JPS62123121A - 細菌内毒素の不活化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内毒素は脂質、炭水化物及び蛋白質を含む複合巨大分子
である。これは主として、ダラム陰性菌の表面に検出さ
れ、通常は脂質多糖と呼ばれる。

このような巨大分子は宿主にとって有害であり、致命的
でさえある。例えば、このような巨大分子によって低血
圧ショックが生じ、骨吸収を含めた多様な毒性反応が体
内で誘発される。口腔では、歯肉組織の炎症及び、歯槽
骨消失のような、限局性骨吸収に主要な要素として内毒
素が関係してい。

る。

理論的には、酸素を放出する化合物が内毒素を不活化す
ることができる。しかし、多くの酸素発生化合物は酸素
を迅速に放出するため、内毒素増殖の抑制に殆んど効果
がない。比較的緩慢に酸素を放出する化合物は内毒素効
果を抑制することができる。しかし、このような化合物
の効果は、酸素放出の条件が体内における優勢な条件に
一致しないという点で、一般に限定されている。

共通に譲渡された米国特許出願第７２６，５４５号（１
９８５年４月２４日出願）に述べられているように、例
えばげつ書類からヒトまでの温血咄乳動物はその体内に
アルカリ性ホスファターゼまたは酸性ホスファターゼを
有する。はルオキンジホスフエート化合物は酸素を比較
的緩慢に放出する性質を有する。このような化合物が放
出する酸素量は過酸化水素が放出する量の１／　である
。アルカリ性ホスファターゼまたは酸性ホスファターゼ
の存在下で２５℃において、２０時間に、このような化
合物の活性酸素の約５０チのみが放出されるにすぎない
。

はルオキンジホスフエート化合物（ＦＤＰ）はホスファ
ターゼ酵素の存在下で、次式に従って、過酸化水素を緩
慢に放出する。

〔式中、又は薬剤学的に受容できる無毒性の陽イオンで
ある、または有機エステル成分を形成する〕投ルオキ／
ジホスフェートを分解するホスファターゼは唾液中なら
びに血漿、腸液及び白血球中に存在する。

細菌内毒素が完全なＰＤＰとも反応することは観察され
ている。この反応はホスファターゼの存在に関係なく生
ずる：すなわち、この反応は温血動物の体外においても
生ずる。しかし、温血呻乳動物を本発明に従ってＦＤＰ
で処置する場合には、ホスファターゼの存在下において
も反応が生ずることは非常に重要である。内毒素が不活
イヒするまで処置を続けるという投与計画が好ましい。

内毒素を不活化することによって、例えば炎症、骨吸収
及び低血圧ンヨノクのような、内毒素の毒性効果を阻止
することが、本発明の目的である。

本発明の他の目的は以下の説明を検討することから明ら
かになるであろう。

本発明の目的の幾つかによると、本発明は薬剤学的に受
容できる無毒性水溶性のはルオキシジホスフエート化合
物を内毒素と接触させて、前記細菌内毒素を不活化させ
ることから成る、細菌内毒素による低血圧ショックと限
局性骨吸収を阻止する方法に関する。

内毒素不活化を立証する方法は、以下で「ＰＭＮＪと呼
ぶ多形核白血球に対する走化性因子発生の誘発を克服す
ることである。このような因子は、ウサギの白血球をそ
の場で発生する内毒素誘発因子によって引きつける（化
学走性）ボイデン（Ｂｏｙ−ｄｅｎ）の化学走性方法に
よって評価される。ボイデン方法では、細菌内毒素の脂
質多糖を哺乳動物からの血清とともにインキュベートす
ると、ＰＭＮガリンとキューイ（Ｇａｌｌｉｎと　Ｑｕ
ｌｅ）編集、ラベンプレス（Ｒａｖｅｎ　ＰｒｅＳｓ）
　　（＝　ニー　ヨーク）６７〜７１頁の「ＰＭＮ化学
走性を測定するだめの改良ボイデンチェンバー法（Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　ＢｏｙｄｓｎＣｈａｍｂｅｒ　Ｍｅｔｈ
ｏａ　ｆａｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ＰＭＮＣｈｅｍｏ
ｔａｘｉｅ　）　ｊ　　にケイテス（Ｃａｔｅｓ）　　
等が述べているような、ボイテンチェンバーを用いて、
化学走性現象は研究される。本発明におけるように内毒
素が化学走性を誘発する場合には、阻害率をボイデン化
学走性テストによって測定することができる。

