SE468626B - Anvaendning av en peroxidifosfatfoerening foer inhibering av hypotensiv chock och lokal benresorption - Google Patents

Description

OS O\ I L' o\ 2 tion: O O O H H fosfataser H H20 X -O-P-O-O-P-O-------9-O-O-P-O------>H O +P0 4 I I I 2 2 4 O 0 O- där X är en nontoxisk farmaceutiskt accepterbar katjon eller avslutar en organisk esterenhet. Fosfatas för nedbrytning av peroxidifosfat är närvarande i saliv liksom i plasma, intes- tinala vätskor och vita blodkroppar.

Det har observerats att bakterieendotoxin också reagerar med intakt PDP. Denna reaktion uppträder oberoende av närvaron av fosfataser, d.v.s. den uppträder också utanför kroppen hos ett varmblodigt djur. Emellertid, vilket är viktigt, upp- träder denna reaktion även i närvaro av fosfatas, när varm- blodiga däggdjur behandlas med PDP i enlighet med föreliggan- de uppfinning. Det är önskvärt att tillhandahålla en kur med vilken behandlingen fortsätter tills endotoxinerna är inak- tiverade.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att deaktivera endotoxiner och därigenom inhibera deras toxiska effekter, såsom inflammation, benresorption och hypotensiva chocker.' Andra ändamål med förliggande uppfinning kommer att framgå av nedanstående beskrivning.

I enlighet med vissa utföringsformer av uppfinningen avser denna en metod för inhibering av hypotensiv chock och lokal benresorption förorsakad av bakterieendotoxin, och innefat- tar bingandet av en icke toxisk vattenlöslig farmaceutiskt accepterbar peroxidifosfatförening i kontakt med endotoxin för att åstadkomma inaktivering av nämnda bakterieendotoxin. 1/ 4:.

Ch CO CH P J (JN En procedur för konstaterande av inaktivering av endotoxin är genom att komma över induktionen av generering av en fak- tor som är kemotaktisk till polymorfonukleära leukocyter, fortsättningsvis benämnda “PMN“. En sådan faktor kan bestäm- mas i enlighet med Boyden's kemotaxismetod, enligt vilken vita blodkroppar från en kanin attraheras (kemotaxis) av endotoxin iducerad faktor genererad i området. I Boyden's metod, när en bakterieendotoxin-lipopolysackarid inkuberas med ett serum från ett däggdjur uppträder följande: inkuberad Serum och endotoxin------àkemotaktiska faktorer för PMN vid kroppstem- peratur under l timme Kemotaxisfenomenet studeras med hjälp av Boyden's kammare så- som beskrives av Cates et al, "Modified Boyden Chamber Method for Measuring PMN Chemotaxis" i Leukocyte Chemotaxis, Methods, Physiology and Clinical Application, utgiven av Gallin and Quie, Raven Press, New York, 1978, sidorna 67 - 71. När en- dotoxin inducerar kemotaxis såsom enligt föreliggande uppfin- ning kan procentandelen inhibering kvantifieras med hjälp av Boyden's kemotaxistest.

Endotoxinmaterial kan introduceras i kroppen i ett varmblo- digt djur genom sin närvaro på ytorna av gramnegativa mikro- organismer, såsom Actinobacillus actinomycetemcomitens (A.a.), Escherichia coli (E.coli), Bacteroides melanenogenicus (B. mel) och Salmonella typhi (S. typhi).

Oral endotoxin isolerad från A.a. är toxisk till alveolar- ben. Icke oralt endotoxin renat från E. coli kan visa sig vara dödligt för värden.

Andra kända procedurer för inhibering av endotoxinbildning l5 468 626 genomföres med användning av resorption i ett benkultur- u medium, och ett kycklingembryoletalitetstest kan också ut- . nyttjas.

