SI20025A - Novi trombinski inhibitorji, njihova priprava in uporaba - Google Patents

Abstract

Opisane so spojine s formulo I , ter njihove farmacevtsko sprejemljive soli, pri čemer imajo substituente v opisu navedene pomene. Spojine se uporabljajo kot inhibitorji trombina.ŕ

Description

NOVI TROMBINSKI INHIBITORJI, NJIHOVA PRIPRAVA IN UPORABA

Področje tehnike, na katerega se nanaša izum (C07K 5/02, C07D 207/02, C07D 223/02, C07D 251/32, C07D 273/18, A61K 31/15, A61K 31/155, A61K 31/17, A61K 31/195)

Izum spada v področje farmacevtske industrije in se nanaša na nove derivate azafenilalanina in postopke za njihovo pripravo in farmacevtske izdelke, kijih vsebujejo. Novi derivati azafenilalanina imajo encimsko inhibitomo delovanje (serinske proteaze) in antikoagulantno delovanje.

Tehnični problem

Obstaja stalna potreba po novih zdravilih z antikoagulantnim delovanjem in možnimi aplikacijami per os ali parenteralno, ki bi bila čim bolj selektivna in s čim manj stranskimi učinki. V zadnjem času so na tem področju vse pomembnejši nizkomolekulami trombinski inhibitorji.

Stanje tehnike

Trombin je kot serinska proteaza eden od ključnih encimov v procesih strjevanja krvi in razvoju tromboze (Edit, J. F.; Allison, P.; Noble, S.; Ashton, J.; Golino, P.; McNard, J.; Buja, L. M.; Willerson, J. T., J. Ciin. Invest. 1989, 84, 18.).

Znana je kristalna struktura serinskih proteaz trombina in serina (Bode, W.; Turk, D.; Karshikov, A. J., Protein Sci. 1992, I, 426.

Sedaj uporabljani antikoagulanti imajo veliko stranskih učinkov in omejeno učinkovitost. Nizkomolekulami trombinski inhibitorji naj bi imeli selektivno učinkovitost in možnost peroralne aplikacije. Znani so reverzibilni in ireverzibilni antagonisti trombina (Kimball, S. D., Curr. Pharm. Design 1995, /,441, Das, J.; Kimball, S. D., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 999, Kimball, S. D., Blood Coagulation and Fibrinolysis 1995, 6, 511, Breznik, M.; Pečar, S., Farm. Vestn. 1997, 48, 545).

Večina reverzibilnih antagonistov trombina izhaja iz peptidomimetično modificirane strukture D-Phe-Pro-Arg. Cilj sprememb je zagotoviti kemično stabilnost, selektivnost in učinkovitost.

V uporabi na Japonskem je učinkovina argatroban (Kikumoto, R.; Tamao, Y.; Tezuka, T.; Tonomura, S.; Hara, H., Ninomiya, K.; Hijikata, A.; Okamoto, S., Biochemistry 1984, 23, 85; Okamoto S., et al. EP 8746).

Napsagatran je selektivni reverzibilni inhibitor in je v klinični fazi preizkušanj (Kimball, S. D., Curr. Pharm. Design 1995, /, 441).

Meta substituirani fenilalaninski derivati z amidinsko ali amidoksimsko strukturo so selektivni inhibitorji trombina (Stuerzbecher, J.; Vieweg, H.; Wikstroem, P., WO 92/08709 (1992)).

Amidinofenilalaninski derivati in aminopiridilalaninski derivati imajo selektivno antitrombotično delovanje (Danilewicz, J., et al. WO 95/13274 (1995)).

Zamenjava amidinopiperidinske Pl skupine z šibko bazično 2-amino-6-metilpiridinsko strukturo je dala selektivni, učinkoviti in peroralno uporaben trombinski inhibitor (Sanderson, P. E. J.; et al., Bioorg. Med. Chem. 1998, 8, 817).

