SE503507C2 - Förfarande för fluorescent-märkning av sockerarter - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 503 507 z förening. Därefter bestrålas provet med en exciterande strål- ning med en våglängd av 320 nm och fluorescensen vid 400 nm bestämmes. Känsligheten ligger här åter på pikomolnivå.

Om ovanstående förfarande användes kan analysen ske med lätt- het med användning av högtrycks vätskekromatografi (HPLC). vilket är en av de mest användbara förfarandena inom området mikroanalys och känsligheten är lika stor eller större än den som kan uppnås med metoden som innefattar användning av ett radioaktivt ämne.

Med det konventionella förfarandet beskrivet ovan är emeller- tid utbytet av den önskade substansen från reaktionen i ut- tryckt som mängden utgångssocker eller sockerkedjorna låg. d v s från 75 till 80%. vilket inte är kvantitativt. Vidare är utbytet för reaktionen vid det konventionella förfarandet tillämpat på ketoser endast omkring 10% vilket är extremt otillfredsställande. Vid sidan av detta måste vid det konven- tionella förfarandet användas ett stort överskott 2-aminopyri- din i förhållande till utgångsmaterialet av socker och socker- kedjor. för att öka Schiffs-basutbytet och också ett stort överskott av natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN) som reduktions- medel. När sockerarter och sockerkedjor. som märkts fluoresce- rande. skall analyseras. måste därför överskottet av 2-amino- pyridin och NaBH CN avlägsnas genom kolonnkromatografi. vil- 3 ket kräver båda tid och skicklighet och försämrar analysens känslighet.

Med dessa omständigheter i minnet är ändamålet med föreliggan- de uppfinning att tillhandahålla ett förfarande för fluoresce- rande märkning. där utbytet vid reaktionen för fluorescerande märkning förbättras. medan förfarandet förenklas vilket förfa- rande möjliggör mikroanalys av sockerarter och sockerkedjor i spårmängder med en mycket högre känslighet än vid tidigare förfaranden.

Uppfinningen avser i korthet ett förfarande för fluorescerande märkning av sockerarter och sockerkedjor. där som motjon an- 10 15 20 25 30 35 3 503 507 vänds en en sur substans fri från vatten vid den fluoresceran- de märkningsreaktionen i den reducerande änden av sockerarten eller sockerkedjorna med ett fluorescerande ämne innefattande åtminstone en aminogrupp.

De sockerarter. till vilken föreliggande uppfinning hänför sig, är exempelvis monosakarider, oligosakarider. polysakari- der och konjugerade sockerarter såsom glykoproteiner eller glykolipoider. Emedan förfaranden vid vilka sockerkedjor kan frånskiljas från konjugerade sockerarter såsom glykoproteiner och glykolipoider. finns det välkända förfaranden såsom hydra- zinolys-N-acetyleríng, trifloroacetolys. alkalisk behandling. enzymatisk uppslutning (endoglykosidas. glykopepdidas o s v).

Det har visat sig att när saltsyra. vilket användes i reak- tionssteget för bildning av Schiffs-basen i det konventionella förfarandet. d v s det steget som innefattar reaktionen för att införa den fluorescerande märkningen. utbytes mot en syra i huvudsak fri från vatten. exempelvis i huvudsak en vattenfri oorganisk syra (innefattande en oorganisk syra upplöst i ett organiskt lösningsmedel. t ex vätefluorid upplöst i pyridin) eller en organisk syra (exempelvis ättiksyra. trifluorättiksy- ra (TFA)). erhålles ett mycket bättre resultat. Sålunda reage- ras exempelvis en sockerart eller en sockerkedja med ett över- skott av fluorescerande ämne med åtminstone en aminogrupp. (exempelvis 2-aminopyridin. 2-aminokinolin. 2.3-diaminopyri- din) i en syra vilken är i huvudsak fri från vatten.

