SI20274A - Novi poliketidi, derivati antrona - Google Patents
Novi poliketidi, derivati antrona Download PDFInfo
- Publication number
- SI20274A SI20274A SI200000126A SI200000126A SI20274A SI 20274 A SI20274 A SI 20274A SI 200000126 A SI200000126 A SI 200000126A SI 200000126 A SI200000126 A SI 200000126A SI 20274 A SI20274 A SI 20274A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- polyketides
- plasmid
- gene
- strain
- dna
- Prior art date
Links
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 title claims abstract description 27
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 26
- 150000008425 anthrones Chemical class 0.000 title claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 241000187419 Streptomyces rimosus Species 0.000 claims description 17
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N Anthron Chemical class COc1cc2Cc3cc(C)cc(O)c3C(=O)c2c(O)c1C=CC(C)C FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical class C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 12
- 101150006059 otcC gene Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 9
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 9
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- -1 actinorodin Natural products 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 239000004100 Oxytetracycline Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101100081917 Streptomyces rimosus otcC gene Proteins 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 229960000625 oxytetracycline Drugs 0.000 description 6
- 235000019366 oxytetracycline Nutrition 0.000 description 6
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 6
- IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N terramycin dehydrate Natural products C1=CC=C2C(O)(C)C3C(O)C4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229930014544 aromatic polyketide Natural products 0.000 description 5
- 125000003822 aromatic polyketide group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 239000006401 lm-medium Substances 0.000 description 5
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 101150057876 OTC gene Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- ULHJWHCSSAEMLW-UHFFFAOYSA-N methyl 6a,7,10a,12-tetrahydroxy-3,8-dimethoxy-1-methyl-6,10,11-trioxo-7h-tetracene-2-carboxylate Chemical compound O=C1C2(O)C(=O)C=C(OC)C(O)C2(O)C(=O)C2=C1C(O)=C1C(C)=C(C(=O)OC)C(OC)=CC1=C2 ULHJWHCSSAEMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015303 Fatty Acid Synthases Human genes 0.000 description 3
- 108010039731 Fatty Acid Synthases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 3
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 3
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029437 Serine/threonine-protein kinase A-Raf Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N caprylic alcohol Natural products CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000019867 fractionated palm kernal oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 2
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229930183776 tetracenomycin Natural products 0.000 description 2
- ZPSJGADGUYYRKE-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran-2-one Chemical class O=C1C=CC=CO1 ZPSJGADGUYYRKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 0 CC1*CCCC1 Chemical compound CC1*CCCC1 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930190265 Griseusin Natural products 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000187560 Saccharopolyspora Species 0.000 description 1
- KQXDHUJYNAXLNZ-XQSDOZFQSA-N Salinomycin Chemical compound O1[C@@H]([C@@H](CC)C(O)=O)CC[C@H](C)[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](CC)[C@@H]1[C@@H](C)C[C@@H](C)[C@@]2(C=C[C@@H](O)[C@@]3(O[C@@](C)(CC3)[C@@H]3O[C@@H](C)[C@@](O)(CC)CC3)O2)O1 KQXDHUJYNAXLNZ-XQSDOZFQSA-N 0.000 description 1
- 239000004189 Salinomycin Substances 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 239000003529 anticholesteremic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127226 anticholesterol agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 238000005899 aromatization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000005387 correlation spectroscopy with 45 degree mixing pulse Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 description 1
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- QLFZZSKTJWDQOS-YDBLARSUSA-N doramectin Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O3)C=C[C@H](C)[C@@H](C3CCCCC3)O4)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C QLFZZSKTJWDQOS-YDBLARSUSA-N 0.000 description 1
- 229960003997 doramectin Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940043265 methyl isobutyl ketone Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N n-Octanol Natural products CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 1
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001548 salinomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000019378 salinomycin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Izum se nanaša na nove poliketide, derivate antrona, s splošno formulo (I) v kateri R1 predstavlja -CH2-CONH2 ali -CH3, R2 predstavlja -OH ali -OCH3, in na postopek za njihovo pripravo kot tudi na uporabo pri pripravi novih biološko aktivnih spojin s potencialnim terapevtskim učinkom.ŕ
Description
Področje izuma
Predloženi izum se nanaša na poliketide, derivate antrona, in na postopek za njihovo pripravo, ki vključuje tehnike rekombinantne DNA in biosinteze na ta način dobljenih rekombinantov. Nove poliketide lahko uporabljamo same ali kot intermediate pri pripravi novih biološko aktivnih spojin, ki imajo potencialno terapevtsko učinkovitost.
