SE465965B - Foerfarande foer immobilisering av ett intracellulaert, glutaraldehydkaensligt enzym - Google Patents

Description

15 20 25 ÉO 35 40 465 965 22 tvärbindningsmedlet. Det är godkänt av hälsomyndigheterna och är också i dag det bästa tvärbindningsmedlet sett ur framställninge- synpunkt och ur ekonomisk synpunkt.

Föreliggande uppfinning avser emellertid immobilisering av intracellulära enzymer, som är känsliga gentemot glutaraldehyd.

Det har hittills varit svårt att immobilisera enzymer av detta slag utan en oönskat hög utspädningsgrad, eftersom det ej har va- rit möjligt att använda glutaraldehydmetoden för immobiliseringen, då en konventionell glutaraldehydbehandling av ett enzym av denna kategori alltid resulterar i praktiskt taget fullständig förlust av enzymaktiviteten. Immobiliseringen av enzymer, som är känsliga mot glutaraldehyd, skiljer sig därför principiellt från immobili- sering av enzymer, som icke är känsliga mot glutaraldehyd. I före- liggande beskrivning och krav betyder uttrycket "ett glutaraldehyd-_ känsligt enzym" ett glutaraldehydkänsligt enzym, som förlorar mera än 75% av sin ursprungliga aktivitet, när det immobiliseras genom glutaraldehydbehandling av de enzymhaltiga cellerna enligt de immobiliseringsmetoder, som beskrivs i US~Patentskrift 5 980 521 och DOS 2 223 540, till bildning av en partikelformig produkt med acceptabel fysikalisk hållfasthet för industriell användning (t.eX. användning för kontinuerlig drift eller i behållare för diskonti- nuerlig drift). Ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för immobilisering av intracellulära, glutaraldehydkänsliga enzy- mer, varvid man använder glutaraldehyd som tvärbindningsmedel, och varvid det immobiliserade enzymet kan framställas i mycket högt utbyte, till ett relativt lågt pris och med en relativt liten ut- spädning av enzymaktiviteten, för att möjliggöra framställning av en produkt, som omfattar ett immobiliserat enzym, vilket är väl lämpat för industriella användningar. _ Förfarandet enligt uppfinningen utmärkes av vad som anges i den kännetecknande delen av krav 1.

I föreliggande beskrivning med krav användes uttrycket "mikrobiella celler" som beteckning på hela mikrobiella celler, ett homogenat, som kan framställas på basis av hela mikrobiella celler, samt allt, vad som ligger däremellan, dvs. delvis sönder- slagna, mikrobiella celler.

I föreliggande beskrivning med krav användes uttrycket "betydande innehåll av primära aminogrupper" som beteckning på ett betydande innehåll av primära aminogrupper i förhållande till det lO 15 20 25 BO 35 40 I 3 " 465 965 totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper.

Med fördel är innehållet av primära aminogrupper över 5%, företrä- desvis 20% av det totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper. I ett typiskt fall kan förhållandet mellan primära, sekundära och tertiära aminogrupper vara l:2:l, när man använder en grenad polyetylenamin som polyamin. Det antas, att de primära aminogrupperna reagerar med glutaraldehyden, varvid det bildas stabila tvärbindningar, och att detta är anledning till att de primära aminogrupperna är viktiga. Försök, som har genomförts med polyetyleniminer, vilka har modifierats genom omsättning av de primära (och sekundära) aminogrupperna med en epoxiförening, har visat, att sådana modifierade polyetyleniminer är inoperabla.

Då reaktionen äger rum i ett vattenbaserat medium, är det underförstått, att den polyamin, som användes enligt uppfinningen, skall vara vattenlöslig.

