SI9600273A - Postopek izdelave /3'-dezoksi-3'-okso-MeBmt/I ciklosporina - Google Patents

Abstract

Postopek za izdelavo ciklosporina s formulo IIv kateri je A ostanek 3'-dezoksi-3'-okso-MeBmt; B je -alfa Abu-, -Thr-, -Val- ali -Nva-; X je -Sar- ali ostanek optično aktivnega alfa-N-metiliranega alfa-amino kislinskega ostanka z (D)-konfiguracijo in Y je -Val- ali dodatno, če je B enak Nva, Nva, ki obsega kultiviranje organizma, da tvori intermediatni ciklosporin s formulo II, v kateri je A enak MeBmt, rekuperiranje intermediatnega ciklosporina in selektivno oksidiranje intermediatnega ciklosporina, da nastane ciklosporin s formulo II, v kateri je A ostanek 3'-dezoksi-3'-okso-MeBmt. Ta spojina je koristna za povečevanje občutljivosti za terapije s kemoterapevtskimi zdravili ali za povečanje učinkovitosti teh terapij, ki vklučujejo antiparazitično, posebno pa antineoplastično ali citostatično kemoterapijo.ŕ

Description

SANDOZA.G.

Postopek za izdelavo ^-dezoksi-S^okso-MeBmt]¹ ciklosporina

Predloženi izum se nanaša na postopek za izdelavo [S^dezoksi^-okso-MeBmt]¹ ciklosporina, posebno na postopek za izdelavo (T-dezoksi^-okso-MeBnit]¹[Nva]²-ciklosporina ali [T-dezoksi-S^okso-MeBmtf-fValp-ciklosporina, pri čemer MeBmt pomeni N-metiI-(4R)-4-but-2E-en-l-il-4-metil-(L)treonil, Nva pa je okrajšava za norvalinski ostanek.

Predloženi izum torej zagotavlja postopek za izdelavo [3’-dezoksi-3’-oksoMeBmtp-ciklosporina s formulo II

II »-A-B-X-MeLeu-Y-MeLeu-Ala- (D) Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal123456 7 8 9 10 11 v kateri je

A ostanek 3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt;

B je -aAbu-, -Thr-, -Val- ali -Nva-;

X je -Sar- ( = sarkozinski ostanek) ali ostanek optično aktivnega a-Nmetiliranega α-amino kislinskega ostanka z (D)-konfiguracijo in

Y je -Val- ali dodatno, če je B enak Nva, Nva, ki obsega kultiviranje organizma, da tvori intermediatni ciklosporin s formulo

II, v kateri je A enak MeBmt, rekuperiranje intermediatnega ciklosporina in selektivno oksidiranje intermediatnega ciklosporina, da nastane ciklosporin s formulo II, v kateri je A ostanek 3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt.

Spojine s formulo II, v kateri je A ostanek 3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt, so koristne za povečevanje občutljivosti za terapijo s kemoterapevtskimi zdravili ali za povečevanje učinkovitosti te terapije, posebno pa so koristne za reverziranje odpornosti različnih tipov (npr. pridobljene ali prirojene) za kemoterapevtska zdravila, ali za povečevanje in krepljenje občutljivosti za terapijo z zdravili, ki jih dajemo. Oblike terapij s kemoterapevtskimi zdravili, pri katerih te spojine lahko uporabimo, vključujejo npr. antiparazitično, npr. antivirusno, antibakterijsko ali antiprotozojsko kemoterapijo, posebno pa antineoplastično ali citostatično kemoterapijo.

Posebno prednostni ciklosporini, ki jih lahko izdelamo z uporabo postopka v smislu izuma, so [3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt]¹-[Nva]²-ciklosporin ali posebno [3’dezoksi^-okso-MeBmtp-fVal^-ciklosporin. Te spojine pripravimo z oksidiranjem [Nva]²-ciklosporina in [Val]²-ciklosporina in ti oksidacijski postopki per se so vključeni v obseg predloženega izuma.

V skladu s tem je nadaljnji vidik predloženega izuma postopek za izdelavo [3’dezoksi^-okso-MeBmtmB^-ciklosporina, kjer je B’ Nva ali Val, ki obsega oksidiranje [B’]²-ciklosporina. [Val]²-ciklosporin je tudi znan kot ciklosporin D.