Stanje tehnike
Znano je, da so poliketidi velika, strukturno različna družina naravnih spojin s številnimi biološkimi in farmakološkimi lastnostmi. Nekateri pomembni primeri vključujejo antibiotike, kot oksitetraciklin in eritromicin, protiglivična sredstva, kot amfotericin in nistatin, zdravila za zdravljenje raka, kot tetracenomicin in doksorubicin, imunosupresive, kot rapamicin in snov FK506, zdravila za zmanjševanje nivoja holesterola, kot mevinolin in lovastatin, antiparazitska sredstva avermektin in doramektin, pospeševalca živalske rasti monenzin in salinomicin, naravni insekticid daptomicin in mnoge druge. Poliketidi so sekundami metaboliti aktinomicet, ki vključujejo rodove Streptomyces, Actinomadura, Micromonospora, Saccharopolyspora in Nocardia. Ocenjuje se, daje bilo do leta 1985 okarakteriziranih okoli 4600 antibiotikov aktinomicetnega izvora, od katerih jih je 74 v klinični uporabi (npr. glej reference v: Hranueli, Prehrambeno-tehnol. biotehnol. rev., 27:163, 1989).
V obdobju od leta 1988 do 1992 so opisali dodatnih 1100 metabolitov, od katerih je približno 40% s poliketidno strukturo (Barr et al., WO prijava 98/27203, 1998).
Poliketide pripravijo s pomočjo encimskih kompleksov poliketid sintetaz (PKS) na biosintetski način, ki je podoben načinu maščobnih kislin, ki jih pripravijo s pomočjo encimskih kompleksov sintetaz maščobnih kislin (FAS). PKS sistemi katalizirajo kondenzacijo enostavnih karboksilnih kislin, aktiviranih s koencimom A, z dekarboksilacijsko kondenzacijo. Velika raznolikost struktur naravnih poliketidov je posledica razlike v dolžini verige, izbiri začetnih in podaljšanih enot in različnih redukcijskih ciklusov, kar vse pogojuje njihovo končno strukturo. Podobnosti v zaporedju skupin amino kislin (izvedenih iz sekvenc DNA) in mehanizmu delovanja med produkti gena PKS so privedle do njihove razdelitve na PKS sisteme tipa I in tipa II po klasifikacijskem sistemu, uporabljenem za FAS (Hopwood in Sherman, Annu. Rev. Genet. 24:37, 1990). PKS modularnega tipa I, odgovorne za biosintezo kompleksnih poliketidov, kot so eritromicin, avermektin in rapamicin, so multifunkcionalni encimi, ki vsebujejo številna enkratna aktivna mesta, organizirana v obliki modula. Za razliko od njih PKS tipa II, odgovorne za biosintezo aromatskih poliketidov, kot so aktinorodin, tetracenomicin, frenolicin, griseusin in pigment spor (produkt skupka whi gena, katerega strukturo je treba šele določiti) obstoji iz 4 do 6 mono- ali bifunkcionalnih proteinov, katerih aktivna mesta se uporabljajo zaporedno za zgodnjo sintezo in modifikacijo poliketidne verige. V kompleksnih poliketidih sta popolna skladnja aktivnih mest in struktura biosinteznih produktov modularnih PKS spodbudila racionalni model novih kompleksnih poliketidov s spreminjanjem genov PKS z genetskimi manipulacijami (npr. Kao et al., J. Am. Chem. Soc. 117:9105, 1995, in Pacey et al, J. Antibiot. 11:1029, 1998). Pristop k racionalnemu modelu novih enostavnih aromatskih poliketidov pa ne more biti tako direkten. Razlog za to je osnovna razlika v načinu, na katerega geni PKS, odgovorni za biosintezo aromatskih in kompleksnih poliketidov, kontrolirajo strukturo produkta. Za razliko od popolne skladnje med aktivnimi mesti in strukturo produktov genov PKS tipa I so geni PKS tipa II vsi strukturno zelo podobni. Zato na osnovi primarne strukture genov PKS tipa II ni mogoče predpostaviti poliketidne strukture njihovih produktov. Zaradi tega so skontruirali poseben sistem vektor-gostitelj za ekspresijo genetsko spremenjenih genov
PKS tipa II. Obstoji iz plazmida pRM5 in seva Streptomyces coelicolor CH999, iz katerega so odstranili celoten skupek genov za biosintezo aktinorodina (geni act). Pri poskusih kombiniranja genov PKS, proizvajalcev različnih aromatskih poliketidov, so ta sistem uporabili za sintezo mnogih novih aromatskih poliketidnih snovi in za razvoj strategije za njihov racionalni model. Ti poskusi so pokazali, da je za dolžino ogljikove verige v aromatskih poliketidih odgovoren produkt gena clf (npr. glej reference v: Khosla et al., WO prij. 96/40968; US 5,935,340, 1996; Hopwood, Chem.Rev. 97:2465, 1997, in Barr et al., WO prij. 98/27203, 1998).
