravu etyl- 4-tetrahydropyranylidénacetátu (Wandsworth, W.S. Jr., Emmons W.D. (1973) v Organic Synthesis (Baumgarten H. ed. Coli. Vol. V., str. 547 - 549, John Wiley and Sons, New York) a vákuovou destiláciou, olej (73 % výťažok).

Kyselina tetrahydrotiopyranyl-4-(4-metyl-benzyltio)-412 octová, alebo (S)Pmp(4-S-Meb)

Táto chránená kyselina bola pripravená z predchádzajúceho esteru, metódou podlá Yima a Huffmana, ako je popísaná pre Pmp (Int. J. Pept. Prot. Res. 21, 568 - 570, 1983), t.t. 113 až 115 “C (50 - 70 % výťažok). [(S)Pmpl,D-Trp²,Pen^,Arg⁸]OT alebo ANTAG

III.

(S)-Pmp(S-Meb)-D-Trp-Ile-Gln-Asn-Pen(Meb)-Pro-Arg(Tos)-GlyNH₂ (600 mg) zostavený metódou SP (vychádzajúcou z 0,5 mmól aminokyselinovej živice), ako je.popísané vyššie, sa rozpustí v kvapanom amoniaku (200 ml) čerstvo destilovaného zo sodíka a spracovaného za bezvodých podmienok s kúskom sodíka až do zachovania svetlomodrej farby po asi 15 až 30 sekúnd. Po odparení amoniaku vo vákuu sa pevná látka rozpustí v 20 ml 50 % AcOH. Tento rozpustený peptid sa pridá k odvzdušnenej vode (2 1) (tento velký objem môže byť významne znížený modifikovaným postupom), pH sa upraví na 7,0 prídavkom koncentrovaného hydroxidu amónneho a cyklizácia na peptiddisulfid sa vykoná asi pri titrácii disulfhydrylpeptidu s 0,1 N hexakyanoželezitanom draselným do vzniku trvalej žltej farby a potom prídavkom 20 % prebytku roztoku hexakyanoželezitanu. Po 20 min. sa hexakyanoželezitanové a hexakyanoželeznatanové soli odstránia miešaním po 10 min. s AG1 X-2 (Cl^-) ionomeničovou živicou (15 g) a potom priechodom suspenzie stĺpcom, obsahujúcim ďalšiu iónomeničovú živicu (15 g) za použitia ďalšieho 0,2N AcOH (100 1) na premývanie. Spojené filtráty a premývacie roztoky sa lyofilizujú. Analýza získanej pevnej látky, obsahujúcej peptid, bola vykonaná na analytickej μBondapak C₁₈ kolóne (30 x 0,39 cm), monitorovanie pri 220 nm a eluácia izokraticky s 55 % rozpúšťadla B (rozpúšťadlo A, 0,05 % TFA, rozpúšťadlo B 60 % MeCN-40 % 0,05 % TFA) rýchlosťou 1,8 ml/min. Za týchto podmienok tu dochádza k dobrému oddeleniu nečistôt. Živica bola rozpustená v najmenšom možnom objeme 50 % kyseliny octovej a nanesená na stĺpec Sephadexu G-15 (115 x 2,7 cm) a eluuje sa rovnakým rozpúšťadlom rýchlosťou asi 50 až 60 ml/h (6). Eluát sa sleduje v UV spektrofotometri pri 254 nm. Frakcie, zodpovedajúce hlavnému piku, sa sledujú analytickou HPLC, analytickou μΒοηά3ρ3Κονου C₁₈ kolónou (30 x 0,39 cm) za eluácie 57 % rozpúšťadla B a peptidy sa detegujú pri 220 nm. Čisté frakcie z hladiska HPLC sa spoja a lyofilizujú. Zvyšok sa rozpustí v 0,2N AcOH (20 ml) a nanesie na preparatívny Dynamax-60A, 8 μιη, C_lg (Rainin) kolóna, 21,4 x 25 cm, s 5 cm ochranným modulom. Gradient prebiehal od 0 do 45 % B po 45 minút, eluácia pri 5 ml/min., sledovanie eluantu pri 280 nm. Stredné časti hlavnej zložky sa eluujú po približne 3,5 hod. Čistejšie frakcie stanovené podlá analytickej HPLC, boli spojené a lyofilizované a získal sa Antag III (240 mg, 42 % z počiatočnej živice). Analogická čistota bola potvrdená chromatografiou na tenkej vrstve (TLC) v štyroch oddelených rozpúšťadlových systémoch, analytickou HPLC a aminokyselinovou analýzou. Analógy poskytli očakáväné pomery ± pri aminokyselinovej analýze. D-tryptofán v peptidoch bol hodnotený UV spektrofotometriou pri 280 nm (13). Nižšia hodnota nájdená pre tryptofán, 0,96, naznačuje, že peptidový lyofilizát môže obsahovať TFA a/alebo vodu.