Opis rešitve tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Izum se nanaša na nove derivate azafenilalanina in njihove analoge s splošno formulo (I) (I)

R¹

/S

R³^ll o

v kateri pomenijo

H₂N ,NR⁴

R¹ ostanek s formulo kjer je R⁴ = H, C1-C3 alkil, OH, O-(C,-C₃)-alkil, NH₂

R² ostanek s formulo

kjer je R⁵ = H, (C,-C3) alkil, CF3, COOR⁹, kjer je R⁶ = H, (C,-C3) alkil, CF₃, COOR⁹, kjer je R⁹ = H, (Ci-C₃)alkil, kjer je R⁷ = H, (Ci-C3)alkil, (C3-C6) cikloalkil, kjer je R⁸ = (C1-C3) alkil, (C3-C7) cikloalkil, kjer je R¹⁰ = H, (Ci-C3) alkil, benzil,

R³ ostanek s formulo

Me

Izum se nanaša tudi na njihove farmacevtsko sprejemljive soli z antikoagulantnim delovanjem, in na farmacevtske pripravke, ki jih vsebujejo. Izum se nanaša tudi na postopke za pripravo derivatov azafenilalanina in analogov s splošno formulo (I).

Derivate azafenilalanina s splošno formulo (I) pripravimo tako, da 4-cianbenzaldehid s formulo (II)

CN (II)

CHO presnovimo z BOC-karbazatom s formulo (III)

O v spojino s formulo (IV)

CN

(IV) ki jo s postopkom redukcije s katalitskim hidrogeniranjem ali z NaCNBH₃ pretvorimo v spojino (V)

CN

ki

a) reagira s trifosgenom in aminom s formulo (VI)

kjer imata R⁵ in R⁶ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifosgenom in aminom s formulo (VII ali VIII ali IX),

(VII) (VIII) (IX) ali s trifozgenom in aminom s formulo (X) R⁷

HN,

-R8 (X)

R kjer imata R in R enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (XI),

COOR¹⁰

(XI) kjer ima R¹⁰ enak pomen kot v formuli (I), v “one pot” reakciji do spojine

CN

\/°γ^ΝΗ kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I).

Zaščitno BOC skupino v spojini (XI) odstranimi s HCI (g) v HOAc pri sobni temperaturi in dobimo spojino (XII),

νη; ο kjer ima R enak pomen kot v formuli (I), ki reagira z aromatskim sulfonilkloridom do spojine (XIII) CN

(XIII)

O. /NH ^XS

R3^ll o

kjer imata R² in R³ enak pomen kot v formuli (I).

Spojino (ΧΙΗ) presnovimo s hidroksilaminom v brezvodnem etanolu do spojine s formulo (XIV)

R¹

O^/NH

RS^II

O (XIV) kjer imajo R¹, R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja skupino OH. Spojino (XIV) presnovimo s katalitskim hidrogeniranjem v spojino (XV) kjer imajo R¹, R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja vodik;

R¹ ίΊ (XV)

o.

R³

S li o

N

I

NH

R²

b) Spojino (V) presnovimo s 4-nitrofenilkloroformatom v aprotičnih topilih ob prisotnosti terciarnih aminov do spojine XVI,

CN

O ki jo s hidroksilaminom presnovimo v spojino XVII.

^Η2^Ν\^>^Ν0Η

ο

NO (XVII)

Izhodne spojine pripravimo, v kolikor ni navedeno drugače, po postopkih opisanih v literaturi; npr. spojino s formulo IV tako kot opisujejo A. Fassler, et. aL, J. Med. Chem. 1996, 39, 3203-3215.

Nove spojine se uporabljajo kot peroralni in parenteralni antikoagulanti. So inhibitorji trombina. Uporabljajo se v kardiovaskularni kirurgiji (bypass, angioplastika), za zdravljenje pri diseminirani intravaskulami koagulaciji, pri tromboembolijah in hemodializi, nestabilni angini pektoris, možganskih trombozah in kot alternativa za heparin pri bolnikih s heparinom izzvano trombocitopenijo. Pri svežem srčnem infarktu naj bi se uporabljali za dodatno zdravljenje v kombinaciji s trombolitično terapijo.

Farmacevtski pripravki, ki so predmet pričujočega patenta so lahko v obliki injekcij ali peroralnih pripravkov. Poleg učinkovine vsebujejo še različne standardne dodatke, odvisno od vrste uporabe. Farmacevtski pripravki so pripravljeni po standardnih postopkih. Odmerek, pogostost in način uporabe odvisijo od različnih dejavnikov, odvisni pa so tudi od posamezne učinkovine in njenih farmakokinetičnih lastnosti ter bolnikovega stanja.