Vrsta S. rimosus, proizvajalec antibiotika oksitetraciklina (OTC), je ena od genetsko najbolje opisanih bakterij izmed industrijsko važnih streptomicet. Izčrpno so preiskovali dva seva: M4018, ki so ga proučevali v Veliki Britaniji, in R6, ki so ga proučevali v Zagrebu. Skupek genov za biosintezo OTC (geni otc) so klonirali iz seva M15883, derivata seva M4018, in izdelali so njeno restrikcijsko mapo [Hunter in Hill, v Biotechnology of Antibiotics (2. izdaja), W.R. Strohl (ured.) Marcel Decker, New York, str. 21, 1997], Sekvenciranje DNA celega skupka je razkrilo funkcijo mnogih genov, za nekatere pa je treba funkcijo še določiti. Skupek genov otc seva R6 je bil prav tako kloniran. Njegova restrikcijska mapa se ne razlikuje od mape seva M15883 (Hranueli et al., Food Technol. Biotechnol. 37 (2): 1999, v tisku). Zaradi tega lahko podatke, dobljene za sev M15883 in sev R6, popolnoma primerjamo. Inaktivacija kromosomske kopije gena o/cDl (katerega produkt sodeluje v gubanju, ciklizaciji in aromatizaciji hipotetičnega nonaketidnega intermediata biosinteze OTC) seva 5. rimosus R6, je pripeljala do izuma, v katerem so opisani novi poliketidi, derivati piranona (Petkovič et al., hrvaška patentna prijava P960131 A, 1998). V nasprotju s tem produkt gena otcC hidroksilira nonaketidni intermediat biosinteze OTC mnogo stopenj po tem, ko so pripravili in nagubali poliketidno verigo [Hunter in Hill, v Biotechnology of Antibiotics (2. izdaja), W.R. Strohl (ured.) Marcel Decker, New York, str. 21, 1997],
Bistvo izuma
Predloženi izum se nanaša na nove poliketide, derivate antrona s splošno formulo (I):
I v kateri
R1 predstavlja -CH2-CONH2 ali -CH3,
R2 predstavlja -OH ali -OCH3, ter na postopek za njihovo pripravo kot tudi na uporabo v pripravi novih biološko aktivnih spojin s potencialnim terapevtskim delovanjem.
Podroben opis izuma
Iz genetsko konstruiranega seva S. rimosus R6-ZGL1 (deponiran kot Streptomyces rimosus R6-ZGL1 (otcC::gmr) v zbirki NCAIM pod pristopno številko NCAIM(P) B 001282) (z inaktiviranim genom otcC) izoliramo nove poliketide, derivate antrona, s splošno formulo I, kjer R1 predstavlja -CH2-CONH2 ali -CH3, R2 pa predstavlja -OH ali -OCH3, ki jih dobimo s fermentacijo, ekstrakcijo, zgoščevanjem, čiščenjem na silikagelu in na koncu z gelno filtracijo na koloni Sephadex LH-20.
Po dostopnih podatkih dobljene spojme do sedaj niso bile opisane. Novi derivati antrona so okarakterizirani s tem, da vsi v strukturi vsebujejo karboksilno skupino in različne dolžine ogljikovih verig, čeprav v genetsko konstruiranem sevu (R6-ZGL1) gen clf, odgovoren za dolžino ogljikove verige, ni spremenjen (glej reference v:Khosla et al., WO prijava 96/40968; US 5,935,340, 1996).
Bakterijski sevi, plazmidi in pogoji gojenja
Sev S. rimosus R6 (Hranueli et al., J. Gen. Microbiol. 114:295, 1979) uporabimo za inaktivacijo gena otcC. Genetska konstrukcija seva S. rimosus R6-ZGL1 (otcC::gmr) je opisana v nadaljevanju. Vsa kloniranja smo izvedli v celicah bakterije Escherichia coli TG1 (Gibson, doktorska disertacija, Univerza v Cambridgeu, Velika Britanija, 1984). Plazmidno DNA dvojnega vektorja pGLW75 smo uvedli v celice ceva E. coli NM544 (deni), iz katerega smo izolirali nemetilirano DNA tega plazmida pred transformacijo celic vrste S. rimosus (Marinus in Palmer, Gene 143:1. 1994).
Kot vir gena otcC in sosednjih delov otc DNA smo uporabili plazmid pPFZ46 (Butler et al., Mol. Gen. Genet. 215:231, 1989). Položaj gena v skupku otc gena smo določili s t.i. povratnim genetskim pristopom, z uporabo degeneriranega oligonukleotida, ki je bil modeliran na osnovi amino-terminalne peptidne sekvence očiščenega encima ATC-oksigenaze (Binnie et al., J. Bacteriol. 171:887. 1989). Za inaktivacijo gena otcC z insercijo gena gmr v njegovo strukturo smo uporabili plazmid pIBI24 bakterije E. coli (Dente et al., Nucl. Acids Res. JU: 1645, 1983). Gen gmr, ki je produkt, odgovoren za odpornost proti antibiotiku gentamicinu (Skeggs et al., J. Gen. Microbiol 133:915, 1987), smo dobili iz plazmida p504 bakterije E. coli (Garven, doktorska disertacija, Univerza v Glasgowu, Velika Britanija, 1995). (Slika 1). Plazmid vrste rodu Streptomyces, pIJ486 (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468. 1986), ki vsebuje genetski marker tsr, ki je produkt, odgovoren za odpornost proti antibiotiku tiostreptonu, smo uporabili za konstrukcijo dvojnega vektorja, ki se lahko razmnožuje v celicah bakterije E. coli kot tudi v celicah vrste rodu Streptomyces. Konstrukcija vseh plazmidov je opisana v nadaljevanju.
