HU217972B

HU217972B - Oxitocin antagonista hatású oktapeptid és ezt tartalmazó gyógyászati készítmény

Info

Publication number: HU217972B
Application number: HU9502366A
Authority: HU
Inventors: George Flouret; Laird Wilson
Original assignee: Northwestern University
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 2000-05-28
Also published as: FI953646A; ZA941160B; CN1121709A; AU6663094A; IL108685A; CN1041634C; IL108685A0; NO954260L; KR960701897A; BR9405914A; PL177055B1; EP0695309A1; HUT74945A; BR1101113A; SK130295A3; DE69419910T2; ATE182898T1; GR3031432T3; ES2134351T3; RU2120944C1

Abstract

A találmány tárgya (S)Pmp–D–Trp–Ile–Gln–Asn–Pen–Pro–Arg–Gly–NH2 | | S S képletű oxitocin-antagonista hatású oktapeptid vagy gyógyászatilag alkalmazható sója,ahol Pmp jelentése ?,?-(3-tiopentametilén)-?-merkaptopropionsav, D–Trpjelentése D-triptofán, Ile jelentése L-izoleucin, Gln jelentése L-glutamin, Asn jelentése L-aszparagin, Pen jelentése L-penicillamin,Pro jelentése L-prolin, Arg jelentése L-arginin, Gly jelentése glicin.A találmány szerinti vegyület terhes nőknek adható a koraszülésmegakadályozására, miközben az antidiuretikus hormonnal, avasopressinnel való antagonizmus következtében a nem kívántmellékhatások elkerülhetők. ŕ

Description

A találmány tárgya olyan új oktapeptid, mely erős oxitocin-antagonista hatással rendelkezik és vasopressinnel szemben gyenge antagonista hatást mutat.

Az Egyesült Államokban a születés előtti megbetegedések és halálozás legfőbb oka a koraszülés. A kora- 5 szülés megakadályozására szolgáló jelenlegi módszerek nem mindig sikeresek és gyakran jelentős mellékhatásokkal járnak. Mivel az anyaméh az oxitocin célszer1 2 3 4 5 6

Cy s-Ty r-I1e-G1n-As n-Cy s-Pro-Le u-G1y-NH₂

I I s-s noxitocin (OT) ve, és feltételezve, hogy az oxitocin nagyban hozzájárul a koraszüléshez, egy hatásos oxitocin-antagonista kifejlesztése a koraszülés sikeres gátlását eredményezné, kevés mellékhatással.

Szerkezetileg az oxitocin (OT) és az antidiuretikus hormon (ADH), más néven vasopressin hasonlóak. Szerkezetük az alább megadott.

8 9

2 3 4 5

Cys-Tyr-Phe-Gln-Ast

I svasopressin (ADH)

Az irodalomban számos vizsgálat számol be ADHantagonisták előállításáról magas vérnyomás kezelésére, valamint oxitocin-antagonisták előállításáról.

1960-ban Law, H. D. és V. DuVigneaud (J. Am. Chem. Soc., 82: 4579) számolt be először egy oxitocin-antagonista (2-O-metil-tirozin-OT) előállításáról. 1967-ben Chan, Fear és DuVigneaud (Endocrinology, 81: 1267) az 1-L-penicillamin-oxitocin és az 1-deamino-penicillamin-oxitocin előállítását ismertették. Ez volt az első tanulmány, amely érzéstelenített patányban bemutatta egy OT-antagonista in vivő méhsszehúzódást gátló hatását és az oxitocinra adott reakciót.

1980- ban Sawyer és munkatársai (Endocrinology, 106: 81) olyan oxitocin-antagonista előállításáról számoltak be, amely egyesítette a Law- és a Chan-féle antagonisták két fontos vonását. Az új antagonista, az l-deamino-penicillamin-2-O-metil-tirozin-oxitocin volt. Oxitocikus biológiai vizsgálattal meghatározva az új antagonista pA₂-értéke 7,8 volt. Az pA₂-érték az antagonista azon moláris koncentrációjának negatív logaritmusa, amely az antagonistával szembeni választ felére csökkenti. Ezt Schild definiálta [British J. Pharmacology, 2: 189(1947)].

1983-ban Manning és munkatársai számos ADHantagonista előállítását ismertették (J. Med. Chem., 26: 1607-161). Ezen antagonisták közül az egyik a (β,βpentametilén-p-merkaptopropionsavkD-Phe^Ile⁴)arginin-vasopressin 8,2-es pA₂-értékű antioxitocikus hatással rendelkezik, más szavakkal 205-szőr hatékonyabb, mint a Sawyer és munkatársai által 1980-ban leírt anyag (lásd 1610. oldal, I. táblázat, 1. számú vegyület). Ez az oxitocin-antagonista a (Pmp',D-Phe²,Phe³,Ile⁴,Arg⁸)oxitocin. Hozzá hasonló oxitocin-antagonistát a (Pmp^l,D-Phe²,Phe³,Ile⁴,Arg⁸)-oxitocint ismertették Wilson és Flouret 1986-ban (Abstract fór Society of the Study fór Reproduction Meeting, 1986. július 14-17.).

1981- ben Melin és munkatársai új oxitocin-antagonistát fejlesztettek ki koraszülés megakadályozására

7 8 9

-Cy s-Pr o-Ar g-Gly-NH₂

I

- s (Endocrinology, 88: 173). 1-Deamino-etil-oxitocint szintetizáltak, melynek-pA₂-értéke 7,2. Kimutatták, hogy ez a vegyület patkányoknál in vivő, emberben in vivő és in vitro megakadályozza a méhösszehúzódást [Akerland és munkatársai: Obstet, and Gynecol., 62: 309 (1983)]. 1985-ben Akerland és munkatársai az l-deamino-[D-Tyr(OEt)²,Thr⁴,Om⁸]-vasopressin előállítását ismertették, melynek pA₂-értéke 8,3. A vegyü30 letet in vitro humán méhszöveten vizsgálták, és kimutatták, hogy gátolja a méhösszehúzódást.

A 4597901 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan vasopressin-antagonistákat ismertet, amelyek az oxitocin és vasopressin cisztein-135 csoportja helyett [IJi-ciklopentametilén^l-merkaptopropionsav-csoportot tartalmaznak.

A vasopressin más aminosavai szubsztituáltak. A vegyületek ezen csoportja vasopressin-antagonista és vizkiválasztó hatással rendelkezik.