Tabulka 1

[a]D²⁷’-	³⁹’ (IN, AcOH)
TLC:	(A)	n-BuOH-AcOH-H₂O	(4:1	:l)	Rf	0.27
	(B)	n-BuOH-AcOH-H₂O	(4:1	:5, horná fáza)	Rf	0.42
	(C)	n-BuOH-AcOH-H₂O	(5:1	:l)	Rf	0.19
	(D)	n-BuOH-AcOH-H₂O:	Pyr	(5:1:1:1)	Rf	0.56

Príklad II

Porovnávacie testovanie zlúčenín

Pre porovnanie s [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁸,Arg⁸joxytocín (antagonista D v tabulke 2) boli syntetizované tri príbuzné zlúčeniny. Jednou z nich je zlúčenina popísaná Manningom a spol., J. Med. Chem. 26, 1607 - 1613 (1983). Táto zlúčenina môže byť nazvaná [Pmp¹,D-Phe²,Phe³,íle⁴,Arg⁸joxytocín. Táto zlúčenina je v tabulke 2 nazývaná antagonista A. Ďalšou zlúčeninou bol [Pmp , D-Trp²,Phe³,íle⁴,Arg⁸]oxytocín, ktorý bol popísaný v US č. 07/239780 a je označený v tabulke 2 ako antagonista B. Tretia porovnávacia zlúčenina [Pmp¹,D-Trp²,Arg⁸Joxytocín bola popísaná v US prihláške č. 07/433664 a je označená ako antagonista C v tabuľke 2. V bioštúdii boli porovnávané štyri zlúčeniny.

Oxytocínová bioštúdia

Protokol použitý pre oxytocínovú bioštúdiu je odvodený od postupu popísaného v článku Sawyera a spol., Endocrinology, 106, 81 (1980), ktorý je naopak založený na článku Munsicka, Brit. J. Pharmacol., 3, 328 (1960) a Holtona, Brit. J. Pharmacol., 3, 328 (1948). Výpočty pre pA2 hodnoty sú popísané Schildom, Brit. J. Pharmacol. (1947). Hlavný rozdiel v postupe od postupov prv popísaných spočíva v integrácii plochy pod kontrakciou namiesto vo výpočte amplitúdy. Integrácia poskytuje oveľa konzistentnejšie a správnejšie výsledky, i keď pA₂ hodnoty sú asi rádovo nižšie ako tie, ktoré sú uvádzané s použitím amplitúdy kontrakcie ako konečného bodu.

Metóda: Zvieratá: 1,5 cm kúsky maternice z nedotknutých krýs (Holtman) v prirodzenom estre sa použijú pre skúšku.

Pufor/skúška kúpel: Použitým pufrom je Munsickov pufor. Tento pufor obsahuje 0,5 mM Mg⁺⁺, ktorý redukuje pA₂ hodnoty, ale výsledky sú uvádzané tak, že lepšie korelujú s dátami in vivo (Sawyer a spol., 1980). Tento pufor je kontinuálne plynovaný 95 % kyslíka: 5 % oxidu uhličitého na pH 7,4. Teplota skúšobného kúpela je 37 “C. Používa sa 10 ml skúšobného kúpela, ktorý obsahuje vodný plášť na udržanie teploty a prívodné a výstupné rúrky na pridávanie a odstraňovanie pufra.

