SE1200214A1

SE1200214A1 - Anordning och förfarande för kvantifiering av bindnings- och disassociationkinetiken vid molekylär växelverkan

Info

Publication number: SE1200214A1
Application number: SE1200214A
Authority: SE
Inventors: Hyun Mo Cho; Gal Won Che; Yong Jai Cho
Original assignee: Korea Res Inst Of Standards
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-04-10
Also published as: WO2011062377A2; CN102713609A; KR101105328B1; US8940538B2; CN102713609B; KR20110056720A; US20120295357A1; WO2011062377A3

Abstract

Föreliggande uppfinning avser en anordning för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetik vid molekylär växelverkan hos små molekylära biomaterial med hög känslighet nästan utan inverkan från en förändring i brytningsindex resulterande från en buffertlösning genom att göra det infallande ljuset så att det faller in på bindningsskiktet av ett biomaterial, som är format på ett tunt dielektriskt skikt, så att det polariserade infallande ljuset tillfredsställer ett ej reflekterande tillstånd för p-vågor och ett kvantifieringsförfarande som använder detsamma.

Description

35 2 [4] Emellertid kräver ellpsometern ett kvantifieringsförfarande med en förbättrad känslighet för att analysera även biomaterial med små molekyler. [5] En konventionell teknik för förbättring av mätkänsligheten vid analys av biomaterial in- nefattar en ytplasmonresonanssensor (Surface Plasmon Resonance (SPR) sensor) (ned- an betecknad som SPR-sensor) i vilken reflektometern och en ytplasmonresonanstekno- logi blandas. Ett ytplasmonresonansfenomen avser ett fenomen i vilket elektroner som existerar i en metallyta exciteras med ljusvågor och vibreras tillsammans i normal riktning hos ytan och ljusenergi absorberas under den tiden. SPR-sensorn har varit känd för att klara att mäta tjockleken och förändringen i brytningsindex hos ett nanoskikt angränsande till en metallyta genom att använda ytplasmonresonansfenomenets känslighet för ljusets polarisationskaraktäristik och även till mätning av en förändring i bindningskoncentratio- nen hos ett biomaterial genom användning av ett ej märkande förfarande som inte använ- der ett ﬂuorescerande material i realtid. [6] Fig. 1 är ett diagram som visar konstruktionen hos en konventionell SPR-sensor för analys av biomaterial. Såsom visas i fig. 1 innefattar den konventionella SPR-sensorn hu- vudsakligen ett prisma 10, ett tunt metallskikt 20, en mikroflödesväg 30, en ljuskälla 40, en polarisator 50, en analysator 60 och en fotodetektor 70. I den konventionella SPR-sensorn är det tunna metallskiktet 20, såsom guld (Au) eller silver (Ag), belagt på en yta av prismat 10 i en tjocklek på flera tiotals nm och har mikroflödesvägar 30 bildade på det tunna me- tallskiktet 20. Här är, när en buffertlösning 34 i vilken prover 32 av biomaterial är lösta sprutas in i mikroflödesvägen 30, biomaterialen bundna till ligandmaterial 22 som är for- made på ytan av det tunna metallskiktet 20, och bildar på så sätt ett bindningsskikt av en förutbestämd tjocklek. [7] Därefter polariseras ljuset som är alstrat av ljuskällan 40 med polarisatorn 50. Det po- lariserade infallande ljuset faller in på gränssnittet till det tunna metallskiktet 20 vid en ytp- lasmonresonansvinkel (nedan betecknad SPR-vinkel (SPR)) via prismat 10 så att den alstrar ytplasmonresonans. Här innefattar det reflekterade ljuset som reflekteras från det tunna metallskiktet 20 optiska data med avseende på bindningsskiktet hos provet 32. Dvs. i processen med prover 32 som binds till och disassocieras från det tunna metallskiktet 20, ändras bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylära växelverkan, såsom en bindningskoncentration och tjockleken eller brytningsindex hos bindningsskiktet, och följ- aktligen ändras ett ytplasmonresonanstillstånd. [8] Fig. 2 visar en bindningskurva som uppträder i processen med proverna 32 när de binds till det tunna metallskiktet 20 och en disassociationskurva som uppträderi proces- sen med proverna 32 när de disassocieras från samma tunna metallskikt 20. I fig. 2 bety- der en stigning i associationhastighetskonstanten ka snabb absorption av biomaterialen, 10 15 20 25 30 35 3 och en sänkning av disassociationshastighetskonstanten kd betyder att biomaterialen dis- associeras långsamt. Med andra ord kan en disassociationskonstant KD=ka/ka för jäm- viktstillståndet hittas genom mätning av associationshastighetskonstanten och disassocia- tionshastighetskonstanten. Till exempel kan det bestämmas huruvida en liten molekyl och ett nytt medicinskt kandidatmaterial som kan användas som ett cancerogent ämne kan användas som en ny medicin genom mätning av en karaktäristik som den lilla molekylen och det nya medicinska kandidatmaterialet är bundet till eller disassocierat från protein in- kluderande riskfaktorer för cancer. [9] Därefter detekteras det reflekterade ljuset inkluderande optisk data, på det sätt som beskrivits ovan, medelst fotodetektorn 70 via prismat 10 och analysatorn 60. Här kan fo- todetektorn 70 hitta bindnings- och disassociationskinetiken hos den molekylära växelver- kan hos proven 32 genom mätning av en förändring i de polariserade komponenterna i det reflekterade ljuset (dvs. intensiteten hos det reflekterade ljuset).