BIOLOŠKI TESTI

In vitro test inhibicije trombina (amidolitični test)

Z amidolitično metodo smo v in vitro testu preizkusili inhibitomo delovanje spojin na trombin. Spojinam z inhibitomim delovanjem na trombin smo določili konstanto inhibicije (Ki) z metodo po Dixonu.

Reagenti:

1. Trombin-Človeški 588 NIH (National Institute of Health, Sigma)

Vsebino stekleničke, ki smo jo hranili pri -20°C, smo raztopili v 14,7 mL bidestilirane vode. Dobili smo raztopino 40NIH U/mL. To smo razpipetirali po 0,26 mL in shranili pri -70°C. Tik pred uporabo smo raztopino odmrznili in k 0,25 mL dodali 4,75 mL HBSA pufra. Dobili smo začetno raztopino trombina z aktivnostjo 2 NIH U/mL. Končna aktivnost trombina v mikrotitrski plošči je bila 0,5 NIH U/mL.

2. Kromogeni substrat S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA-2HCl, Mr - 625,6), 25 mg (Chromo-genix)

K vsebini stekleničke smo dodali 40 oz. 20 mL bidestilirane vode in dobili 1 oz. 2 mM raztopino substrata. To smo razpipetirali in shranili pri -20°C. Končna koncentracija substrata v reakcijski zmesi je bila 0,25 oz. 0,5 mM.

3. HBSA pufer

Za pripravo 500 mL HBSA pufra, pH= 7,5 smo potrebovali:

• 1,1915 g Hepes pufra (Sigma); c = 10 mM, • 4,3875 g NaCl, • 0,5 g govejega serumskega albumina 98% (Sigma).

Pufer smo hranili v hladilniku pri 8 °C.

4. Dimetilsulfoksid (DMSO)

5. Bidestilirana voda

6. Inhibitorji trombina benzamidin in spojina LK 632.

a) Benzamidin

Benzamidin je na tržišču dostopen v obliki močno higroskopnega hidroklorida. Zato smo mu pred pripravo raztopine določili vsebnost vode z metodo po Karl-Fisherju. Vsebnost vode je bila 16,535 ut.%. Zaradi nepolamosti ga nismo mogli raztopiti v vodi. Naredili smo 300 mM raztopino v DMSO, ki smo jo redčili z bidestilirano vodo na koncetracije od 50 do 200 mM. Po 50 pL smo dodali v vdolbinice na mikrotitrski plošči, končni volumen je bil 200 pL. Koncentracije v testnem sistemu so bile torej štirikrat nižje, in sicer od 12,5 do 50 mM.

a) Trombinski inhibitor LK-632

Zaradi slabe topnosti smo osnovne raztopine trombinskih inhibitorjev pripravili v DMSO. Osnovne raztopine smo hranili v hladilniku pri 8°C. Pred analizo smo jih redčili z bidestilirano vodo, tako da koncentracija DMSO ni presegala 20 vol %, kar predstavlja koncentracijo DMSO, ki še ne vpliva inhibitomo na trombin.

Amidolitična metoda

Princip metode

Trombin ima amidolitično aktivnost, to pomeni, da cepi amidne vezi v kromogenem substratu. Sprošča se rumeno obarvan p-nitroanilin, ki mu merimo absorbanco pri valovni dolžini 405 nm. Ob dodatku trombinskega inhibitorja se amidolitična aktivnost trombina zniža, posledica je manjši porast absorbance pri 405 nm. Iz naklona krivulj časovnega porasta absorbance izračunamo konstanto inhibicije (Ki) z metodo po Dixonu.

Potek dela

1. V mikrotitrsko ploščo smo razpipetirali po 50 pL HBSA oz. po 100 pL, kjer smo merili aktivnost trombina brez inhibitorja za določitev ponovljivosti ali absorpcijo samega inhibitorja (slepi preizkus).

2. Razpipetirali smo po 50 pL raztopin inhibitorjev, za vsako koncentracijo štiri vzporednice. Pri meritvi aktivnost samega trombina, nismo dodali inhibitorja. Za slepi preizkus smo uporabili najvišjo koncentracijo inhibitorja (tu se absorbanca tekom merjenja ni bistveno spreminjala).