Närvaron av polyaminen resulterar överraskande i ett mycket högt aktivitetsutbyte av enzymet. Utan polyaminen kan aktivitets- utbytet av enzymet vara av storleksordningen O-15%, medan däre- mot aktivitetsutbytet med polyamin kan vara av storleksordningen 30-70%. Man behöver inte någon partikelformig bärare, och utspäd- ningen av enzymaktiviteten är därför liten. , När man genomför immobiliseringen, tillsättes polyaminen till de mikrobiella cellerna före eller samtidigt med glutaralde- hyden. Om glutaraldehyden tillsättes till de mikrobiella cellerna först, kommer aktivitetsutbytet av enzymet i den immobiliserade produkten att bli reducerat, om inte polyaminen tillsättes mycket snabbt efter glutaraldehydtillsatsen, beroende på pH, temperatur, koncentration och liknande parametrar.

Det torde observeras, att de relativa mängderna av mikro- biella celler, glutaraldehyd och polyamin bör väljas på ett sådant- sätt, att produkten omfattande immobiliserat enzym är väl lämpad för industriellt ändamål, vilket innebär att produkten bör ha hög enzymaktivitet, högt aktivitetsutbyte (i förhållande till den to- tala enzymaktiviteten före immobilisering), hög enzymstabilitet och hög mekanisk stabilitet.

Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen omsätter man hela mikrobiella celler.

Vid en annan föredragen utföringsform av uppfinningen immobi- liseras glutaraldehydkänsligt penicillin V-acelas framställt med hjälp av bakteriestammen NRRL ll24O (eller stammar, som i huvusak 10 15 20 25 ÉO 35 40 465 965 , 4 är identiska därmed, häribland mutanter och varianter därav).

Ytterligare föredragna utföringsformer av uppfinningen omfattar immobilisering av ureas framställt med hjälp av en stam hörande till arten Bacillus pasteurii, av laktas framställt med hjälp av en stam hörande till arten Kluyveromyces fragilis eller av stam- men NRRL B-ll 229 samt även av ett malolaktiskt enzym framställt med hjälp av en stam hörande till arten Leuconostoc oenos.

En föredragen utföringsform av uppfinningen omfattar använd- ning av en vattenbaserad del av fermentationsvätskan som vatten- baserat medium. Denna utföringsform, som omfattar direkt behand- ling av fermentationsvätskan med glutaraldehyd, är därför en ytterst enkel och ekonomisk immobiliseringsmetod. Emellertid kan cellerna separeras från fermentationsvätskan, t.ex. genom centri- fugering, och därefter på nytt suspenderas i vatten eller en lämp- lig buffert med pH mellan 5 och 10, varvid den vattenbaserade de- len av denna suspension är det vattenbaserade mediet, som där- efter behandlas med glutaraldehyd. På liknande sätt kan den vat- tenbaserade delen av det cellslam, som separeras från fermenta- tionsvätskan, t.eX. genom centrifugering, och som har konsistens som en tandpasta, användas som det vattenbaserade medium, som där-_ efter behandlas med glutaraldehyd. , Det föredras, att man som polyamin använder en polyalkylen- imin, företrädesvis en grenad polyalkylenimin, vari alkylendelen innehåller mellan 2 och 4 kolatomer.

Företrädesvis användes en grenad polyetylenimin eller en polyalkylen-polyamin som nämnda polyamin.

Vid ännu en annan föredragen utföringsform av uppfinningen användes en grenad polyetylenimin med en molekylvikt av mellan 500 och 100 000 Dalton som polyamin.

Företrädesvis användes ett förhållande primära aminekviva- lenter/aldehydekvivalenter inom intervallet mellan 0,0l:l och lO:l, företrädesvis mellan O,l:l och lzl.

En föredragen utföringsform av uppfinningen omfattar den sekvens, som består i att polyaminen sättes till det vattenbase- rade mediet med de mikrobiella cellerna och att därefter glutar- aldehyden tillsättes.