Seve vrste E. coli smo vzgajali in vzdrževali ob standardnih pogojih (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Kompletni tekoči (LM) in trden (CM) hranilni medij za vzgajanje in vzdrževanje celic vrste S. rimosus in fermentacij ski medij (FM) za biosintezo poliketidov so že bili opisani (Hranueli et al., J. Gen. Microbiol 114:295. 1979, in Vešligaj et El., Appl. Environ. Microbiol. 41:986. 1981).
Rokovanje z DNA in z mikroorganizmi
Metode za izolacijo in čiščenje kromosomskih in plazmidnih DNA, digeriranje DNA z restrikcij skimi endonukleazami, elektroforezo v gelu agaroze, prenos DNA na membrano, markiranje DNA z digoksigeninom ter hibridizacijo in detekcijo so opisali Sambrook et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Celice bakterije E. coli smo transformiran s pomočjo DNA plazmida z uporabo aparature za elektroporacijo (Bio-Rad Pulsing aparat) v skladu z navodili proizvajalca, medtem ko smo celice seva 5. rimosus R6 transformirali z uporabo istega aparata po metodi, opisani v Pigac in Schrempf (Appl. Environ. Microbiol. 61:352, 1995).
Konstrukcija plazmidov pGLW75, ki vsebujejo inaktivirani gen otcC
Plazmid p508x smo dobili iz plazmida p508 (Garven, doktorska disertacija, Univerza v Glasgowu, Velika Britanija, 1995). Ta plazmid (ki temelji na vektorju pIBI24, ki je v celicah bakterije E. coli prisoten v velikem številu kopij) vsebuje del skupka gena otc od restrikcij skega mesta Pstlyj do restrikcij skega mesta 5flcl2i. Segment DNA med restrikcijskima mestoma Kpnl^ in Kpn(.]9 smo zamenjali z DNA linkerjem, ki vsebuje enkratno restrikcijsko mesto encima Xbal (spajanje topih koncev). Iz plazmida p504 smo klonirali del DNA, ki vsebuje gen gmr, v enkratno restrikcijsko mesto Xbal plazmida p508x, da dobimo plazmid pGLW72. V paralelni konstrukciji smo fragment skupka gena otc z 2,3 kb (od restrikcij skega mesta S/P/2I14 do restrikcij skega mesta Ρό’/Ιπ) klonirali iz plazmida pPFZ46 (Butler et al., Mol. Gen. Genet. 215:231, 1989) v plazmid PIBI24, da dobimo plazmid pGLW73. V ta plazmid smo nato subklonirali Pst\-Sac[ fragment DNA s 3,9 kb iz plazmida pGLW72, ki je vseboval gmr marker. To insercijo smo izvedli z delnim digeriranjem DNA plazmida pGLW72. Delno digeriran fragment DNA smo nato očistili iz gela agaroze, digerirali z endonukleazo Sac\ in povezali s plazmidnim vektorjem pGLW73. Dobljeni plazmid smo imenovali pGLW74 (sl. 1). Plazmid pGLW74 vsebuje genetični marker gmr kloniran znotraj gena otcC in omejen s fragmenti DNA iz seva S. rimosus R6, to je 2,7 kb navzdol in
1,8 kb navzgor od gena otcC. Vse do sedaj opisane plazmide smo konstruirali z uporabo vektorjev, ki vsebujejo izvor za replikacijo DNA v bakteriji E. coli.
Končni del DNA v konstrukciji dvojnega vektorja je bil nestabilen plazmid pIJ486, ki vsebuje izvor za replikacijo DNA v vrsto rodu Streptomyces. Plazmid pGLW74 vsebuje enkratno restrikcijsko mesto za encim Sad, uporabljeno za njegovo linearizacijo. Linearizirani plazmid smo nato ligirali s plazmidom pIJ486, digeriranim znotraj njegovega enkratnega restrikcijskega mesta za encim Sad. Dobljen dvojni vektor smo poimenovali pGLW75, ki vsebuje inaktivirani gen otcC (sl. 1).