Polygraf/prevádzač. Kúsky maternicového tkaniva použité pre skúšku sa napoja na zariadenie Statham Strain Gauge Force Transducer, ktorý sa naopak pripojí k zariadeniu Grass Polygraph Model 79 na sledovanie koncentrácií.

Skúšobný protokol:

(a) Tkanivo sa ekvilibruje v skúšobnom kúpeli počas jednej hodiny s premývaním novým pufrom každých 15 minút. Jeden gram zaťaženia je po celú dobu udržiavaný na tkanive.

(b) Tkanivo sa stimuluje na počiatku oxytocínom v koncentrácii 10 nM pre aklimatizáciu tkaniva a so 4 mM KCl kvôli stanoveniu maximálnej kontraktilnej odozvy.

(c) Potom sa stanoví krivka kumulatívnej dávkovej odozvy s oxytocínom a koncentrácia oxytocínu ekvivalentná približne 80 % maxima použitého na hodnotenie pA₂ antagonistu.

(d) Tkanivo sa vystaví oxytocínu (Calbiochemical) na jednu minútu a premyje sa pred prídavkom ďalšej dávky agonistu alebo antagonistu. Ak sa testuje antagonista, je podaný päť minút pred agonistom. Agonista sa podáva po jednu minútu. Všetky odozvy sú integrované za použitia integrátora 7P10 Grass. Toto je hlavný rozdiel medzi našim protokolom a inými protokolmi z literatúry, kde sa zvyčajne meria amplitúda koncentrácií ako odozva. Jediná koncentrácia oxytocínu rovná 80 % a maximálnej odozvy sa použije pre test antagonistu. Použijú sa tri rôzne koncentrácie antagonistov, dve, ktoré budú znižovať odozvu viac ako o 50 % (ideálne by tento vzťah mal byť 25 %, 50 % a 75 %). Toto sa opakuje pre každú dávku antagonistu trikrát pre tri body skúšky.

Anti-ADH aktivita je meraná zmenou antagonistu v moči pri ADH za prítomnosti a neprítomnosti antagonistu na stanovenie špecifity antagonistu. Anti-ADH skúška je popísaná v práci Sawyera a spol., Endocrinology, 63, 694 (1958).

Boli vykonané ďalšie štúdie na stanovenie, či výsledky bioskúšky na krysách zodpovedajú väzobnej schopnosti maternicových OT receptorov u krýs a u ludi. Boli porovnávané relatívne väzobné afinity 5 rôznych oxytocínových antagonistov.

Skúšky oxytocín receptoru

Metóda: Krysy. Maternicové tkanivo bolo odobrané v 21. dni kotnosti (doručenie = dni 21-^2 až 22-^^₂^ ^z Holzmanových krýs.

Tkanivo bolo odobrané celé, premyté vodou, rozrezané na malé kúsky a zmrazené na -70 “C za homogenizácie.

Ľudia: Ľudské myometriálne tkanivo bolo zhromaždené od pacientov v dobe cisárskeho rezu po súhlase. Tkanivo bolo premyté v studenom pufre, rozrezané na malé kúsky a zmrazené pri -70 °C za homogenizácie.

Izolácia oxytocín receptorov: Oxytocín receptory (OTrs) sú umiestnené na bunečnej membráne a sú prítomné vo vysokých koncentráciách na konci ťarchavosti v tkanive maternice. Zmrazené tkanivo sa homogenizuje v Tris pufre, homogenát sa sfiltruje a filtrát sa odstredí pri 1 000 g po 15 minút pri 4 ’C. Supernatant sa odstredí pri 40 000 g po 30 minút a peleta, obsahujúca bunečné membrány, sa resuspenduje v 10 % sacharóze. Potom sa vykoná odstredenie s hustotným gradientom umiestnením 10 % sacharózovej suspenzie nad 35 % sacharózu a odstredením po 30 minút v rotore s otočnými nádobkami pri 105 000 g. Membrány na rozhraní 10 %/30 % sacharózy sa odstránia a resuspendujú v Tris pufre, obsahujúcom EDTA po 30 minút. Tento postup odstráni dvojväzobný katión a vedie k disociácii akéhokoľvek entogénne naviazaného OT k receptoru. Táto zmes sa potom odstred’uje 15 minút pri 100 000 g a peleta, obsahujúca membránové OTrs, sa resuspenduje v Tris, PMSF, Mg⁺⁺ pufra ultrazvukom.

