ES2245272A6 - Mejoras introducidas en el objeto de la patentes española es2059558 que consiste en un proceso mejorado para la produccion de una ciclosporina. - Google Patents
Mejoras introducidas en el objeto de la patentes española es2059558 que consiste en un proceso mejorado para la produccion de una ciclosporina.Info
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- ES2245272A6 ES2245272A6 ES009302382A ES9302382A ES2245272A6 ES 2245272 A6 ES2245272 A6 ES 2245272A6 ES 009302382 A ES009302382 A ES 009302382A ES 9302382 A ES9302382 A ES 9302382A ES 2245272 A6 ES2245272 A6 ES 2245272A6
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Abstract
Mejoras introducidas en el objeto de la patente Española ES2059558 consistiendo dichas mejoras en un proceso para la producción de una ciclosporina de fórmula II. La invención comprende cultivar un organismo para producir una ciclosporina intermedia de fórmula II en donde A es MeBmt, recuperar la ciclosporina intermedia y oxidarla selectivamente para producir una ciclosporina de fórmula II en donde A es un residuo 3''-desoxi-3''-oxo-MeBmt. Los compuestos así obtenidos son útiles a la hora de aumentar la sensibilidad a la terapia con fármacos quimioterapéuticos o a la hora de aumentar la eficacia de dicha terapia.
Description
Mejoras introducidas en el objeto de la patente
española ES2059558 que consisten en: "Un proceso mejorado para la
producción de una ciclosporina".
Esta invención se relaciona con un proceso
mejorado para la producción de
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}
ciclosporina, en particular con un proceso mejorado para la
producción de
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[Nva]^{2}-Ciclosporina
o
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[Val]^{2}-Ciclosporina.
Esta invención constituye una adición a la
invención descrita en la patente española ES 2059558 relativa al
uso de ciclosporinas y nuevas ciclosporinas como nuevos compuestos
per se, donde se proponen diferentes procesos de síntesis de
las mismas, bien por procedimientos sintéticos, semisintéticos y
por aplicación de técnicas de cultivo modificadas. Por tanto, las
mejoras introducidas en el objeto de la patente española ES 205955
consisten en un proceso mejorado relacionado con la aplicación de
técnicas de cultivo modificadas para la producción de una
ciclosporina de fórmula II:
en
donde:
A es un residuo
3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt;
B es -\alphaAbu-, -Thr-, -Val- o -Nva-;
X es -Sar- o el residuo de un residuo
\alpha-aminoácido
\alpha-N-metilado, ópticamente
activo, que tiene la configuración (D); e
Y es -Val-, pudiendo ser trambién Nva cuando B es
Nva; son útiles a la hora de aumentar la sensibilidad a la terapia
con fármacos quimioterapéuticos o a la hora de aumentar la eficacia
de dicha terapia y, en particular, son útiles a la hora de invertir
la resistencia a fármacos quimioterapéuticos de tipos variables
(por ejemplo, adquirida o innata), o bien a la hora de aumentar o
restablecer la sensibilidad a la terapia de administración de
fármacos. Formas de terapia con fármacos quimioterapeúticos, a las
cuales puede aplicarse la presente invención, incluyen, por
ejemplo, quimioterapias anti-parasíticas, por
ejemplo anti-virales,
anti-bacteriales o
anti-protozoarias y, en particular, quimioterapia
anti-neoplástica o citostática.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un proceso mejorado para la producción de una
ciclosporina de fórmula II como se ha definido anteriormente, cuyo
proceso comprende cultivar un organismo para producir una
ciclosporina intermedia de fórmula II en donde A es MeBmt,
recuperar la ciclosporina intermedia y oxidar selectivamente la
ciclosporina intermedia para producir una ciclosporina de fórmula
II en donde A es un residuo
3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt.
Ciclosporinas particularmente preferidas que
pueden ser producidas empleando el proceso de la invención son
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}
-[Nva]^{2}-Ciclosporina o especialmente
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]'-[Val]^{2}-Ciclosporina.
Estos compuestos se preparan por oxidación de
[Nva]^{2}-Ciclosporina y
[Val]^{2}-Ciclosporina y, alcance de la
invención, quedan incluidos estos procesos de oxidación per
se.
Por tanto, según otro aspecto, la invención
proporciona un proceso para la producción de
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[B']^{2}-Ciclosporina
en donde B' es Nva o Val, cuyo proceso comprende oxidar
[B']^{2}-Ciclosporina. La
[Val]^{2}-Ciclosporina se conoce también como ciclosporina D.
[Val]^{2}-Ciclosporina se conoce también como ciclosporina D.