Den toxiska reaktionen inhiberas effektivt genom behandling av endotoxin in situ i en varmblodig värd med en effektiv inhiberande mängd av en icke toxisk vattenlöslig farmaceu- tiskt accepterbar peroxidifosfatförening. Peroxidifosfatet reagerar med endotoxinet i kroppen som en intakt molekyl, under inaktivering av peroxidifosfatföreningen. Eftersom endotoxinet inaktiveras är det uppenbart att endotoxin rea- gerar med peroxidifosfatet.

Generellt är ca. 0,1 - 7% peroxidifosfatförening i en farma- ceutisk bärare, såsom i lösning, effektiv i en föreskriven dos av ca. 0,2 - 14 mg per kg kroppsvikt. Inhiberingseffek- tiviteten kan konstateras genom reducerad endotoxineffekt och kvantifieras på basis av inhiberad kemotaxis till PMN.

Typiska icke toxiska vattenlösliga farmaceutiskt accepter- bara peroxidifosfatföreningar är alkalimetallsalterna (t.ex.litium, natrium och kalium), alkaliska jordartsmetall- salter (t.ex. magnesium, kalcium och strontium) och zink-, tenn och kvaternära ammoniumsalter, liksom Cl-C12-alkyl-, adenylyl-, guanylyl-, cytosylyl- och tymylylestrar. Alkali- metall, särskilt kaliumsalt föredrages bland de oorganiska katjonerna. Tetrakaliumperoxidifosfatet är ett stabilt, luktfritt, finfördelat, friflytande, vitt icke hygrosko- piskt kristallint fast material med en molekylvikt av 346,35 och ett aktivt syreinnehåll av 4,6%.

Fl Tetrakaliumperoxidifosfat är vattenlösligt till 47 - 51% vid 0 - 6lOC, men olösligt i vanliga lösningsmedel såsom acetonitril, alkoholer, etrar, ketoner, dimetylformamid, dimetylsulfoxid och liknande. En 2%-ig vattenlösning har ett pH av ca. 9,6 och en mättad lösning därav ett pH av 468 626 ca. 10,9. En 10%-ig lösning i vatten vid 25°C visade ingen aktiv syreförlust efter 4 månader och vid 50OC visade en %-ig lösning en förlust av aktivt syre av 3% under 6 må- nader.

Bland de organiska föreningarna är de som uppvisar hydro- foba egenskaper såsom Cl-C12-alkylradikal och de som under- lättar snabb upptagning av peroxidifosfatenheten av celler- na, såsom adenylyl-, guanylyl-, cytosylyl- och tymylylestrar föredragna.

Peroxidifosfatföreningen kan administreras oralt eller sys- temiskt för att inhibera endotoxiner i den orala kaviteten eller andra delar av kroppen.

Farmaceutiska bärare lämpade för oralt intag är belagda tab- letter sammansatta av material, som motstår nedbrytning av magsyror vid pH som råder i magen (ca. 1 - 3), eftersom peroxidifosfat skulle inaktiveras av sådana magsyror. I stället upplöses bärarna inrymmande tabletterade granuler av peroxidifosforsyrasaltet i form av fast material av de intestinala vätskorna, som har ett högre pH (ca. 5,5 - 10) och icke inaktiverar peroxidifosfatet utan kvarlämnar detta för att utsättas för enzymatisk verkan av fosfatas som är närvarande i människa eller andra varmblodiga djur. En lämplig tablettbeläggningslösning är sammansatt av en fettsyraester såsom N-butylstearat (typiskt ca. 40 - 50 och företrädesvis ca. 45 viktdelar), vax såsom karnuba- vax (typiskt ca. 15 - 25 och företrädesvis ca. 20 vikt- delar), fettsyra såsom stearinsyra (typiskt ca. 20 - 30 och företrädesvis 25 viktdelar) och cellulosaester såsom cellulosaacetatftalat (typiskt ca. 5 - 15 och företrädes- vis ca. 10 viktdelar) och organiskt lösningsmedel (typiskt ca. 400 - 900 delar). Andra lämpliga beläggningsmaterial innefattar schellack och sampolymerer av maleinsyraanhyd- rid och eteniska föreningar såsom polyvinylmetyleter. Dy- w 468 626 lika beläggningar är särskilda från tabletter som nedbry-I tes i den orala kaviteten i vilka tablettmaterialet typiskt innehåller ca. 80 - 90 viktdelar mannitol och ca. 30 - 40 viktdelar magnesiumstearat.