内毒素はアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミテ
ンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅ−ｔｅｍｃｏｍｉｔｅｎｓ）（Ａ、　ａ　）、大
腸菌（Ｅｓ　ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　（Ｅ、　
Ｃｏ１１）、　　バクテロイデス会メラネノゲニカス（
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｌａｎｅｎｏｇｅｎｉｃ
ｕｓ）（Ｂ、　ｍｅｌ）及びチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ）のような、
ダラム陰性菌の表面に存在することＫよって、温血動物
の体内に導入される。

Ａ、ａ、から単離した口腔内毒素は歯槽根に対して有害
である。Ｅ、　Ｃｏ１１　　から単離した非口腔内毒素
は宿主に対して致命的であることが実証される。

内毒素形成を阻止する他の公知の方法は、骨培養培地内
での吸収を用いて実施される。ニワ）　ＩＪ胚死亡率テ
ストを用いることもできる。

内毒素を温血宿主内で薬剤学的に受容できる無毒性水溶
性のＲルオキシジホスフエート化合物の阻害有効量によ
ってｉｎ　５ｉｔｕ　　処理することによって、毒性反
応は効果的に阻止される。ｋルオキシジホスフエートは
完全な分子として体内の内毒素と反応し、はルオキシジ
ホスフエート化合物ハネ活化される。内毒素が不活化さ
れるので、内毒素トハルオキシジホスフエートが反応す
ることは明らかである。

一般に、例えば溶液のような、薬剤学的キャリヤ中約０
１〜７係のはルオキ／−，＞ホスフェート化合物が体重
Ｉ　Ｋ９につき約０．２〜１４７ｎｑの投与計画で効果
的である。阻害効果は内毒素効果の低下によって実証さ
れ、ＰＭＮに対する化学走性の阻害に基づいて測定され
る。

薬剤学的に受容できる、典型的な無毒性水溶性のにルオ
キンジホスフエート化合物はアルカリ金属塩（例えば、
リチウム、ナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土金
属塩（例えば、マグネシウム、カルシウム及びスチロン
チウム塩）、徂鉛、錫、及び第４級アンモニウム塩なら
びに０１〜□２アルキル、アデニリル、グアニリル、シ
トシリル及びチミリルエステルである。無機陽イオンの
中ではアルカリ金属塩、特にカリウム塩が好ましい。

はルオキンニリン酸四カリウムは分子量３４６．３３、
活性酸素含量４６チを有する安定性、無臭性、細粒状、
自由流動性、非吸湿性の白色結晶性固体である。

はルオキシニリン酸四カリウムけＯ℃〜６１℃において
４７〜５１％水溶性でちるが、アセトニトリル、アルコ
ール、エーテル、ケトン、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキンド等のような、一般的な溶媒に不溶であ
る。この化合物の２チ水溶液は約９６のｐＨを有し、飽
和溶液は約１０．９のｐＨを有する。２５℃における１
０％水溶液は４か月後に活性酸素損失を示さなかったが
、５０℃において１０％溶液は６か月後に３係の活性酸
素損失を示した。

有機化合物の中では、Ｃアルキルラジカ１〜１２ ルのような疎水性を有する化合物及び細胞によるはルオ
キンジホスフエート成分の迅速な摂取を促進する、例え
ばアデニリル、グアニリル、シトシリル、及びチミリル
・エステルのような、化合物が好ましい。

