SE526768C2 - System och förfarande för embryotransport för tillverkade frön - Google Patents

Description

Den syntetiska gametofyten placeras inuti fröhöljet så att gametofyten väsentligen fyller fröhöljet. En hjärt- bladsfixering kan vara centralt placerad i den syntetiska gametofyten. Hjärtbladsfixeringen innefattar ett centralt beläget hàlrum som sträcker sig delvis genom hjärtblads- fixeringens längd och är dimensionerat att uppta växtem- bryot däri. Det välkända Växtembryot är ungefär 4-7 mil- limeter långt och ungefär 0,5 millimeter i diameter.

Växtembryots form är tämligen cylindrisk, men oregelbun- den i tvärsektion och varierad i diameter utmed sin längd. Växtembryot omfattar en rotämnesände och en hjärt- bladsände. Växtembryot placeras i hjärtbladsfixeringens hålrum med hjärtbladsänden först. Växtembryot förseglas typiskt inuti fröhöljet medelst minst en ändförsegling.

Transport av Växtembryot till fröhöljets inre har tidigare använt antingen konventionella manuella pincet- ter eller vacuumplockningsanordningar för överföring av Växtembryot genom tillverkningslinjen för tillverkade frön. I sådana överföringssystem som använder konventio- nella pincetter placeras växtembryona manuellt i separata fröhöljen, ett i taget, av tekniker. I sådana överfö- ringssystem som använder vacuumplockanordningar greppas växtembryona ett i taget vid sidorna från ett första läge och överförs till ett andra läge av en automatisk robot- arm. Vid änden av robotarmen finns ett plockhuvud, till vilket en vacuumkälla är kopplad. Plockhuvudet innefattar en spets som har en spetsöppning dimensionerad att greppa och hålla ett enda växtembryo via vacuumtryck. Efter att plockhuvudet har greppat embryot placeras embryot för er- hållande av dess morfologiska mått och lägesmåtten för rotämnesänden. Embryot återpositioneras sedan så att em- bryot hålls vid rotämnesänden och överförs sedan till det andra läget för placering av embryot i fröhöljet. Så snart robotarmen har förflyttats till det andra läget stängs vacuumkällan av för frigöring av embryot. Även om sådana växtembryotransportsystem är effekti- va för transport av växtembryon är de inte problemfria. 10 15 20 25 30 35 5226 768 3 Vid användning av konventionella manuella pincetter är till exempel den kraft som appliceras pà embryona svår att styra. Detta resulterar i risk för skada pà embryona och implementering av kraftsensorer för ett sådant litet föremål genom användning av konventionella metoder för överbryggande av detta problem är alltför opraktiska för kommersiell framgång. Vid användning av vacuumplockhuvu- den greppas embryot inte alltid framgångsrikt på grund av embryonas slumpmässiga riktning och variationen i storlek och form hos embryona. Embryots yta är dessutom krökt, vilket kan förhindra en korrekt tätning mot plockhuvudets spetsöppning. En sådan ofullständig tätning kan låta tillräckligt mycket luft strömma kring embryot för att ett otillräckligt vacuum skall bildas. Avsaknad av sug- kraft finns därför för greppande och hållande av embryot under överföringsprocessen, vilket leder till misslyckade överföringar. Misslyckade överföringar av livsdugliga em- bryon är kostsamma i moderna automatiserade materialhan- teringssystem.

Med båda de förutnämnda överföringsmetoderna finns för det andra ett problem när antingen operatören eller det automatiska plockhuvudet försöker släppa embryot i fröhöljet. Eftersom embryona hålls fuktiga eller våta för förhindrande av skada genom uttorkning kan embryot mer specifikt förbli fäst vid spetsen av antingen pincetten eller plockhuvudet, på grund av ytspänningen som bildas mellan fukten på embryot och kontaktytan på pincetten el- ler plockhuvudets spets. I fallet med konventionella pin- cetter placerar teknikern, för att frigöra embryot, ty- piskt embryot för kontakt med sidan av hjärtbladsfixe- ringens öppning för skapande av ytspänning däremellan för övervinnande av den ytspänning som hör samman med pin- cettspetsarna. I fallet med vacuumplockhuvudet trycks en lufttryckspust ut ur spetsens öppning för övervinnande av ytspänningen och för tvingande av embryot ut ur vacuumhu- vudet. I vissa fall är luftflödesstöten antingen otill- räcklig för frigöring av embryot eller för kraftig, så 10 15 20 25 30 35 526 768 4 att embryot skadas av träffkraften mot botten av fixe- ringen. I endera fallet kan livsdugliga embryon förstö- ras, vilket är dyrbart i kommersiell användning. Effek- terna av ytspänning och de konventionella metoderna för övervinnande av dessa kan dessutom orsaka oönskad för- flyttning av embryot, vilket i sin tur påverkar embryots riktning för införing i fröhöljet och kan leda till in- korrekt placering av eller skada på embryot.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning hänför sig till ett embryo- transportsystem som avhjälper bristerna hos den kända tekniken och andra genom användning av en automatisk mik- ropincett i embryoöverföringsprocessen. Mikropincetten är, såsom kommer att beskrivas i detalj nedan, specifikt utformad för att minska pincettspetsarnas kontaktyta på embryona, för minskning av ytspänningen däremellan.