A jelen találmány oxitocin-analóg oxitocin-antagomstára vonatkozik. A találmány szerinti vegyület az oxitocin risztéin-1 -csoportja helyett β,β-ίβ-ΟορεηΐΗΓηεύlén)-[5-merkapto-propionsavcsoportot, L-tirozin-2-csoportja helyett D-triptofán-csoportot, a 6-os helyzetű ciszteincsoport helyett penicillamin-csoportot, a 8-as helyzetű L-leucin-csoport helyett L-arginin-csoportot tartalmaz. A kapott [(S)Pmp^l,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]-oxitocin új vegyület, mely figyelemreméltó tulajdonságokkal rendelkezik.

Nagyon aktív mint oxitocin-antagonista. Ugyanakkor, bár szerkezetileg hasonló a vasopressinhez és az irodalomban leírt vasopressin-antagonistákhoz, az új vegyület minimális vasopressin-antagonista hatást mutat. Ha e két antagonista hatás arányát tekintjük, a talál55 mány szerinti vegyület antioxitocin/antivasopressin hányadosa igen magas érték. Terápiás célokra a tulajdonságok ilyen koombinációja igen előnyös. Erős antioxitocin hatás érthető el minimális anti-ADH-mellékhatással. A találmány szerinti vegyület alkalmas arra, hogy a szervezetben lévő oxitocin által kiváltott méhösszehú2

HU 217 972 Β zodast megakadalyozza, es ezáltal alkalmas a koraszü- A találmány szerinti oxitocin-antagonista az alábbi lés meggátlására. képletü:

23456789 ( S ) Pmp-D-Tr p- I le-Gln-.

I s ahol Pmp jelentése 3,3-(3-tiopentametilén)-p-merkaptopropionsav,

D-Trp jelentése D-triptofán,

He jelentése L-izoleucin,

Gin jelentése L-glutamin,

Asn jelentése L-aszparagin,

Pen jelentése L-penicillamin,

Pro jelentése L-prolin,

Arg jelentése L-arginin,

Gly jelentése glicin.

Az új vegyület figyelemreméltó tulajdonságait biológiai vizsgálatokkal mutattuk ki, melyeket a következőkben részletezünk.

Oxitocin-biológiai vizsgálat

Az alkalmazott biológiai vizsgálatok a Sawyer és munkatársai által ismertetett eljárások [Endocrinology, 106, 81 (1980)] módosított változatai. A Sawyer és munkatársai által ismertetett eljárások ugyanakkor Munsick [Brit. J. Pharmacol., 3, 328 (1960)] és Holton [Brit. J. Pharmacol., 3, 328 (1948)] vizsgálati módszerein alapulnak. A pA₂-érték becslésére vonatkozó számításokat Schild ismertette [British J. Pharmacology, 2, 189 (1947)]. A találmány szerinti vegyület vizsgálata során alkalmazott eljárás leginkább abban különbözik a korábban leírt eljárásoktól, hogy az összehúzódás alatti területet integráljuk, míg mások az amplitúdóval számolnak. Az integrálással kapott eredmények sokkal konzisztensebbek és megbízhatóbbak, mint azok, melyeknél végpontként az összehúzódás amplitúdóját alkalmazták, bár a pA₂-értékek közel egy nagyságrenddel kisebbek.

Módszer:

1. Állat: a vizsgálatra természetes estrus állapotban lévő szűz patkány (Holtzman) 1,5 cm-es méhdarabját alkalmazzuk.

2. Puffer/vizsgálati idő: Munsicks-puffert alkalmazunk. Ez a puffer 0,5 mmol Mg⁺⁺-t tartalmaz, amely csökkenti a pA₂-értéket, de az így kapott eredmények jobban korrelálnak az in vivő eredményekkel [Sawyer és munkatársai (1980)]. A pufferhez folyamatosan 95% oxigént és 5% szén-dioxidot adunk, ami 7,4-es pH-értéket eredményez. A fürdő hőmérséklete 37 °C. A 10 ml-es vizsgálati fürdő vízköpenyt tartalmaz a hőmérséklet egyenletesen tartására, és a puffer beadagolására, valamint eltávolítására bevezető és kivezető nyílással van ellátva.

3. Poligráf/átalakító: a vizsgálathoz használt méhszövetdarab egyik végét lerögzítjük, a másik végét egy Statham nyúlásmérő erőátalakítóhoz kapcsoljuk, melyet Grass Polygraph-modell 79 készülékhez csatolunk, és megfigyeljük az összehúzódásokat.

4. Mérési protokoll: a) A szövetet egyensúlyi állapotba hozzuk azáltal, hogy egy órán keresztül a vizsgá\sn-Pen-Pr o-Arg-Gly-NH₂ !

- s lati fürdőben tartjuk és minden 15 percben új pufferrel megmossuk. Az egész idő alatt a szöveten 1 g nyomást tartunk fenn;

b) A szövetet 10 nmol oxitocinnal stimuláljuk, hogy akklimatizálódjon, majd 4 mmol kálium-kloriddal meghatározzuk a maximális összehúzódási reakciót;

c) Oxitocinnal felvesszük a kumulatív dózishatásgörbét, és az antagonista pA₂-értékének meghatározásához a maximum 80%-nak megfelelő oxitocin-koncentrációt vesszük;

d) A szövetet 1 percre oxitocinba helyezzük (Calbio20 Chemical, San Diego, Kalifornia), majd kimossuk. Az agonista vagy antagonista következő dózisait 3 perces intervallumokban adjuk. Amikor az antagonistát vizsgáljuk, azt az agonista előtt 5 perccel adjuk. Az agonistát egy percig adjuk. Minden választ 7P10 Grass Integra25 torral integrálunk. Ez a fő különbség a jelen protokoll és az irodalomban leírtak között, amelyek általában válaszként az összehúzódások amplitúdóját mérik. A maximális választ kiváltó oxitocin-koncentráció 80%-át használjuk az antagonista teszteléséhez. Három különböző antagonista-koncentrációt alkalmazunk, két olyat, mely az agonistára adott választ 50%-kal és egy olyat, mely több mint 50%-kal csökkenti (ideálisan ez a viszony 25%, 50% és 75%). Az antagonista minden dózisával a vizsgálatokat háromszor ismételjük;

e) PA₂-számítás: kiszámoljuk az antagonista dózishatás (DR) arányait, és függvényben ábrázoljuk a log(DR-l) vs antagonista-koncentráció logaritmusát. A függvényt a legkisebb négyzetanalízissel számoljuk. A pA₂ az antagonista-koncentráció abban a pontban, ahol a regresszióvonal keresztezi a log(DR-1) ordinátapontját. A pA₂-érték az antagonista azon koncentrációjának negatív logaritmusa, amely az agonistára adott választ a felére csökkenti.