Konstrukcija seva X rimosus R6-ZGL1
Inaktivirano kopijo gena (otcC::gmr, prisotna na plazmidu pGLW75) smo uvedli v celice seva S. rimosus R6 z elektroporacijo. Plazmid pGLW75 je vseboval genetska markerja gmr in tsr. Dobljene transformante smo selekcionirali na odpornost proti antibiotiku tiostreptonu. Odpornost proti antibiotiku tiostreptonu smo uporabili za primarno selekcijo transformantov, medtem ko smo lahko odpornost proti antibiotiku gentamicinu v vrste S. rimosus uporabili samo za sekundarno selekcijo. Naknadna nasaditev transformantov na medij CM, ki vsebuje gentamicin, je potrdila prisotnost celovitega genetskega markerja gmr v njihovih celicah. Po rasti celic transformantov seva S. rimosus R6 v mediju LM v neselektivnih pogojih (v odsotnosti antibiotikov) v času, za katerega predpostavljamo, da je prišlo do rekombinacije med DNA plazmidom in DNA kromosomom bakterije S. rimosus, smo celice transformantov nasadili na medij CM, ki prav tako ne vsebuje antibiotikov. V takem sistemu se plazmid pogosto izgubi med deljenjem celic [segregacijska nestabilnost plazmida pIJ486 v odsotnosti selekcije je dobro opisana (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468, 1986)]. Inaktivacijo gena za hidroksilazo (gena otcC) izvedemo znotraj kromosoma seva S. rimosus R6. Do inaktivacije gena v kromosomu pride, kadar kopija gena otcC:.gmr zamenja izvirni gen otcC v kromosomu ob izgubi vektorja pIJ486 in pridruženih delov DNA. Da bi potrdili verodostojnost inaktivacije, smo kromosomsko DNA izolirali iz izbranih kolonij transformantov (ki so odporne proti gentamicinu, občutljive pa proti tiostreptonu), digerirali z restrikcijskimi endonukleazami FcoRI in Sad, prenesli na membrano (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) in hibridizirali s sondo, ki je vsebovala gen otcC (ali del DNA od Kpnl]9 do Sph[2o)· Na ta način smo konstruirali sev S. rimosus R6-ZGL1.
Biosinteza novih poliketidov
Sev S. rimosus R6-ZGL1 (otcC::gmr), shranjen v 40% glicerolu pri temperaturi -70 °C, smo presadili na trden medij CM v petrijevke z vsebnostjo gentamicina (500 pg/mL) [CM medij vsebuje: 10,0 g ekstrakta slada, 4,0 g kvasnega ekstrakta, 4,0 g glukoze, 2% agarja (m/v), destilirana voda do 1,0 1; pH naravnamo na 7,2 z 10%-nim NaOH; sterilizacija 40 minut pri 110 °C]. Petrijevke smo inkubirali v termostatu 5 do 7 dni (pri 25 - 30 °C), nakar so zrasle posamezne kolonije streptomicet. Z eno kolonijo streptomicet smo nasadili 50 ml tekočega medija LM, ki vsebuje gentamicin (500 pg/ml) [LM medij vsebuje: 40,0 g dekstrina, 16,0 g CSL (com steep liquor; približno 50% trdne snovi), 7,0 g CaCO3, 2,0 g (NH^SO^ destilirana voda do 1,0 1; pH smo naravnali na 7,2 z 10%-nim NaOH; sterilizacija 30 minut pri 120 °C] in dobljeno suspenzijo smo inkubirali na rotacijskem stresalniku (150 - 300 obr/min) 48 do 72 ur pri temperaturi od 25 do 30 °C. Medij FM za biosintezo poliketidov, ki vsebuje gentamicin (500 pg/ml), [FM medij vsebuje: 55 g koruznega škroba, 7,5 g CSS (com steep solid), 7,0 g CaCO3, 8,5 g (NH^SO^ 2,0 g N^Cl, 0,14 g COC12 x 6H2O, 10,0 g sojinega olja, vodovodna voda do 1,0 1; naravni pH; sterilizacija 40 minut pri 120 °C], smo nasadili z 10% biomase streptomicet iz medija LM. Biosintezo (fermentacijo) smo izvedli na rotacijskem stresalniku (150 - 300 obr/min) v času 5 do 7 dni pri temperaturi od 25 do 30 °C.
