SE465514B - Foerfarande och anvaendning av ett separationsmedium vid separation av enantiomerer - Google Patents

Description

465 514 10 15 20 25 30 35 2 olika typer av läkemedelsberedningar. Kromatografiska me- toder är dessutom effektiva verktyg för t ex kvantifiering av enantiomerer i biologiska vätskor och därmed karakteri- sering av de enskilda enantiomerernas effekter i biolo- giska system. Kromatografi kan även användas för isolering av adekvata mängder av enantiomert rena substanser som ej kan framställas genom stereoselektiv syntes eller som krä- ver dyrbara utgángsmaterial. Vidare kan isolering av enan- tiomera metaboliter ur komplicerade biologiska prover, t ex urin- och vävnadsprover, även ske med hjälp av kro- matografi.

Kolonner med olika slag av kiral, stationär fas an- vänds för närvarande på området. Emellertid är dylika kolonner i regel alltför specificerade och klarar enbart separation av ett snävt spektrum av föreningar. De olika packningsmaterialen är ofta svàrframställningsbara och dyra, och kolonner för användning i preparativt syfte är i regel ekonomiskt ogynnsamma.

Såsom framgår av ovanstående föreligger pà flera om- råden ett stort behov av ett tillförlitligt, snabbt och billigt förfarande för separation av enantiomerer i racemiska blandningar. Vidare är behovet stort av ett separationsmedium som är lätt och billigt att framställa och har lång hàllbarhetstid.

I den svenska utläggningsskriften 8303221-9 av Her- mansson beskrivs separation av olika substanser, före- trädesvis optiska isomerer, med hjälp av transportprotei- net orosomucoid, som i en kolonn är immobiliserat pà en bärare, t ex kiselgelpartiklar. I nämnda publikation be- skrivs olika kända tekniker för separation av enantiome- rer, och att nackdelarna vid dessa kända tekniker kan un- danröjas genom separation med hjälp av orosomucoid immo- biliserat i en separationskolonn. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att undan- röja ovanstående nackdelar och problem genom àstadkommande av ett förfarande för separation av enantiomerer och ett separationsmedium för utförande av förfarandet. 10 15 20 25 30 35 465 514 3 Detta ändamål uppnås med hjälp av ett förfarande och ett separationsmedium av inledningsvis nämnt slag, vilka har de i de efterföljande patentkravens kännetecknande del angivna särdragen. Vid en föredragen utföringsform sepa- reras optiska isomerer, t ex enantiomerer, kromatogra- fiskt, genom att bringas i kontakt med den stationära fasen, som utgörs av cellulas, ett derivat eller ett fragment därav immobiliserat på en bärare i en separa- tionskolonn, varefter de optiska isomererna elueras ut separat.

Med föreliggande uppfinning uppnås åtskilliga för- delar jämfört med känd teknik. Utgàngsmaterialet och sepa- rationsmediet, dvs cellulaset, derivatet eller fragmentet därav, är enkelt och billigt att framställa och rena även i stora mängder. Vidare kan cellulaset, derivatet eller fragmentet därav effektivt immobiliseras på en bäraryta, t ex av kiselgel, vilket är fallet vid en föredragen utfö- ringsform av föreliggande uppfinning. Dessutom kan den med separationsmediet packade kolonnen vid en kromatografisk analysmetod användas för separation av mycket hydrofoba enantiomerer med hjälp av enkla rörliga faser. Separa- tionsmediet enligt föreliggande uppfinning uppvisar dess- utom hög stereoselektivitet och kapacitet för åtskilliga ämnen, vilket gör det lämpligt för preparativa separatio- ner av enantiomerer, Vidare finns flera möjligheter att via den rörliga fasens sammansättning reglera retentions- tiderna. Avslutningsvis uppvisar den stationära fasen in- nehållande cellulaset, derivatet eller fragmentet därav god stabilitet, vilket gör den lämplig för rutinanalyser.