OT receptorová skúška. Väzobná skúška zahrňuje 0,1 ml 20 000 cmp trítiom značeného OT (New England Nuclear, 37,1 Ci/Nmól), 0,1 ml OT antagonistu pridaného vo zvyšujúcej sa koncentrácii, 0,25 ml pufra a 0,05 ml membrány (70 až 150 μg proteínu). Nešpecifická skúmavka obsahovala 100 násobok do nej pridaného studeného OTA. Inkubácia sa vykonáva 30 minút pri 30 ’C. Membrána sa peletuje odstredením v ultračistých miniskúmavkách (5 x 41 mm) po 30 minút pri 105 000 g. Výsledná peleta, obsahujúca naviazaný H-OT, sa rozpustí v 0,IN NaOH pri 45 ’C po 30 minút a táto zmes sa potom umiestni do kvapalinovej scintilačnej počítacej kvapaliny a v scintilačnom čítači sa zráta dpm.

Hodnoty sa analyzujú skúšobnými metódami nelineárnych kriviek s použitím McPhersonovho EBDA (J. Pharmacol. Methods, 14, 213 - 228, 1985) a Munsonovho a Rodbardovho LIGAND (Anál. Biochem., 107, 220 - 239, 1980) programu na nasýtenie a kompetičnú analýzu pre stanovenie Kd a Ki.

Výsledky porovnávacej bioštúdie a receptorových štúdií sú uvedené v tabuľkách 2 až 4.

Tabuľka 2

_Λ_, * OTA	Oxytoc. bioštúdia	ADH bioštúdia pomer anti-OT/antiADH
relatívna	relatívna anti-ADH aktivita	pA₂
PÄ₂	anti-oxytočínová aktivita
A	7.35	0.7	7.66	1.000	0.70
B	7.51	1.0	7.40	0.550	1.82
C	7.77	1.7	5.51	0.007	242.86
D	8.86	22.4	< 5.75	0.012	> 1866.7

Zlúčenina popísaný

A je [Pmp¹,D-Phe²,Phe³,íle⁴,Arg⁸] oxytocín, Manningom a spol., J. Med. Chem., 26, 1607 ako je - 1613

(1983 ) .
Zlúčenina	B	je
Zlúčenina	C	je
Zlúčenina	D	je

[Pmp¹,D-Phe²,Phe³,íle⁴,Arg⁸] oxytocín = ANTAG I. [Pmp¹,D-Trp²,Arg⁸] oxytocín = ANTAG II.

[(SjPmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸] oxytocín = ANTAG III.

V tabuľke 2 zlúčenina D, predstavujúca novú zlúčeninu podľa tohto vynálezu, demonštruje vyššiu anti-oxytocínovú aktivitu ako ostatné tri zlúčeniny. Ďalej mala oveľa nižšiu anti-ADH aktivitu. Pomer anti-OT/anti-ADH pre zlúčeninu D je vyššia ako 1 866,70, zatiaľ čo pomer pre zlúčeninu A bol 0,7, zlúčeninu B 1,8 a zlúčeninu C 242,9. Tieto údaje preto naznačujú, že u zlúčeniny D môže byt očakávané, že bude dochádzať k menej anti-ADH vedľajším účinkom pri podaní účinnej dávky oxytocínového antagonistu ako u zlúčenín A, B alebo C.

Tabuľka 3 ilustruje porovnanie väzobných afinít (Ka) vyhodnotených zo skúšky receptorov krysej maternice (Ka) oproti bioštúdii. Korelácia log_1Q Ka s log_1Q ^ED50 bola vysoko signifikančná (r = 0,92, p < 0,01). Porovnanie relatívnej aktivity ANTAG III (zlúčenina D) s ANTAG I (zlúčenina B) v skúške receptora krysej maternice a bioštúdii je uvedená v tabulke 5. V obidvoch skúškach je ANTAG III približne 20x účinnejší ako ANTAG I.