Tabletterade granuler av peroxidifosfatsaltet bildas genom blandning av ca. 30 - 50 viktdelar av peroxidifosfatsaltet med ca. 45 - 65 viktdelar av ett fast polyhydroxisocker så- som mannitol och vätning med ca. 20 - 35 viktdelar av en lösning av en polyhydroxisockerförening såsom sorbitol, sikt- ning till rätt storlek, blandning med ca. 20 - 35 viktdelar av ett bindemedel såsom magnesiumstearat och komprimering av granulerna till tabletter med en tablettformningsmaskin.

De tabletterade granulerna belägges genom sprayning av ett skum av en lösning av beläggningsmaterialet därpå och tork- ning för avlägsnande av lösningsmedel. Dylika tabletter skil- jer sig från dentaltabletter, vilka typiskt är komprimerade granuler utan någon särskild skyddande beläggning.

En effektiv administreringsdos av peroxidifosfat vid en föreskriven kur, när administreringen sker genom oralt in- tagande, är ca. 0,1 - 6 gram per kg kroppsvikt dagligen och när administreringen sker systemiskt såsom genom intra- muskulär, intraperitoneal eller intravenös injektion är doseringen ca. 0,1 - 2 gram per kg kroppsvikt dagligen.

Fysiologiskt accepterbara pyrogenfria lösningsmedel är lämp- liga bärare för användning vid konventionell systemisk ad- ministrering. Salinlösning buffrad med fosfat till ett fysiologiskt pH av ca. 7 - 7,4 är den föredragna bäraren för systemisk administrering. Sådana lösningsmedel skiljer sig från vatten-humektantvehiklar som typiskt användes i tandvårdsmedel. En dylik lösning beredes typiskt genom sterilisering av avjoniserat destillerat vatten, kontroll för att säkerställa pyrogenfrihet med hjälp av Limulus amebocytlysattest (LAL) beskriven av Tsuji et al i 1» "Pharmaceutical Manufacturing", oktober 1984, sidorna - 41, och därefter tillsats av en fosfatbuffert (pH t.ex. 8,5 - 10) framställd i pyrogenfritt sterilt vatten och ca. l - 100 mg peroxidifosfatderivat och natriumklorid till en koncentration av ca. 0,5 - 1,5 vikt-%. Lösningen kan paketeras i provrör för användning efter återsterili- sering genom passage genom ett mikroporfilter. Som alter- nativ kan andra lösningar såsom Ringer's lösning innehål- lande 0,86 vikt-% natriumklorid, 0,03 vikt-% kaliumklorid .och 0,033 vikt-% kalciumklorid användas.

Nedanstående exempel illustrerar peroxidifosfatföreningens (PDP) förmåga att inhibera kemotaxis inducerad av endo- toxingenererad faktor i serum och inhibera endotoxintoxi- citet gentemot ben.

Exempel l PMN erhålles från de peritoneala kaviteterna i vuxna vita New Zealand kaniner 12 timmar efter intraperitoneala injek- tioner av 200 ml lösning innehållande 0,2% glykogen i ste- ril isoton saltlösning (0,85% NaCl). Cellerna (PMN) renas från exudatet erhållet från kaninens peritoneala kavitet och renas såsom beskrives av Taichman et al (Arch. Oral Biol. 21 p. 257, 1976). Bakterieendotoxin renat från E. coli er- hållen från Associates of Cape Cod Incorporated, Woods Hole, Maine, förbehandlas med olika koncentrationer av PDP (tet- rakaliumsalt) vid 37OC under 1 timme. Kemotaxisprovet ut- föres sedan med behandlade och icke behandlade endotoxiner med hjälp av Boyden's kammare såsom beskrivits ovan. Er- hållna data är summerade i tabellerna l och 2. 468 626.