I jämförelse med t ex den ovannämnda svenska utlägg- ningsskriften 8303221-9 av Hermansson skiljer sig den däri beskrivna uppfinningen från den föredragna utföringsformen av föreliggande uppfinning först och främst i att separa- tionsmediet enligt föreliggande uppfinning är baserat på cellulas, som till skillnad från orosomucoid inte är ett transportprotein. Mellan dessa båda proteiner föreligger stora strukturella och funktionella skillnader. 465 514 10 15 20 25 30 35 4 Vidare uppvisar cellulaset, derivatet eller fragmen- tet därav ofta hög kapacitet som separationsmedium vid kromatografiska metoder enligt föreliggande uppfinning.

Exempelvis separerades enantiomerer i ett prov av 30 pg av det ß-blockerande läkemedlet propranolol i en injektionsvolym av 500 ul i en analytisk kolonn, och separation av samma provmängd propranolol kunde också åstadkommas av i en så liten injektionsvolym som 20 ul.

Denna höga kapacitet förenklar avsevärt kvantifiering av olika enantiomerer.

Det är inom konventionell teknik ej tidigare känt att använda enzymet cellulas, derivat eller fragment därav vid separation av optiskt aktiva isomerer. Enligt föreliggande uppfinning har dock cellulas visat sig vara ytterst väl lämpat för användning inom nämnda område främst p g a dess rymdstruktur med en mångfald tillgängliga ytgrupper och aktiva ställen.

I naturen omsätts årligen enorma mängder cellulosa.

De främsta aktörerna i detta sammanhang är svampar och bakterier. De första stegen i processen för nedbrytning av cellulosa katalyseras av cellulasenzymer, som hydrolyserar 6-1,4-bindningar i cellulosakedjorna. På grund av hög kristallinitet och det faktum att cellulosan oftast är associerad med andra substanser, t ex lignin, är den ett utomordentligt svàrhydrolyserat material. Detta har gjort att cellulaserna har utvecklats mot en hög grad av specia- lisering. Cellulaserna brukar indelas i endoglukanaser, som kan hydrolysera interna bindningar i cellulosakedjan, och exoglukanaser eller cellobiohydrolaser, som attackerar fràn den icke-reducerande änden och i allmänhet ger cello- bios som produkt. Ett mycket ambitiöst försök att klassi- ficera cellulaser efter homologi i aminosyrasekvensen har gjorts av Henrissat et al. (se Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. Gene, 81 (1989) 83).

Mögelsvampen Trichoderma reesei är en effektiv pro- ducent av cellulaser, och vissa mutanter ger mer än 20 g enzym per liter kulturvätska, varav ungefär 50% utgörs av 'v 10 15 20 25 30 35 465 514 5 cellobiohydrolas I (CBH I). T. reesei bildar huvudsakligen fyra olika cellulaser, dvs tvà endoglukanaser samt två cellobiohydrolaser (CBH I och CBH II). Både enzymerna och motsvarande gener är väl karakteriserade (se J. Knowles et al., Cellulase families and their genes. Tibtech, 5 (1987) 255). Molekylvikterna för cellulaserna ligger i omrâdet 50-65 kD. De tillhör alltså kategorin stora monomerer, och samtliga innehåller kolhydrater. Vidare är de isoelektri- ska vid làga pH-värden (3,5-6,0). De av Trichoderma pro- ducerade cellulaserna har samtliga en gemensam struktuell organisation, där huvuddelen av enzymet utgörs av en kata- lytisk domän. Till denna är via en flexibel arm en extra bindningsdomän kopplad, bestående av ca 30 aminosyror.

Bindningsdomänen har en karakteristisk aminosyrasekvens och tredimensionell struktur (se P. Kraulis et al., Deter- mination of the three-dimensional structure of the C-ter- minal domain of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. A study using nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical stimulated annealing.

Biochemistry, 28 (1989) 7241). I fallet med CBH II är också den tredimensionella strukturen hos den katalytiska domänen känd (T. Bergfors et al., Crystallization of the core protein of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. J. Mol. Biol. 209 (1989) 167). Huvuddelen av enzy- mernas kolhydrat finns i den flexibla armen och är där bundet via O-glykosidbindningar till serin- eller trecnin- rester. Bindningsdomänen ökar enzymernas katalytiska akti- vitet mot kristallin cellulosa, förmodligen genom att åstadkomma en hög effektiv cellulaskoncentration pà själva fiberytan.