Minskning av ytspänning resulterar i förbättrad embryo- frigöringsförmåga för embryotransportsystemet.

Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning tillhandahållas ett förfarande för transport av embryon.

Förfarandet innefattar positionering av minst ett embryo beläget på en uppbärningsyta i ett hämtningsläge. Det orienterade embryot hämtas med en automatisk mikropincett genom manövrering av mikropincetten till ett stängt läge.

Mikropincetten är flyttbar mellan ett hämtläge och ett frigöringsläge. Den automatiska mikropincetten förflyttas till frigöringsläget, där ett fröhölje är placerat i för- hållande till frigöringsläget. Bmbryot frigörs sedan i fröhöljet genom manövrering av mikropincetten till ett öppet läge.

Enligt en annan utföringsform av föreliggande upp- finning tillhandahálles ett förfarande för transport av växtembryon till ett odlingsmedium. Förfarandet innefat- tar avbildning av ett flertal växtembryon uppburna på en första yta för erhållande av minst ett utvalt växtembryo- attribut, och orientering av ett växtembryo i ett förut- 10 15 20 25 30 35 bestämt hämtningsläge baserat på växtembryoattributet.

Det orienterade embryot överförs med hjälp av mikropin- cett från hämtningsläget till ett frigöringsläge och fri- görs från mikropincetten i odlingsmediet i frigöringslä- get.

I ytterligare en utföringsform av föreliggande upp- finning tillhandahàlles ett förfarande för transport av odlade embryon i ett materialhanteringssystem som har ett första positioneringsbord, en överföringsanordning med mikropincett och ett andra positioneringsbord. Förfaran- det innefattar positionering av en yta som har ett fler- tal slumpmässigt orienterade embryon på det första posi- tioneringsbordet och erhållande av minst ett attribut hos de slumpmässigt orienterade embryona. Ett av embryona orienteras sedan enligt det erhållna attributet genom styrd manövrering av det första positioneringsbordet, så att embryot får ett valt, repeterbart hämtningsläge. Em- bryot överförs från ytan med hjälp av den automatiska mikropincetten till ett valt, repeterbart frigöringsläge på avstånd från ytan, och placeras i ett fröhölje posi- tionsmässigt styrt av det andra positioneringsbordet.

Kort beskrivning av ritningarna De föregående aspekterna och många av de åtföljande fördelarna hos uppfinningen kommer att förstås bättre med hjälp av följande detaljerade beskrivning med hänvisning till de bifogade ritningarna, på vilka: fig 1 är en utföringsform av ett embryotransportsy- stem konstruerat i enlighet med föreliggande uppfinning, fig 2 är en alternativ utföringsform av embryotrans- portsystemet konstruerat i enlighet med föreliggande upp- finning, fig 3 är en partiell perspektivvy av mikropincetten som hämtar ett kvalificerat embryo, fig 4 är partiell sidovy av mottagningsenheten, var- vid det kvalificerade embryot frigörs från mikropincetten 10 15 20 25 30 35 och placeras i ett odlingsmedium, såsom ett tillverkat frö, och fig 5 är ett blockdiagram som visar komponenterna hos embryotransportsystemen i fig 1 och 2.

Detaljerad beskrivning av de föredragna utföringsformerna Föreliggande uppfinning kommer nu att beskrivas med hänvisning till figurerna, där lika hänvisningsbeteck- ningar betecknar lika komponenter. Fig 5 är ett block- schema som visar en utföringsform av ett embryotransport- system 20 konstruerat enligt föreliggande uppfinning. Em- bryotransportsystemet 20 består av en embryoinriktnings- enhet 22, en överföringsenhet 24 och en embryomottag- ningsenhet 26. Vid drift hämtar embryotransportsystemet 20 växtembryon ett i taget från ett läge i tillverknings- linjen för tillverkade frön och placerar varje embryo i ett separat odlingsmedium, sàsom ett fröhölje. För detta syfte orienterar inriktningsenheten 22 växtembryona som skall greppas av överföringsenheten 24. Överföringsenhe- ten 24 greppar ett efter ett embryona från inriktningsen- heten 22 och förflyttar embryona till ett andra läge, där embryona tas emot av embryomottagningsenheten 26. Embryo- transportsystemet 20 innefattar vidare ett styrsystem 28, vilket har en dator 56 eller annan allmän beräkningsan- ordning. Styrsystemet 28 sänder och tar emot styrsignaler till och från enheterna 22, 24 och 26 för automatisering av embryotransportprocessen.