口腔または身体の他の部分における内毒素を阻害スるた
めに、はルオキノンホスフエート化合物を経口投与また
は全身投与することができる。

ｋルオキンジホスフエートは胃酸によって不活化される
ので、経口摂取に適した薬剤学的キャリヤは胃中の胃酸
（ｐＨ約１〜３）による分解に安定である物質から成る
被覆された銅剤である。むしろ、キャリヤはその中に含
むＲルオキシニリン酸塩固体物質とともに、胃酸より高
いｐＨ（約５．５〜１０）を有するかペルオキシジホス
フェートを不活化しない腸液によって溶解して、纜ルオ
キンジホスフエートをヒトその他の温血動物中に存在す
るホスファターゼの酵素作用にさらすことになる。好ま
しい錠剤被覆溶液はＮ−ブチルステアレートのような脂
肪酸エステル（典型的には約４０〜５０重量部、好まし
くは約４５重量部）、カルナウバろうのようなワックス
（典型的には約１５〜２５、好ましくは約２０重量部）
、ステアリン酸のような脂肪酸（典型的には約２０〜３
０重量部、好ましくは２５重量部）及び酢酸フタル酸セ
ルロースのようなセルロースエステル（典型的に約５〜
１５重量部、好ましくは約１０重量部）及び有機溶媒（
典型的には４００〜９００部）から成るものである。こ
の他の好ましい被覆材料にはセラック及び、ポリビニル
メチルエーテルのような、エチレン系化合物と無水マレ
イン酸とのコポリマーがある。このような被覆は、錠剤
材料が典型的にマンニトール約８０〜９０重量部とステ
アリン酸マグネ／ウム約３０〜４０重量部とを含む、口
腔内で破壊する錠剤とは明確に別のものである。

ｋルオキシニリン酸塩の錠剤化顆粒は、ｋルオキシニリ
ン酸塩約３０〜５０重量部に例えばマンニトールのよう
なポリヒドロキシ糖（固体）約４５〜６５重量部を混合
し、例えばンルビトールのようなポリヒドロキシ糖化合
物（溶液）約２０〜３５重量部によって濡らし、サイズ
に合せてふるい分けし、例えばステアリン酸マグネンウ
ムのような結合剤約２０〜３５重量部を混合し、顆粒を
圧縮製錠機によって錠剤に圧縮成形することによって形
成する。錠剤化顆粒に被覆剤溶液の泡を吹き付け、乾燥
させて溶媒を除去することによって被覆する。このよう
な錠剤は、特別な保ａ被覆なしに顆粒を圧縮成形したも
のである歯科用錠剤とは異なる。

はルオキシジホスフエートを経口摂取によって投与する
場合、所定の投与計画によるＲルオキンジホスフエート
の有効投与量は体重ＩＫりにつき１日に約０．１〜６ｇ
であシ、例えば筋肉内注入、腹腔内注大または静脈内注
入によるように、投与が全身性である場合に、投与量は
体重Ｉ　Ｋ９につき１日に約０．１〜２ｇである。

全身投与に対して技術上認められた方法で使用するため
に適したキャリヤは、発熱性物質を含まない、生理学的
に受容できる溶媒である。生理学的ｐＨ（約７〜７．４
）にリン酸塩によって緩衝化した良塩水が全身投与用に
好ましいキャリヤである。このような溶媒は歯みがき剤
に典型的に用いられる湿潤性ビヒクルとは明らかに異な
る。このよう々溶液は脱イオン化蒸留水を殺菌し、ツジ
（Ｔｓｕｊｉ）　　等カｒファーマンニーティカル・マ
ニュファクチャーリング（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ　Ｍａｎｕ−ｆａｃｔｕｒｉｎｇ）Ｊ　ｌ　９８４年
ｌＯ月号、３５〜４１頁に述べているリムルス・アメー
バ様細胞溶解産物（ＬＡＬ）　　テストを用いて非発熱
性であることを保証するために検査してから、これに発
熱物質を含まない無菌水中に製造したリン酸塩緩衝液（
例えば、ｐＨ約８５〜１０）、ペルオキシジホスフェー
ト化合物誘導体約１〜ｉｏｏｍｙと約０．５〜１．５重
量％の濃度に達するまでの塩化すｌ−ＩＪウムを加える
ことによって典型的に製造される。この溶液は微小孔フ
ィルターに通して再無菌化した後に使用するまでビンに
充填することができる。

代替手段として、塩化ナトリウム０．８６重８％、塩化
カリウム０．０３重量％と塩化カルシウム０、０３３重
８％を含むリンゲル溶液のような、他の溶液を用いるこ
ともできる。