Tabulka 4 predstavuje väzobnú afinitu rôznych OTA k íudskému maternocivému Otr v porovnaní s krysou biostúdiou. Korelácia log₁₀ Ka k log_1Q ED₅₀ bola vysoko signifikančná (r - 0,95, p < 0,01). Porovnanie relatívnej väzobnej aktivity ANTAG III versus ANTAG I k ludskému OTr (hOTr) je uvedená v tabuľke 5. Pri tomto hodnotení je ANTAG III (zlúčenina D) asi 80x účinnejšia ako ANTAG

I. Preto sa zdá, že podlá skúšok na krysách by mohol byt ANTAG III relatívne účinný u ludí. Táto možnosť je ďalej podporená in vivo štúdiami vykonanými na kotných paviánoch, ako je popísané ďalej.

Príklad III

Testovanie zlúčenín na brezivých paviánoch

Účelom tejto štúdie je vyhodnotiť relatívnu in vivo aktivitu štyroch oxytocínových antagonistov za použitia uviazaného modelu kotného paviána a v porovnaní týchto výsledkov s predchádzajúcimi aktivitami vyhodnotenými za použitia krysích skúšok a ludských OTr skúšok. Pavián je vynikajúci zvierací model, kvôli jeho fyziologickej a anatomickej podobnosti s lud'mi (pozri články nášho laboratória, Am. J. Obstet. Gynecol., 163, 1815 - 1882,

1990, Am. J. Obstet. Gynecol., 165, 456 - 560, 1991, Am. J. Obstet. Gynecol., 165, 1487 - 1498, 1991, články iných laboratórií: Endocrine Reviews 11, 124 - 150, 1990, 11, 151

Breziví uviazaní paviáni boli študovaní medzi 130. začiatku brezivosti - 184. deň). Oxytocínoví podávaní ako injekcie jediného bolusu 1 mg a o 1 minútu neskôr nasledovala infúzia

- 176, 1990) , a 145. dňom od antagonisti boli intraarteriálne oxytocínu. Oxytocín bol podávaný infúziou kontinuálne na začiatku pri 10 mj a za zdvojnásobovania dávky každých 20 minút až na 40 mj./min. alebo až do tej doby, kedy sila sťahu (CF = (frekv. x priem, amplitúda)/10 minút) ako odpoveď bola signifikančná (t.j. CF > 50). Ak nebola žiadna signifikančná odpoveď, bol test s oxytocínovým podnetom opakovaný o 24 hodín neskôr. Interval antagonisti - odpoveď (ARI = antagonists - response) bol stanovený vynásobením času do prvej signifikantnej odpovede v minútach pomerom kontrakcie k pulzu (CF/OT koncentrácia). Výsledky: Výsledky sú uvedené v tabuľke 5. ARI bol vo vysokej zhode s výsledkami krysích a ľudských OTr hodnotení väzobnej afinity (Ka) (r - 0,98, p < 0,01) zo 4/5 oxytocínových antagonístov. Jeden oxytocínový antagonista (antagonista F v tabuľke 5) nevykazuje žiadnu inhibičnú aktivitu pri testovanej dávke, i keď vykazoval dobrú väzobnú afinitu v krysích a ľudských OTr skúškach a krysej bioštúdii. Tento oxytocínový antagonista nebol vyrobený v našom laboratóriu a nie je analógom oxytocínu. Jeden mg najlepšieho testovaného oxytocínového antagonistu (zlúčenina D, nová zlúčenina podľa vynálezu) blokuje odpoveď na oxytocínového antagonistu po viac ako 24 hodín. Porovnanie relatívnych aktivít rôznych OTAs so zlúčeninou B (ANTAG I) naznačuje, že zlúčenina D, [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]oxytocín (t.j. ANTAG III) je asi 130 krát účinnejšia ako zlúčenina B. Súhrnne relatívne aktivitné pomery (pozri tabuľka 5) ANTAG III (D) k ANTAG I (B) pri krysej bioštúdii, krysej receptorovej štúdii, ľudskej receptorovej štúdii a in vivo skúške s paviánmi, bolo 22, 20, 82 a 133. Tieto hodnoty indikujú, že krysie skúšky by mohli nedoceňovať potenciu ANTAG III u primátov.