3. Dodali smo po 50 pL trombina (razen pri slepem preizkusu), ki smo ga tik pred tem odmrznili in redčili po predpisu.

4. Inkubirali smo 30 min pri 25°C.

5. Dodali smo po 50 pL substrata.

6. Premešali smo mikrotitrsko ploščo na mizi in jo vstavili v spektrofotometer za mikrotitrske plošče (Multiskan MIC 340, Titertek). Vsaki 2 minuti smo 26 minut merili absorbance pri 405 nm.

7. Izračunali smo Ki z metodo po Dixonu

Testiranje benzamidina in potencialnega trombinskega inhibitorja z amidolitično metodo nam je dalo naslednji vrednosti Ki: za benzamidin je pri koncentracijah od 12,5 do 50 mM konstanta inhibicije Ki = 3,5 mM, za spojino LK 632 pa je pri koncentracijah od 0,1 do 0,7 mM konstanta inhibicije Ki - 0,1 mM. To pomeni, daje spojina LK 632 inhibitor trombina.

Opis slik:

SLIKA 1 prikazuje inhibicijo trombina s spojino LK 632 pri lmM substratu SLIKA 2 prikazuje inhibicijo trombina s spojino LK 632 pri 2mM substratu

IZVEDBENI PRIMERI

Izum pojasnjujejo, vendar nikakor ne omejujejo naslednji izvedbeni primeri:

PRIMER 1 4-Nitrofenil 3-(terc-butoksikarboniI)-2-(4-cianobenzil)-karbazat

N-l-(terc-butoksikarbonil)-N-2-[(4-cianofenil)metil]-hidrazin (247.3 mg, 1 mmol) raztopimo v 7 ml kloroforma brez etanola, prepihamo z argonom, dodamo 0.14 ml (1 mmol) trietilamina ali ustrezno bazo (N-metilmorfolin, piridin )in 15 mg 1hidroksibenzotriazola, ter raztopino ohladimo na -5 °C. Med mešanjem dokapavamo 212.17 mg (1 mmol) 4-nitrofenilkloroformata raztopljenega v 5 ml kloroforma brez etanola. Reakcijsko zmes mešamo pol ure pri -5 °C, nato pa še 24 ur pri sobni temperaturi, jo uparimo na rotavaporju in dodamo 20 ml etilacetata. V ločniku spiramo z 10 ml 10% citronske kisline, z 10 ml vode in z 10 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na₂SO4, filtriramo in filtrat uparimo na rotavaporju.

Produkt očistimo s kolonsko kromatografijo (mobilna faza: diklorometan /metanol = 100/1). Izkoristek: 34.3%; Tališče: 163-165°C; IR (KBr, cm·’): 3290.8, 2982.0, 2226.0, 1724.5,

1594.9, 1519.3, 1395.8,1348.8 , 1293.2,1196.4, 1161.6, 1063.6, 863.9; ‘H-NMR (CDC1₃): δ (ppm) 1.47 (s, 9H, Boc); 4.82 in 4.94 (2s, 2H, Ar-CH₂N); 6.58 (širok s, IH; NH); 7.34 (d, 2H, J=9.04 Hz, H-Ar₂-_>6·); 7.62 in 7.91 (2d, 2H vsak, J_2;6= 8.29 Hz, J_3>5= 8.29 Hz, HAr_2i3j5j6); 8.3 (d, 2H, J=9.04 Hz, H-Ar₃>_{; 5}·); Molekulska masa : izračunana : 412.4; ugotovljena :413( MH⁺)

Elementna analiza za C₂oH₂o04N6: %C %H %N izračunana: 58.25 4.89 13.59 ugotovljena: 58.17 4.33 12.63

PRIMER 2 4-nitrofenil 3-(terc-butoksikarbonil)-2-(4-(amino(hidroksiimino)metil)benzil)-karbazat

4-Nitrofenil 3-(terc-butoksikarbonil)-2-(4-cianobenzil)-karbazat 412.4 mg (1 mmol) raztopimo v 15 ml brezvodnega etanola, prepihamo z argonom in dodamo 66.1 mg (2 mmol) hidroksilamina. Reakcijsko zmes mešamo v argonovi atmosferi pri sobni temperaturi 24 ur in uparimo na rotavaporju. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (mobilna faza: kloroform/metanol = 30/1). Dobimo svetlo rumene kristale.