次の実施例ははルオキシジホスフエー）　（ＦＤＰ）化
合物が血清中の内毒素産生因子によって誘発される化学
走性を阻止し、骨に対する内毒素毒性を阻止し得ること
を説明する。

実施例１ 無菌の等張性食塩水（０，８５％Ｎａ（Ｊ　）中の０．
２チグリコ一ゲン溶液２００ｍ１を成熟ニュージランド
白ウサギに腹腔内注入した１２時間後に、同ウサギの腹
腔からＰＭＮを入手する。ウサギの腹腔から得て、タイ
チマン（Ｔａｉｃｈｍａｎ）等が述べているように〔ア
ーチ場オーラルφパイオール。

（Ａｒｃｈ、　０ｒａ１．　Ｂｉｏｌ、）２１巻、２５
７頁。

１９７６）精製した滲出液から白血球を精製する。

ケイプ・コド社（Ｃａｐｅ　Ｃｏｄ　工ｎｃ、）　（メ
イン州。

ウッドホール）の関連会社から入手した大腸菌から精製
した細菌内毒素を３７°において種々の濃度のＰＤＰ（
四カリウム塩）によって１時間前処理する。次に、前述
のボイデンチャンパを用いて処理及び非処理の内毒素に
よる化学走性分析を行う、データは表１と２に要約する
。

表１ １・　対照＋　　　　　　　　　１３９±４．２３、　
孟息！ＰＤＰと　　　　　　１４２．５±１２４０＋Ｓ
、Ｄ、＝標準偏差 廿　培地＝１０チウシ血清アルブミン含有アール液 柑　血清＝ヒト血清（正常） 表１の結果は、内毒素が予想通りに、ＰＭＮの化学走性
を高める因子の放出増加を誘発すること（２の処理）：
ＰＤＰ（０，５％）がＰＭＨに対して効果を有さないこ
と（３の処理）；及びＦＤＰに＝１：′て前処理した内
毒素が毒素の化学走性活性を有意【減じられること（４
，５及び６の処理）を示している。これらのデータはＦ
ＤＰによる内毒素の処理が毒素の生物学的効果を非活性
化することを示唆する。

実施例２ 表２は他のボイデン・チャンバーテストによって得られ
たデータを示す。ＦＤＰは実施例工におけるように四カ
リウム塩として用いる。

表２ （実施例１と同じ） ３、ＰＤＰｏ、５％と血清＋　　１３９５±４．９（１
％ｇ／耐） （１ｎｇ／ｍ／） 十　実施例１と同じ血清 上記表に示したデータによると、少なくとも０１チ程度
のＰＤＰ有効濃度が内毒素の生物学的活性を非活性化す
る。

実施例３ 骨培養系における内毒素活性に対するＰＤＰの効果 ンスｙ４（ＡＡＹ４）から単離した内毒素が骨培養系に
おいて骨吸収を誘発するテスト〔キＩＪ−ムン（工ｎｆ
ｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）　　３　Ｑ巻、３６２〜３７
３百、１９８０）を用いて、ＦＤＰがＹ４からの内毒素
の骨吸収活性を非活性化するか否かを評価す１１６頁（
１９６５）に述べているように、妊娠１８日口のラット
に４５ＣａＣ１１！　　を注入することによって、ラッ
ト胎仔の前培養物を作成する。次に１９日０にラットを
殺し、胎芽の撓骨と尺骨をそれらの軟骨端部とともに取
り出し、培養のためにＢＧＪ培地〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ
）、　　＝ニー　ヨーク州バッファロー〕に３７℃にお
いて、５％ＣＯ２とともに挿入した。この培地に加熱し
た（５７℃に３時間）５％ウシ胎仔血清を補充する。■
孔につき培地０．５　ｍｌを含む２４孔■〔ヌンク（Ｎ
ｕｎｃ）、　　ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））に、骨を１孔に
４個ずつ挿入する。