Med hänvisning till fig l kommer nu embryoinrikt- ningsenheten 22 att beskrivas i närmare detalj. Såsom framgår av fig 1 innefattar inriktningsenheten 22 ett precisions-X-Y-rotationspositioneringsbord 40. Positione- ringsbordet 40 translationsförskjuts selektivt i tvâ di- mensioner och roterar kring en axel som är vinkelrät mot translationsriktningarna. Positioneringsbordet 40 kan speciellt röra sig framåt och bakåt i X-riktningen, från sida till sida i Y-riktningen och rotera kring Z-axeln för âstadkommande av vinkelförskjutning. I en utförings- 10 15 20 25 30 35 7 form av föreliggande uppfinning kan positioneringsbordet 40 vara konventionellt hopmonterat av tvâ linjärrörelse- bord, ett för X-riktningen och ett för Y-riktningen, så- som modell F55-332 och ett rotationsrörelsebord, såsom modell F55-327, vilka alla finns att tillgå från Edmund Industrial Optics, Barrington, New Jersey. På positions- bordets 40 ovansida finns en uppbärningsyta 44, såsom en petriskål, på vilken ett flertal embryon 46 är slumpmäs- sigt orienterade. Embryona 46 kan slumpmässigt placeras på uppbärningsytan 44 manuellt av tekniker eller genom en automatiserad process från tillverkningslinjen för till- verkade frön.

Inriktningsenheten 22 innefattar vidare ett avbild- ningssystem 50 eller annat lämpligt system för erhållande av attribut hos växtembryona 46. Avbildningssystemet 50 kan erhålla vilket som helst antal växtembryoattribut, såsom storlek, form, axiell symmetri, hjärtbladsform el- ler -utveckling, ytstruktur, färg etc. I en utföringsform erhåller avbildningssystemet 50 antingen storleken eller storleks- och formmått, och baserat på dessa mått kommer embryona 46 att klassificeras som okvalificerade eller kvalificerade växtembryon. För att klassificeras som ett kvalificerat embryo bör embryots mått indikera, inom en tillräcklig tolerans, att embryot kommer att passa i öpp- ningen 126 hos en hjärtbladsfixering 128 (se fig 4). Av uppfinnarna av föreliggande uppfinning har konstaterats att ett sådant urvalskriterium kommer att ge en accepta- bel procentsats livsdugliga embryon.

Förutnämnda attribut erhålles av avbildningssystemet 50 genom att bilder av växtembryona 46 först förvärvas och sedan digitalt lagras medelst en välkänd digital av- bildningskamera 54. De förvärvade och digitalt lagrade bilderna bearbetas sedan av ett program som exekveras av datorn 56 hos styrsystemet 28 (se fig 5). Programmet gör en kvalitativ bestämning av varje växtembryo 46 och base- rat på förutbestämda parametrar, storlek och form i detta fall, definierar och lagrar vilka växtembryon som är kva- 10 15 20 25 30 35 526 768 8 lificerade, nu kallade kvalificerade embryon 48. Utöver att bearbeta bilderna tagna av digitalkameran 54 för val- da embryoattribut bestämmer programmet också externa em- bryoattribut, i detta fall positionsinformation sammanhö- rande med varje diskret kvalificerat växtembryo 48. Ef- tersom varje odlingsmedium skall ta emot ett enda kvali- ficerat embryo bör det förstås att ett urvalskriterium, inkluderande antingen storlek eller form och storlek, kommer att diskvalificera grupper eller kluster av embry- on som kan finnas pà uppbärningsytan 44.

I en alternativ utföringsform kan växtembryona 46 kvalificeras eller på annat vis konstateras vara lämpliga för groning baserat pà andra kriterier, t ex ytstruktur, färg, IR-absorption eller -reflektion, betastràlningsab- sorption, axiell symmetri och hjärtbladsutveckling eller vilket som helst annat attribut som är allmänt mätbart medelst kameraliknande avkänningsanordningar. För detta syfte kan de förvärvade och digitalt lagrade bilderna från digitalkameran 54 skickas till styrsystemets 28 da- tor 56 (se fig 5) och bearbetas av ett klassificerings- såsom det som beskrivs i PCT/US99/12128 med ti- teln: Method for classification of somatic embryos, program, in- lämnad den 1 juni 1999, vars beskrivning inkorporeras häri genom hänvisning. Frogrammet gör en kvalitativ be- stämning av växtembryona och definierar och lagrar vilka växtembryon som är kvalificerade baserat på förutbestämda parametrar.