Izkoristek: 64.9 mg (14.5 % ); Tališče: 92-97 °C; IR (KBr, cm’¹): 3483.3, 3384.1, 2980.3, 1734.2, 1647.0, 1522.6, 1490.5, 1347.2, 1211.1, 1157.7, 1111.3, 1013.0, 861.5, 751.6; 'HNMR (DMSO-d₆):5 (ppm) 1.39 (s, 9H, Boc); 4.72 in 4.89 (2s, 2H, Ar- CH₂N); 7.38 (d 2H, J= 8.67 Hz, H-Ar_2;6 ); 7.58 in 7.85 (2d, 2H vsak, J_2>6=8.29 Hz, J₃,₅= 8.29 Hz, H-Ar₂,3,5,0); 8.32 (d, 2H, J= 8.67 Hz, H-Ar₃-,₅·); 9.83 (s,IH, =N-OH)

Molekulska masa C₂oH₂₃Ns07 : izračunana 445.43

PRIMER 3 Hidroklorid 4-nitrofenil 2-(4-cianobenziI)-karbazata

4-Nitrofenil-3-(terc-butoksikarbonil)-2-(4-cianobenzil)-karbazata (484 mg, 1.174 mmol) raztopimo v 8 ml ledocta in uvajamo HCI plin 20 min. Potek reakcije spremljamo s TLC. Ledocet uparimo na rotavaporju, oljnat produkt pa prelijemo z etrom, in odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek: 235 mg (57.5 %); IR (KBr, cm'¹): 2222.0, 1730.9, 1593.8,' 1518.2, 1355.4, 1217.0, 1070.2, 995.2, 867.8, 744.0

PRIMER 4 4-Nitrofenil 3-(naftaIen-2-suIfoniI)-2-(4-cianobenzil)-karbazat Hidroklorid 4-nitrofenil 2-(4-cianobenzil)-karbazata (235 mg, 0.675 mmol) raztopimo v

1.5 ml brezvodnega DMF, prepihamo z argonom in dodamo 0.198 ml (1.350 mmol) trietilamina. Suspenzijo ohladimo na -5 °C in med mešanjem dokapavamo 168.4 mg (0.675 mmol) naftalen-2-sulfonilklorida, raztopljenega v 5 ml kloroforma brez etanola. Reakcijsko zmes mešamo pol ure pri -5 °C, nato pa še 24 ur pri sobni temperaturi, jo uparimo na rotavaporju in dodamo 10 ml etilacetata.V ločniku spiramo 2-krat s 5 ml vode, s 5 ml 10% citronske kisline in s 5ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na₂SO₄, filtriramo in filtrat uparimo na rotavaporju.

Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (mobilna faza: diklorometan/metanol =100 / DIzkoristek : 216 mg (63.7%); IR (KBr, cm’¹): 3275.8, 2225.4, 1726.7, 1584.8, 1492.3,

1410.6, 1324.4, 1276.0, 1214.7, 1156.0, 1111.6, 835.0, 750.2, 553.3; Molekulska masa C₂₅H₁₈N₄O₆S : izračunana: 502.50; ugotovljena : 503 (MH ⁺)

PRIMER 5 l-(terc-butoksikarbonil)-2-(4-cianobenzil)-4-(/V⁴A^z4-P^entameril^en)semikarbazid

Trifosgen (6,977 g) raztopimo v 40 ml brezvodnega diklorometana, prepihamo z argonom, ter ohladimo na -5 °C. Med mešanjem dokapavamo raztopino N-l-(terc-butoksikarbonil)N-2-[(4-cianofenil)metil]-hidrazina (11,640 g) in N,N-diizopropiletilamina (12.282 ml) v 80 ml diklorometana. Reakcijsko zmes po dodatku mešamo še 5 minut, nato naenkrat dodamo zmes piperidina (4.642 ml) in Ν,Ν-diizopropiletilamina v 80 ml diklorometana, ter mešamo še 20 minut pri sobni temperaturi. Reakcijsko zmes uparimo na rotavaporju, raztopimo v 150 ml etilacetata, spiramo z 100 ml 5% citronske kisline, z 100 ml 5% raztopine NaHCCh in z 100 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z MgSO₄, filtriramo in filtrat uparimo na rotavaporju.