[10] Problem med den konventionella SPR-sensorn för analys av biomaterial beskrivs nedan med hänvisning till fig. 3 och 4. Fig. 3 är ett diagram som visar mätningen av den ellipsometriska konstanten Lp med användning av SPR-sensorn, vilket visar en liknande karaktristik som vid konventionell reflexionsförmåga. Såsom visas i fig. 3 bildades det tun- na metallskiktet 20 av ett tunt Au-skikt på 50 nm tjocklek, och en Ijuskälla 40 med en våg- längd på 633 nm användes. Dessutom uppmättes ett bindningsskikt till en tjocklek på 0 till 1 nm. Vidare uppmättes bindningsskiktet till 1,45 i brytningsindex n, och buffertlösningen 34 hade ett brytningsindex n på 1,333 och 1,334.

[11] Enligt principerna för den konventionella SPR-sensorn, mäts storleken på en förskjut- ning i SPR-vinkeln över tiden, visande en minimal reflektionsförmåga, genom mätning av reflektionsförmågan eller den ellipsometriska konstanten Lp från vilken en förändring i in- tensiteten hos det reflekterade ljuset kan bli känd. Här har, om ytplasmonresonansfeno- menet är tillfredsställande, reflektionsförmågan eller den ellipsometriska konstanten Lp ett minimalt värde, och SPR-vinkeln är nära 59° såsom visas i fig. 3. Man kan också se att den ellipsometriska konstanten Lp rör sig åt höger med en ökning av tjockleken hos bind- ningsskiktet och även en stigning i brytningsindex hos buffertlösningen 34. Fig. 3 visar en jämförelse av ett fall i vilket biomaterialen som har ett brytningsindex på 1,45 binder unge- fär 1 nm och ett fall i vilket det inte förekom någon bindning av biomaterial och det före- kom en förändring av SPR-vinkeln endast när brytningsindexet hos buffertlösningen 34 förändrades från 1,333 till 1,334. Av ﬁg. 3 framgår det att de två fallen visar en liknande förändring i SPR-vinkeln. Med andra ord behöver bara ren bindnings- och disassocia- tionskarakteristika från vilka en förändring i brytningsindexet hos buffertlösningen har av- lägsnats mätas, men man kan se att när bindnings- och disassociationskarakteristika hos 10 15 20 25 30 4 biomaterial mäts uppstår ett problem i mätningsresultat beroende på en förändring i bryt- ningsindex hos buffertlösningen.

[12] Fig. 4 är ett diagram som illustrerar ett konventionellt problem i vilket den i proven in- byggda bindnings- och disassociationskinetiken, som framträder i en process där proven binds och disassocieras, och en förändring i brytningsindex, vilken resulterar från en buf- fertlösning blandas samman. Fig. 4(a) är ett diagram som visar i proven 32 existerande bindnings- och disassociationskoncentrationer och som framträder l bindnings- och disas- sociationsprocessen. Fig. 4(b) är ett diagram som visar en förändring i mätresultaten hos SPR-sensorn resulterande från en förändring i brytningsindex hos buffertlösningen 34.

Fig. 4(c) är ett diagram som visar bindnings- och disassociationskoncentrationer hos pro- ven 32, uppmätta medelst SPR-sensorn, i det tillstånd i vilket den i proven 32 existerande bindningskoncentrationen och en förändring i brytningsindex resulterande från buffertlös- ningen 34 blandas samman. Dvs. proven 32 är mycket känsliga för effekter (angivna med pilar) enligt en förändring i brytningsindex hos buffertlösningen 34, och sålunda uppträder bindnings- och disassociationskoncentrationerna inte tydligt hos endast rena prover 32.

Följaktligen är det svårt att beräkna bindnings- och disassociationskoncentrationerna hos proverna 32 genom analys av bindnings- och disassociationskoncentrationerna hos en- dast rena prover 32.