La [B']^{2} Ciclosporina para utilizarse en el
proceso de oxidación, puede obtenerse mediante cultivo de un
organismo productor de [B']^{2}-Ciclosporina, o
bien puede obtenerse por síntesis parcial o completa, incluyendo la
derivación de una ciclosporina diferente o producto de fermentación
relacionado.
En la etapa de oxidación del proceso mejorado de
la invención o del proceso según el otro aspecto anteriormente
mencionado, se pueden emplear cualquier agente oxidante, disolvente,
catalizador o condiciones o esquema de reacción que resulten
adecuados. Reactivos adecuados para la reacción de oxidación
incluyen sulfuro de dimetilo en combinación con
N-cloro-succinimida o
preferentemente dimetilsulfóxido en combinación con
N,N'-diciclohexilcarbodiimida, preferentemente en un
disolvente orgánico no polar tal como tolueno. Más preferentemente,
sin embargo, como agente oxidante se utiliza dodecilmetilsulfóxido
en combinación con N,N'-diciclohexilcarbodiimida en
un disolvente tal como tolueno. Se prefiere el
dodecilmetilsulfóxido tanto con respecto al sulfuro de dimetilo
como con respecto al dimetilsulfóxido, dado que el sulfuro de
dimetilo es indeseable por motivos de seguridad y ecología y el
dimetilsulfóxido dá lugar a la producción de sulfuro de dimetilo
como subproducto de la reacción. Igualmente, se presentan menos
problemas de olor indeseable asociados con el uso del
dodecilmetilsulfóxido. Preferentemente, la reacción de oxidación se
lleva a cabo a una baja temperatura, por ejemplo, de -15 a
+20ºC.
La invención se describirá ahora, solo a título
ilustrativo, en el siguiente ejemplo el cual describe la
preparación de
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[Val]^{2}-Ciclosporina.
La Ciclosporina D (conocida también como
[Val]^{2}-Ciclosporina) se prepara por
fermentación de un organismo adecuado, tal como Tolypocladium
inflatum GAMS (depositado en la US Northern Regional Research
Laboratories Culture Collection con el nº de depósito NRRL 8044),
recuperado del caldo de fermentación y posteriormente purificado en
la forma descrita a continuación.
500 l de una solución nutriente que contiene, por
l, 40 g de glucosa, 2 g de caseinato sódico, 2,5 g de fosfato
amónico, 5 g de MgSO_{4}7H_{2}O, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 3 g de
NaNO_{3}, 0,5 g de KCl, 0,01 g de FeSO_{4} y agua
desmineralizada hasta 1 l, se inoculan con 50 l de un
pre-cultivo de la cepa NRRL 8044 y se incuba en un
fermentador de acero bajo agitación (170 rpm) y aireación (1 l de
aire/minuto/1 l de solución nutriente) durante 13 días a 27ºC
(véase la solicitud de Patente Alemana publicada 2 455 859).
El licor de cultivo se agita con la misma
cantidad de acetato de n-butilo, se concentra por
evaporación en vacío después de la separación de la fase orgánica y
el extracto en bruto se desgrasa mediante una distribución en tres
etapas entre metanol/agua (9:1) y éter de petróleo. La fase
metanólica se separa, se concentra por evaporación en vacío y el
producto en bruto se precipita por la adición de agua. el material
obtenido trás la filtración, se cromatografía sobre gel de sílice
con hexano/acetona (2:1) como eluyente. Las fracciones inicialmente
eluidas contienen predominantemente ciclosporina A y ciclosporina D
y las fracciones eluidas posteriormente contienen de forma
predominante ciclosporina C. Para la purificación adicional, las
fracciones que contienen ciclosporina A y D se cristalizan en una
cantidad de 2-2,5 veces de acetona a -15ºC. El
cristalizado se cromatografía adicionalmente dos veces sobre gel de
sílice, conteniendo ciclosporina D, en una forma enormemente
enriquecida, aquellas fracciones eluidas inicialmente con acetato
de etilo saturado con agua. Estas fracciones se disuelven en la
cantidad doble de acetona y se dejan cristalizar a -15ºC. El
producto cristalino en bruto de ciclosporina D resultante se
disuelve, para su purificación adicional, en una cantidad de 10
veces de acetona, se añade 2% en peso de carbón vegetal activo y se
efectúa un calentamiento durante 5 minutos a 60ºC. El filtrado
limpio y casi incoloro obtenido trás la filtración sobre talco, se
concentra por evaporación a un tercio de su volumen y se deja
enfriar a temperatura ambiente, trás lo cual la ciclosporina D
cristaliza de forma espontánea. La cristalización se completa
mediante reposo a -17ºC. Los cristales obtenidos por filtración se
lavan con una pequeña cantidad de acetona enfriada con hielo y
posteriormente se secan en alto vacio a 80ºC durante 2 horas.