Det bör förstås att andra klassificeringsmetoder och -system kan användas med föreliggande uppfinning för ur- val av kvalificerade embryon. Exempelvis kan embryona klassificeras genom den flerstegsscreeningprocess som be- skrivs i den parallellt löpande ansökan US 10/6l1756 med titeln: Automated system and method for harvesting and multi-stage screening of plant embryos, inlämnad den 30 juni 2003, vars beskrivning inkorporeras häri genom hän- visning. Embryona kan dessutom klassificeras som kvalifi- cerade genom en spektroskopisk analysmetod, såsom IR- 10 15 20 25 30 35 spektroskopi, NIR~spektroskopi eller Raman-spektroskopi, såsom beskrivs i PCT/US99/12128 med titeln: Method for classification of somatic embryos, inlämnad den l juni 1999. Dessa klassificeringsmetoder kan användas för vilka som helst absorptions-, transmittans- eller reflektans- spektra hos embryona för klassificering av embryona en- ligt deras kemiska sammansättning. Andra metoder som an- vänder Raman-spektroskopi för klassificering av embryon, vilka kan användas med föreliggande uppfinning beskrivs i den parallellt löpande ansökan US 10/611530 med titeln: Method for classifying plant embryos using Raman spec- troscopy, inlämnad den 30 juni 2003, vars beskrivning in- korporeras häri genom hänvisning. Toppkupolen belägen vid ett växtembryos hjärtbladsände kan dessutom avbildas tre- dimensionellt och analyseras för klassificering av embry- on som klassificerade. Vissa metoder för tredimensionell avbildning av en toppkupol hos ett växtembryo finns i den parallellt löpande ansökan US 10/611529 med titeln: Method and system for three-dimensionally imaging an api- cal dome of a plant, inlämnad den 30 juni 2003, vilken inkorporeras häri genom hänvisning.

Sá snart ett flertal embryon 46, vid drift, är slumpmässigt placerade på uppbärningsytan 44 förvärvar avbildningssystemets 50 avbildningskamera 54 bilder av embryona 46 och överför bilderna till datorn 56 (se fig 5) för bearbetning. Sá snart en bestämning gjorts pà var- je embryo 46 av om de är kvalificerade embryon 48 eller okvalificerade embryon bestäms positionsinformationen för varje kvalificerat embryo 48 av datorn 56. Baserat på po- sitionsinformationen som bestämts för varje kvalificerat embryo 48 riktas de kvalificerade embryona 48 därefter ett i taget in genom förflyttning av positioneringsbordet 40 till ett känt hämtningsläge för hämtning medelst över- föringssystemet 24. Det kvalificerade embryot 48 hämtas sedan av överföringssystemet 24 och överförs därefter till mottagningsenheten 26, såsom kommer att beskrivas närmare nedan. I den visade utföringsformen orienteras de 10 15 20 25 30 35 01 PC (fx \'l C7\ CO 10 kvalificerade embryona 48 ett efter ett i hämtningsläget, så att varje kvalificerat embryo 48 kan greppas med sin hjärtbladsände 58 i linje med X-riktningen såsom tydli- gast visas i fig 3, vänd motsatt mottagningsenheten 26 (vänd åt vänster i fig 1).

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning kan den köordning i vilken de kvalificerade embryona 48 väljs för hämtning bestämmas för förbättring av embryotransportpro- cessens genomströmning. De kvalificerade embryonas 48 hämtningsordning från uppbärningsytan 44 kan bestämmas genom vilken som helst kapacitetsförbättringsrutin. I den föredragna utföringsformen utförs kapacitetsförbättrings- rutinen av datorn 56 (se fig 5), vilken sorterar den po- sitionsinformation som inhämtats av avbildningssystemet 50 och bearbetats av datorn 56 för val av hämtningsord- ningen för kvalificerade embryon 48 baserat på de kvali- ficerade embryonas 48 relativa lägen. Vid drift sorterar rutinen först alla kvalificerade embryon 48 enligt rota- tionspositionering med början med det kvalificerade em- bryo som har en rotationsposition, i antingen grader el- ler radianer, närmast en definierad referensposition, sà- som den förvalda positionsinställningen för positionsbor- det. Rutiner styr därefter positioneringsbordet 40 för sekventiell orientering av de kvalificerade embryon 48 som skall hämtas av överföringsenheten 24 enligt den sor- terade rotationspositionsinformationen.