Bland ovan uppräknade syror föredrages ättiksyra. men andra syror, vilka inte innehåller vatten (exempelvis TFA) kan också användas.

Standardreaktionsvillkoren är en temperatur från rumstempera- tur till l00°C och en reaktionstid på flera minuter till en timme. Företrädesvis hålles temperaturen vid 90°C och reak- tionstiden vid omkring 15 min. Vid denna reaktion bildas Schiffs-baser kvantitativt och det resulterande reaktionssys- temet kan renas genom koncentration och torkning under för- minskat tryck och genom azeotropisk behandling. 10 15 20 25 30 35 503 507 4 För reduktion av nämnda Schiffs-bas. vilken är i och för sig känd. är det möjligt att använda vanliga reducerande medel för Schiffs-baser, men borankomplex är speciellt lämpliga. Den vanliga typen av borankomplex kan användas, men beroende på senare steg. föredrages ett flyktigt borankomplex. bland vilka följande kan nämnas: boran-pyridinkomplex. boran-trietylamin- komplex och borandimetylaminkomplex. De fluorescerande ämnena, vilka användes för att bilda Schiffs-basen och syran är i hu- vudsak fria från vatten och kan tillsättas till detta reduk- tionssystem. Standardvillkoren för reduktionsreaktionen är en temperatur från rumstemperatur till l00°C och reaktionstiden från en tim till 10 tim; företrädesvis är temperaturen omkring 90°C och reaktionstiden omkring en tim. Efter reaktionen kan föroreningar avlägsnas genom koncentration av reaktionsbland- ningen under förminskat tryck och genom azeotropisk behand- ling. Därefter upplöses blandningen i ett lämpligt lösningsme- del och utsättes för analys genom HPLC.

Enligt förfarandet vid föreliggande uppfinning är reaktionsut- bytet för den fluorescerande märkningen kvantitativ. även för aldos (inklusive aminosockerarter) och ketos och när ett flyk- tigt reagens användes kan detta med lätthet avlägsnas.

Uppfinningen kommer att närmare förklaras med hjälp av följan- de exempel och hänvisning delvis till bifogade figurer där fig. l och fig. 2 visar resultaten av HPLC kromatografisk ana- lys av N-acetylglykosamin och fruktos av vilka båda märkts fluorescerande och fig. 3 visar resultat av en analys av om- vänd faskolonnkromatografi av fluorescerande märkt fetuin.

Exemplen är enbart belysande och icke avsedda att avgränsa uppfinningen.

Exempel l Fluorescerande märkning av N-acetylglykosamin I 100 ml vatten. 11.06 mg N-acetylglykosamin (omkristalliserad 10 15 20 25 30 35 f» 505 507 ur metanol: Wako Pure Chemical Industries. Ltd.) upplöstes.

Därefter infördes en mängd av 2 ul av denna lösning (vilken innehöll 1 nmol N-acetylglykosamin) i ett provrör och lyofili- serades för avlägsning av vattnet. Till provröret fördes 10 ul pyridilamineringsmedel (23 M lösning av 2-aminopyridin í ättiksyra). Provröret förseglades och upphettades till 90°C.

Efter 15 min öppnades provröret och överskottsreagens och ät- tiksyra avlägsnades genom azeotrop behandling med användning av trietylamin och en koncentration under förminskat tryck. Återstoden upplöstes i 50 ul metanol och 2 ul boran-pyri- dinkomplex (Aldrich Chemical Co., Inc.) tillsattes och rören förseglades. Därefter genomfördes reaktionen genom att hålla proröret i 90°C under en tim. Efter reaktionen öppnades röret och reagenser och lösningsmedel avlägsnades genom koncentra- tion under förminskat tryck och azeotrop destillation. Åter- stoden upplöstes i 200 ul vatten och 2 ul av denna lösning (motsvarande 10 pmol) analyserades med HPLC med förfarandet enligt H. Takemoto. S. Hase och T. Ikenaka (Anal. Bíochem.. 145. 245 (1985)). Fig. 1 visar kromatogrammet visande förhål- landet mellan elueringstid (minuter, abskissa) och fluorescens intensitet (ordinata). Vidare kan nämnas att en Ultrasphere C18 kolonn (4.6x250 mm, Beckman Instruments. Inc.) användes med 0.025 M natriumcitratbuffert (pH4.0) innehållande 0.l% acetonitril som lösningsmedel och en strömningshastighet på 0.8 ml/min. Ytan på den erhållna toppen användes för beräkning av utbytet av fluorescenserande märkning. vilket var 94.12.