Cristales prismáticos incoloros, P.F.
148-151ºC.
[\alpha]_{D}^{20} = -245º (c=0,52 en
cloroformo)
[\alpha]_{D}^{20} = -211º (c=0,51 en
metanol)
Se combinan y calientan a 70ºC, con agitación,
478 g (2,2 moles) de dodecilmetilsulfuro, 52,5 g de ácido acético
glacial y 1 l de etanol anhidro. En el espacio de 90 minutos, se
añade, con agitación, una solución de 215 g (2,2 moles) de peróxido
de hidrógeno en 540 ml de agua y se continua la agitación durante 1
hora aproximadamente y hasta que la reacción se ha completado al
menos en un 90%, tal y como se determina por análisis
cromatográfico en fase gaseosa. La mezcla se enfría entonces a
20-25ºC y se añade una solución de 27 g de
metabisulfito sódico en 41 ml de agua y la mezcla resultante se
agita durante 20 minutos, mientras se mantiene la temperatura en
20-25ºC. Se añaden entonces 3 l de tolueno y una
solución de 93 g de bicarbonato sódico en 1,07 l de agua, se agita
la mezcla y las fases se dejan que se separen. La fase acuosa se
desecha entonces, la fase orgánica se lava con 1 l de agua, se
desecha el agua de lavado y la fase orgánica se concentra bajo
presión reducida a un volumen de 1,25 l aproximadamente. El
concentrado se calienta a 50-55ºC y se añaden 1,5 l
de hexano. La solución resultante se siembra entonces con cristales
de dodecilmetilsulfóxido y se enfría durante un periodo de 1 hora
aproximadamente a 20-25ºC, trás lo cual se agita a
esta temperatura. La solución se enfría entonces a
0-5ºC en el espacio de un periodo de 30 minutos
aproximadamente, se agita a esta temperatura durante 3 horas
aproximadamente y el precipitado sólido se recoge por centrifugado.
El sólido se lava luego con 400 ml de hexano frío (0ºC) y se seca a
una temperatura no superior a 60ºC bajo presión reducida, para
obtener un rendimiento de 462 g de dodecilmetilsulfóxido
(aproximadamente 90% del rendimiento teórico).
Se disuelven 269 g (0,22 moles) de ciclosporina D
pura en 2,95 l de tolueno, se añaden 283 g (1,22 moles) de
dodecilmetilsulfóxido preparado como se ha descrito anteriormente,
se enfría la mezcla a 0-5ºC y se añaden 78 g de
ácido dicloroacético junto con 50 ml más de tolueno. La temperatura
de la mezcla de reacción se mantiene en 0-5ºC
durante 45 minutos aproximadamente, trás lo cual se añade una
solución de 205 g (0,99 moles) de
N,N'-diciclohexilcarbodiimida en 290 ml de tolueno.
La mezcla de reacción se agita durante 30 minutos aproximadamente y
hasta que la reacción se ha completado al menos en un 95% tal y
como se determina mediante cromatografía HPLC. Se añade una
solución de 81 g (0,64 moles) de ácido oxálico en 630 ml de agua y
la mezcla resultante se agita a 0-5ºC durante 3
horas aproximadamente. Los sólidos formados se separan por
centrifugado y se lavan con 440 ml de tolueno frío (5ºC) y los
sólidos se desechan posteriormente. La fracción líquida de la
mezcla de reacción y los líquidos de lavado se combinan entonces,
se permite la separación de las fases, se desecha la fase acuosa y
se añade una solución acuosa de bicarbonato sódico (80 g en 1,25 l)
a la fase orgánica hasta que el pH alcanza un valor de
7-8. Después de agitar, se deja que las fases se
separen, se desecha la fase acuosa y la fase orgánica se lava con
650 ml de agua. El agua de lavado se desecha y la fase orgánica se
evapora hasta sequedad bajo presión reducida, a una temperatura no
superior a 60ºC. El residuo se disuelve en una mezcla de 560 ml de
acetato de isopropilo y 10 ml de agua con calentamiento a
55-60ºC. En el espacio de 30 minutos
aproximadamente, la solución se enfría a 40ºC aproximadamente y se
siembra con cristales de dodecilmetilsulfóxido. Durante un periodo
de 90 minutos aproximadamente, la mezcla se enfría entonces a -10 a
-15ºC y se agita a esta temperatura durante 4 horas
aproximadamente. Los sólidos se separan por centrifugado, se lavan
con 390 ml de acetato de isopropilo y luego se desechan. La
fracción líquida de la mezcla de reacción y los líquidos de lavado
se combinan entonces para obtener una solución de 1,28 kg que
contiene aproximadamente 256 g de
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[Val]^{2}-Ciclosporina
(aproximadamente 95% del rendimiento teórico).