Med hänvisning till fig 1 kommer nu överföringsenhe- ten 24 att beskrivas närmare. Såsom beskrivits ovan häm- tar överföringsenheten 24 ett kvalificerat embryo 48 från uppbärningsytan 44 i det kända hämtningsläget och överför det kvalificerade embryot 48 till ett känt frigöringslä- ge. Såsom bäst framgår av fig 1 innefattar överföringsen- heten 24 en överföringsanordning 60 som är selektivt för- flyttbar styrt utmed ett spàr 62. Överföringsanordningens 60 selektiva rörelse kan åstadkommas medelst vilket som helst välkänt linjärt manöverdon (ej visat), såsom en linjär motorskruv eller ett pneumatiskt kolv- och cylin- 10 15 20 25 30 35 768 526 ll derarrangemang, och styras av styrsystemet 28 (se fig 5). Överföringsanordningen 60 kan innefatta ett hölje 66 med en motordriven vridbar axel 70 som sträcker sig från höl- jet 66 i Y-riktningen. Den vridbara axeln 70 är selektivt vridbar mellan hämtningsläget visat med streckade linjer i fig 1 (längst till vänster) och frigöringsläget, såsom visas längst till höger i fig 1, och styrs av styrsyste- met 28. Fastgjort vid den vridbara axeln 70 för vridning tillsammans med denna är ett förlängningselement 72. Vid förlängningselementets 72 distala ände är en mikropincett 80 fastgjord.

Såsom bäst framgår av fig 3 innefattar mikropincet- ten 80 armar 84, vid vilka mikropincettsspetsar 88 är fastgjorda. Mikropincettens 80 spetsar 88 är företrädes- vis fastgjorda vid armarna 84 i en vinkel, t ex 30°, för underlättande av hämtning och frigöring av de kvalifice- rade embryona 48. Mikropincetten 80 kan tillverkas av ki- sel i en etsningsprocess eller liknande. Det bör förstås att kisel i de avsedda dimensionerna kan ge efter. Mikro- pincettens 80 spetsar 88 är rörliga mellan ett öppet läge visat med streckad linje i fig 3 i vilket utrymmet mellan spetsarna 88 är tillräckligt för upptagning av ett kvali- ficerat embryo 48 däremellan, och ett stängt läge i vil- ket mikropincettens 80 spetsar 88 greppar det kvalifice- rade embryot 48. Mikropincettens 80 spetsar 88 är speci- fikt utformade för att skapa en kontaktyta som är till- räckligt liten för att minimera effekterna av ytspänning som skapats av fukt hos embryot i kontakt med mikropin- cettens 80 spetsar 88. Spetsarna 88 är särskilt utformade med en lämplig kontaktyta som möjliggör frigöring av det kvalificerade embryot 48 när mikropincetten 80 manövreras till det öppna läget, och kommer att minimera hanteringen eller förflyttningen av det kvalificerade embryot före frigöring. I en utföringsform kan kontaktytan vara sådan att när mikropincetten 80 manövreras för att frigöra det kvalificerade embryot 48 övervinner det kvalificerade em- bryots 48 vikt ytspänningen däremellan, vilket i sin tur 10 15 20 25 30 35 12 separerar det kvalificerade embryot 48 från mikropincet- ten 80. I en utföringsform är kontaktytan på varje mikro- pincettspets ungefär 10-100 mikrometer bred och ungefär 2 millimeter hög. Det bör förstås att endast ett litet par- ti av höjden pà 2 millimeter kommer att komma i egentlig kontakt med embryot, företrädesvis vid den distala änden, på grund av embryots storlek, form och ytkrökning. Mikro- pincetter som kan användas i föreliggande uppfinning finns att tillgå från MEMS Precision Instruments (http://www.memspi.com).

I drift, så snart positioneringsbordet 40 har orien- terat ett kvalificerat embryo 48 till hämtningsläget häm- tar överföringsenheten det kvalificerade embryot 48. För att göra detta translationsförskjuts överföringsanord- ningen 60 utmed spåret 62 och vrids mikropincetten 80 av den vridbara axeln 70 till hämtningsläget, vilket visar med streckad linje i fig 1. Mikropincetten 80 kan vridas till hämtningsläget samtidigt med att överföringsanord- ningen förflyttas eller vrids till hämtningsläget efter att överföringsanordningen 60 har förflyttats. Så snart hämtningsläget har uppnåtts manövreras mikropincetten 80 från det öppna läget, visat med streckad linje i fig 3, till det stängda läget för greppande av det kvalificerade embryot 48. Mikropincetten 80 kan manövreras till det stängda läget på ett antal olika sätt. I den föredragna utföringsformen manövreras emellertid mikropincetten 80 till det stängda läget genom applicering av elektrisk ström på armarna 84 enligt känd teknik och styrs av da- torn. Mikropincetten 80 kan på liknande sätt manövreras till det öppna läget, när så önskas, genom avstängning av appliceringen av elektrisk ström till armarna 84, enligt känd teknik.