Mint oxitocin-analógot, a talmány szerinti vegyüle45 tét [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]-oxitocinnak jelölhetjük. Amikor a találmány szerinti vegyületet vizsgáltuk, összehasonlító anyagként oxitocint alkalmazva, tíz vizsgálat átlagában a pA₂-értéket 8,86-nál nagyobbnak találtuk.

ADH biológiai vizsgálat

A találmány szerinti vegyület vasopressin-antagonista hatását is megvizsgáltuk. Az anti-ADH-hatás meghatározható annak a mérésével, hogy a vizelet ADHtartalma hogyan változik az antagonista jelenlétében vagy anélkül. Megfelelő ADH-vizsgálatot ismertetnek Sawyer és munkatársai az Endocrinology-ben [63, 694 (1958)]. Ezzel a módszerrel mérve azt találtuk, hogy a találmány szerinti vegyület [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁴,Arg⁸]oxitocin nagyon alacsony vasopressin-antagonista hatás60 sál rendelkezik. Az oxitocin-antagonista/ADH antago3

HU 217 972 Β nista hatás hányadosa a korábbi bejelentésben ismertetett 200 vegyület hányadosához viszonyítva nagyon magas volt.

Oxitocin-antagonista hatásának köszönhetően, mely csak minimális vasopressin-antagonista hatással párosul, a találmány szerinti vegyület a humán és állatgyógyászatban olyan szimptómák kezelésére alkalmas, melyek oxitocin-antagonistát igényelnek. Használható méhösszehúzódás, tejhiány és koraszülés megakadályozására. Bár a vegyület szerkezete az oxitocinéhoz és a vasopressinéhez is hasonlít, nem csak megnövekedett antioxitocin hatással, hanem erősen csökkent antiADH-aktivitással is rendelkezik. A vegyület alkalmazható továbbá dysmenorrhoa gátlására, illetve oxitocinnal megindított szülés esetén a túlságosan felerősített méhösszehúzódások gyengítésére vagy magas vérnyomás kezelésére.

A találmány szerinti vegyület nőknek a szokásos módokon adagolható. Kórházi használatnál az intravénás adagolás lehet a leggyakoribb alkalmazási mód. Ugyanakkor a vegyület alkalmazható intraperitoniálisan, subcutan vagy intramusculárisan is és az orális alkalmazás is elképzelhető. Ha szükséges, az orálisan alkalmazható tabletták és kapszulák enteroszolvens bevonattal lehetnek ellátva, amely megvédi a vegyületet a gyomorban való elbomlástól és elősegíti a béltraktusban való kioldódást. A széttört tabletta nyelv alá helyezése is alkalmas beviteli mód lehet. Ezt az alkalmazási módot akkor alkalmazhatjuk, ha szoptatós anyánál tejelapadást kívánunk elérni.

A kezelésekhez a vegyület hatásos, de nem toxikus mennyiségét alkalmazzuk. A szimptómák megelőzésére vagy kezelésére alkalmazandó dózis több tényezőtől, így a nőbeteg típusától, korától, súlyától, egészségi állapotától, a szimptóma súlyosságától, az adminisztráció módjától stb. függ. Egy gyakorlott orvos a kezelendő állapot súlyosságának és az adminisztráció módjának figyelembevételével meg tudja határozni és fel tudja írni a hatékony mennyiséget. Például steril normál sóoldatban való intravénás alkalmazás esetén a hatékony dózis 0,01-100 mg/testsúlykg/nap lehet.

A találmány szerinti vegyületet új módszerrel állítjuk elő. A múltban a peptidekben a triptofán helyettesítését elkerülték, mivel a triptofán-peptidek savérzékenyek. Bodanszky és munkatársai [J. Med. Chem., 23, 1258-1261 (1980)], valamint Sawyer és munkatársai [Endocrinology, 106, 81 (1980)] a (Trp⁸)-oxitocint sokkal bonyolultabb, indirekt módon állították elő, hogy elkerüljék a Trp-peptid savas kezelését. Jelen bejelentésben hivatkozunk a 07/289780 és 07/433644 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben ismertetett eljárásokra is.

1. példa [(S)Pmp^!,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸J-oxitocin előállítása a) β-Merkapto-propionsavszármazékok előállítása Tetrahidro-tiopirán-4-ont trietil-foszfono-acetáttal reagáltatunk Wadsworth és Emmons módszere szerint [Wadsworth, W. S., Jr. Emmons, W. D.: Organic

Synthesis (Baumgarten, H. ed.) Col. Vol. V, 547-549 (1973), kiadó: John Wiley & Sons, NY],

Etil-4-tetrahidro-piranilidén- (TÉP) acetátot kapunk. 4-metil-benzil-merkaptán Yim és Huffman szerinti [Yim, N. C. F. & Huffman, W. F.: Int. J. Pept. Prot. Rés., 21, 568-570 (1983)] Michael-addíciójával, majd azt követő elszappanosítással tetrahidro-tiopiranil-4-(4-metil-benzoltio)-4-ecetsavat [(S)Pmp(SMeb)] kapunk.

A rövidítések megfelelnek az IUPAC-IUB Biokémiai Nómenklatúra Bizottság javaslatainak [J. Bio. Chem., 264, 688-693 (1989)]. Amennyiben külön nem jelöljük, akkor az aminosav L-konfigurációjú. Más használt rövidítések jelentése az alábbi: OT=oxitocin; Ρπιρ=β,βpentametilén-P-merkaptopropionsav; (5)Ρηιρ = β,β-(3tiapentametilénj^-merkaptopropionsav; Boc=tercbutil-oxi-karbonil; Meb=4-metil-benzil; Tos=p-toluolszulfonil; ONp=4-nitro-fenil-észter; DCM = diklórmetán; TFA= trifluor-ecetsav; EtOH= etanol; DIEA=diizopropil-etil-amin; DMF=dimetilformamid; DCC = diciklohexil-karbodiimid; HOBt= 1-hidroxibenzotriazol; MeOH=metanol; CHL=kloroform; Ac₂O=ecetsavanhidrid; Pyr=piridin; Et₂O=etil-éter, HPLC=nagy nyomású folyadékkromatográfia; TLC=vékonyréteg-kromatográfia; PITC = fenil-izotiocianát; PTC=fenil-tiokarbamoil; UV=ultraviola; OR=optikai forgatóképesség.