Zmes suspendiramo v 30 ml etra in dodamo 10 ml heksana. Oborino odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek : 6.59g ( 42,3 %); IR (KBr, cm’¹): 3294.0, 2947.0, 2842.0,’ 2228.5, 1730.4,

1637.6, 1518.8, 1441.5, 1369.9, 1273.9, 1156.8, 1049.3, 946.3, 876.1, 819.9, 749.0, 638.0, 546.0

Molekulska masa C19 H₂6 N₄ O3: izračunana : 359.45; ugotovljena : 359 (M ⁺)

PRIMER 6 l-(terc-butoksikarboniI)-2-(4-(amino(hidroksiimino)metiI)-benziI)-4(A^/vApentametilenj-semikarbazid l-(terc-butoksikarbonil)-2-(4-cianobenzil)-4-(/V⁴,7V⁴-pentametilen)- semikarbazid 94 mg (0.262 mmol) raztopimo v 5ml brezvodnega etanola, prepihamo z argonom in dodamo

17.3 mg (0.524 mmol) hidroksilamina. Reakcijsko zmes mešamo v argonovi atmosferi pri sobni temperaturi 24 ur in uparimo na rotavaporju. Produkt Čistimo s kolonsko kromatografijo (mobilna faza: kloroform/metanol = 20/1). Dobimo bele kristale.

Izkoristek: 58 mg ( 66 % ); Tališče: 88-92 °C; IR (KBr, cm·¹): 3359.4, 2936.2, 2852.3,

1724.4, 1642.0, 1441.9, 1367.9, 1251.8, 1158.0, 1050.1, 1020.6, 934.0, 852.7, 789.7, 601.7;

*H-NMR (DMSO-d6):6 (ppm): 1.37 (m, 6H, CH₂-piperidin3-₄’₅ ); 1.38 (s, 9H, Boc); 3.2 (m, 4H, CH₂-piperidin₂’,6’); 4.38 in 4.39 (2s, 2H, Ar- CH₂N); 5.75 (s, 2H, NH₂); 7.49 in 7.78 (2d, 2H vsak, J₂,₆=8.29 Hz, J_3>5= 8.29 Hz, Η-Αγ_2Λ5,₆); 9.19 ( s, IH, NH); 9.54 (s,IH, =N-OH)

Molekulska masa C₂o H23 N5 O₇ : izračunana : 391,47; ugotovljena : 392( MH ⁺)

PRIMER 7 Hidroklorid -2-(4-cianobenzil)-4-( A^A^-pentametilenj-semikarbazida l-(terc-butoksikarbonil)-2-(4-cianobenzil)-4-(/V⁴,/V⁴-pentametilen)- semikarbazid (7,5 lg) raztopimo v 30 ml ledocta in uvajamo HCI plin 20 min. Potek reakcije spremljamo s TLC.

Ledocet uparimo na rotavaporju, oljnat produkt pa prelijemo z etrom. Tekočo fazo odlijemo, oborino pa pri 50 C 24 ur sušimo v sušilni pištoli nad NaOH.

Izkoristek: 5.747 g (93.4 %) zmesi

IR (KBr, cm’¹): 3417.8, 2934.6, 2664.1, 2227.3, 1711.6, 1641.3, 1433.7, 1402.3, 1249.6, 1132.0,1017.8; Molekulska masa C14H19CIN4O: izračunana: 294.78; ugotovljena : 295 (MH⁺)

PRIMER 8 l-(naftaIen-2-sulfonil)-2-(4-cianobenziI)-4-( A^^-pentametilen)semikarbazid

Hidroklorid -2-(4-cianobenzil)-4-( M^-pentametilenJ-semikarbazida (8.940 g) raztopimo v 100 ml kloroforma brez etanola, prepihamo z argonom in dodamo 7,73 ml trietilamina. Raztopino ohladimo na -5 °C in med mešanjem dokapavamo 6.873 g naftalen-2sulfonilklorida, raztopljenega v 60 ml kloroforma brez etanola. Reakcijsko zmes mešamo pol ure pri -5 °C, nato pa še 24 ur pri sobni temperaturi. Reakcijsko zmes uparimo na rotavaporju in dodamo 150 ml etilacetata.V ločniku spiramo 2-krat s 100 ml vode, s 100 ml 10% citronske kisline in s 100 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na₂SO₄, filtriramo in filtrat uparimo na rotavaporju. Produkt suspendiramo v etru in oborino odfiltriramo s presesavanjem.Oborino nato segrevamo v etanolu na 40 °C in neraztopljene kristale odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek : 3.68 g (27 %)