[13] Å andra sidan används, för att korrigera en förändring i brytningsindex hos buffertlös- ningen 34 och för att förhindra fel i resulterande från diffusion mellan proverna 32 och buf- fertlösningen 34, ett korrigeringsförfarande som använder en noggrant utarbetad ventilan- ordning och en noggrant utarbetad luftinsprutningsanordning och två eller fler kanaler som används som referenskanaler. Emellertid är detta förfarande svårt att använda till att sär- skilja en förändring i SPR-vinkeln resulterande från en förändring i brytningsindex hos buf- fertlösningen 34 och en förändring i SPR-vinkeln resulterande från ren bindnings- och dis- associationskaraktäristika, och förändringarna kan alltid tjäna som mätfelfaktorer. Följakt- ligen har den konventionella SPR-sensorn ett fundamentalt problem i mätning av bind- nings- och disassociationskaraktäristikan hos ett material som har låg molekylvikt, såsom en liten molekyl, beroende på begränsningarna i mätförfarandet, såsom det ovan beskriv- na.

[14] Vidare kräver den konventionella SPR-sensorn en hög tillverkningskostnad för sen- sorn eftersom den använder det tunna metallskiktet tillverkat av ädel metall, såsom guld Au eller silver (Ag), för ytplasmonresonans. Dessutom är det tunna metallskiktet 20 pro- blematiskt genom att ett brytningsindex har en skarp variation eftersom ytans råhet inte är 10 15 20 25 30 35 5 Iikformig beroende på tillverkningsprocessen och kvantitativ mätning för biomaterial är svår beroende på instabil optisk karaktäristisk.

Redogörelse för uppfinningen Tekniska problem

[15] Följaktligen har uppfinningen åstadkommits med tanke på ovanstående problem som förekommer enligt teknikens ståndpunkt, och en utföringsform av föreliggande uppfinning är att tillhandahålla en anordning och ett förfarande för kvantifiering av bindnings- och dis- associationskinetiken vid molekylär växelverkan, vilket inte är påverkat av en förändring i brytningsindex resulterande från en buffertlösning i en neddoppning i vätskemiljö av mik- roflödesvägar och som klarar en ökad mätningskänslighet beroende på att ett tunt metall- skikt med instabil ljuskaraktäristik inte används.

[16] En annan utföringsform av föreliggande uppfinning är att tillhandahålla en anordning och ett förfarande för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid moleky- lär växelverkan, vilken klarar en ökning av tillförlitligheten och verkningsgraden vid under- sökningar av bindnings- och disassociationskinetiken genom användning av en struktur av mikroflödesvägar som är optimerad för analys av biomaterial med små molekyler.

Lösning på problem

[17] Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning tillhandahålls en anordning för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär växelverkan, inne- fattande en struktur 100 för mikroflödesvägar, innefattande ett underlag 110, ett substrat 120 som är format på underlaget 110 och tillverkat av en halvledare eller av ett dielektriskt material, ett tunt dielektriskt skikt 130 format på substratet 120, en omhöljningsenhet 140 som är utförd så att den har ett infallsfönster 142 respektive ett reflexionsfönster 144 an- ordnade på den ena och på den andra sidan och är anordnade på underlaget 110, och mikroflödesvägar 150 som är bildade i underlaget 110 och mellan underlaget 110 och omhöljningsenheten 140; en provinsprutningsenhet 200 för bildande av ett bindningsskikt 160 av prover på det tunna dielektriska skiktet 130 genom insprutning av en buffertlösning 210, innefattande proverna av ett biomaterial in i mikroflödesvägarna 150; en polarisa- tionsalstringsenhet 300 för strålning av infallande ljus, polariserat genom infallsfönstret 142, till bindningsskiktet 160 vid en infallsvinkel 6 som tillfredsställer ett tillstånd av ej re- flekterande p-våg; och en polarisationsdetekteringsenhet 400 för detektering av en föränd- ring i polarisationen hos reflekterat ljus i bindningsskiktet 160 vilken faller in genom reflex- ionsfönstret 144. 10 15 20 25 30 35 6

[18] Det tunna dielektriska skiktet 130 innefattar ett halvledaroxidskikt eller ett glasskikt tillverkat av ett transparent material. Det är att föredra att det tunna dielektriska skiktet 130 har en tjocklek på 0 till 1000 nm.

[19] Vidare innefattar strukturen 100 av mikroflödesvägar en mångfald av inﬂödesvägar 152 och en mångfald av utflödesvägar 154 vilka är bildade på den ena respektive den andra sidan av underlaget 110, och mikroflödesvägarna 150 hos mångfalden av kanaler är konfigurerade så att de har ett ﬂertal barriärribbor 146 formade på en insida av omhölj- ningsenheten 140 och så att de förbinder inflödesvägarna 152 respektive utflödesvägarna 154.

[20] Vidare bildar strukturen 100 av mikroflödesvägar mikroflödesvägen 150 för en enda kanal, och en mångfald av olika självsammansatta monoskikt 132 till vilka proven är bundna bildas dessutom på det tunna dielektriska skiktet 130.