[B’]² ciklosporin za uporabo v oksidacijskem postopku lahko dobimo s kultiviranjem organizma, ki tvori [B’]²-ciklosporin, ali pa z delno ali popolno sintezo, ki vključuje derivatizacijo drugačnega ciklosporina ali sorodnega fermentacijskega produkta.

Katerokoli prikladno oksidcijsko sredstvo, topilo, katalizator ali reakcijske pogoje ali sheme lahko uporabimo v oksidacijski stopnji postopka v smislu predloženega izuma ali postopka z nadaljnjega vidika. Prikladni reagenti za oksidacijsko reakcijo vključujejo dimetilsulfid v kombinaciji z N-kloro-sukcinimidom ali prednostno dimetil sulfoksid v kombinaciji z Ν,Ν’-dicikloheksilkarbodiimidom, prednostno v nepolarnem organskem topilu, kot je toluen. Bolj prednostno pa uporabimo dodecil metil sulfoksid v kombinaciji z Ν,Ν’-dicikloheksilkarbodiimidom kot oksidacijsko sredstvo v topilu, kot je toluen. Dodecil metil sulfoksid je prednosten tako glede na dimetil sulfid kot tudi na dimetil sulfoksid, kajti dimetil sulfid je nezaželen zaradi var3 nostnih in ekoloških razlogov, dimetil sulfoksid pa povzroča nastajanje dimetil sulfida kot stranskega produkta reakcije. Prisotni pa so tudi problemi zaradi neželenih vonjav, nastalih pri uporabi dodecil metil sulfoksida. Prednostno oksidacijsko reakcijo izvedemo pri nizki temperaturi, npr. od -15 do +20 °C.

Predloženi izum je nadalje ponazorjen z naslednjim primerom, ki opisuje pripravo [T-dezoksi^-okso-MeBmtf-fVal^-ciklosporina.

PRIMER

a. Priprava ciklosporina D

Ciklosporin D (tudi znan kot [Val]²-ciklosporin) pripravimo s fermentacijo prikladnega organizma, kot je Tolypoclad,ium inflatum GAMS (deponiran pri US Northern Regional Research Laboratories Culture Collection kot depozit št. NRRL 8044), rekuperiranjem iz fermentacijske juhe in nato čiščenjem, kot je opisano spodaj.

500 1 hranilne raztopine, ki vsebuje na liter: 40 g glukoze, 2 g natrijevega kazeinata, 2,5 g amonijevega fosfata, 5 g MgSO₄.7H₂O, 2 g KE1₂PO₄, 3 g NaNO₃,0,5 g KC1,0,01 g FeSO₄ in demineralizirano vodo po 11, inokuliramo s 501 predkulture seva NRRL 8044 in inkubiramo v fermentorju iz nerjavnega jekla ob mešanju (170 obr./min) in aeraciji (1 1 zraka/minuto/1 hranilne raztopine) 13 dni pri 27 °C (glej objavljeno nemško patentno prijavo 2 455 859).

Kulturni likvor zmešamo z enako količino n-butil acetata, koncentriramo z uparjenjem v vakuumu po ločitvi organske faze in surovemu ekstraktu odstranimo maščobe s tristopenjsko porazdelitvijo med metanol/vodo (9:1) in petroleter. Metanolno fazo ločimo, koncentriramo z upaijenjem v vakuumu in surovi produkt oborimo z dodatkom vode. Snov, ki jo dobimo po filtraciji, kromatografiramo na silikagelu s heksanom/acetonom (2:1) kot eluantom. Začetne eluirane frakcije vsebujejo predominantno ciklosporin A in ciklosporin D, kasneje eluirane frakcije pa vsebujejo predominantno ciklosporin C. Frakcije, ki vsebujejo ciklosporin A in D, za nadaljnje čiščenje kristaliziramo iz 2- do 2,5-kratne količine acetona pri -15 °C. Kristalizirano snov nadalje kromatografiramo 2-krat na silikagelu, frakcije, ki se na začetku eluirajo z etil acetatom, nasičenim z vodo, vsebujejo ciklosporin D v zelo obogateni obliki. Le-te raztopimo v 2-kratni količini acetona in pustimo kristalizirati pri -15 °C. Nastali surovi kristalni produkt ciklosporina D raztopimo za nadaljnjo čiščenje v 10-kratni količini acetona, dodamo 2 mas.% aktivnega oglja in segrevamo 5 minut pri 60 °C. Bistri in skoraj brezbarvni filtrat, ki ga dobimo po filtraciji preko smukca, koncentriramo z upaijenjem do tretjine njegovega volumna in pustimo, da se ohladi na sobno temperaturo, nato pa ciklosporin D kristalizira spontano. Kristalizacija je končana potem, ko zmes pustimo, da stoji pri -17 °C. Kristale, ki jih dobimo s filtracijo, izperemo z majhno količino ledeno-hladnega acetona in nato posušimo v visokem vakuumu pri 80 °C v 2 urah.