Efter att det kvalificerade embryot 48 har hämtats fràn uppbärningsytan 44 translationsförskjuts överfö- ringsanordningen 60 utmed spåret 62 till ett andra frigö- ringsläge, medan axeln 70 samtidigt vrids i pilens 92 riktning motsatt hämtningsriktningen. På grund av den 10 15 20 25 30 35 13 lilla storleken hos mikropincetten 80 och det kvalifice- rade embryo 48 som skall hämtas kan avbildningskameran 54 drivas kontinuerligt för att ge återkopplingsstyrinforma- tion för ompositionering av positioneringsbordet 40 och/eller styrning av manövreringen av mikropincetten 80 via datorn 86 (se fig 5).

Under det att överföringsanordningen 60 visas i lin- jär translationsförskjutning utmed spåret 62 bör det för- stås att andra metoder för överföring av de kvalificerade embryona från hämtningsläget till frigöringsläget är möj- liga. Exempelvis kan överföringsanordningen 60 använda en robotsvängarm som vrids kring Z-axeln för förflyttning av mikropincetten mellan sådana kända lägen. Det bör dessut- om förstås att höljet 66 kan vara ett robothölje som kan förflytta sig i X-, Y- och Z-riktningarna, liksom vridas kring Z-axeln. Robothöljet hos en sàdan överföringsanord- ning kan användas tillsammans med eller utan positione- ringsbordet 40 för positionering av mikropincetten för hämtning av de valda kvalificerade embryona.

Med hänvisning åter till fig 1 kommer mottagningsen- heten 26 nu att beskrivas närmare. Såsom beskrivits ovan tar mottagningsenheten 26 emot det kvalificerade embryot 48 från överföringsenheten 24 i frigöringsläget. Såsom bäst framgår av fig 1 innefattar mottagningsenheten 26 ett tredimensionellt precisionspositioneringsbord 100, vilket selektivt translationsförskjuts i tre dimensioner.

Positioneringsbordet 100 tillåts särskilt förflytta sig framåt och bakåt i X-riktningen, från sida till sida i Y- riktningen, liksom uppåt och nedåt i Z-riktningen. I en utföringsform av föreliggande uppfinning kan positione- ringsbordet 100 monteras konventionellt av två linjärrö- relsebord, ett för X-riktningen och ett för Y-riktningen, såsom modell F55-332, och ett linjärrörelsebord för Z- riktningen, såsom modell F53-673, vilka alla finns att tillgå från Edmund Industrial Optics, Barrington, New Jersey. 10 15 20 25 30 35 14 På positioneringsbordets 100 ovansida finns en be- hàllarbricka 110. Behållarbrickan 110 innefattar ett flertal hålrum 114, vilka sträcker sig vertikalt därige- nom, varav endast ett visas i fig 4. Såsom bäst framgår av fig 4 finns upptaget i varje hàlrum 114 ett välkänt tillverkat fröhölje 120, såsom det som beskrivs i US-5 701 699 (Carlson et al), vars beskrivning inkorpore- ras häri genom hänvisning. Mottagningsenheten 26 innefat- tar vidare minst en positionsavkännare 124 (se fig 1), såsom en lasermikrometer eller avbildningskamera, för er- hållande av positionsinformation om det kvalificerade em- bryot 48. Positionsavkännare 124 är belägen så att det kvalificerade embryot 48 placeras inom avkänningsomràdet i frigöringsläget. Avkänningssensorn 124 bestämmer läget för centrum av det kvalificerade embryots 48 hjärt- bladsände 58 (se fig 4). Positioneringsbordet 100 kan in- nefatta en avbildningskamera (ej visad) för noggrann lo- kalisering och lagring av centrum av hjärtbladsfixering- ens 128 öppning 126 i det tillverkade fröet 120. Alterna- tivt kan behållarbrickan 110 orienteras på positione- ringsbordet 100 så att positionsinformation om varje frö- höljes 120 fixeringsöppning 126 kan erhållas i förhållan- de till ett känt fast läge hos behållarbrickan 110 och lagras i styrsystemet.

Vid drift, med positionsinformation om hjärtblads- fixeringsöppningen 126 hos det tillverkade fröhöljet 120 och positionsinformation om hjärtbladsänden 58 hos det kvalificerade embryot 48 som hålls av mikropincetten 80 ovanför positioneringsbordet 100 justerar och indexerar positioneringsbordet 100 noggrant behållarbrickans 134 läge, så att den förflyttar hjärtbladsfixeringens 128 öppning 126 till det exakta läget för det kvalificerade embryo 48 som hålls av mikropincetten 80. Vid denna tid- punkt manövreras mikropincetten 80 från det stängda läget till det öppna läget och det kvalificerade embryot 48 frigörs från mikropincetten 80 in i det tillverkade frö- höljets 120 hjärtbladsfixering 128. 10 15 20 25 30 35 15 Såsom beskrivits ovan i en alternativ utföringsform kan överföringsanordningens hölje 66 vara ett robothölje som kan röra sig i X-, Y- och Z-riktningarna. Robothöljet hos en sådan överföringsanordning kan användas tillsam- mans med eller utan positioneringsbordet 100 för för- flyttning av mikropincetten till ett läge för frigöring av det kvalificerade embryot i fröhöljet.