Tabell l Kemotaxis - genom- snittligt antal mig- % reduktion Behandling rerande PMN + S. D. i kemotaxis 1. Kontr011++ 139 1 4,2 2. Serum+++ och 1 ng/m1 endotoxin 343,0 i 37,6 3. 0,5% PDP och ++ 142,5 i 12,0 4. Endotoxin (1 ng/ml) förbehandlat med 0,5% PDP 0Ch + Serum serum++ 100,0 i 18,4 - 44% jämfört med 2 . Endotoxin (0,5 ng/ml) förbe- handlat med 0,5% PDP och serum++ 154,0 i 2,8 - 56% jämfört med 2 6. Endotoxin (0,25 ng/ml) förbe- handlat med O,5% PDP och serum++ 138,5 3 2,8 - 60% jämfört -med 2 + S.D. = standard deviation ++ medium = Earl's lösning innehållande 10% bovint serum- albumin +++ serum = humanserum (normal) Resultaten i tabell 1 anger att endotoxin såsom förväntats inducerar en kraftig frigöring av en faktor som ökade kemo- taxis av PMN (behandling nr. 2), PDP (0,5%) hade ingen ef- fekt pà PMN (nr. 3) och endotoxiner förbehandlade med PDP reducerade signifikant toxinets kemotaktiska aktivitet (behandlingarna nr. 4, 5 och 6). Dessa data indikerar att CN en behandling av endotoxin med PDP deaktiverar toxinets biologiska effekt.

Exempel82 Tabell 2 visar data erhållna med hjälp av ytterligare Boyden Chamber tester såsom i exempel l. PDP utnyttjas i form av tetrakaliumsaltet.

Tabell 2 Kemotaxis - genom- snittligt antal mig- % reduktion Behandling rerande PMN + S.D. i kemotaxis l. Kontrollmedium (som i exempel 1) 136,5 i 6,3 2. Endotoxin 1 ng/ml och serum+ 329,0 i 39,5 3. PDP 0,5% och serum+ 139,5 3 4,9 4. Endotoxin (1 ng/ml) förbehandlat med 0,58 PDP och serum* 188,0 i 9,8 -43,08 . Endotoxin (1 ng/ml) förbehandlat med 0,25% PDP och serum* 206,5 i 17,6 -378 6. Endotoxin (1 ng/ml) förbehandlat med 0,18 PDP och serum* 231,0 i 17,6 -30% + serum enligt exempel 1.

Data i ovanstående tabell visar att en effektiv koncentra- tion av PDP av åtminstone så lite som 0,l% deaktiverar en- dotoxinets biologiska aktivitet.

OK 03 Ch FJ C\ Exempel 3 Effekter av PDP på endotoxinaktivitet i benkultursystem Testet i vilket ett endotoxin isolerat från Acintobacillus actinomycetemcomitans Y4 (AAY4) inducerar resorptionen av ben i ett benkultursystem (Kiley and Holt, Infect. Immun. :362-373, 1980) användes för att bestämma huruvida PDP deaktiverar benresorptionsaktiviteten för endotoxin från Y4. Råttfosterbenkultur såsom beskrivits av Raisz, J. Clin.

Invest. 44:l03-116, 1965, framställdes genom injicering av råttor med 45 CaCl2 på artonde dagen från befruktning. Råt- torna offras sedan på nittonde dagen och radii och ulnae från embryo med sina broskändar avlägsnas och placeras för kultivering i BGJ-medium (Gibco, Buffalo, New York) vid 37OC med 5% C02. Mediet kompletteras med 5%-ig värmt (57°C under 3 timmar) kalvfosterserum. Benen placeras fyra och fyra i ett fack i 24-facksplattor (Nunc, Gibco) innehållande 0,5 ml medium per fack. Frigöramüfizav 45Ca till kultiveringsmediet från ben inkuberat i närvaro av ett testagens jämföres med frigöringen från ben inkubera- de i kontrollmedium, och resultaten för benresorption ut- tryckes som ett förhållande.