Cellulasernas strukturella uppbyggnad gör dem sär- skilt användbara vid förfarandet enligt föreliggande upp- finning. Cellulasmolekylen känner sàlunda av den ringa strukturella skillnaden mellan t ex två enantiomerer, och binder till sig den ena enantiomeren starkare än den andra, vilket efter eluering med lämpligt elueringsmedel kan àskàdliggöras i ett kromatogram. Det i beskrivningen 465 514 10 15 20 25 30 35 6 och i patentkraven genomgående använda uttrycket "cellu- las, derivat eller fragment därav" är avsett att inkludera samtliga naturliga cellulaser, cellulasderivat och cellu- lasfragment. Det är uppenbart för fackmannen pà området dl att cellulasmolekylen kan modifieras, t ex gentekniskt, med avseende pà aminosyrasekvensen, utan att dess egen- skaper som separationsmedium enligt föreliggande uppfin- ning väsentligen förändras, varför uttrycket "cellulas, derivat eller fragment därav" är avsett att inkludera även dylika modifierade cellulaser. Vid en föredragen utfö- ringsform används åtminstone en av cellulaserna cellobio- hydrolas I (CBH I), cellobiohydrolas II (CBH II), endoglu- kanas I (EG I) och endoglukanas III (EG III) eller derivat därav.

Vid ett framställningsförfarande renades CBH I och CBH II från kulturfiltratet av svampen Trichoderma reesei QM 9414 genom affinitetskromatografi, varvid p-amino- bensyl-1-tio-ß-D-cellobiocid användes som ligand, kopplad till Sepharose 4B. Därefter utfördes eluering med 100 mM laktos (med avseende på CBH I) eller 10 pM cellcbios (med avseende pà CBH II), vilka cellulaser därefter avlägsnades genom diafiltrering pá membraner av typ PM-10 (Amicon, USA). Blandningar av cellulasisoenzymerna erhölls och fraktionerades ytterligare genom jonbyteskromatografi.

Homogeniteten testades både med hjälp av SDS-PAGE och IEF- PAGE. Komponenterna med ett pI-värde av 3,9 (CBH I) resp 5,9 (CBH II) användes vid de flesta av försöken, men re- sultaten med isoenzymblandningar var väsentligen iden- tiska. De molära adsorptionskoefficienterna är 73 000 M_l-cm_1 för CBH I och 75 000 M_l-cm_l för CBH II, och är oförändrade för ráproteinerna. f Vid en föredragen utföringsform av föreliggande upp- finning är cellulas, ett derivat eller ett fragment därav immobiliserat pà en bärare i en för kromatografi avsedd kolonn, varvid cellulaset, derivatet eller fragmentet där- av följaktligen tillsammans med bäraren utgör den statio- nära fasen. Den vid förfarandet enligt föreliggande upp- 10 15 20 25 30 35 465 514 7 finning använda kromatografiska separationskolonnen kan vara vilken inom tekniken känd kolonn som helst som kan packas med separationsmediet och bäraren enligt förelig- gande uppfinning. Den rörliga fasen kan väljas bland vil- ken ändamålsenlig rörlig fas som helst. Vid en annan före- dragen utföringsform av föreliggande uppfinning kan den rörliga fasen föreligga i blandning med kiralt cellulas, ett derivat eller ett fragment därav vid ett vätskekroma- tografiskt separationsförfarande, varvid den stationära fasen är akiral.

Den för immobilisering av separationsmediet avsedda bäraren kan vara vilken inom tekniken lämplig bärare som helst, men är vid en föredragen utföringsform av förelig- gande uppfinning silikagel eller ett derivat därav, såsom diolsilikagel. När cellulaset skall immobiliseras i kro- matografikolonnens stationära fas sätts enligt en utfö- ringsform av uppfinningen inledningsvis perjodsyra (H5IO6) till en vattensuspension av diolsilikagel, som framställts enligt välkända, publicerade metoder. Den erhållna alde- hydsilikagelen tvättas sedan omsorgsfullt med avminerali- serat vatten, som renats med hjälp av ett filtrerings- system av typ Milli-Q. Aldehydsilikagelen överförs där- efter till en fosfatbuffertlösning (pH 7) av cellulaset.