b) Peptidszintézis. Az antagonista védett prekurzorját szilárdfázis- (SP) módszerrel állítjuk elő [Merrifield, R. B.: J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-54 (1963)]. A szintézisnél a Boc-aminosavak [Steward, J. M. & Young, J. D.: Solid Phase Peptide Synthesis, 1, 176 (1984), Pierce Chemical Co., Rockford, IL] szintézisének stratégiáját követjük. A Pmp minden 1-helyzetű analógjánál a tiolcsoportot 4-metil-benzil-csoporttal védjük. A kapcsolás teljessé tételét ninhidrin-teszttel ellenőrizzük [Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D. & Cook, P. I.: Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)]. A védett peptideket a gyantáról ammonolízissel távolítjuk el [Manning, M., J. Ám. Chem. Soc., 90, 1348-1349 (1968)]. Az oldalláncban lévő védőcsoportokat Na/folyékony ammóniával [du Vigneaud, V., Ressler, C., Swan, J. M., Roberts, C. W., Katsoyannis, P. G. & Gordon, S.: J. Am. Chem. Soc., 75, 4879-4880 (1953)], vagy folyékony HF-anizollal [Sakakibara, S. & Shimonishi, Y.: Bull. Chem. Soc. Jpn., 38, 1412 (1965)] végzett redukcióval távolítjuk el, a diszulfhidril-peptideket nagy hígítású oldatban [Manning, M., Lammek, B. & Kolodziejczyk, A. M.: J. Med. Chem., 24, 701-706 (1981)] kálium-vas(III)-cianiddal oxidáljuk ciklikus diszulfiddá [Hope, D. B., Murti, V. V. S. & du Vigneaud, V.: J. Bioi. Chem., 27, 1563-1566 (1962)]. A szabad peptideket a kis mennyiségű mellékterméktől Sephadex G-15-ön [Manning, M., Wuu, T. C. & Baxter, J. W. M.: J. Chromatogr., 38, 396-398 (1968)] végzett gélfiltrációval [Porath, J. & Flodin, P. Natúré (London), 183, 1657-1659 (1959)] és preparatív HPLC-vel [Flouret, G., Brieher, W., Mahan, K. és Wilson, L., Jr.: J. Med. Chem., 34, 642-646 (1991)] tisztítjuk meg. A peptid tisztaságát TLC-, HPLCmódszerrel, aminosav-analízissel [Bidlingmeier, B. A.,

HU 217 972 Β

Cohen, S. A. & Tarvin, T. L.: J. Chromatogr., 336, 93 -104 (1984)] határozzuk meg.

Az analógok peptidszekvenciáját SP-módszerrel határozzuk meg, mechanikai keverőt és speciális tartályt alkalmazva. Néhány peptid esetében, ahol ez lehetséges, a védőcsoport eltávolítását folyékony HF-fel végezzük, teflonnal bevont készüléket (Protein Research Foundation, Osaka, Japán) alkalmazva. A Boc-aminosavakat Bachemtől, a szintetikus vagy ionos gyantákat a BioRad-tól, minden más reagenst az Aldrich Chemical Co.-tól, a Pierce-től vagy a Chemical Dinamicstól vásároltunk. A peptid tisztaságát analitikai HPLCmódszerrel ellenőrizzük, a korábbiakban ismertetett Milipore-készüléket [Flouret, G., Brieher, W., Mahan, K. és Wilson, L„ Jr.: J. Med. Chem., 34, 642-646 (1991)] és egy analitikai pBondapak C₎₈ oszlopot (30x0,39 cm) alkalmazva. Preparatív HPLC-ként az előzőekben ismertetett Gilson autopreparatív HPLC System 71-t [Flouret, G., Brieher, W., Mahan, K. és Wilson, L., Jr.: J. Med. Chem., 34, 642-646 (1991)] és egy 5 cm-es védőmodullal ellátott 21,4x25 cm-es preparatív oszlopmodult alkalmazunk, ahol mindkét modul Dynaax-60A-val [8 pm, C_t8 (Rainin)] van töltve. A kromatografáláshoz vagy szintézishez alkalmazott oldószerek HPLC-minőségűek (Fisher Scientific). Az analitikai és preparatív HPLC-hez oldószerként a) 0,05% TFA-t; b) 60% MeCN-t - 40% oldószer A-t alkalmazunk. A peptidek tisztaságát vékonyréteg-kromatográfiásan is ellenőrizzük szilikagél G-vel bevont Uniplate-t (0,25 mm, Analtech.) alkalmazva. Oldószerrendszerként az alábbiakat alkalmazzuk: A) nBuOH-AcOH-H₂O (4:1:1); B) n-BuOH-AcOH: ICO (4:1:5, felső fázis); C) n-BuOH-AcOH:H₂O:Pyr (5:1:1:1) (az arányok tömegarányokat jelentenek). A peptideket Erlich-reagenssel vagy klór-tolidinnel [Stewart, J. M. & Young, J. D.: Solid Phase Peptide Synthesis, 1, 176 (1984), Pierce Chemical Co., Rockford, IL] tesszük láthatóvá. Az aminosav-analízishez az analógokat 6N sósavval, 24 órán át, 110 °C-on hidrolizáljuk, majd a kapott aminosav-komponenst fenilizo-tiocianáttal reagáltatjuk, és a Waters Associates Picotag-módszerrel, Waters Picotag-t alkalmazva, az előzőekben leírt módon elrendezve [Flouret, G., Brieher, W., Mahan, K. és Wilson, L., Jr.: J. Med. Chem., 34, 642-646 (1991)]. A peptidek optikai forgatóképességét Rudolph-polariméterrel (±0,01 pontosság) mérjük.

A védett peptidek szilárd fázisú szintézise

A szintézishez Boc-aminosavakat, az oldallánc funkciós csoportjainak védelmére Boc-Arg(Tos)Boc-Pen(Meb)- és (S)Pmp(Meb)-csoportokat alkalmazunk. Boc-Gly-gyantát [0,7 mmol Boc-Gly(g)] alkalmazunk, melyet 1%-ban divinil-benzollal térhálósított, 200-400 mesh méretű klórmetilezett gyantán a megfelelő Boc-aminosav céziumsójának észterezésével állítunk elő [Gisin, B. F.: Helv. Chim. Acta, 65, 1476-1482 (1973)]. Az előzőek szerint módosított, szilárd fázisú szintézis [Flouret, G., Brieher, W., Mahan, K. és Wilson, L., Jr.: J. Med. Chem., 34, 642-646 (1991)] kívánt számú kapcsolási lépéseihez a