Vid förfarandet enligt uppfinningen kan man företrädesvis använda ett förhållande glutaraldehyd/mikrobiella celler (vikt/W vikt) av mellan 0,0l:l och l0O:l, företrädesvis mellan O,l:l och l0:l. m., 10 15 20 25 50 35 40 5 465 965 Vid ännu en föredragen utföringsform av uppfinningen formas de isolerade, immobiliserade cellerna, företrädesvis genom granu- lering eller strängsprutning. Enligt en annan utföringsform formar man tvättade och isolerade immobiliserade celler genom torkning, marnbehandling och siktning till en partikelstorlek inom området mellan 100 och 1000/um, företrädesvis mellan 200 och 700/um.

Uppfinningen omfattar även en immobiliserad enzymprodukt, som har framställts under användning av förfarandet enligt uppfin- ningen.

Vidare omfattar uppfinningen användning av den immobiliserade enzymprodukten enligt uppfinningen, varvid den immobiliserade enzymprodukten kan användas diskontinuerligt eller kontinuerligt, i sistnämnda fall företrädesvis i en kolonn.

En föredragen utföringsform för användning av den immobili- serade enzymprodukten enligt uppfinningen omfattar användning av immobiliserat penicillin V-acylas framställt med hjälp av stammen NRRL 11240 (eller stammar, som i huvudsak är identiska därmed, är ibland mutanter och varianter därav), varvid man använder immobili- serat penicillin V-acylas kontinuerligt.

För att påvisa den överraskande aktivitetsbevarande effekten av polyaminen i kombination med de glutaraldehydkänsliga enzymerna hänvisas till följande jämförelseförsök. a) 2 g spraytorkat ureas, som innehåller celler från Bacillis pasteurii ATCC ll859 (6200 IE/g vid pH 7) suspenderades i 98 ml vatten med l0/uM B-merkaptoetanol. Cellsuspensionens pH var 7,7, när man under omröring tillsatte 1,6 ml 25% glutaraldehyd. Efter 20 minuters omröring vid rumstemperatur sjönk pH-värdet till 6,9.

De immobiliserade cellerna filtrerades och tvättades två gånger med 0,5 l l mM ß-merkaptoetanol i vatten. Efter vakuumtorkning (90 minuter vid ca 5000) erhölls 0,7 g immobiliserat preparat med en aktivitet av 64 IE/g, uppmätt under optimala förhållanden, med en partikelstorlek på 125-500 um. Detta svarar mot ett aktivitets- utbyte på 0,3%. I b) En cellsuspension, som är identisk med den ovan under a) beskrivna, behandlades i stället för medelst den under a) beskrivna behandlingen med 4 ml 10% polyetylenimin (molekylvikt 60 000, Dow Chemicals PEI 600), vars pH-värde var inställt på 7, varefter 2,75 ml 25% glutaraldehyd tillsattes. Omröringen fortsattes i 60 minuter vid rumstemperatur. Efter filtrering, tvättning och tork- ning som under a) hade de resulterande 0,75 g immobiliserade 465 965 cellerna en aktivitet på 5600 IE/g (125-500/um), dvs. aktivitets- utbytet var 54%.

Definitionerna av enheterna för de ursprungliga enzymatiska aktiviteterna av enzymerna i följande exempel framgår av följande Tabell I.

Tabell I Enzym Bestämning av ursprungliga enzymaktiviteter Ureas pH-stat-titrering med l N H01 vid pH 7,0 och 5000.

Man använde 5m*(0,5 M) karbamid i 0,2 M fosfat- buffert som substrat. l enhet är l/u mol karbamid hydrolyserat/minut.

“ Penicillin V- -acylas Inkubering vid 4000 med 5% penicillin V i 0,2 M fosfatbuffert vid pH 7,5. Efter avlägsnande av cellerna bestämdes bildad 6-APA med p-aminobens- aldehyd enligt Balasingham et al. (1972), Bio- chem. Biophys. Acta 276, 250-56. l enhet = 1/u mol 6-APA framställd/minut.