Ekstrakcija, zgoščevanje in čiščenje novih poliketidnih snovi
Fermentacijsko lužnico (2,0 1) seva 5. rimosus R6-ZGL1 smo nasitili z dodatkom anorganske soli, npr. z natrijevim dihidrogenfosfatom, in ekstrahirali z organskim topilom, ki se slabo meša z vodo, npr. z n-butanolom, n-oktanolom, kloroformom, etilacetatom, metil-izo-butilketonom, itd., prednostno pa z etil-acetatom. Topilo smo uparili pri znižanem tlaku in temperaturi od 35 do 50 °C. Različne snovi, prisotne v dobljeni trdni snovi, smo razdelili v frakcije s kromatografijo na koloni silikagela z eluiranjem z dvema sistemoma topil (A: kloroform-metanol, B: n-heksan-etil-acetat). Frakcije, eluirane s sistemom A (8-16% metanola) smo združili in topilo uparili pod zmanjšanim tlakom. Z razdelitvijo smo nadaljevali s filtracijo na koloni Sephadex LH20 in s ponovnim eluiranjem s sistemom topil A. Frakcije, eluirane s sistemom A (6% metanola), so vsebovale snov 1 (35 mg). Frakcije, eluirane s sistemom B (30-45% etilacetata), smo združili in topilo uparili pod zmanjšanim tlakom. Dobljeno trdno snov smo raztopili v 2 ml metanola in ohladili na + 4 °C. Po 20 urah se je oborila snov 3 (7 mg) kot rumena oborina. Frakcije, eluirane s sistemom B (65-80% etil acetata), smo prav tako združili in topilo uparili pod zmanjšanim tlakom. Dobljeno trdno snov smo raztopili v 2 ml metanola in ohladili na + 4 °C. Snov 2(11 mg) se je oborila kot svetlo rumena oborina po 24 urah.
Ekstrakcijo, zgoščevanje in čiščenje poliketidov od 1 do 3 smo spremljali s tenkoslojno kromatografijo (TLC) na silikagelnih ploščah (Merck, kat. št. 15684) z uporabo zmesi topil kloroform - metanol - voda (9 : 4 : 0,1) kot mobilne faze.
Kemijska karakterizacija novih poliketidov
Kemijsko strukturo dobljenih poliketidov smo določili na osnovi 2D homonukleamih in heteronukleamih študij ob uporabi COSY-45 tehnike za neposredno določevanje H-H pripajanja (Williams in Fleming, Methods in Organic Chemistry, 5. izdaja, McGraw-Hill Publishing Co, London, Velika Britanija, 1997), HC-COBI tehnike za določevanje H-C interakcije preko ene vezi (!J) (Sanders in Hunter, Modem NMR Sprectroscopy: A Guide for Chemists, Oxford University Press, Velika Britanija, 1987) in HMBC tehnike za določevanje H-C interakcije preko dveh (2J) in treh vezi (J) (Williams in Fleming, Methods in Organic Chemistry, 5. izdaja, McGraw-Hill Publishing Co, London, Velika Britanija, 1997).
IR spekter je odkril številne absorpcijske trakove med 1675 in 1615 cm'1, kar kaže na prisotnost karbonilov, lastnih poliketidom.
Priprava novih derivatov antrona je prikazana s sledečimi primeri, ki v nobenem primeru niso omejevalni dejavnik za izum.
Primer 1
-karbamoilmetil-1,8,10-trihidroksi-10-metil-9-okso-9,10-dihidroantracen-2karboksilna kislina (1) ali
3-karbamoilmetil-l,8,10-trihidroksi“10-metil-antron-2-karboksilna kislina (1)
Z eno kolonijo seva S. rimosus R6-ZGL1 (otcC::gmr) nasadimo 50 ml medija LM, ki vsebuje gentamicin (500 pg/ml). Dobljeno mikrobno suspenzijo gojimo na rotacijskem stresalniku (200 obr/min) 72 ur pri 28 °C. Medij za biosintezo poliketidov (FM), ki vsebuje gentamicin (500 pg/ml), nasadimo z 10% mikrobne biomase iz medija LM. Biosintezo (fermentacijo) izvedemo na rotacijskem stresalniku (200 obr/min) v času 7 dni pri temperaturi 28 °C. Fermentacijsko juho (2,0 1) nasitimo z dodatkom natrijevega dihidrogenfosfata (1,2 kg) in jo trikrat ekstrahiramo z enakim volumnom (2,0 1) etil acetata. Organske sloje združimo in uparimo pod zmanjšanim tlakom pri 40 °C do suhega ostanka. Suhi ostanek (2,0 g) razdelimo s kromatografijo na stolpcu silikagela z eluiranjem s sistemom topil A (kloroform-metanol). Frakcije, eluirane s sistemom A (8-16% metanola), združimo in koncentriramo z upaijenjem pod zmanjšanim tlakom. Z nadaljnjo razdelitvijo nadaljujemo na koloni Sephadex LH-20 s ponovnim eluiranjem s kloroformom-metanolom (6% metanola).
Frakcije, za katere je TLC pokazala, da vsebujejo spojino 1, zberemo in koncentriramo z uparjenjem pod zmanjšanim tlakom, pri Čemer dobimo 35 mg spojine I v obliki rumenega prahu.