Boc-Gly-gyantát manuálisan helyezzük el. Minden egyes lépésnél a Boc-csoportot DCM-ben trifluorecetsavval eltávolítjuk, a gyantát DCM-ben 10% DIEA-val semlegesítjük, majd a kapcsolást a Boc-aminosav és a DCC háromszoros feleslegében végezzük. A megfelelő lépéseknél DMF-ben a Boc-Asn-ONp vagy Boc-Gln-ONp hatmólos feleslegét alkalmazzuk, a feleslegben alkalmazott reagenst vízzel való kicsapással nyerjük vissza. A kapcsolási reakció befejeztét ninhidrin-teszttel követjük, mely rendszerint negatív eredményt ad. Ha az eredmény pozitív, a kapcsolási lépést megismételjük, ha azonban csak gyengén pozitív, a pepiidet Ac₂O: DIEA: DCM (1:1:8) eleggyel acilezzük. A 2-es helyzetbe nem védett Boc-D-Trp-t viszünk be. A Boc-csoportot 1% merkaptoetanolt és 10% anizolt tartalmazó DCM-ben 30% TFA-val eltávolítjuk, és az [(S)Pmp/S-Meb]-t DMF-ben visszük be 3 mól felesleget és aktiválószerként DCC-t és HOBt-t alkalmazva. A kész peptidet a gyantáról ammonolízissel távolítjuk el, ammóniával telített metanolt (25 ml) alkalmazva. 3 nap múlva a gyantát szűréssel eltávolítjuk, majd háromszor forró DMF-fel extraháljuk. A metanolos és DMF-es extraktokat egyesítjük és szárazra pároljuk. A maradékot DMF-ben (2-3 ml) feloldjuk, a DMF-s oldatokat egyesítjük, majd a védett peptid-amidokat vízzel vagy EtOH: Et₂O-eleggyel kicsapjuk. 400-600 mg védett peptidet kapunk. Az ammonolízis után kapott védett peptidek TLC-analízise általában egy fő komponenst mutat ki, kevés szennyezéssel, így azokat közvetlenül alkalmazzuk a szabad peptidek előállítására.

Etil-4-tetrahidro-tiopiranilidén-acetát

Ezt az észtert az etil-4-tetrahidro-piranilidén előállításánál leírtakkal [Wadsworth, W. S., Jr. Emmons, W. D.: Organic Synthesis (Baumgarten, H. ed.), Coll. Vol. V, 547-549 (1973), John Wiley & Sons, New York] azonos módon állítjuk elő, majd vákuumban desztilláljuk. Olajos terméket kapunk (74%).

Tetrahidro-tiopiranil-4-(4-metil-benzoltio)-4-ecetsav [(S)Pmp(4-S-Meb)]

A fenti savat Yim and Huffman Pmp előállítására leírt módszere szerint [Int. J. Pept. Prot. Rés., 21, 568-570 (1983)] állítjuk elő. Olvadáspont: 113-115 °C, kitermelés: 50-70%.

[(S)Pmp^l,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]OT vagy Antag III

A szilárd fázisú, előzőekben ismertetett reakcióval összességében kapott 600 mg (S)Pmp(S-Mebj-DTrp-Ile-Gln—Asn-Pen(Meb)-Pro-Arg(Tos)-Gly NH₂-t 600 ml nátriumról frissen desztillált ammóniában feloldjuk, majd vízmentes körülmények között nátriumdarabbal 15-30 percig kezeljük, amíg halványkék színű nem lesz. Az ammóniát vákuumban ledesztilláljuk, majd a szilárd maradékot 20 ml 50%-os ecetsavban feloldjuk. Az így feloldott peptidet 2 1 levegőmentesített vízhez adjuk (a fenti nagy mennyiség jelentősen csökkenthető egy módosított eljárás szerint), koncentrált ammónium-hidroxiddal a pH-értéket 7,0-ra állítjuk. A peptid-diszulfiddá való ciklizálását oly módon végezzük, hogy a diszulfhidril-peptidet 0,01 N kálium-vas(III)-cianiddal titráljuk mindaddig, míg az oldat színe állandó

HU 217 972 Β sárgára nem változik, majd 20% kálium-vas(III)-cianid-felesleget adunk hozzá, 20 perc múlva a vas(III)cianidot és a vas(III)-cianid-sót 15 g AG1 X-2 (Cl ) ioncserélő gyantával való 10 perces keveréssel eltávolítjuk, a szuszpenziót olyan kolonnán vezetjük át, amely további (15 g) ioncserélő gyantát tartalmaz, a mosáshoz további 0,2N ecetsavat (100 ml) alkalmazva. Az egyesített szűrleteket és mosófolyadékokat liofílizáljuk. A kapott peptidtartalmú szilárd anyagot pBondapak C_l8 analitikai oszlopra visszük (30x0,39 cm), 220 nm-nél vizsgáljuk, 1,8 ml/perc sebességgel B oldószerrel [A oldószert,05% TFA; B oldószer=60% MeCN-40% TFA (0,05%-os)] eluáljuk. Ezen körülmények között a szenynyezések jól feloldódnak. A maradékot a lehető legkisebb mennyiségű, 50%-os ecetsavban feloldjuk, majd Sephadex G-15 oszlopra (115x207 cm) visszük, és ugyanazzal az oldószerrel 50-60 ml/h sebességgel eluáljuk. Az eluátumot UV-spektrofotométerrel 254 nm-nél vizsgáljuk. A legnagyobb csúcshoz tartozó frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk, analitikai pBondapak C_l8 (30x0,39 cm) oszlopot, eluálószerként 57%-os B oldószert alkalmazva és a peptid detektálását 220 nm-en végezve. A HPLC-kritériumok szerint tiszta frakciókat összeöntjük és liofílizáljuk.

A maradékot 0,2N ecetsavban (20 ml) oldjuk, és egy 5 cm-es védőmodullal ellátott, preparatív Dynamax-60A oszlopra [8 pm; C_i8; (Rainin); 21,4x25 cm] visszük. 0-45% gradiensű oldószerrel 45 percig 5 ml/perc sebességgel eluáljuk az anyagot, és az eluenst 280 nm-nél vizsgáljuk. A fő komponens legnagyobb mennyisége körülbelül 3,5 óra múlva eluálódik. Az analitikai HPLC-vel meghatározott, tiszta frakciókat egyesítjük és liofílizáljuk. 240 g Antag Ill-at kapunk, 42%-ot a gyanta kezdeti szakaszáról. Azonos tisztaság mutatható ki vékonyréteg-kromatográfiásan (TLC) négy különböző oldószerrendszert alkalmazva, analitikai HPLCvel és aminosav-analízissel is. Az A analóg a várt aminosavanalízis-arányokat adta ±10% eltéréssel. A peptidekben a D-triptofánt UV-spektrofotometriásan 280 nm-nél azonosítjuk. A triptofánnál talált alacsonyabb érték (0,96) arra enged következtetni, hogy a peptid-liofilizátum TFA-t és/vagy vizet tartalmaz. (Lásd 1. táblázat.)