Laktas Först öppnas icke immobiliserade celler genom be- handling vid rumstemperatur med ca 8% 1-butanol i o,1 M feefetbuffert med pH 7 i 20 minuter. Imkube- ring (vid 5790 för Kluyveromyces fragilis lactase och vid 6000 för lactasen från NREL B-ll, 229) med 4,75% (vikt/vol) laktos i mjölkbuffert med pH 6,5 (Das grosse Melkerei Lexikon, Schultz 1965, band 2, M-Z p. 740). Efter avlägsnande av cellerna bestämdes den framställda glukosen med Boehringer Mannheims blodsockerreagens (GOD-Perid metod). l enhet = l/u mol glukos framställd/ minut. ' Malolaktiskt enzym Inkubering vid 3000 med 53 mM L-mdiet, 1,67 mm NAD* den 0,7 mm Mncig i 0,1 M foefetbdffert med pH 5. Efter avlägsnande av cellerna bestämdes bildat iektee med LDH + NAD* enligt Gutmenn, I., och Wahlefeld, A.W. (1974) i Methods of Enzymatic Analysis, andra upplagan, band 5, (H.U. Bergmeyer, ed.) Academic Press, sid 1465-67. l enhet = 1/u mol laktat bildat/minut. mn lO 15 20 25 50 465 965 Följande exempel illustrerar föreliggande uppfinning ytter- ligare. Exemplens principiella innehåll framgår av följande ta- bell.

Framställning Användning av Enzym av immobiliserat immobiliserat Exempel enzym enzym Penicillin x l ~ 7 V-acylas _ X 8 _ lo 2 x ll - lj Laktas ¿ . X ! 4 13 x l - l5 Ureas X 16 Malolaktiskt x l7 - 18 enzym x 19 - 20 Exempel l2 avser ett jämförelseförsök utan polyetylenimin.

I samtliga följande exempel inställes pH-värdet för poly- etyleniminen på ca 7 före tillsatsen. Emellertid kan man också er- hålla tillfredsställande immobiliserade enzymer med hjälp av poly- etyleniminer med andra pH-värden, t.ex. inom intervaller från ca 4 till ca 9.

Exempel l Till l l fermentationsvätska svarande mot stammen NRRL ll240, innehållande ca l% torra celler och l,5 penicillin V-acy- lasenheter/ml, tillsatte man under omröring 50 ml 10% polyetylen- imin (grenad, molekylvikt 60 000, PEI 600 från Dow Chemicals), följt av 25 ml 25% glutaraldehyd efter 5 minuter. Man fortsatte omröringen i ytterligare 60 minuter vid rumstemperatur, och de immobiliserade cellerna avfiltrerades därefter, varpå de tvättades. med fosfatbuffert (50 mM pH 7) och lufttorkades. Härvid erhölls 14,2 g torkade immobiliserade celler med en aktivitet på 71 enhe- ter/g med en partikelstorlek mellan 180 och 420/um, motsvarande ett aktivitetsutbyte på 65%. ' Exempel 2 Till 1,5 l fermentationsvätska härrörande från stam NRRL ll240 (0,68 penicillin V-acylasenheter/ml) tillsattes under omröring 45 ml av 10% polyetylenimin (grenad, molekylvikt 600, PEI 6 från Dow Chemicals) och 50 ml 25% glutaraldehyd vid 400.

Man fortsatte omröringen under reducerad hastighet i 60 minuter, och de bildade multi-cellpartiklarna filtrerades därefter, varpå de tvättades med fosfatbuffert med pH 7 och lufttorkades. Det tor- kade preparatet (21 g) hade en penicillin V-acylasaktivitet pä lO 15 25 50 465 965 , 8 14,5 enheter/g vid en partikelstorlek av 200-700/um, vilket sva- rar mot ett aktivitetsutbyte på 50%.

Exempel 5 580 l fermentationsvätska med stammen NRRL ll240 (2,5 avxyldes till ca 1500, och 40 1 10% polyetylenimin (Polymin P, BASF) tillsattes under omröring, efterföljt av 9,4 l 25% glutaraldehyd (Union Carbide). satte härefter omröringen vid reducerad hastighet i ytterligare 45 minuter, varpå man tillsatte ß-merkaptoetanol till en slutlig koncentration av 25 mM, och delimmobiliserade cellerna separerades på en filterpress. Den våta filterkakan granulerades, och granula- tet torkades som en fluidiserad massa vid 50-5500. Härvid erhölls _ 7,1 kg torrt preparat med 55 enheter/g (icke fraktionerade partik- lar), vilket motsvarar ett aktivitetsutbyte på Äl%.