'H NMR: (400MHz, DMSO-d6); 12,41 (2H, br. s, NH2), 11,97 (IH, s, 2-COOH), 7,77 (IH, s, 8-OH), 7,64 (IH, s, 1-OH), 7,69 (IH, t, J = 8,0 Hz, H-6), 7,42 (IH, dd,
J = 7,6 Hz, H-5), 7,40 (IH, s, H-4), 6,95 (IH, d, J = 8,4 Hz, H-7), 6,29 (IH, s, 10OH), 3,72 (2H, ABq, J = 16 Hz, 3-CH2-), 1,51 (3H, s, 10-CH3).
13C NMR: (100MHz, DMSO-d6); 191,5 (C-9), 171,1 (3-CH2-CO-NH2), 166,9 (2COOH), 161,5 (C-8), 158,3 (C-l), 152,0 (C-lOa), 151,5 (C-4a), 141,8 (C-3), 137,4 (C-6), 126,2 (C-2),119,1 (C-4), 117,1 (C-5), 116,0 (C-7), 113,0 (C-8a), 111,6 (C-9a),
69,4 (3-CH?-CO-NH?), 38,7 (IO-CH3).
Primer 2
1.8.10- trihidroksi-3,10-dimetil-9-okso-9,10-dihidroantracen-2-karboksilna kislina (2) ali
1.8.10- trihidroksi-3,10-dimetil-antron-2-karboksilna kislina (2)
Po fermentaciji in izolaciji, opisani v primeru 1, izvedemo ločenje suhega ostanka s kromatografijo na koloni silikagela z eluiranjem s sistemom topil B (n-heksan-etil acetat). Frakcije, eluirane s sistemom B (65-80% etil acetata), združimo in koncentriramo z uparjenjem pod zmanjšanim tlakom. Dobljeno trdno snov raztopimo v 2 ml metanola in ohladimo na + 4 °C. Po 24 urah se obori snov 2(11 mg) kot svetlo rumena oborina.
Ή NMR: (400MHz, DMSO-d6); 12,00 (IH, br. s, 2-COOH), 7,81 (IH, s, 8-OH), 7,53 (IH, s, 1-OH), 7,68 (IH, ζ J = 8,0 Hz, H-6), 7,42 (IH, dd, J = 7,6 Hz, H-5), 7,28 (IH, s, H-4), 6,93 (IH, d, J = 8,2 Hz, H-7), 6,23 (IH, s, 10-OH), 2,37 (3H, s, 3-CH3), 1,50 (3H, s, 10-CH3).
13C NMR: (100MHz, DMSO-d6): 191,4 (C-9), 167,4 (2-COOH), 161,5 (C-8 in C-l), 152,0 (C-lOa), 151,3 (C-4a), 144,8 (C-3), 137,3 (C-6), 126,5 (C-2), 118,4 (C-4), 117,5, 116,0 (C-5 in C-7), 113,0 (C-8a), 110,9 (C-9a), 38,7 (10-CH3), 20,0 (3-CH3).
Primer 3
3-karbamoilmetil-1,8-dihidroksi-10-metoksi-10-metil-9-okso9,10-dihidroantracen-2-karboksilna kislina (3) ali
3-karbamoilmetil- 1,8-dihidroksi-10-metoksi- 10-metilantron-2-karboksilna kislina (3)
Po fermentaciji in izolaciji, opisani v primeru 1, dobimo snov 3 (7 mg) z ločenjem suhega ostanka s kromatografijo na koloni silikagela z eluiranjem s sistemom topil B (30-45% n-heksan-etil acetat). Kot v primeru 2 frakcije, ki vsebujejo snov 3, združimo in koncentriramo z uparjenjem pod zmanjšanim tlakom in prav tako raztopimo v 2 ml metanola. Raztopino ohladimo na +4 °C. Po 20 urah se obori snov 3 kot rumena oborina.
'H NMR: (400MHz, DMSO-d6); 12,41 (2H, br. s, NH2), 11,94 (IH, s, 2-COOH), 7,76 (IH, s, 8-OH), 7,60 (IH, s, 1-OH), 7,69 (IH, t, J = 8,0 Hz, H-6), 7,42 (IH, dd, J = 7,6 Hz, H-5), 7,39 (IH, s, H-4), 6,95 (IH, d, J = 8,4 Hz, H-7), 3,81 (2H, ABq, J = 16 Hz, 3-CH2-), 3,61 (3H, s, 10-OCH3), 1,51 (3H, s, 10-CH3).
13C NMR: (100MHz, DMSO-d6): 191,5 (C-9), 170,2 (3-CH2-CO-NH2) 166,8 (2COOH), 161,6 (C-8) 158,3 (C-l), 152,0 (C-lOa), 151,7 (C-4a), 141,1 (C-3), 137,6 (C-6), 126,2 (C-2), 119,2 (C-4), 117,2 (C-5), 116,1 (C-7), 113,0 (C-8a), 111,9 (C-9a),
69,4 (3-CH2-CO-NH2), 51,8 (10-O-CH3), 38,7 (IO-CH3).