IR (KBr, cm’¹): 3191.7, 2931.6, 2221.0, 1680.5, 1433.5, 1333.1, 1168.8, 857.9, 749.4, 692.2

Molekulska masa C₂₄H₂₄N₄O3S: izračunana: 448.54; ugotovljena : 449 (MH⁺)

PRIMER 9 l-(naftaIen-2-suIfonil)-2-(4-(amino(hidroksiimino)metil)-benzil)-4-( /V⁴^-pentametilen)-semikarbazid (LK 632)

-(naftalen-2-sulfonil)-2-(4-cianobenzil)-4-( //^-pentametilenj-semikarbazid (3.68g) suspendiramo v 100 ml brezvodnega etanola, prepihamo z argonom in dodamo 541.4 mg hidroksilamina. Reakcijsko zmes mešamo v argonovi atmosferi pri sobni temperaturi 24 ur in uparimo na rotavaporju. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (mobilna faza:

kloroform/metanol = 9/1). Dobimo bele kristale.

Izkoristek: 1.49 g (38 %); Tališče: 195-200 °C; IR (KBr, cm'¹): 3383.4, 2935.1, 1660.5,

1427.4, 1335.0, 1162.8, 1075.1, 934.4, 751.2, 678.3; *H-NMR (DMSO-d₆):6 (ppm):1.04 (m, 4H, CH₂-piperidin3’₅·); 1.24 (m, 2H, CH₂-piperidin4·); 3.00 (m, 4H, CH₂-piper₂-_i6·); 4.24 in 4.38 (2s, 2H, Ar- CH₂N); 5.77 ( s, 2H, NH₂); 7.15 in 7.59 (2d, 2H vsak, J_2>6=8.24 Hz, J_3>5= 8.29 Hz, H-Ar_2>3)5)6); 7.58-8.50 (m, 7H, H-Ar); 9.38 (s, IH, NH₂); 9.62 (s,IH, =NOH)

Molekulska masa C24H27N5O4S: izračunana: 481.57; ugotovljena : 482 (MH ⁺)

PRIMER 10 l-(naftalen-2-suIfonil)-2-(4-amidino-benzil)-4-(/V⁴^V⁴-pentametilen)semikarbazid acetat

-(naftalen-2-sulfonil)-2-(4-(amino(hidroksiimino)metil)-benzil)-4-( V⁴,/V⁴- pentametilen)semikarbazid (100 mg) raztopimo v 10 ml ledocta in dodamo 0,029 ml acetanhidrida. Raztopino prepihamo z argonom, dodamo 10 mg katalizatorja, 10% Pd/C in 24 ur uvajamo vodik pri sobni temperaturi in normalnem tlaku. Katalizator nato odfiltriramo skozi guč (B4). Raztopino uparimo na rotavaporju ter prelijemo z etrom, da izpade kosmičasta sivobela oborina, ki jo odfiltriramo s presesavanjem.

Izkoristek: 50,4 mg (52%)

IR (KBr, cm'¹): 3246.4, 1655.3, 1561.1, 1417.9, 1245.0, 1170.0, 1026.0, 816.5, 745.4, 689.7, 642.3 ‘H-NMR (DMSO-d6):b (ppm): 1.03 (m, 4H, CH2-piperidin₃-5·); 1.22 (m, 2H, CH₂-piper4·); 2.98 (m, 4H, CH₂-piperidin₂;₆·); 4.46 (s, 2H, Ar- CH₂N); 7.35 in 7.70 (2d, 2H vsak, J₂,6=8.24 Hz, J_3>5= 8.29 Hz, H-A^p^); 7.59-8.38 (m, 7H, Η-Ar); Molekulska masa C24H27N5O3S: izračunana: 465.57; ugotovljena : 466 (MH ⁺)

Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo

Lek, tovarna farmacevtskih in kemičnih izdelkov d.d.