Exempel 4 En serie immobiliserade preparat från samma fermentations- vätska med stammen NRRL ll240 som i Exempel 5 visar effekten av variationer av koncentrationen av polyetylenimin vid konstant tillsats av glutaraldehyd. Resultaten framgår av Tabell II. penicillin V-acylasenheter/ml) Man fort- Tabeii Ii ïgåïššïšegšmin Penicillin v-acyiasaktivitét, % Vikt/Vol ' enheter/g produkt (200-400/um) 0,2 1 0,5 36 0,8 58 1,0 ii 1,2 70 I samtliga fall tillsatte man den angivna mängden Polyamin P (BASF) under omröring som en 10% lösning till 0,5 l fermentations-' vätska med stammen NRRL ll24O (2,5 Penicillin V-acylasenheter/g) I efterföljt av 10 ml 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omröringen med reducerad hastighet i ytterligare 60 minuter, varefter cellerna avfiltrerades, tvättades med 25 mM ß-merkaptoetanol i 50 mM fos- fatbuffert med pH 7,5 och lufttorkades. Härvid erhölls ca 9 g torrt material vid varje försök.

Exempel 5 Till 2 l fermentationsvätska med stammen NRRL ll240 (2,0 penicillin V-acylasenheter/ml) tillsattes 200 ml 10% polyetylen- imin (Polymin P, BASF), och cellerna koncentrerades därefter till 10 15 20 25 465 965 ca en tiondel av den ursprungliga volymen. 6 ml 25% glutaraldehyd tillsattes till cellslammet under omröring, och man lät omröringen fortsätta med reducerad hastighet i ytterligare 60 minuter. De immobiliserade cellerna filtrerades därefter och tvättades med 25 mM ß-merkaptoetanol i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5 på ett glasfilter. Efter lufttorkning vid rumstemperatur erhölls 20 g preparat med 65 enheter/g (200-400/um). Detta motsvarar ett akti- vitetsutbyte“på ca 55%.

En serie immobiliserade¿preparat, som framställdes på samma sätt som beskrivits ovan men med varierande mängder glutaraldehyd, visar effekten av variationer av glutaraldehydkoncentrationen efter konstant tillsats av polyetylenimin och efterföljande koncentre- ring. Resultaten framgår av följande Tabell III.

Tabell III Glutaraldehyd, Penicillin V-acylasaktivitet % vikt/vol ' enheter/g torrt preparat (200-400/um). 0,5 106 0,75 65 1,0 I 56 1,5 57 5,0 25 Det erhölls mellan 9 och ll g torrt material vid varje för- sök per l fermentationsvätska.

Exempel 6 550 l fermentationsvätska med stammen NRRL ll240 (2,4 peni- cillin V-acylasenheter/ml) kyldes tilf¥ï5OC, och under omröring tillsattes 24,5 l 10% polyetylenimin (grenad, molekylvikt ca 700, PEI l5T från Taihei Sangyo Kaisha) följt av 5,5 l 50% glutaralde- hyd (Union Carbide). Man fortsatte därefter omröringen med reducerad hastighet i ytterligare 45 minuter, varefter B-merkapto- etanol tillsattes till en slutlig koncentration av 25 mM, och de immobiliserade cellerna separerades på en membranpress. Filter- kakan strängsprutades (öppning 500/um), och partiklarna torkades i en fluidiserad massa vid 50-5500. Utbytet var 6,2 kg torrt pre- parat med 85 penicillin V-acylasenheter/g (partikelstorlek under 500/um) svarande mot ett aktivitetsutbyte på 65%. 10 15 20 4 10 465 965 .