Endotoxin från AAY4 erhålles från University of Pennsyl- vania, School of Dentistry. AAY4-endotoxin behandlas med olika koncentration av PDP-tetrakaliumsalt vid 37°C. överskott av PDP avlägsnas genom dialysmembran (3500 mole- kylvikt maximum). Detta tillåter icke-reaktivt PDP att diffundera ut under det att endotoxin med molekylvikt överstigande 3500 kvarhålles på insidan av påsen. Erhål- na data summeras i tabell 3. .[> O\ CO (H IJ Ch ll Tabell 3 45Ca frigjort Test/ + S.D.

Antal Behandling råttor % kontroll Signifikans H- 1. Kontroll 6 30,11 1,98 --- --- 2. lolpq/ml endotoxin 6 H- ss,4e 4,71 2,s7io,16 97% jämfört med l 3. 10/ng/ml endotoxin förbehand- lat med 100 mcg PDP 6 H- 7s,47 2,9 2,61io,1 ej signifikant 4. lojug/ml endotoxin förbehand- lat med 1000 mcg PDP 6 1,o6io,14 31,98 i 4,27 97% jämfört med 2 Data visar att endotoxin från Y4 AA signifikant inducerade benresorption (jämför 1 med 2), under det att en förbehand- ling av endotoxinet med 1000 mcg/ml PDP (0,l%) effektivt inhiberar endotoxinets benresorptiva aktivitet.

Resultaten i exemplen 1 - 3 är representativa för effekter- na av PDP-tetrakaliumsalt och andra icke-toxiska vattenlös- liga framceutiskt accepterbara PDP-salter såsom andra alka- limetallsalter, alkaliska jordartsmetallsalter, zinksalt och tennsalt liksom Cl-C12-alkyl-PDP-salter och andra or- ganiska PDP-föreningar, särskilt innefattande adenylyl-, 468 e26_ 12 guanylyl-, cytosylyl- och tymylylestrar och kvaternära ammo- nium-PDP-salter när det gäller att inhibera kemotaxis in- ducerad av endotoxingenererad faktor i serum och inhibera endotoxintoxicitet gentemot ben i råttor, kaniner och däggdjur i allmänhet.

Claims (6)

10 15 20 25 J; C'J\ CO O\ I J CA A3 P a t e n t k r a v

1. Användning av en icke-toxisk, vattenlöslig, farmaceutiskt accepterbar peroxidifosfatförening i form av ett alkali- metall-, zink-, tenn- eller kvaternärt ammoniumsalt eller en Cl - C12 - alkyl-, adenylyl-, guanylyl-, cytosylyl- eller tymylylester för framställning av ett läkemedel för inhibering av hypotensiv chock och lokal benresorption förorsakad av bakterieendotoxiner.

2. Användning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att peroxidifosfatföreningen är närvarande i en mängd av ca 0,1 - 7% i en farmaceutisk bärare.

3. Användning enligt något av kraven 1 och 2, k ä n n e - t e c k n a d av att peroxidifosfatföreningen är när- varande i tabletterade granuler med en beläggning därpå, vilken ej bryts ned under passage genom magen hos varm- blodiga däggdjur och vilken upplöses av intestinala vätskor med ett pH av 5 - 10.

4. Användning enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a d som kaliumsalt. av att peroxidifosfatföreningen är närvarande

5. Användning enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a d som Cl - C12 -alkylester. av att peroxidifosfatföreningen är närvarande

6. Användning enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a d som adenylyl-, guanylyl-, cytosylyl- eller tymylylester. av att peroxidifosfatföreningen är närvarande