Till denna lösning sätts även natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN). Kärlet med reaktionsblandningen får stå två dygn på ett vippbord, varefter materialet tvättas med fosfatbuffert. Materialet packas slutligen i stålkolonner avsedda för kromatografiska ändamål med hjälp av s k slurry-teknik.

Vid reaktionen reagerar aldehydgruppen med amino- gruppen och ger en imin, dvs en Schiffsk bas. Iminogruppen reduceras av natriumcyanoborhydriden till en aminogrupp, som fungerar som bindning mellan silikagelen och cellu- laset. På så sätt immobiliseras cellulaset kovalent på silikagelderivatet. 465 514 10 15 20 25 30 35 8 Separationsmediet enligt föreliggande uppfinning, dvs cellulaset, derivatet eller fragmentet därav, kan användas för separation av optiskt aktiva isomerer med hjälp av kromatografiska och närbesläktade tekniker, t ex elektro- fl fores och vätske-vätskeextraktioner (s k tvåfassystem) för separation, bestämning och isolering av optiskt aktiva substanser, t ex enantiomerer i racemiska blandningar.

Föredragna exempel på optiskt aktiva substanser på vilka förfarandet och separationsmediet enligt föreliggande uppfinning är tillämpbara är vissa läkemedel, t ex ß- blockerare, herbicider, feromoner och insekticider. Det är emellertid uppenbart för fackmannen på området att sepa- ration av föreningar utöver de ovannämnda kan göras. Före- liggande uppfinning kan således utgöra ett nödvändigt och viktigt komplement till befintliga förfaranden för separa- tion av optiskt aktiva föreningar, men kan även mer eller mindre ersätta befintliga förfaranden.

Föreliggande uppfinning kommer nu att beskrivas när- mare med hänvisning till de bifogade figurerna, där: Fig 1-3 visar kromatogram som åskådliggör separation av enantiomererna hos tre olika optiskt aktiva läkemedels- substanser.

Fig 4 visar kromatogram som åskådliggör reproducer- barheten av stationära faser baserade på separationsmediet enligt föreliggande uppfinning.

Fig 5 visar stabiliteten av separationsmediet enligt föreliggande uppfinning, dels med avseende pá retention, dels med avseende på effektivitet.

Stationära faser med immobiliserat cellulas har vid utförda försök uppvisat god separationsförmåga (hög ste- reoselektivitet och god separationseffektivitet) för ett stort antal enantiomera substanser, t ex åtskilliga ß- blockerande substanser. Försök har utförts på bl a de tre läkemedelssubstanserna propranolol (se fig l), alprenolol (se fig 2) och prilokain (se fig 3). De två förstnämnda är ß-blockerande substanser, medan den sistnämnda är ett lokalbedövningsmedel. Separationer har också erhållits av 10 15 20 25 30 35 465 514 9 det magsyrahämmande läkemedlet Omeprazole, vilket dock ej visas här. Separationerna i fig 1 och 2 har utförts med cellulassilikagelfasen packad i en stàlkolonn. Den rörliga fasen var en acetatbuffert, som hade ett pH av 4,7 och in- nehöll O,5% 2-propanol. Den rörliga fasen för separationen av prilokain innehöll även en kvartär ammoniumförening i form av 1,1 mM tetrabutylammonium. Enligt uppfinningen er- hålls mycket höga stereoselektiviteter och fullständig upplösning av enantiomererna med användning av okomplice- rade vattenbaserade, rörliga faser, vilket framgår av de visade kromatogrammen. a-värdet definieras som förhållan- det mellan retentionstiderna för tvà enantiomerer, och så pass höga a-värden som från 1,5 till 7,2 erhölls. Reten- tionstiderna för enantiomerer, t ex av läkemedlen i fig 1-3 samt av läkemedlet metoprolol kan styras med hjälp av pH-värdet (se tabell I nedan). Tillsättning av en anjonisk komponent (se tabell II nedan), såsom oktansulfonat, till den rörliga fasen möjliggör också styrning av retentions- tiden, i detta fallet för läkemedlet labetalol. 465 514 10 15 20 25 30 35 10 TABELL I Styrning av retentionstiden med pH pH 4,7 6,8 Prov k'1 a Rs k'1 a Rs Propranolol 0,46 2,6 4,6 6,2 4,7 4,3 Alprenolol 0,16 5,1 4,8 2,8 8,3 4,9 Metoprolol 0,10 1,7 0,7 2,1 2,6 3,9 Prilokain <0,0l - - 0,13 2,1 1,2 k'l är kapacitetsfaktorn för den först eluerade enantiomeren; k' = (tR - to)/to, där tR är retentionstiden för provet och to är den tid det tar för en oretarderad substans att passera kolonnen. a = k' den först eluerade enantiomeren. för den sist eluerade enantiomeren / k' för RS är den kromatografiska upplösningen av provtoppar, varvid fullständigt separerade substanser har ett värde av 1,5. 10 15 20 25 30 35 465 514 ll TABELL II Styrning av retentionstiden (k') genom tillsats av anjon (oktansulfonat) Oktansulfonat (mM) O 5 Prov k'l a k'l a (RR/SS)- 0,25 1,92 0,52 1,52 labetalol Från tabell I framgår att kapacitetsfaktorn, vilken är ett mått pà substansens retardation, för ett sà rela- tivt hydrofobt ämne som propranolol kan minskas till ett k'-värde av 1 eller lägre genom en pH-minskning fràn 6,8 till 4,7 och fortfarande separeras med en hög stereoselek- tivitet (a). Retentionstiden för hydrofila joniserade aminer, t ex labetolol, kan ökas genom tillsättning av en jonparbildare till den rörliga fasen (se tabell II).