Exempel Z En serie immobiliserade preparat från samma fermentations- vätska med stammen NRRL 11240 som i Exempel 5 och 4 visar effek- ten av de använda olika typerna av polyetylenimin.

Mol- I Penicillin ' Utbyte av Polyetylen- vikt % V-acy1asakti- torrt pre- imin X lo-5 PEI vitet, enhe- parat, g ter[g PEI 600, “ _ Dow Chemicals 60 A 0,5 105 8 Poiymin Hs, BAS? - f' 0,8 50 16 Polymin P, BASF - 1,0 70 10 Sedipur CL 950, BASF (100) 1,0 50 ll PEI 15 T, Taihei Sangvo Kaisha Ltd. 0,7 0,7 154 7 PEI 210 T, Taihei Sangyo Kaisha Ltd. 40-60 0,9 80 10 Epomin P-1000, Shokubai Kagaku Kogyo Co. 60-80 0,9 65 14 Epomin P-500, Shokubai Kagaku Kogyo Co. _50-40 0,9 120 7 I samtliga fall tillsatte man den angivna mängden poly- etylenimin under omröring som en 10% lösning till 0,5 l fermenta- tionsvätska med stammen NRRL 11240 (2,5 penicillin V-acylasenhe- ter/ml) följt av 10 ml 25% glutaraldehyd. Omröringen fortsattes med reducerad hastighet i ytterligare 45 minuter, varefter cellerna avfiltrerades, tvättades med 25 mM B-merkaptoetanol i 50 mM fos- fatbuffert med pH 7,5 och lufttorkades.

Exempel 8 10 g av de celler, som immobiliserades såsom beskrivits i Exempel 1, sattes till 200 ml 5% (vikt/vol) rått K-penicillin V i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5. Deacylering genomfördes vid 4000 med en omröringshastighet på 150 varv/minut och ett konstant pH av 7,5 (genom titrering med 4 N Na0H). 95% av penicillinet om- vandlades till 6-APA under loppet av 2,5 timmar. Metoden kunde < upprepas med färskt penicillin V minst 20 gånger utan någon väsent- lig reduktion av omvandlingen. Omvandlingsgraden bestämdes genom _ HPLC (vätskekromatografi under högt tryck), separation av reak- tionsblandningen på en Waters' uBondapak C-18-kolonn (eluerad med en gradient_från 20% metylalkohol i vatten till 50% metylalkohol Pic A-reagens) och efterföl- \'/ i vatten, jonparbildning med Water's lO 15 20 . 11' 465 965 jande uv-bestämning. Se Waters Associates' information brochure Paired-Ion Chromatography, D 61 Maj 1976, tryckt i USA (Maple Street, Milford, Mass.). Resultaten vad avser omvandling av 5% (vikt/vol) K-penicillin V till 6-APA vid 4000 framgår av Tabell IV.

Tabell IV Försöksnummer Omvandli s ad 1 0 _ 7:) L.

Exempel Q 9,7 g av de immobiliserade cellerna från Exempel 2 sattes till 100 ml 5% (vikt/vol) K-penicillin V i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5. Deacyleringen genomfördes vid 4000 med en omrörings- hastighet av 150 varv/minut och ett konstant pH av 7,5 med hjälp av en pH-stat. Mera än 90% penicillin omvandlades till 6-APA under 5 timmar. Efter 10 på varandra följande försök hade omvand- lingstiden stigit till ca 5,5 timmar och efter 20 på varandra föl- jande försök till 4 timmar.