1. táblázat [a]D²⁷- 39 (IN, AcOH)*

TLC:**	(A) n-BuOH: AcOH: H₂O (4:1:1)	Rf0,27
(B) n-BuOH: AcOH :H₂O (4:1:5, felső fázis)	0,42
(C) n-BuOH: AcOH: H₂O (5:1:1)	0,19
(D) n-BuOH: AcOH: H₂O: Pyr (5:1:1:1)	0,56

* Az optikai forgatókcpcsscgct 10 cm hosszú polariméter csőben, IN AcOH-oldatban, Rudolph-polarimctcrt alkalmazva (±0,01°), 27 °C-on, fényforrásként nátriumlámpát alkalmazva (hullámhossz: 589 mg) mérjük ** TLC részére szilikagél G előre bevont lapokat (hosszúság: 20 cm, vastagság: 0,25 mm, Uniplates, Analtech) alkalmazunk. Az oldószerrendszereknél megadott arányok tömegarányt jelentenek. A B szolvens esetében a keverés után két fázis keletkezik, a felső fázist alkalmazzuk. A vegyületeket Ehrlich-reagens (p-dimetilamino-benzaldchid hígított HCl-bcn oldva) cs/vagy klór-tolidine színreagens alkalmazásával tesszük láthatóvá

2. példa

Vegyületek összehasonlító vizsgálata

Az [(S)Pmp¹,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]-oxitocinnal (D antagonista, 2. táblázat) való összehasonlításhoz három vegyületet szintetizáltunk. Ezen vegyületek közül az egyik a Manning és munkatársai által a J. Med. Chem.-ben, 26, 1607 (1983) ismertetett vegyület volt. Ez a vegyület a (Pmp',D-Phe²,Phe³,Ile⁴,Arg⁸)-oxitocin. A másik vegyület a (Pmp¹,D-Trp²,Phe³,Ile⁴,Arg⁸)-oxitocin, melyet a 07/239,780 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismertet, s melyet a 2. táblázatban B antagonistának jelölünk. A harmadik vegyület a (Pmp¹,D-Trp²,Arg⁸)-oxitocin, melyet a 07/433,664 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismertet, s melyet a 2. táblázatban C antagonistának jelölünk. A négy vegyületet összehasonlító biológiai vizsgálattal vizsgáltuk.

Oxitocikus biológiai vizsgálat

Módszer:

Állat: a vizsgálatra természetes estrus állapotban lévő szűz patkány (Holtzman) 1,5 cm-es méhdarabját alkalmazzuk.

Puffer/vizsgálati fürdő: Munsick-puffert alkalmazunk. Ez a puffer 0,5 mmol Mg⁺⁺-t tartalmaz, amely csökkenti a pA₂-értéket, de az így kapott eredmények jobban korrelálnak az in vivő eredményekkel (Sawyer és munkatársai, 1980). A pufferhez folyamatosan 95% oxigént és 5% szén-dioxidot adunk, ami 7,4-es pH-értéket eredményez. A fürdő hőmérséklete 37 °C. A 10 ml-es viszgálati fürdő vízköpenyt tartalmaz a hőmérséklet egyenletesen tartására, és a puffer beadagolására, valamint eltávolítására bevezető és kivezető nyílással van ellátva.

Poligráf/átalakító: a vizsgálathoz használt méhszövetdarab egyik végét lerögzítjük, a másik végét egy Statham nyúlásmérő erőátalakítóhoz kapcsoljuk, melyet Grass Polygraph-modell 79 készülékhez csatolunk, és megfigyeljük az összehúzódásokat.

Mérési protokoll: a) A szövetet egyensúlyi állapotba hozzuk azáltal, hogy egy órán keresztül a vizsgálati

HU 217 972 Β fürdőben tartjuk és minden 15 percben új pufferrel megmossuk. Az egész idő alatt a szöveten 1 gr nyomást tartunk fenn;

b) A szövetet 10 nmol oxitocinnal stimuláljuk, hogy akklimatizálódjon, majd 4 mmol kálium-kloriddal meg- 5 határozzuk a maximális összehúzódási reakciót;

d) A szövetet oxitocinba helyezzük 1 percre (Calbiochemical, San Diego, Kalifornia), majd kimossuk. Az agonista vagy antagonista következő dózisait 3 perces intervallumokban adjuk. Amikor az antagonistát vizsgáljuk, azt az agonista előtt 5 perccel adjuk. Az ago- 15 nistát egy percig adjuk. Minden választ 7P10 Grass Integrátorral integrálunk. Ez a fő különbség a jelen protokoll és az irodalomban leírtak között, amelyek általában válaszként az összehúzódások amplitúdóját mérik.

A maximális választ kiváltó oxitocin-koncentráció 20 80%-át használjuk az antagonista teszteléséhez. Három különböző antagonista-koncentrációt alkalmazunk, két olyat, mely az agonistára adott választ 50%-kal és egy olyat, mely több mint 50%-kal csökkenti (ideálisan ez a viszony 25%, 50% és 75%). Az antagonista minden dó- 25 zisával a vizsgálatokat háromszor ismételjük.

Az anti-ADH-aktivitást oly módon mérjük, hogy meghatározzuk a vizelet ADH-tartalmának változását antagonista jelenlétében és anélkül. Az anti-ADH-vizsgálatot Sawyer és munkatársai ismertetik az Endocri- 30 nology-ben [63, 694 (1958)].

Ha a patkánybiológiai vizsgálatok eredményei megfelelőek voltak, további vizsgálatokat végeztünk, és patkánynál és humán vizsgálatokban meghatároztuk a méh OT-receptorokhoz való kötési affinitást. 5 külön- 35 böző oxitocin-antagonista kötési affinitását hasonlítottuk össze.

Oxitocin-receptorvizsgálat

Módszer. Patkány napos terhes Holtzman-patkányokból méhszöve- 40 tét távolítottunk, el (szállítás=21_1/2-22_1/2nap). A szövetet megtisztítottuk tartalmától, jéghideg pufferben leöblítettük, kis darabokra vágtuk és homogenizálás közben -70 °C-on megfagyasztottuk.

Humán

Császármetszéskor a betegek beleegyezésével myometriás szöveteket gyűjtöttünk. A szöveteket hideg pufferrel leöblítettük, kis darabokra vágtuk, és homogenizálás közben -70 °C-on megfagyasztottuk.