[21] Vidare har vart och ett av infallsfönstret 142 och reflexionsfönstret 144 hos omhölj- ningsenheten 140 en krökt skalform med en förutbestämd krökning, och det infallande lju- set och det reflekterande ljuset faller in på infallsfönstret 142 respektive reflexionsfönstret 144, i en vertikal vinkel eller vid en nästan vertikal vinkel med en storlek så att ett polarise- rat tillstånd för var och en av det infallande ljuset och det reflekterande ljuset inte föränd- ras så mycket.

[22] Vidare har var och en av infallsfönstret 142 och reflexionsfönstret 144 hos omhölj- ningsenheten 140 en plan arkform. Det infallande ljuset och det reflekterande ljuset faller in på infallsfönstret 142 respektive reflexionsfönstret 144, i en vertikal vinkel eller vid en nästan vertikal vinkel med en storlek så att ett polariserat tillstånd för var och en av det in- fallande ljuset och det reflekterande ljuset inte förändras så mycket.

[23] Vidare är omhöljningsenheten 140 integrerat tillverkad av glas eller ett transparent syntetiskt hartsmaterial.

[24] Vidare är bindningsskiktet 160 ett ﬂerlagrigt skikt, innefattande ett självsammansatt monoskikt 132 som är lämpligt för bindning av egenskaper hos olika biomaterial, ett ﬁxe- ringsmaterial, och olika biomaterial inklusive molekyler som är bundna till fixeringsmateria- let.

[25] Vidare innefattar polarisationsaIstringsenheten 300: en ljuskälla 310 för strålning av förutbestämt ljus, och en polarisator 320 för polarisering av det strålade ljuset. Här strålar ljuskällan 310 monokromatiskt ljus eller vitt ljus, och det kan vara en laser eller en laserdi- od, vilken har en våglängdsvariabel struktur.

[26] Vidare kan polarisationsalstringsenheten 300 innefatta åtminstone en av: en kollima- torlins 330 för tillhandahållande av parallellt ljus till polarisatorn 320, och en första kom- pensator 350 för fasfördröjning av de polariserade komponenterna hos det infallande lju- 10 15 20 25 30 35 7 set. Här kan polarisatorn 320 och den första kompensatorn 350 vara roterbart utformade eller så kan de dessutom utrustas med polarisationsmoduleringsmedel.

[27] Vidare kan polarisationsdetekteringsenheten 400 innefatta en analysator 410 som är utförd att polarisera det reflekterade ljuset, en fotodetektor 420 som är utförd att erhålla förutbestämda data genom detektering av det polariserade reflekterade ljuset, och en driftsprocessor 430 som är elektriskt förbunden med fotodetektorn 420 och är utförd att inducera kvantifierade värden baserat på optisk data. Vidare kan driftsprocessorn 430 in- ducera de kvantifierade värdena, inklusive en bindningskoncentration, och en disassocia- tionskonstant hos proverna, genom att hitta en ellipsometrisk konstant Lp eller A avseende en fasdifferens hos en ellipsometri.

[28] Vidare kan polarisationsdetektorenheten 400 dessutom innefatta åtminstone en av en andra kompensator 440 för fasfördröjning av polariserade komponenterna hos det reflek- terade ljuset och ett spektroskop 450 för att göra ett spektrum av det reflekterade ljuset.

Här kan analysatorn 410 och den andra kompensatorn 440 vara roterbart utförda eller dessutom vara utrustade med andra medel för polarisationsmodulering.

[29] Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahålls ett förfarande för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär växelverkan, inne- fattande ett första steg S100 hos en provinsprutningsenhet 200 med insprutning av en buffertlösning 210, inklusive prover av små molekylära biomaterial, till mikroflödesvägar 150 hos en struktur 100 av mikroflödesvägar; ett andra steg S200 där prover binds till ett tunt dielektriskt skikt 130 hos strukturen 100 av mikroflödesvägar, för att så bilda ett bind- ningsskikt 160, ett tredje steg S300 för en polarisationsalstringsenhet 300 som polariserar förutbestämt ljus och gör det polariserade ljuset så att det faller in på bindningsskiktet 160 med en infallsvinkel för att tillfredsställa ett ej reflekterande tillstånd av p-vågor genom ett infallsfönster 142 hos strukturen 100 av mikroflödesvägar; ett ﬁärde steg S400 varvid re- flekterat ljus hos bindningsskiktet 160 infaller på en polarisationsdetekteringsenhet 400 genom ett reflexionsfönster 144 hos strukturen 100 av mikroflödesvägar; och ett femte steg S500 varvid polarisationsdetekteringsenheten 400 detekterar ett polarisationstillstånd hos det reflekterade ljuset med användning av en ellipsometri eller en reflektometri.

[30] Vidare sprutas i det första steget S100, buffertlösningen 210 inkluderande proverna av olika koncentrationer in i respektive mikroflödesvägar 150 hos strukturen 100 av mikro- flödesvägar innefattande multipla kanaler.