Exempel 10 Immobiliserade celler motsvarande en torrvikt på 100 g och härrörande från produkten i Exempel 6 utsattes för ny svällning i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5 innehållande 5 mM-B-merkaptoetanolv och packad i en kolonn med en diameter på 10 cm (massvolym 400 ml). 65 g rått K-penicillin V i 1,5 1 av samma merkaptoetanolhaltiga buffert som angivits ovan recirkulerades genom en förvärmare till kolonnen (vars temperatur hölls på 5500) och tillbaka till en be- hållare (vars temperatur hölls vid 1200), i vilken pH-värdet kon- tinuerligt inställdes på 7,5 genom titrering med 4 M Na0H. Med en_ cirkulationshastighet av 14 bäddvolymer per timme uppnåddes en omvandling av penicillin V till 6-APA på 98% efter 4 timmars för- lopp. Efter 10 på varandra följande försök måste reaktionstiden ökas till 6 timmar. 465 965 12 Exempel ll Till 500 ml fermentationsvätska med Kluyveromyces fragilis NRRL Y 1109 (pH inställt på 7,5) tillsatte man under omröring 40 mi 10% polyatylenimin (grenad, moiakyivikt 700, PEI 15 T 5 från Taihei Sangyo Kaisha), följt av 16 ml 25% glutaraldehyd.

Efter 60 minuters omröring vid rumstemperatur utsattes partik- larna för filtrering, granulering och lufttorkning. Det erhållna 6,5 g torra materialet hade en laktasaktivitet på ca 500 enheter/g, vilket motsvarar ca 50% av den ursprungliga aktiviteten. 10 Exempel 12 ~ -1 ' Till 500 ml fermentationsvätska med NRRL B-11,229 med 5,1 laktasenheter/ml sattes 25 ml 10% polyetylenimin (PEI 15 T från Taihei Sangyo Kaisha Co.) under omröring, följt av 10 ml 25% glutaraldehyd. Omröringen fortsattes i l timme vid rumstemperatur, 15 varefter de immobiliserade cellerna avfiltrerades och lufttorka- des. 4,0 g torkat preparat innehöll 209 laktasenheter/g, vilket motsvarar ett uthyte på 55%.

För att demonstrera effekten av polyetyleniminen utfördes ett jämförelseförsök utan polyetylenimin på följande sätt. 20 Till 500 ml fermentationsvätska med NRRL B-ll, 229 med 5,1 laktasenheter/ml satte man 10 ml 25% glutaraldehyd under omrö- ring. Omröringen fortsattes i l timme vid rumstemperatur. De be- handlade cellerna flockulerades med 0,5% Superfloc (l2,5 ml 20% Superflock C 521, ett katjoniskt flockuleringsmedel), filtrerades 25 och lufttorkades. 5,7 g torkat preparat innehöll 105 laktasen- heter/g, vilket motsvarar ett utbyte på 15%.

Exempel 15 Till 500 ml fermentationsvätska med NRRL B-ll, 229 innehål- lande intracellulärt laktas sattes 50 ml 10% polyetylenimin 50 (PEI 15 T från Taihei Sangyo Kaisha) följt av 14 ml 25% glutar- aldehyd. Man fortsatte omröringen i 50 minuter, och preparatet filtrerades och lufttorkades. Det visade sig, att de torkade partiklarna innehöll ca 50% av den ursprungliga laktasaktiviteten, och att de kunde användas för upprepade diskontinuerliga omvand- 55 lingar av 4% laktos vid 6000.

Exempel 14 Till 500 ml 6 gånger koncentrerad fermentationsvätska med Bacillus pasteurii ATCC ll 859 (6,5 g torra celler, 9500 ureas- enheter/g) satte man under omröring 18 ml 10% polyetylenimin 40 (grenad, molekylvikt 60 000, PEI 600 från Dow Chemicals), följt 10 _15 20 25 50 35 40 « 15' 465 965 av 20 ml 25% glutaraldehyd. Efter ytterligare 60 minuters omrö- ring vid rumstemperatur avfiltrerades de immobiliserade cellerna, varpå de lufttorkades. Härvid erhölls 13,8 g torra, immobilise- rade celler med en ureasaktivitet på 1900 enheter/g och med en partikelstorlek på 500-700/um. Detta motsvarar ett aktivitetsut- byte på ca 45%. ' Exempel 15 Till 100 ml av en 4% (vikt/vol) vattenbaserad suspension av Bacillus pasteurii ATCC 11 859 med 250 ureasenheter/ml satte man 32 ml 10% polyetylenimin (Polymin HS, BASF) under omröring, följt av 5 ml 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omröringen i 1 timme vid 490, varefter cellerna avfiltrerades och lufttorkades. 2,3 g torrt preparat innehöll en ureasaktivitet på 3100 enheter/g (partikelstorlek 500-700/um), vilken motsvarar ett aktivitetsut- byte på 51%.