Oxitocin-receptorok izolálása

Oxitocin-receptorok (Otrs) a sejtmembránon találhatók és nagy koncentrációban vannak jelen a terhesség végén a méhszövetben. A megfagyasztott szö10 vetet Tris-pufferben homogenizáljuk, a homogenizátumot szűrjük, a szűrletet 4 °C-on 15 percig 1000 gnél centrifugáljuk. A felszínen úszó részt 30 percig 40 000 g-nál centrifugáljuk, és a sejtmembránt tartalmazó pelletet 10% szacharózban szuszpendáljuk. A 10%-os szacharóz-szuszpenziót 3 5%-os szacharóz tetejére tesszük, és 30 percig 105 000 g-vel ultracentrifugáljuk. A 10%-os/35%-os szacharóz határfelületén lévő membránokat eltávolítjuk, és EDTA-t tartalmazó Tris-pufferben 30 percig szuszpendáljuk. Ezzel az eljárással a kétértékű kationok eltávolíthatók, és a receptorhoz endogén módon kötött OT disszociálódik. A kapott keveréket 15 percig 100 000 g-nél centrifugáljuk, és az OTrs-t tartalmazó pelletet szonikációval Trsi-, PMSF-, Mg+ ’ -tartalmú pufferben szuszpendáljuk.

OT-receptorvizsgálat

A kötőanyag 0,1 ml 20 000 cmp-s tríciummal jelzett OT-t [New England Nuclear, 37,1 Ci (nmol)] tartalmaz. A kötőanyaghoz 0,1 ml növekvő koncentrációjú OTantagonistát, 0,25 ml puffért és 0,05 ml membránt (70-150 pg protein) adunk. Egy nemspecifikus cső 100-szor hideg OT-antagonistát ad hozzá. Az inkubálást 30 percig 30 °C-on végezzük. A membránokat 105 000 g-nél való centrifügálással ultratiszta kis csövekbe (5x41 mm) pelletáljuk 30 percig. A ³H-OT kötést tartalmazó pelletet 30 perc alatt 45 °C-on 0,1 N NaOH-ban oldjuk, és a kapott elegyet folyadékszcintillátorba helyezzük. (A szcintillátor számlálója méri a folyadékot és a dpms-t.) A Kds- és Kis-értékek meghatározásához az adatokat McPherson EBDA [J. Pharmacol. Methods, 14, 213-228 (1985)] és Munson és Rodbard, LIGAND [Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980)] programját alkalmazva a nemlineáris görbeillesztési módszerrel analizáltuk. A receptor- és összehasonlító vizsgálatok eredményeit a 2-4. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat

Oxitocikus biológiai vizsgálat	ADH biológiai vizsgálat
ÓTA*	pA₂	relatív antioxitocikus aktivitás	pA,	relatív anti-ADH- aktivitás	anti-OT/anti-ADH arány
A	7,35	0,7	7,66	1,000	0,70
B	7,51	1,0	7,40	0,550	1,82
C	7,77	1,7	5,51	0,007	242,86
D	8,86	22,4	<5,75	0,012	>1866,7

* A vcgyülct=(Pmp¹,D-Phe²,Phe³,Ilc⁴,Arg⁸)-oxitocin [Manning cs társai, J. Med. Chem., 26, 1607-1613 (1983)] B vcgyülct=(Pmp^l,D-Trp²,Phe³,Ilc⁴,Arg^s)-oxitocin (=Antag I)

C vcgyülct=(Pmp¹,D-Trp²,Arg⁸)-oxitocin (=Antag 11)

D vegyülct=[(S)Pmp',D-Trp²,Pcn⁶,Arg⁸]-oxitocin (=Atitag 111)

HU 217 972 Β

A 2. táblázat adataiból kitűnik, hogy a találmány szerinti D vegyület nagyobb antioxitocin hatással rendelkezik, mint a másik három vegyület, továbbá az antiADH-aktivitása sokkal kisebb. A D vegyület antioxitocin/anti-ADH-hányadosa nagyobb, mint 1866,60, míg az A vegyület hányadosa 0,7, a B vegyület hányadosa 1,8, a C vegyület hányadosa 242,9. Ezek az adatok igazolják, hogy a D vegyület hatékony dózisban való alkalmazása esetén kevesebb anti-ADH-mellékhatással kell számolni, mint a B, C vagy A vegyület alkalmazásakor.

A 3. táblázat patkányméhreceptor-vizsgálat alapján becsült és a biológiai vizsgálattal kapott kötőaffinitás(Kas) adatokat tartalmazza. A Log₁₀Ka és a Log|₀ED₅₀közötti korreláció szignifikáns (r=0,92; p<0,01).

Az 5. táblázat az Antag III (D vegyület) és Antag I (B vegyület) összehasonlító relatív aktivitásait tartalmazza patkányméhreceptor-vizsgálattal és biológiai vizsgálattal. Mindkét vizsgálat alapján az Antag III hússzor hatékonyabb, mint az Antag I.

A 4. táblázat a különböző OT-antagonisták humán méh OTr-hez való kötőaffinitását tartalmazza a patkány vizsgálati eredményekhez hasonlítva. A Log,₀Ka és a Log|₀ED₅₀ közötti korreláció szignifikáns (r=0,95; p<0,01). Az Antag III versus Antag I humán OTr-hez (hOTr) való kötőaktivitást az 5. táblázat tartalmazza. Az adatok alapján az Antag III nyolcvanszor hatékonyabb, mint az Antag I. Ezért úgy tűnik, hogy a patkány vizsgálattal kapott adatok alábecsülik az Antag III humán relatív hatékonyságát. Ezt valószínűsítik a terhes cerkófmajommal végzett alább ismertetett in vivő kísérletek is.