Exempel 2 Fluorescerande märkning av fruktos Först upplösten 9.01 mg fruktos (Wako) i 100 ml vatten. Av denna lösning överfördes 2 ul (innehållande 1 nmol fruktos) till ett provrör. Samma förfarande som i exempel 1 användes för N-acetylglykosamin upprepades och analysen skedde på samma sätt. Resultaten visas i fig. 2. Utbytet vid den fluoresceran- de märkningsreaktionen erhölls som ytan under denna topp. Ut- bytet av den fluorescerande märkningen var 92.3%. 10 15 20 25 30 35 503 507 6 Exempel 3 Analys av sockerkedjan hos fetuín (glykoprotein från fetal serum på kalv) (1) Isolering av sockerkedjor från fetuin På vanligt sätt hydrolyserades 480 ug (1 nmol) fetuin (Sigma Chemical Co.) och därefter N-acylerades det som beskrives av S. Hase. T. Ikenaka och Y. Matsushima (J. Biochem.. 90. 407-414 (1981)) och av S. Takasaki, T.Mizuochi och A. Kobata (Methods in Enzymol., 83, 263 (1982)). Reaktionsblandning in- nehållande sockerkedjorna och sönderdelat protein ljofilisera- des. Detta ljofiliserade ämne tillsattes 45 ul metanol och 5 ul 5 M 2-aminopyridinlösning i ättiksyra. Lösningen tilläts reagera vid 90°C under 15 min. Därefter avdestíllerades lös- ningsmedlet och oreagerat 2-aminopyridin avlägsnades genom att fyra gånger azeotropdestillera med trietylamin. Till denna återstod sattes 50 ul metanol. varefter 2 ul boran-pyri- dinkomplex (Aldrich) tillsattes. Provröret förseglades och re- duktionsreaktionen tilläts ske under l tim vid 90°C. Efter reaktionen avlägsnades lösningsmedlet och reagensen genom azeotropdestillation. Den erhållna återstoden analyserades med ett välkänt förfarande (S. Hase. K. Okawa och T. Ikenaka, J.

Biochem.. 91, 735 (1982)) för HPLC med omvänd faskolonn (Cosmosíl C18 (Nakarai Chemicals. Ltd.), 4,6x250 mm). När lösningsmedlet. 0.1 M ammoniumacetatbuffert (pH 4.0) användes vid en gradient av 0% till 0,5% 5-butanol och separation skil- de erhölls sockerkedja A, vilken identifierades både enzyma- tiskt och med instrumentell analys. Fíg. 3 visar resultaten av analys vid denna kromatografi på samma sätt som i fig. 1. Ur elueringstiden. förefaller sockerkedja A att ha en komplex struktur. (2) Komponentanalys för sockerkedja A erhållen ur fetuin Sockerkedja A erhållen på ovan beskrivet sätt i del (1) hydro- lyserades med två slags metoder beskrivna nedan. Varje produkt 10 15 20 25 30 35 7 503 507 märktes fluorescerande genom användning av 2-aminopyridin och analyserades därefter. (a) Analys av neutrala sockerarter Först upplöstes 100 pmol socker i 60 ul 4 M vattenlösning av TFA och hydrolysen tilläts ske under 3 tim vid 100°C. Reak- tionsblandningen koncentrerades under förminskat tryck och återstoden upplöstes i 200 ul 10% lösning av pyridin i meta- nol. Till denna blandning satten 10 ul vattenfri ättiksyra och blandningen fick stå vid rumstemperatur under åtskilliga minuter. Därefter sänktes trycket till 10-3 torr och koncen- tration till torrhet genomfördes. Äterstoden upplöstes i 45 ul metanol. Till denna sattes 5 ul 5 M2-aminopyridin i ät- tiksyra och blandningen tilläts reagera vid 90°C under 15 min.