Označitev ciklosporina D

Brezbarvni prizmatični kristali; tal.: 148°-151 °C.

[a]²⁰D = -245° (c=0,52 v kloroformu) [a]²⁰D = -211° (c=0,51 v metanolu)

b. Priprava dodecil metil sulfoksida

478 g (2,2 mol) dodecil metil sulfida, 52,5 g ledocta in 11 brezvodnega etanola združimo in segrejemo na 70 °C ob mešanju. V 90 minutah ob mešanju dodamo 215 g (2,2 mol) vodikovega peroksida v 540 ml vode, nato pa mešanje nadaljujemo približno 1 uro, dokler ni reakcija vsaj 90 % izpopolnjena, kar določimo s plinsko kromatografsko analizo. Zmes nato ohladimo na 20-25 °C in dodamo raztopino 27 g natrijevega metabisulfita v 41 ml vode, nato pa nastalo zmes mešamo 20 minut ob vzdrževanju temperature pri 20-25 °C. Nato dodamo 3 1 toluena in raztopino 93 g natrijevega bikarbonata v 1,07 1 vode, zmes mešamo in pustimo, da se fazi ločita. Vodno fazo nato zavržemo, organsko fazo izperemo z 1 1 vode, izpiralno vodo zavržemo in organsko fazo koncentriramo ob znižanem tlaku do volumna približno 1,25 1. Koncentrat segrejemo na 50-55 °C in dodamo 1,51 heksana. Nastalo raztopino nato cepimo s kristali dodecil metil sulfoksida in ohladimo v približno 1 uri na 2025 °C in nato mešamo pri tej temperaturi. Raztopino nato ohladimo na 0-5 °C v približno 30 minutah, mešamo pri tej temperaturi približno 3 ure in trdno oborino zberemo s centrifugiranjem. Trdno snov nato izperemo s 400 ml hladnega (0 °C) heksana in posušimo pri temperaturi, ki višja od 60 °C ob znižanem tlaku, da dobimo 462 g dodecil metil sulfoksida (približno 90 % teoretičen dobitek).

c. Oksidacija ciklosporina D v [3^,-dezoksi-3^,-okso-MeBmtU-[Val]-ciklosporin

269 g (0,22 mol) čistega ciklosporina D raztopimo v 2,95 1 toluena, dodamo 283 g (1,22 mol) dodecil metil sulfoksida, pripravljenega, kot je opisano zgoraj, zmes ohladimo na 0-5 °C in dodamo 78 g dikloroocetne kisline skupaj z nadaljnjimi 50 ml toluena. Temperaturo reakcijske zmesi vzdržujemo pri 0-5 °C približno 45 minut in nato dodamo raztopino 205 g (0,99 mol) Ν,Ν’-dicikloheksilkarbodiimida v 290 ml toluena. Reakcijsko zmes mešamo približno 30 minut, dokler reakcija ni vsaj 95 % izpopolnjena, kar določimo s HPLC. Dodamo raztopino 81 g (0,64 mol) oksalne kisline v 630 ml vode in nastalo zmes mešamo pri 0-5 °C približno 3 ure. Nastale trdne snovi ločimo s centrifugiranjem in izperemo s 440 ml hladnega (5 °C) toluena in trdne snovi nato zavržemo. Tekočo frakcijo reakcijske zmesi in izpiralne tekočine nato združimo, faze pustimo, da se ločijo, vodno fazo zavržemo in dodajamo vodno raztopino natrijevega bikarbonata (80 g v 1,25 1) k organski fazi do vrednosti pH 7-8. Po mešanju faze pustimo, da se ločijo, vodno fazo zavržemo in organsko fazo izperemo s 650 ml vode. Izpiralno vodo zavržemo in organsko fazo uparimo do suhega pri znižanem tlaku, pri temperaturi, ki ni višja od 60 °C. Ostanek raztopimo v zmesi 560 ml izopropilacetata in 10 ml vode ob segrevanju na 55-60 °C. V približno 30 minutah raztopino ohladimo na približno 40 °C in cepimo s kristali dodecil metil sulfoksida. Nato zmes v približno 20 minutah ohladimo na -10 do -15 °C in mešamo pri tej temperaturi približno 4 ure. Trdne snovi odstranimo s centrifugiranjem, izperemo s 390 ml izopropilacetata in nato zavržemo. Tekočo frakcijo reakcijske zmesi in izpiralne tekočine nato združimo, da dobimo 1,28 kg raztopine, ki vsebuje približno 256 g [3’dezoksi-S^okso-MeBmtp-fVal^-ciklosporina (približno 95 % teor. dobitek).