Tabuľka 3 Porovnanie relatívnej väzby k maternicovým receptorom (Ka) a bioštúdiovej inhibíčnej aktivity (ED_5Q) pre oxytocínových antagonistov

Oxytqcínový antagonista	Receptorová štúdia Ka (10⁺⁸M^-1)	Oxytocínová bioštúdia ED₅₀ (nm)
A	0.39	44.76
B	1.16	30.90
C	2.03	16.98
C2	11.50	1.91
D	24.40	1.38 ,
E	0.51	102.33
F	5.89	19.93

receptorová štúdia - maternica brezivej krysy (P-21) bioštúdia - estrus krysieho uterusu

A - popísaná Manningom a spol., J. Med. Chem. 26, 1607 (1983) B - [Pmp¹,D-Trp²,Phe³,íle⁴,Arg⁸]oxytocín = ANTAG I C - [Pmp¹,D-Trp²,Arg⁸]oxytocín = ANTAG II

C2 - [Pmp¹,D-Trp²,Arg⁸]oxytocín = ANTAG II-2 D - [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]oxytocín = ANTAG IIII E - [Mpa¹,D-Tyr(Et)²>Thr⁴,Orn⁸]oxytocín (t.j. ATOSIBAN) • F - L-366,948 od Merck Pharmaceutical

Tabulka 4 Porovnanie väzby maternicového receptoru (Ka) v ľudskom myometriálnom tkanive s krysou maternicovou bioštúdiovou inhibičnou aktivitou (ED_5Q) pre oxytocínových antagonistov

OTA	Receptorová skúška Ka(10⁺⁸M^-1)	Bioštúdia ED_5q (nM)
B	0.51	30.9
C	1.82	17.0
D	41.7	1.38
E	0.53	102.3
F	2.49	20.0

Receptorová štúdia - myometriálne tkanivo odobrané ženám pri vykonaní cisárskeho rezu bioštúdia - estrus krysej delohy zlúčeniny B - F sú popísané v tab. 3

Tabuľka 5 Porovnanie pomerov biologickej aktivity (ARI) oxytocínových antagonistov (OTA) u brezivých paviánov k pomerom oxytocín receptorovej (OTr) väzobnej afinity a bioštúdie aktivity u krýs a u ľudí

OTA	ARI	ARI (OTA/ΑΝΤΙ)	rOTr (OTA/ANTI)	hOTr (OTA/ANTI)	Bioštúdia (ΑΝΤΙ/OTA)
B	59	1	1.0	1.0	1.0
C	547	9	1.8	3.6	1.8
D	7856	133	20.0	81.8	22.1
E	-	-	0.4	1.0	0.3
F	0	0	5.1	4.9	1.5

ARI - interval antagonista - odozva u brezivých paviánov (pozri text pri vysvetlení výpočtu rOTr - krysí oxytocínový receptor hOTr - ľudský oxytocínový receptor bioštúdia - krysia oxytocínová bioštúdia

ΑΝΤΙ - ANTAG I

Zlúčeniny B - F sú popísané v tabuľke 3.

I keď bol vynález popísaný najmä v súvislosti so špeciálnymi a vhodnými vyhotoveniami, je potrebné chápať, že je schopný modifikácie bez toho, aby bol porušený rozsah vynálezu. Nasledujúce patentové nároky sú mienené ako pokrývajúce všetky variácie, použitia alebo adaptácie vynálezu, všeobecne jeho princípy a zahrňujúce takéto odchýlky od predloženého popisu, ktoré sú v tejto oblasti bežné alebo sú odborníkom v odbore zrejmé.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Oxytocínový antagonista všeobecného vzorca

1 23456789 (S)Pmp-D-Trp-Ile-Gln-Asn-Pen-Pro-Arg-Gly-NH₂

I I s-s kde (S)Pmp je kyselina β ,β-( 3-tiapentametylén)^merkaptopropiónová, D-Trp je D forma tryptofánu a íle, Gin, Asn, Pen (Pen = penicilamín), Pro, Arg sú L formy izoleucínu, glutaminu, asparagínu, prolínu a argininu.