Claims (6)
- Patentni zahtevki1. Novi poliketidi, derivati antrona, s splošno formulo II v kateriR1 predstavlja -CH2-CONH2 ali -CH3,R2 predstavlja -OH ali -OCH3.
- 2. Nova spojina po zahtevku 1, označena s tem, da R1 predstavlja -CH2-CONH2,R2 predstavlja -OH.
- 3. Nova spojina po zahtevku 1, označena s tem, da R predstavlja -CH3, R pa predstavlja -OH.1 o
- 4. Nova spojina po zahtevku 1, označena s tem, da R predstavlja -CH2-CONH2, R pa predstavlja -OCH3.
- 5. Postopek za pripravo novih poliketidov, derivatov antrona, po zahtevku 1, označen s tem, da konstruiramo sev S. rimosus R6-ZGL1 s pomočjo plazmidov pPFZ46, pIBI24, p504, p508x in pIJ486, nakar izvajamo fermentacijo 5 do 7 dni pri temperaturi 25 do 30 °C na rotacijskem stresalniku, nato izolacijo z ekstrakcijo z organskim topilom, ki se slabo meša z vodo, in z njihovim ločenjem s pomočjo kromatografije na koloni silikagela ob uporabi dveh običajnih sistemov topil, kot kloroforma-metanola ali n-heksana-etil acetata, čemur sledi ločenje na koloni Sephadex LH-20 z eluiranjem z zmesjo preje omenjenih topil ali z obarjanjem v metanolu.
- 6. Novi poliketidi, derivati antrona, za uporabo kot biološko aktivne spojine ali kot intermediati pri pripravi novih biološko aktivnih spojin, ki imajo potencialno terapevtsko učinkovitost.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HR990153A HRP990153A2 (en) | 1999-05-20 | 1999-05-20 | Novel polyketides, antrone derivatives |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI20274A true SI20274A (sl) | 2000-12-31 |
Family
ID=10946930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI200000126A SI20274A (sl) | 1999-05-20 | 2000-05-19 | Novi poliketidi, derivati antrona |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| HR (1) | HRP990153A2 (sl) |
| SI (1) | SI20274A (sl) |
-
1999
- 1999-05-20 HR HR990153A patent/HRP990153A2/hr not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-05-19 SI SI200000126A patent/SI20274A/sl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HRP990153A2 (en) | 2001-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0910633B1 (en) | Hybrid polyketide synthase I gene | |
| US6271255B1 (en) | Erythromycins and process for their preparation | |
| Stutzman-Engwall et al. | Multigene families for anthracycline antibiotic production in Streptomyces peucetius. | |
| US10047363B2 (en) | NRPS-PKS gene cluster and its manipulation and utility | |
| JP2000515390A (ja) | 新規ポリケチド誘導体およびそれを製造するための組換え方法 | |
| US20090286291A1 (en) | Borrelidin-producing polyketide synthase and its use | |
| US20080287483A1 (en) | Polyketides and Their Synthesis and Use | |
| CZ20004912A3 (cs) | Polyketidy a jejich syntéza | |
| KR101542243B1 (ko) | 이소발레릴 스피라마이신 ｉ을 생산하는 유전학적으로 공학처리된 균주 ｗｓｊｉａ | |
| Maharjan et al. | Identification and functional characterization of an afsR homolog regulatory gene from Streptomyces venezuelae ATCC 15439 | |
| Yang et al. | New secondary metabolites from an engineering mutant of endophytic Streptomyces sp. CS | |
| US7807418B2 (en) | Method for producing hybrid polyketide synthases | |
| SI20274A (sl) | Novi poliketidi, derivati antrona | |
| AU2019101637A4 (en) | Streptovaricin derivative, and preparation method and use thereof | |
| SI20073A (sl) | Novi poliketidi, derivati piranona | |
| Jiang et al. | Genetic engineering ofSorangium cellulosum reveals hidden enzymology in myxobacterial natural product biosynthesis | |
| Arakawa | Characterization of the Biosynthetic Gene Clusters Located on the Streptomyces Linear Plasmid | |
| He | Molecular analysis of the aureothin biosynthesis gene cluster from streptomyces thioluteus HKI-227: new insights into polyketide assemply | |
| Sydor | Elucidation of the prodiginine biosynthetic pathway in Streptomyces coelicolor A3 (2) | |
| Salem | Biosynthesis of marineosin, a spiroaminal undecylprodiginine natural product | |
| Yang | Xianshu Yang | |
| JP2009219493A (ja) | ポリケチド類及びそれらの合成 | |
| Chen | Molecular mechanism for the biosynthesis of antifungal HASF and antibacterial WAP-8294A2 | |
| JP2003174884A (ja) | ｒｈｏＧ遺伝子およびその使用 |