Embryotransportsystemets 20 drift kommer nu att be- skrivas med hänvisning till fig l-5. Ett flertal embryon 46 transporteras från embryogenestillverkningslinjen, an- tingen manuellt eller genom en automatisk process, och placeras slumpmässigt pà uppbärningsytan 44 hos preci- sionspositioneringsbordet 40. Avildningskameran 54 för- värvar sedan och lagrar digitalt, om så krävs, bilder som kommer att användas för bestämning av om nâgra av embryo- na 46 kan betraktas som kvalificerade att placeras i ett tillverkat frö 120.

Om embryona 46 är kvalificerade att placeras i ett tillverkat frö bestäms lägesinformation för varje kvali- ficerat embryo 48 och används för sammanställning av en embryohämtningskö. I en utföringsform av föreliggande uppfinning sorteras de kvalificerade embryona 48 och ar- rangeras i kön enligt rotationskoordinatsinformation. Sá snart styrsystemet 28 har alstrat en hämtningskö, under användning av en kapacitetsförbättringsrutin eller inte, inriktas det första kvalificerade embryot 48 av positio- neringsbordet 40 medelst styrsignaler som utsänds av styrsystemet 28 till det exakta hämtningsläget.

Samtidigt med eller sekventiellt efter inriktning av det kvalificerade embryot 48 till hämtningsläget sänder styrsystemet 28 styrsignaler till överföringsanordningen 60, så att överföringsanordningen 60 translationsför- skjuts till hämtningsläget och den vridbara axeln 70 vri- der mikropincetten 80 i riktningen motsatt pilen 92 till embryohämtningsläget. Sá snart mikropincetten 80 är i hämtningsläget manövreras mikropincetten 80 till det stängda läget, varigenom det kvalificerade embryot 48 10 15 20 25 30 35 526 768 16 greppas mellan mikropincettspetsarna 88. I en utförings- form för förbättring av hämtningsprocessens noggrannhet och för styrning av den kraft som anbringas på det kvali- ficerade embryot 48 kan avbildningssystemet 50 kontinuer- ligt förvärva bilder av mikropincettspetsarnas 88 läge i förhållande till det kvalificerade embryot 48 för åstad- kommande av återkopplingsstyrinformation till datorn.

Efter att det kvalificerade embryot 48 har hämtats från uppbärningsytan 44 translationsförskjuts överfö- ringsanordningen 60 i den motsatta riktningen utmed spå- ret 62 till frigöringsläget, medan axeln 70 samtidigt vrids i motsatt riktning visad med pilen 92. I frigö- ringsläget håller mikropincetten 80 det kvalificerade em- bryot 48 inom avkänningsfältet för positionsavkännaren 124 för inhämtning av positionsinformation om det kvali- ficerade embryots 48 hjärtbladsände 58. Såsom bäst fram- går av fig 1 och 4 är det kvalificerade embryots 58 längdaxel i frigöringsläget i linje med Z-riktningen.

Samtidigt med eller före inhämtandet av positionsin- formation för det kvalificerade embryot kan, såsom note- ras ovan, en andra avbildningskamera sammanhörande med positioneringsbordet 100 lokalisera läget för hjärtblads- fixeringens 128 öppning 126 i det tillverkade fröet 120 beläget pá positioneringsbordet 100. Alternativt kan be- hàllarbrickan 110 riktas in på positioneringsbordet, så att positionsinformation om fixeringsöppningen 126 hos varje fröhölje 120 kan erhållas och lagras av styrsyste- met. Som en följd därav, med både positionsinformation om det tillverkade fröhöljets 120 hjärtbladsfixeringsöppning 126 och positionsinformation om det kvalificerade embry- ots 48 hjärtbladsände 58, placerar positioneringsbordet 100 sig självt via styrsignaler utsända av datorn 56 för att korrekt och noggrant rikta in det kvalificerade em- bryot 48 med hjärtbladsfixeringens 128 öppning 126.

Så snart det kvalificerade embryot 48 är inriktat med hjärtbladsfixeringens 128 öppning 126 manövreras mik- ropincetten 80 av styrsystemet 28 till det öppna läget, 10 15 20 25 30 35 E 768 v!! f.. O 17 varigenom det kvalificerade embryot 48 släpps i det till- verkade fröhöljet 120. Sàsom beskrivits ovan är mikropin- cettens 80 spetsar 88 utformade för minskning av kontakt- ytan mot det kvalificerade embryot 48. Det kvalificerade embryots vikt i sig kan övervinna den ytspänning som alstras mellan det fuktiga kvalificerade embryot och mik- ropincettspetsarnas 88 kontaktyta, varigenom det kvalificerade embryot 48 frigörs från mikropincetten 80.