La solución obtenida en la forma anteriormente
descrita se enriquece utilizando cromatografía sobre gel de sílice.
Se preparan dos columnas conteniendo cada una de ellas 1 kg de gel
de sílice suspendido en 2,5 l de acetato de isopropilo y cada
columna se carga con 162 g de la solución. Las columnas se eluyen a
una velocidad de flujo de 500 ml/hora con acetato de isopropilo
saturado con agua y las fracciones se recogen en la gama de los
primeros 4 l (primer eluado), los siguientes 500 ml (segundo
eluado), los siguientes 4,5 l (tercer eluado) y el siguiente litro
(cuarto eluado). Tal y como se determina por HPLC, el producto
deseado se encuentra en el tercer eluado. De este modo, se desechan
los primeros eluados y se retienen los segundos y cuartos eluados
para su reprocesado. Los terceros eluados de ambas columnas se
combinan, se concentran bajo presión reducida a un volumen de 320
ml aproximadamente y luego se evaporan hasta sequedad bajo presión
reducida, a una temperatura no superior a 60ºC, para obtener
aproximadamente 40 g de producto.
Este producto se purifica adicionalmente por
cristalización en terc-butilmetileter. el producto
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]'-[Val]^{2}-Ciclosporina
puro resultante resulta tener un punto de fusión del orden de
195-198ºC, una rotación óptica
[\alpha]_{D}^{20} =-255,1º (c=0,5 en CHCl_{3} y un
peso molecular de 1214,65.
De forma análoga, puede prepararse
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]'-[Nva]^{2}-Ciclosporina
por oxidación de [Nva]^{2}-Ciclosporina
prácticamente como se ha descrito anteriormente para la oxidación
de [Val]^{2}-Ciclosporina.
Claims (6)
1. Mejoras introducidas en el objeto de la
patente española ES2059558 relativa al uso de ciclosporinas, nuevas
ciclosporinas como nuevos compuestos per se y a procesos de
síntesis de las mismas caracterizado porque dichas mejoras
consisten en un proceso mejorado para la producción de una
ciclosporina de fórmula II
en
donde:
A es un residuo
3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt;
B es -\alphaAbu-, -Thr-, -Val- o -Nva-;
X es -Sar- o el residuo de un residuo
\alpha-aminoácido
\alpha-N-metilado, ópticamente
activo, que tiene la configuración (D); e
Y es -Val-, pudiendo ser también Nva cuando B es
Nva; caracterizado porque comprende cultivar un organismo
para producir una ciclosporina intermedia de fórmula II en donde A
es MeBmt; recuperar la ciclosporina intermedia; y oxidar
selectivamente la ciclosporina intermedia para producir una
ciclosporina de fórmula II en donde A es un residuo
3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt.
2. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque se obtiene
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[Nva]^{2}-Ciclosporina
o
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[Val]^{2}-Ciclosporina.
3. Un proceso para la producción de
[3'-desoxi-3'-oxo-MeBmt]^{1}-[B']^{2}-Ciclosporina
en donde B' es Nva o Val, caracterizado porque comprende
oxidar una [B']^{2}-Ciclosporina.
4. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque como reactivo de oxidación se emplea
dimetilsulfuro en combinación con
N-clorosuccinimida.
5. Un proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como agente
oxidante se emplea dimetilsulfóxido en combinación con
N,N'-diciclohexilcarbodiimida o
dodecilmetilsulfóxido en combinación con
N,N'-diciclohexilcarbodiimida.
6. Un proceso según la reivindicación 4 ó 5,
caracterizado porque se lleva a cabo a una temperatura
comprendida entre -15º a +20º en un disolvente orgánico no polar
tal como tolueno.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009302382A ES2245272A6 (es) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | Mejoras introducidas en el objeto de la patentes española es2059558 que consiste en un proceso mejorado para la produccion de una ciclosporina. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009302382A ES2245272A6 (es) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | Mejoras introducidas en el objeto de la patentes española es2059558 que consiste en un proceso mejorado para la produccion de una ciclosporina. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2245272A6 true ES2245272A6 (es) | 2005-12-16 |
Family
ID=35601611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES009302382A Expired - Fee Related ES2245272A6 (es) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | Mejoras introducidas en el objeto de la patentes española es2059558 que consiste en un proceso mejorado para la produccion de una ciclosporina. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2245272A6 (es) |
-
1993
- 1993-11-15 ES ES009302382A patent/ES2245272A6/es not_active Expired - Fee Related
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