Denna reaktionsvätska koncentrerades och torkades under för- minskat :ryck till 1o'3 2-aminopyridin som icke reagerat avlägsnades genom azeotopde- torr och därefter avlägsnades det stillation med trietylamin fyra gånger. Återstoden upplöstes i 50 ul metanol och denna lösning. 2 ul boran-pyridinkomplex tillsattes. Provröret förseglades och blandningen tilläts rea- gera 1 tim vid 90°C. Därefter koncentrerades reaktionsbland- ningen och torkades under förminskat tryck på l0_3 torr var- efter azeotropdestillation genomfördes upprepade gånger. Den erhållna återstoden analyserades med välkända förfaranden (H.

Takemoto, S. Hase och T. Ikenaka. Anal. Biochem., 145. 245 (1985)). Resultatet visas i tabell l. (b) Analys av aminosockerarter Först tillsattes till 100 pmol sockerkedjor 20 ul 6 M HCl, 20 ul M TFA och 20 ul vatten och blandningen hydrolysera- des 6 tim vid 100°C. Det följda förfarandet var detsamma som i del (a) ovan. Resultaten visas i tabell 1. Tabell 1 visar ock- så resultaten av analysen av neutrala sockerarter och amino- socker med korrektion av data (visas som mol/mol sockerkedja) genom användning av den internationella standarden rhamnose. 10 15 20 25 505 507 a Tabell 1 Prov Man Gal G1nNAc (A) 2,7 3,2 5,3 Noter: Gal : galaktos GlcNAc: N-acetylglykosamin Man : mannose Ur ovanstående resultat förefaller strukturen hos sockerkedjan (A) av intresse vara följande motsvarande huvudsockerkedje- strukturen hos fetuin.

Gal-GlcNAc-Man \\\Man-c1cNAc-o1@NAC-PA Man'/ Gal-c1cNAc // Gal-GlcNAc (PA = pyridylaminogrupp) Som förklarats i detalj är det möjligt. med förfarandet enligt föreliggande uppfinning, att märka sockerarter och sockerked- jor fluorescerande i en kvantitativ reaktion och genom att ut- nyttja flyktiga lösningsmedel förenklat förfarande vilket gör det möjligt att erhålla mikroanalys av en spårmängd av socker- art eller sockerkedja.

Claims (5)

9 505 597

1. Förfarande för fluorescerande märkning av sockerarter eller sockerkedjor genom den fluorescerande märkningsreak- tionen vid den reducerande änden av en sockerart eller sockerkedja med ett fluorescerande ämne med åtminstone en aminogrupp kännetecknat av följande två separata steg (1) att det fluorescerande ämnet får reagera med sockerarten eller sockerkedjan i närvaro av en syra i huvudsak fri från vatten för att bilda en Schiffsbas och (2) att Schiffsbasen därefter reduceras.

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att syran ut- göres av vattenfri ättiksyra eller trifluorättiksyra.

3. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att det fluore- cerande ämnet är 2-aminopyridin, 2-aminokinolin eller 2,3-di- aminopyridin.

4. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att Schiffs- ,basen, bildad vid märkningsreaktionen, reduceras med använd- ning av ett flyktigt boran-komplex.

5. Förfarande enligt krav 4, kännetecknat av att det flyktiga boran-komplexet utgöres av ett boran-pyridin-komplex, ett boran-trietylaminkomplex eller ett boran-dimetyl-amino- komplex.