Om det kvalificerade embryot 48 av någon anledning förblir kopplat till mikropincettspetsarna 88 kan positioneringsbordet 100 stötas till något för frigöring av det kvalificerade embryot 48 från mikropincetten 80.

Utföringsformerna av föreliggande uppfinning ger flera fördelar jämfört med för närvarande tillgängliga embryotransportsystem, varav vissa nu kommer att förkla- ras. Genom användning av en mikropincett och styrning av dess manövreringsavstånd kan för det första den kraft som utövas pà de kvalificerade embryona styras noggrant, vil- ket minimerar potentiell skada på de kvalificerade embry- ona. Genom användning av en mikropincett minskas för det andra mikropincettens spetsars kontaktyta mot embryot än- damàlsenligt och betydande jämfört med kända metoder, vilket i sin tur minimerar ytspänningskrafterna mellan mikropincettspetsarna och det kvalificerade embryot.

Under det att den inriktningsenhet 22 i utförings- formerna som visas i fig l och beskrivs här använder ett positioneringsbord bör det förstàs att andra inriktnings- enheter kan användas. Exempelvis, sàsom bäst framgår av fig 2, kan embryona hämtas från ett vanligt transportband 140. För detta syfte antingen förinriktas embryona pá transportbandet 140 för att greppas av den överföringsen- het som beskrivits här eller kan överföringsenheten an- vända ett multiriktnings- och rotationsrobothölje för in- riktning av mikropincetten i förhållande till de kvalifi- cerade embryona. Embryotransportsystemet 20 kan dessutom använda det inriktnings- och avbildningssystem som be- skrivs i PCT/US00/40720 (WO 01/13702), vilken uttryckli- 10 15 18 gen inkorporeras häri genom hänvisning, för positionering av de kvalificerade embryona i en tillräcklig orientering i hämtningsläget. Det bör vidare förstås att det kvalifi- cerade embryot inte behöver införas direkt i det tillverkade fröhöljet i frigöringsläget såsom beskrivits ovan. I stället kan det kvalificerade embryot införas i en tillfällig bärare, eller skulle kunna frigöras på en annan yta i ett önskat läge eller önskad riktning. Ytan kan vara en tillfällig lagringsplats eller en rörlig yta, såsom ett transportband, en rörlig bana eller ett positioneringsbord, för att nämna några.

Under det att de föredragna utföringsformerna av uppfinningen har illustrerats och beskrivits bör det för- stàs att flera förändringar kan göras av dessa utan av- steg fràn uppfinningens omfång enligt kraven. -'. m)

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 526 768 19 PATENTKRAV

1. Förfarande för transport av växtembryon, omfat- tande: positionering av minst ett växtembryo beläget på en uppbärningsyta i ett hämtningsläge, hämtning av det inriktade växtembryot med automatisk mikropincett genom manövrering av mikropincetten till ett stängt läge, varvid mikropincetten är rörlig mellan ett hämtningsläge och ett frigöringsläge, förflyttning av den automatiska mikropincetten till frigöringsläget, positionering av ett fröhölje i förhållande till frigöringsläget, och frigöring av växtembryot i fröhöljet genom manövre- ring av mikropincetten till ett öppet läge.

2. Förfarande enligt krav 1, varvid uppbärningsytan är ett transportband.

3. Förfarande enligt krav l, varvid växtembryot po- sitioneras medelst ett positionsstyrt bord.

4. Förfarande enligt krav 3, varvid det positions- styrda bordet är ett precisions-X-Y~rotationsposition- eringsbord.

5. Förfarande enligt krav 1, varvid växtembryot pla- ceras i hämtningsläget med en vald orientering.

6. Förfarande enligt krav 1, vidare omfattande av- bildning av minst ett växtembryo för erhållande av ett eller flera valda embryoattribut.

7. Förfarande enligt krav 6, varvid attributen är valda ur gruppen bestående av storlek, form, axelsymme- tri, hjärtbladsutveckling, ytstruktur, färg och läge.

8. Förfarande enligt krav 6, varvid positioneringen av växtembryot baseras på det erhållna attributet.

9. Förfarande enligt krav l, vidare omfattande ori- entering av växtembryot, så att växtembryots hjärtblads- ände är vänd mot fröhöljet i frigöringsläget. ()"1 | J (j\ \J CN CO 1 20

10. Förfarande enligt krav l, vidare omfattande er- hållande av positionsinformation för växtembryot vid fri- göringsläget.