Såsom framgår av kromatogrammen i fig 4, kan statio- nära faser baserade på immobiliserat cellulas framställas med god reproducerbarhet. En god överensstämmelse i sepa- rationen för en aminoalkohol erhölls med tvà olika satser av immobiliserad cellulaskiseldioxid. Stationära faser baserade på cellulaskiseldioxid uppvisar även mycket god stabilitet, vilket framgår av fig 5. Retentionen för enan- tiomererna och separationskolonnens effektivitet var i stort sett konstant även efter en månads kontinuerlig kör- ning med en buffert som rörlig fas. Under denna period hade flera olika prover körts genom kolonnen och många olika typer av rörliga faser använts.

Claims (9)

465 514 10 15 20 25 30 35 1 12 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för separation av enantiomerer med hjälp av ett separationsmedium, k ä n n e t e c k n a t därav, att enantiomererna bringas i kontakt med separa- tionsmediet, som är åtminstone ett cellulasenzym, ett derivat eller ett fragment därav och som eventuellt är immobiliserat på en bärare, varefter enantiomererna elueras ut separat.

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e o k - n a t därav, att man separerar enantiomerer som väljs bland (D,L)-propranolol, (D,L)-alprenolol, prilokain och Omeprazole.

3. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n rivatet e t e c k n a t därav, att oellulasenzymet, de- eller fragmentet därav är immobiliserat på en bä- rare av silikagel eller ett derivat därav.

4. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att cellulasenzymet, de- rivatet eller fragmentet därav tillsammans med bäraren utgör den stationära fasen i en kolonn vid en kromato- grafisk metod.

5. Förfarande enligt kraven 1 och 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att cellulasenzymet, derivatet eller fragmentet därav föreligger fritt i den rörliga fasen i en kolonn vid en kromatografisk metod.

6. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att cellulasenzymet är åtminstone en av cellobiohydrolas I, cellobiohydrolas II, endoglukanas I eller endoglukanas III eller ett derivat eller fragment därav.

7. Användning av ett separationsmedium för separation att separationsmediet är åtminstone ett cellulasenzym, ett av enantiomerer, k ä n n e t e c k n a d därav, derivat eller ett fragment därav, som eventuellt är immo- biliserat på en bärare. 10 15 20 25 30 35 465 514 13

8. Användning enligt kravet 7, n a d därav, att cellulasenzymet, derivatet eller fragmentet därav är immobiliserat pà en bärare av silika- k ä n n e t e c k - gel eller ett derivat därav.

9. Användning enligt kraven 7 och 8, k ä n n e - t«e c k n a d därav, att cellulasenzymet är àtminstøne en av cellobiohydrolas I, cellobiohydrolas II, endoglukanas I eller endoglukanas III eller ett derivat eller fragment därav.