3. példa

Vegyületek vizsgálata terhes cerköfmajmokon (baboont)

A vizsgálat célja az volt, hogy tisztázzuk a négy oxitocin-antagonista relatív in vivő aktivitását lekötözött, terhes cerkófmajommodellt alkalmazva, és a kapott eredményeket összehasonlítsuk a patkány- és humán OTr-vizsgálatok eredményeivel. Az emberhez való fiziológiai és anatonómiai hasonlósága miatt a cerkóímajom kiváló állatmodell [lásd laboratóriumunk publikációit: Am. J. Obstet Gynecol., 163, 1818-1882 (1990); Am. J. Obstet Gynecol., 165, 1487-1498 (1990) és más laboratóriumok publikációi: Endocrine Reviews, 11,

124-150 (1990), 11, 151-176 (1990)]. A terhes cerkófmajmokat a terhesség 130-145. napja között vizsgáltuk (szállítás =184. napon). Az oxitocin-antagonistát intraarteriálisan 1 mg bolusinjekció formájában adagoltuk, majd 1 perc múlva oxitocin-infüziót adtunk. Az oxitocint folyamatosan adtuk, a kezdő dózis 10 mU/perc volt, majd minden 20 percben a dózist megkétszereztük mindaddig, míg a 400 mU/perc dózist el nem értük, vagy míg az Összehúzódási erő [CF = (frekvenciaxamplitúdó)/10 perc] nem volt szignifikáns (CF>50). Ha nem volt szignifikáns válasz, az oxitocinnal provokált vizsgálatot 24 óra múlva megismételtük. Az antagonista-válaszintervallumot (ARI) oly módon határoztuk meg, hogy az első szignifikáns méhösszehúzódáshoz szükséges időt (percben mérve) megszoroztuk a pulzushányadossal (CF/OT-koncentráció). Az eredményeket az 5.

táblázat tartalmazza. Az antagonisták 4/5-ének ARIértékei és patkány- és humán OTr-kötő affinitásának értékei (Ka) jól korreláltak (r=0,98; p<0,01). Egy oxitocinantagonista (F vegyület, 5. táblázat) a vizsgált dózisban nem mutatott gátló hatást, annak ellenére, hogy a patkány- és humán OTr és a patkánybiológiai vizsgálatban közepesen erős kötőaffinitást mutatott. Ezt az oxitocinantagonistát nem a laboratóriumunkban állítottuk elő és nem oxitocin-analóg. A legjobb vizsgált oxitocin-antagonista (a találmány szerinti D új vegyület) az oxitocinantagonistára adott válasz több mint 24 óráig blokkolta. A B és D vegyület különböző OT-antagonisták relatív aktivitásával való összehasonlítása azt igazolja, hogy a D vegyület [(S)Pmp>,D-Trp², Pen^{3 * * 6 *},Arg⁸]-oxitocin (Antag III) körülbelül 130-szor hatékonyabb, mint a B vegyület. Összegezve: az Antag III (D vegyület), Antag II (B vegyület) relatív aktivitáshányadosa a patkánybiológiai vizsgálat, patkányreceptor-vizsgálat, humánreceptorvizsgálat és in vivő cerkófmajom-biológiai vizsgálat alapján rendre 22, 20 és 133. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a patkánybiológiai vizsgálat esetleg az Antag Ill-at kevésbé hatékonynak mutatja a valóságosnál.

3. táblázat

Oxitocin-antagonisták relatív méhreceptorkötő képességének (Ka) és biológiai vizsgálat szerinti gátló aktivitásának (ED₅₀) összehasonlítása

Oxitocin- antagonista	Rcceptorbiológiai vizsgálat Ka(10⁺⁸M-')	Oxitocikus biológiai vizsgálat ED₅₀ (nM)
A	0,39	44,76
B	1,16	30,90
C	2,03	16,98
C2	11,50	1,91
D	24,40	1,38
E	0,51	102,33
F	5,89	19,93

Receptorvizsgálat - terhes patkányméh (P 21)

Biológiai vizsgálat - cstrous állapotú patkányméh

A - Mannig és munkatársai ismertetik, J. Med. Chem., 26:1607,1983

B - (Pmp^l,D-Trp²,Phc³,Ilc⁴,Arg⁸)-oxitoxin=Antag I

C - (Pmp^l,D-Trp²,Arg⁸)-oxitoxin=Antag II

C2 - (Pmp¹,D-Trp²,Pcn⁶,Arg⁸)-oxitoxin=Antag II 2

D - [(S)Pmp^l,D-Trp²,Pen⁶,Arg⁸]-oxitoxin=Antag III

E - [Mpa*,D-Tyr(Et)²,Thr⁴,Orn⁸]-oxitoxin=Atoxiban

F - L 3 66,948 (Merck)

4. táblázat

Oxitocin-antagonisták humán myometrial szövetben való méhreceptor kötő hatásának (Ka) és patkányméh biológiai vizsgálatban mutatott gátló hatásának (ED₅₀) összehasonlítása

ÓTA	Receptorbiológiai vizsgálat Ka(IO*⁸M ')	Biológiai vizsgálat ED_S0 (nM)
B	0,51	30,9
C	1,82	17,0

HU 217 972 Β

4. táblázat (folytatás)

ÓTA	Receptorbiológiai vizsgálat Ka(IO^+sM-')	Biológiai vizsgálat ED₅₀ (nM)
D	41,7	1,38
E	0,53	102,3
F	2,49	20,23

Receptorvizsgálat - nőkből C-sectióval vett myometrial-szövet Biológiai vizsgálat - cstrous patkánymeh B F vegyület - a 3. táblázatnál megadott

5. táblázat oxitocin-antagonista terhes cerkófmajómnál mért biológiai aktivitásának (ARI), humán és patkányoxitocin-receptor (OTr) kötőaffinitásának, valamint biológiai vizsgálatával kapott hatásának összehasonlítása

ÓTA	ARI	ARI (ÓTA/ANTI)	ROTr (OTA/ANTI)	hOTr (OTA/ANTI)	Biológiai (OTA/ANTI)
B	59	1	L0	1,0	1,0
C	547	9	1,8	3,6	L8
D	7856	133	20,0	81,8	22,1
E	-	-	0,4	1,0	0,3
F	0	0	5,1	4,9	1,5

ARI - antagonista-válaszintervallum terhes cerkófmajmoknál (lásd a számítások ismertetését) rOTr - patkány-oxitocin-rcccptor hOTr - humán oxitocin-reccptor

Biológiai vizsgálat - patkánybiológiai vizsgálat

ANTI - ANTAG1

B-F vegyületek - a 3. táblázatnál megadott

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1 . (S) Pmp-D-Tr p-11e-Gln-Asn-Pen-Pr o-Ar g-G1y-NH₂

I I s - s képletű, oxitocin-antagonista hatású oktapeptid vagy
2. Gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként gyógyászatilag alkalmazható sója.

(S)Pmp-D-T r p-11e-G1n-As n-Pe n-Pr o-Arg-G1y-NH₂

S - S képletű, oxitocin-antagonista hatású oktapeptidet vagy gyógyászatilag alkalmazható sóját tartalmazza.
3. A 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény méhösszehúzódás, tejhiány és koraszülés megakadályozására, dysmenorrhoea gátlására, oxitocinnal megindított szülés esetén a túlságosan felerősített méhösszehú45 zódások gyengítésére vagy magas vérnyomás kezelésére.