[31] Vidare binds i det andra steget S200, proverna till en mångfald av olika självsamman- sättande monoskikt 132 som är bildade på det tunna dielektriska skiktet 130, för att så bil- da de olika bindningsskikten 160. 10 15 20 25 30 35 8

[32] Vidare innefattar det femte steget S500 ett steg med en analysator 410 som polarise- rar det reflekterade ljuset, ett steg varvid en fotodetektor 420 erhåller förutbestämd optisk data genom detektering av det polariserade reflekterade ljuset, och ett steg varvid en driftsprocessor 430 inducerar kvantifierade värden, innefattande en bindningskoncentra- tion, en bindningskonstant och en disassociationskonstant hos proven, genom att hitta en eliipsometrisk konstant w eller A hos ellipsometrin baserat på dessa optiska data.

[33] Fördelaktiga effekter med uppfinningen

[34] Såsom beskrivits ovan används, i enlighet med anordningen och förfarandet för kvan- tifiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär växelverkan enligt upp- finningen, ett tunt dielektrisk skikt istället för ett tunt metallskikt för bindning av proverna.

Följaktligen kan bindnings- och disassociationskinetiken som endast existerar i proverna mätas noggrant nästan helt utan påverkan från en förändring i brytningsindex resulteran- de från en buffertlösning. Dessutom ﬁnns det en föredel i att tillverkningskostnaderna kan reduceras märkbart genom användning av ett substrat och ett tunt dielektriskt skikt tillver- kat av en billig halvledare eller ett dielektriskt material.

[35] Vidare används enligt föreliggande uppfinning en ellipsometri och en reflektometri i ett ej reflekterande tillstånd av p-vågor, och infallande ljus som har en hög mängd ljus tillhan- dahålls genom användning av en laser eller en laserdiod. Följaktligen minskas signalbrus- förhållande, varvid en högkänslig mätning uppnås. Vidare finns det en fördel i att när en ellipsometri används är en kvantitativ mätning med användning av ett amplitudförhållande Lp möjlig i ett ej reflekterande tillstånd av p-vågor och en högkänslig mätning är möjlig via mätningen av en fasdifferens A vid en vinkel som inte är det ej reflekterande tillstånd av p- vågon

[36] Vidare innefattar strukturen med mikroflödesvägar enligt föreliggande uppfinning mik- roflödesvägar som är optimerade för analys av biomaterial med små molekyler och en multipelkanal eller en enkel kanal sammansatt av en mångfald av självsammansatta mo- noskikt. Följaktligen kan olika experimenttillstånd tillhandahållas i vilka prover med varie- rande koncentrationer sprutas in i de multikanaliga mikroﬂödesvägarna eller graden av bindning hos de självsammansatta monoskikten varieras. Följaktligen ligger det en fördel i att verkningsgraden i analysexperiment på biomaterial kan förbättras.

[37] Vidare kan föreliggande uppfinning användas för olika industriella områden, såsom bio, medicinsk behandling, livsmedel och en miljö eftersom högkänslig mätning för bioma- terial kan genomföras på ett ej signerande sätt l en miljö av mikroflödesvägar med ned- sänkning i vätska. 10 15 20 25 30 35 9

[38] Även om föreliggande uppfinning har beskrivits tillsammans med några exemplifiera- de utföringsformer, är det för en fackman uppenbart att föreliggande uppfinning kan modi- fieras och varieras i olika former utan att man lämnar den tekniska andemeningen i före- liggande uppfinning. Det är uppenbart att alla modifieringar eller variationer eller båda fal- ler inom ramarna för de bifogade patentkraven.

Kort figurbeskrivning

[39] De ovanstående egenskaperna och andra fördelar med föreliggande uppfinning kommer att förstås bättre från den följande detaljerade beskrivningen tillsammans med de medföljande ritningarna, i vilka:

[40] Fig. 1 är ett diagram som visar konstruktionen av en konventionell SPR-sensor för analys av biomaterial;

[41] Fig. 2 är ett diagram som visar en förändring i bindningskoncentrationen i en process av prover som bundits till och disassocierats från ett tunt metallskikt;

[42] Fig. 3 är en grafisk framställning som visar mätresultaten av en ellipsometrisk kon- stant Lp med användning av den konventionella SPR-sensorn;

[43] Fig. 4 till 6 är diagram som illustrerar ett konventionellt problem i vilket bindnings- och disassociationskinetiken inneboende i proverna, framträder i en process där proverna binds och disassocieras, och en förändring av brytningsindexet resulterande från en buf- fertlösning blandas samman;

[44] Fig. 7 är ett schematiskt diagram som visar konstruktionen av en anordning för kvanti- fiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär växelverkan enligt en utfö- ringsform av föreliggande uppfinning;

[45] Fig. 8 är en perspektivisk vy som visar ett exempel på en multikanalig struktur av mik- roflödesvägar enligt föreliggande uppfinning;

[46] Fig. 9 är en sprängskiss av den multikanaliga strukturen av mikroflödesvägar;