Claims (9)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Spojine s splošno formulo I R¹ %/^NH

   R3^zXll o

   v kateri pomenijo ^H2^Nx^>^NR4

   R¹ ostanek s formulo kjer je R⁴ = H, Ci-C₃ alkil, OH, O-(C,-C₃)-alkil, NH₂ kjer je R⁵ = H, (C_rC₃) alkil, CF₃, COOR⁹,

   COOR¹⁰ kjer je R⁶ = H, (Ci-C3) alkil, CF3, COOR⁹, kjerjeR⁹ = H, (Ci-C3)alkil, kjer je R⁷ = H, (Ci-C3)alkil, (C3-Cg) cikloalkil, kjer je R⁸ = (Ci-C3) alkil, (C₃-C₇) cikloalkil, kjer je R¹⁰ = H, (C1-C3) alkil, benzil,

   R ostanek s formulo ter njihove farmacevtsko sprejemljive soli.
2. 2. Spojine s formulo 1 po zahtevku 1 označene s tem, da se uporabljajo kot terapevtsko aktivne snovi.
3. 3. Postopek za pripravo spojin s formulo I po zahtevku 1 označen s tem, da 4-cianbenzaldehid s formulo (II)

   CN

   CHO presnovimo z BOC-karbazatom s formulo (III) (lil) v spojino s formulo (IV)

   CN (IV) ki jo s postopkom redukcije s katalitskim hidrogeniranjem ali z NaCNBHj pretvorimo v spojino (V),

   CN (V) ki

   a) reagira s trifosgenom in aminom s formulo (VI) kjer imata R⁵ in R⁶ enak pomen kot v formuli (I), ali s trifosgenom in aminom s formulo (VII ali VIII ali IX), νη₂ (VII) (Vlil) (IX) ali s trifozgenom in aminom s formulo (X) R⁷

   HN

   R⁸ (X) • 7 8 kjer imata R in R enak pomen kot v formuli (I), ali s trifozgenom in aminom s formulo (XI),

   COOR¹⁰ (XI) kjer ima R¹⁰ enak pomen kot v formuli (I), v “one pot” reakciji do spojine

   CN

   O. ^NH (XI) kjer ima R² enak pomen kot v formuli (I), kiji nato odstranimo zaščitno BOC skupino s HCI (g) v HOAc pri sobni temperaturi in dobimo spojino (XII), nh; ci kjer ima R enak pomen kot v formuli (I), ki reagira z aromatskim sulfonilkloridom do spojine (XIII) CN (XIII) %/^NH

   RS^II

   O kjer imata R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), ki jo nato presnovimo s hidroksilaminom v brezvodnem etanolu do spojine s formulo (xiv)

   R¹

   I %/^NH

   R^ll o

   kjer imajo R¹, R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja skupino OH, ki jo potem presnovimo s katalitskim hidrogeniranjem v spojino (XV) kjer imajo R¹, R² in R³ enak pomen kot v formuli (I), R⁴ pa predstavlja vodik;

   R¹ (XV)

   R³'

   N

   I

   NH

   R²

   b) ali spojino (V) presnovimo s 4-nitrofenilkloroformatom v aprotičnih topilih ob prisotnosti terciarnih aminov do spojine XVI,

   CN

   O (XVI) ki jo s hidroksilaminom presnovimo v spojino XVII ^Η2^Ν\^^Ν0Η
4. 4. Uporaba spojin s formulo I po zahtevku 1 za pripravo zdravil, ki zavirajo trombin in nastajanje fibrina in trombusov.
5. 5. Farmacevtski pripravki, označeni s tem, da vsebujejo terapevtsko učinkovito množino spojine s formulo I po zahtevku 1 in farmacevtsko sprejemljive pomožne snovi.
6. 6. Farmacevtski pripravki po zahtevku 5 označeni s tem, da se uporabljajo za zaviranje trombina v krvi človeka in drugih sesalcev.
7. 7. Farmacevtski pripravki po zahtevku 5 označeni s tem, da se uporabljajo za zaviranje nastajanja fibrina in trombusov v krvi človeka in drugih sesalcev.
8. 8. Uporaba spojin s formulo I po zahtevku 1 za pripravo zdravil za zaviranje trombina v krvi človeka in drugih sesalcev.
9. 9. Uporaba spojin s formulo I po zahtevku 1 za pripravo zdravil za zaviranje nastajanja fibrina in trombosov v krvi človeka in drugih sesalcev.