Exempel 16 0,5 g av de celler, som immobiliserades såsom beskrivits i Exempel'14, packades i en kolonn (1 cm ø x 10 cm), och ett substrat, som innehåller 1% karbamid (0,0l% MgCl , 10 mM ß-mer- kaptoetanol) och vars pH-värde var inställt på 9, fördes genom massan vid 4000. 98% av karbamiden kunde hydrolyseras med en strömningshastighet på 50 ml/h, och halveringstiden för enzym- aktiviteten var ca 1000 timmar.

Exempel 12 Till 0,25 l fermentationsvätska med Leuconostoc oenos DSM 20252, inställd på pH 6,5 med Na0H, med 14 enheter malo- laktisk aktivitet per 1, sattes under omröring 5 ml 10% poly- etylenimin (Polymin P, BASF), följt av 1 ml 25% glutaraldehyd.

Omröringen fortsattes i ytterligare 50 minuter vid 400, varefter de immobiliserade cellerna avfiltrerades, tvättades med 0,1 M fosfatbuffert med pH 6 och vatten och därpå frystorkades. De torkade cellerna hade konstant en malolaktisk aktivitet på 5,4 enheter/g, vilken motsvarar ett aktivitetsutbyte på ca 40%.

Exempel lå 1,6 g våta celler av Leuconostoc oenos DSM 20252 med 96 enheter malolaktisk aktivitet/g suspenderades i 16 ml vatten, och pH-värdet inställdes på 7,0. Man tillsatte 1,7 ml 10% poly- etylenimin (Polymin P, BASF) under omröring, följt av 1,5 ml av 25% glutaraldehyd. Omröringen fortsattes i l timme vid rums- temperatur, varefter de immobiliserade cellerna filtrerades, 465 965 , 10 15 lfl tvättades med vatten och lufttorkades. Den torkade produkten (0,5 g) hade en malolaktisk aktivitet på 55 enheter per g, vilket motsvarar ett aktivitetsutbyte på 28%.

Exempel 19 Immobiliserade celler som beskrivits i Exempel 17 i en mängd svarande mot 4 g torrt material sattes till 50 ml mM L-malat i 0,1 M fosfatbuffert vid pH 5,0 tillsammans med 85/umol NAD+ och 55/umol MnC1é. Härvid erhölls total omvandling av malat till laktat under loppet av 5 timmar. Metoden kunde upprepas minst 5 gånger utan någon ökning av reaktionstiden.

Exempel_gQ 0,55 g av preparatet från Exempel 18 sattes till 10 ml 55mM L-malat i 0,1 M fosfatbuffert med pH 4,0 tillsammans med 17/umol NAD+ och 7/umol MnC12. Härvid erhölls total omvandling av malat till laktat under loppet av 6 timmar, och metoden kunde upprepas med färskt malat, NAD+ och MnC1p minst 5 gånger utan - någon ökning av reaktionstiderna. _ f)

Claims (3)

'f 465 965 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för immobilisering av ett intracellulärt, glutaraldehydkänsligt enzym, k ä n n e t e c k n a t av att man i ett vattenbaserat medium och utan närvaro av partikelformig bärare omsätter mikrobiella celler, som innehåller intracellulä- ra, glutaraldehydkänsliga enzymer, med glutaraldehyd i när- varo av en polyamin med ett innehåll av primära aminogrupper av mera än 5 % av det totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper, och att man isolerar det erhållna, immobiliserade enzymet.

2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att innehållet av primära aminogrupper i polyaminen över- stiger 20 % av det totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t av att polyaminen är en polyalkylenpolyamin.