[47] Fig. 10 är en perspektivisk vy som visar ett annat exempel på den flervägs strukturen av mikroflödesvägar enligt föreliggande uppfinning;

[48] Fig. 11 är en sprängskiss som visar ett exempel på en enkelkanals struktur av mikro- flödesvägar enligt föreliggande uppfinning;

[49] Fig. 12 är ﬂödesschema som illustrerar ett förfarande för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken hos molekylär växelverkan enligt föreliggande uppfinning;

[50] Fig. 13 är en grafisk framställning som visar en förändring hos de ellipsometriska konstanterna Lp och A enligt en förändring i brytningsindex hos en buffertlösning i fall där ett tunt dielektriskt skikt är bildat på ett kiseloxidskikt; 10 15 20 25 30 35 10

[51] Fig. 14 är en grafisk framställning som visar en förändring hos de ellipsometriska konstanterna Lp och A enligt en förändring i tjockleken hos bindningsskiktet hos prover i fall där ett tunt dielektriskt skikt är bildat på ett kiseloxidskikt;

[52] Fig. 15 är en grafisk framställning som visar en förändring hos de ellipsometriska konstanterna w och A enligt en förändring i tjockleken hos bindningsskiktet hos prover i fall där ett substrat är tillverkat av ett glasmaterial; och

[53] Fig. 16 är en grafisk framställning som visar en förändring hos den ellipsometriska konstanten Lp enligt en förändring i tjockleken hos bindningsskiktet hos prover i fall där ett substrat är tillverkat av kisel (Si).

[54]

[55] < beskrivning av hänvisningssiffror för principiella element i ritningarna>

[56] 100, 100': strukturen med mikroflödesvägar 110: underlag

[57] 112: sporenhet 120: substrat

[58]130: tunt dielektriskt skikt 140: omhöljningsenhet

[59] 132: självsammansatta monoskikt 142: infallsfönster

[60] 144: reflexionsfönster 146: barriärribbor

[61] 150: mikroflödesvägar 152: inflödesvägar

[62] 154: utflödesvägar 160: bindningsskikt

[63] 200: provinsprutningsenhet 210: buffertlösning

[64]300: polarisationsalstringsenhet

[65] 310: ljuskälla 320: polarisator

[66] 330: kollimatorlins

[67] 350: första kompensator 410: analysator

[68] 400: polarisationsdetekteringsenhet

[69] 420: fotodetektor 430: driftsprocessor

[70] 440: andra kompensator 450: spektroskop Utföringsformer av uppfinningen

[71] Nedan beskrivs några utföringsformer av föreliggande uppfinning i detalj med hänvis- ning till de bifogade ritningarna. Samma hänvisningssiffra anger samma element.

[72]

[73] [Konstruktioner av en anordning för kvantifiering av bindnings- och disassociationski- netiken hos molekylär växelverkan]

[74] Först beskrivs konstruktionen av anordningen för kvantifiering av bindnings- och dis- associationskinetiken vid molekylär växelverkan enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning med hänvisning till de bifogade ritningarna. 10 15 20 25 30 35 ll

[75] Fig. 7 är ett schematiskt diagram som visar konstruktionen av en anordning för kvanti- fiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär växelverkan enligt en utfö- ringsform av föreliggande uppfinning. Såsom visas ifig. 7 innefattar anordningen för kvan- tifiering av bindnings- och disassociationskinetiken för molekylär växelverkan enligt upp- finningen utföringsformen av föreliggande uppfinning huvudsakligen en struktur 100 av mikroflödesbanor och en provinsprutningsenhet 200, vilken tillhandahåller en miljö av mik- roflödesvägar med nedsänkning i vätska, och ett optiskt system, innefattande en polarisa- tionsalstringsenhet 300 som tillhandahåller infallande ljus och en polarisationsdetekte- ringsenhet 400 som detekterar en förändring i polarisationen av reflekterat ljus.

[76] Föreliggande uppfinning är till för mätning av bindnings- och disassociationskinetiken hos biomaterial, innefattande små molekyler, genom användning av en ellipsometri och en reflektometri. l anordningen enligt uppfinningen, i provinsprutningsenheten 200, spru- tas en buffertlösning 210 innefattande prover (ej visat) av biomaterial in i strukturen 100 av mikroflödesbanor. Här kan strukturen 100 av mikroflödesbanor ha en mikroflödesväg 150 som är bildad av en multikanal eller en enkelkanal, såsom beskrivs nedan.

[77] Fig. 8 är en perspektivisk vy som visar ett exempel på en multikanalig struktur av mik- roflödesvägar enligt föreliggande uppfinning, och fig. 9 är en sprängskiss av den multika- naliga strukturen av mikroflödesvägar. Såsom visas i fig. 8 och 9 innefattar strukturen 100 av mikroflödesvägar ett underlag 110, ett substrat 120, ett tunt dielektriskt skikt 130 och en omhöljningsenhet 140. Strukturen 100 av mikroflödesvägar är utförd så att den har en mångfald av mikroflödesvägar 150 i form av multikanalen.