Raztopino, dobljeno kot je opisano zgoraj, obogatimo s kromatografijo na silikagelu. Pripravimo dve koloni, tako da vsaka vsebuje 1 kg silikagela, suspendiranega v 2,5 1 izopropil acetata in vsako napolnimo s 162 g raztopine. Koloni eluiramo pri pretočni hitrosti 500 ml/uro z izopropil acetatom, nasičenim z vodo in frakcije zberemo v območju prvih 4 1 (prvi eluat), naslednjih 500 ml(drugi eluat), naslednjih 4,5 1 (tretji eluat) in naslednjega 11 (četrti eluat). S HPLC določimo, da je želeni produkt v tretjem eluatu. Tako prve eluate zavržemo, druge in četrte pa ohranimo za reprocesiranje. Tretje eluate iz obeh kolon združimo, koncentriramo pri znižanem tlaku do volumna približno 320 ml in nato uparimo do suhega pri znižanem tlaku pri temperaturi, ki ni višja od 60 °C, da dobimo približno 40 g produkta.

Ta produkt nadalje očistimo s kristalizacijo iz terc.butil metil etra. Za nastali očiščeni [3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt]’-[Val]²-ciklosporin določimo, da ima tališče v območju od 195-198 °C, optično rotacijo [a]²⁰D = -255,1 ⁰ (c=0,5 v CHC1₃) in molekulsko maso 1214,65.

[3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt]’-[Nva]²-ciklosporin lahko pripravimo analogno z oksidacijo [Nva]²-ciklosporina v bistvu tako, kot je opisano zgoraj za oksidacijo [Val]²-ciklosporina.

Claims (6)

1. Postopek za izdelavo ciklosporina s formulo II

II i-A-B-X-MeLeu-Y-MeLeu-Ala- (D) Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-t 123 4 5 6 7 8 9 10 11 v kateri je

A ostanek 3’-dezoksi-3’-okso-MeBmt;

B je -aAbu-, -Thr-, -Val- ali -Nva-;

X je -Sar- ali ostanek optično aktivnega a-N-metiliranega α-amino kislinskega ostanka z (D)-konfiguracijo in

Y je -Val- ali dodatno, če je B enak Nva, Nva, označen s tem, da obsega kultiviranje organizma, da tvori intermediatni ciklosporin s formulo II, v kateri je A enak MeBmt, rekuperiranje intermediatnega ciklosporina in selektivno oksidiranje intermediatnega ciklosporina, da nastane ciklosporin s formulo II, v kateri je A ostanek 3’-dezoksi-3’-oksoMeBmt.

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da je uporaben za izdelavo [3’-dezoksi3’-okso-MeBmt]¹-[Nva]^{2 3 4 5}-ciklosporina ali (^-dezoksi^-okso-MeBmtp-JVal]²ciklosporina.

3. Postopek za izdelavo p^dezoksi^-okso-MeBintp-fB^-ciklosporina, kjer je B’ Nva ali Val, označen s tem, da obsega oksidiranje [B’]²-ciklosporina.

4. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da dimetilsulfid v kombinaciji z N-klorosukcinimidom uporabimo kot oksidacijsko sredstvo.

5. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označen s tem, da dimetil sulfoksid v kombinaciji z Ν,Ν’-dicikloheksilkarbodimidom ali dodecil metil sulfoksid v kombinaciji z Ν,Ν’-dicikloheksilkarbodimidom uporabimo kot oksidacijsko sredstvo.

6. Postopek po zahtevku 4 ali 5, označen s tem, da ga izvedemo pri temperaturi med -15 °C in +20 °C v nepolarnem organskem topilu, kot je toluen.