試験剤の存在下でインキュベートした骨から、培養培地
への４５Ｃａ放出を対照培地でインキュベートした骨か
らの放出と比較し、骨吸収結果を比で表す。

ＡＡＹ４からの内毒素ははンフルバニア大学歯学部から
入手する。ＡＡＹＪ内毒素を３７℃において種々の濃度
のＰＤＰ四カリウム塩によって処理する。過剰なＦＤＰ
は透析膜によって除去する（最大分子量、３５００）。

これは未反応ＦＤＰを拡散させるが、３５００より大き
い分子量を有する内毒素は袋の内側に保留される。表３
にはデータを要約する。

表３ 放出４５Ｃａ　試験 １　対照　　　　　　　６　　　３０．１１±１．９８
　・・・　　　　・・・２、内毒素Ｙ４ＡＡ　　　　６
　　　８５．４６±４．７１　２．８７−４−１）、１
６　１に比べ１０μ’ｊ／ｒｙｔｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　て９７チ１０μｇ凶ｅ このデータはＹ４ＡＡからの内毒素が骨吸収を有意に誘
発するが（１と２を比較）、ＦＤＰ（０，１％）の１０
００　ｍｃｇ／ｍｅによる内毒素前処理は内毒素の骨吸
収活性を効果的に阻害することを示している。

実施例１〜３の前記結果はＰＤＰ四カリウム塩及びその
他の無毒性水溶液の薬剤学的に受容できるＦＤＰ塩（例
えば他のアルカリ金属塩、アルカリ土金属塩、扼鉛塩、
錫塩）、ならびにＣ１〜１２アルキ、ルＰＤＰ塩及びそ
の他の有機ＦＤＰ化合物（特に、アデニリル、グアニリ
ル、シトシリル及びチミリル・エステルならびに第４級
アンモニウムＦＤＰ塩を含む）の、血清中の内毒素素産
生因子によって誘発される化学走性の阻害ならびにラッ
ト、ウサギ及び一般哺乳動物における骨に対する内毒素
の毒性の抑制における効果を表している。

（外５名）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）細菌内毒素によつて生ずる低血圧ショック及び限
   局性骨吸収を阻止する方法において、薬剤学的に受容で
   きる無毒性、水溶性のペルオキシジホスフェート化合物
   を内毒素に接触させることによつて、前記細菌内毒素を
   不活化させる方法。
2. （２）前記ペルオキシジホスフェート化合物が薬剤学的
   キャリヤ中に約０．１〜７％量で存在する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
3. （３）前記ペルオキシジホスフェート化合物と前記内毒
   素との前記接触を温血哺乳動物中で行い、前記ペルオキ
   シジホスフェート化合物を前記温血動物の体重１Ｋｇあ
   たり約０．２〜１４ｍｇの投与計画で供給する特許請求
   の範囲第２項記載の方法。
4. （４）前記ペルオキシジホスフェート化合物が被覆を有
   する錠剤化顆粒として存在し、前記被覆が前記混血動物
   の胃を通過する間に破壊せず、ｐＨ５〜１０の腸液によ
   つて溶解する特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）前記ペルオキシジホスフェート化合物をリン酸塩
   で緩衝化した、非発熱性蒸留水と塩化ナトリウムの溶液
   に含めて前記温血動物に投与する特許請求の範囲第３項
   記載の方法。
6. （６）前記ペルオキシジホスフェート化合物がアルカリ
   金属塩、亜鉛塩、錫塩もしくは第４級アンモニウム塩と
   して、またはＣ＿１＿〜＿１＿２アルキル、アデニリル
   、グアニリル、シトシリルまたはチミリル・エステルと
   して存在する特許請求の範囲第１項記載の方法。
7. （７）前記ペルオキシジホスフェート化合物がカリウム
   塩として存在する特許請求の範囲第６項記載の方法。
8. （８）前記ペルオキシジホスフェート化合物がＣ＿１＿
   〜＿１＿２エステルとして存在する特許請求の範囲第６
   項記載の方法。
9. （９）前記ペルオキシジホスフェート化合物がアデニリ
   ル、グアニリル、シトシリルまたはチミリル・エステル
   として存在する特許請求の範囲第６項記載の方法。
10. （１０）薬剤学的に受容できる、無毒性の水溶性ペルオ
    キシジホスフェート化合物の細菌内毒素不活化への用途
    。