[78] Underlaget 110 har en kvadratisk platt form, såsom visas i fig. 9, och har en spåren- het 112 formad i längdriktning. Substratet 120 och det tunna dielektriska skiktet 130 är formade i spårenheten 112. Vidare är inflödesvägarna 152 och utflödesvägarna 154 hos mikroflödesvägarna 150 formade på den ena och den andra sidan på spårenhetens 112 bas. Här är spårenheten 112, inflödesvägarna 152 och utflödesvägarna 154 formade med användning av etsningstekniks för halvledare eller genom exponeringsteknik.

[79] Substratet 120 har en kvadratisk platt form och den är formad i spårenheten 112 av underlaget 110. Enligt föreliggande uppfinning är substratet 120 tillverkat av kisel (Si) vil- ket har ett komplext brytningsindex på ungefär 4,1285 + i0,0412 vid 532 nm och tillhanda- håller stabila fysikaliska egenskaper med låga kostnader. Emellertid kan substratet 120 vara tillverkat av en halvledare eller ett dielektriskt material som inte är kisel (Si).

[80] Det tunna dielektriska skiktet 130 tjänar till att ha prover (ej visat) av biomaterial med små molekyler bundna därtill och disassocierade därifrån och till att reflektera infallande ljus. Det tunna dielektriska skiktet 130 är format på substratet 120, såsom visas i fig. 9.

Här kan det tunna dielektriska skiktet 130 vara tillverkat av ett transparent och tunt skikt- 10 15 20 25 30 35 12 material, inkluderande ett halvledaroxidskikt eller ett glasskikt. Vidare är det att föredra att tjockleken hos det tunna dielektriska skiktet 130 är 0 till 1000 nm. Å andra sidan innefattar de vanligaste exemplen på ett tunt dielektriskt skikt 130 ett kiseloxidskikt (SiO), vilket har växt i tjocklek på ﬂera nanometer genom naturlig oxidering av kisel (Si). Brytningsindex hos kiseloxidskiktet är ungefär 1,461 vid 532 nm och skiljer sig väldigt mycket från bryt- ningsindexet hos substratet 120 tillverkat av kisel (Si). Följaktligen hjälper kiseloxidskiktet till att öka mätkänsligheten enligt föreliggande uppfinning. Vidare kan ett glasskikt tillverkat av optiskt glas användas som det tunna dielektriska skiktet 130. Det tunna dielektriska skiktet 130 som är format på kiseloxidskiktet och glasskiktet kan ha ett konstant brytnings- index, jämfört med ett tunt metallskikt, såsom guld (Au) eller silver (Ag). Följaktligen finns det fördelar i att stabila ljuskaraktäristika kan tillhandahållas och tillverkningskostnaderna hos föreliggande uppfinning kan reduceras.

[81] Såsom visas i fig. 5 till 6b är omhöljningsenheten 140 utrustad med ett infallsfönster 142 och ett reflexionsfönster 144 tillhandahållet på den ena respektive den andra sidan av underlaget 110. Här är infallsfönstret 142 och reflexionsfönstret 144 formade i en krökt skalform, vilken har en förutbestämd krökning så att det infallande ljuset och det reflekte- rade ljuset kan falla in vertikalt på infallsfönstret 142 och reflexionsfönstret 144. Såsom vi- sas i fig. 9 är omhöljningsenheten 140 dessutom utrustad med en mångfald barriärribbor 146 för att bilda mikroflödesvägarna 150 av en mikroskala. Endast infallsfönstret 142 och reflexionsfönstret 144 hos omhöljningsenheten 140 kan vara tillverkade av ett genomsläppligt material, såsom glas eller transparent syntetiskt harts, men det är att före- dra att för att underlätta tillverkningen, kan hela strukturen av omhöljningsenheten 140, in- klusive infallsfönstret 142, reflexionsfönstret 144 och barriärribborna 146 vara integrerat formade genom användning av ett gjutningsförfarande. Å andra sidan kan en syntetisk harts innefatta till exempel akrylsyraharts såsom polymetylmetakrylat (PMMA). Kisel(Si)- baserade material, såsom kiselfosfatpolymer (PDMS) och polydimetylsiloxan, kan också användas som det syntetiska hartsmaterialet.

[82] Mikroflödesvägen 150 är en passage i vilken buffertlösningen 210, inkluderande pro- verna, strömmar och från vilka buffertlösningen 210, inklusive proverna, töms. En mång- fald mikroflödesvägar 150 är bildad. Dvs. eftersom varje utrymme mellan barriärribborna 146 av omhöljningsenheten 140 kommunicerar med inflödesvägen 142 och utﬂödesvägen 154, vilka är formade i underlaget 110 såsom beskrivits ovan, mångfalden mikroflödesvä- gar 150 är formade i strukturen 100 av mikroflödesvägar. Här är bredden hos mikroflö- desvägarna 150 i en mlkroskala på 1 mm eller mindre.

[83] Fig. 10 är en perspektivisk vy som visar ett annat exempel på den multikanaliga struk- turen av mikroflödesvägar enligt föreliggande uppfinning. Såsom visas i fig. 10 kan i en 10 15 20 25 30 35 13 multikanalig struktur 100' av mikroflödesvägar infallsfönstret 142' och reflexionsfönstret 144' hos en omhöljningsenhet 140' ha en platt arkform. I ett sådant fall har polarisations- alstringsenheten 300 och polarisationsdetekteringsenheten 400 i ﬁg. 7 infallande ljus och reflekterat ljus som faller in på infallsfönstret 142' respektive reflexionsfönstret 144', i en nästan vertikal vinkel i en storlek så att polarisationstillståndet hos vardera av det infallan- de ljuset och det reﬂekterade ljuset inte förändras mycket eller är fast hos det infallande ljuset och det reflekterade ljuset i respektive positioner där det infallande3 ljuset och det reflekterade ljuset är vertikalt infallande på infallsfönstret 142' respektive reflexionsfönstret 144'.

[84] Fig. 11 är en sprängskiss i perspektiv av ett exempel på en enkelkanalig struktur av mikroflödesvägar enligt föreliggande uppﬁnning. Såsom visas i fig. 11 innefattar en struk- tur 100" av mikroflödesvägar med en enda kanal en mikroflödesväg 150". Dvs. strukturen 100" av mikroflödesvägar innefattar ett par barriärribbor 146" formade i båda ändar av en omhöljningsenhet 140" och en inflödesväg 152" och en utflödesväg 154" formad i ett un- derlag 110, för att därvid forma mikroflödesvägen 150" av en enda kanal. Vidare är en mångfald olika självsammansättande monoskikt (SAM) 132 formade på ett tunt dielektriskt skikt 130. Det självsammansättande monoskiktet 132 är bildat av en monomer vilken är sammansatt av en huvudgrupp och en ändgrupp och är frivilligt anordnat genom en ke- misk bindningsmetod av molekyler. Här kan vart och ett av de självsammansatta mono- skikten 132 ha olika gränssnittskaraktäristik genom kemisk omvandling av funktionsgrup- pen i ändgruppen hos det självsammansatta monoskiktet 132. Dvs. vart och ett av de självsammansatta monoskikten 132 har en sensorstruktur med olika bindnings- och dis- associationsgrad från ett prov, och det självsammansatta monoskiktet 132 kan samtidigt ha varierande bindnings- och disassociationskinetik för biomaterial.

[85] Provinsprutningsenheten 200 sprutar, såsom visas i fig. 7 in buffertlösningen 210, in- klusive prover (ej visat) tillverkade av biomaterial med små molekyler, i inflödesvägen 152 hos mikroflödesvägarna 150. Provinsprutningsenheten 200 innefattar en ventilanordning (ej visad) som är utförd att lösa upp proverna i buffertlösningen 210 i en förutbestämd koncentration och att spruta in buffertlösningen 210 i mikroflödesvägarna 150 eller att stänga insprutningen av proverna. Här kan provinsprutningsenheten 200 spruta in buffert- lösningen 210 i mikroflödesvägarna 150 i varje kanal i det tillstånd i vilket proverna har oli- ka koncentrationer eller har en mellantid. Å andra sidan kan, när buffertlösningen 210 sprutas in i mikroflödesvägarna 150, en del av proverna (ej visat) vara bundna på det tun- na dielektriska skiktet 130, för att därvid bilda ett bindningsskikt 160 med en förutbestämd tjocklek. Här kan bindningsskiktet 160 vara ett multilagrigt skikt, bestående av det själv- sammansättande monoskiktet 132 lämpat för bindningskaraktäristiken hos olika biomate- 10 15 20 25 30 35 14 rial, ett ﬁxeringsmaterial, och olika biomaterial innefattande molekyler bundna till fixe- ringsmaterialet.

[86] Polarisationsalstringsenheten 300 fungerar, såsom visas i fig. 7, för att stråla infallan- de ljus, polariserat genom infallsfönstret 142 hos strukturen 100 med mikroflödesvägar till bindningsskiktet 160. Polarisationsalstringsenheten 300 kan innefatta en ljuskälla 210 och en polarisator 320 som viktiga element och kan vidare innefatta en kollimatorlins 330, en fokuseringslins 340 eller en första kompensator 350. Här kan polarisatorn 320 och den första kompensatorn 350 vara roterbart utförd eller kan dessutom innefatta andra polarisa- tionsmoduleringsmedel. Å andra sidan kan det polariserade infallande ljuset ha polarise- rade komponenter av typen p-vågor och s-vågor, och ljus som ligger närmast p-vågor kan falla in på bindningsskiktet 160 för att öka signalbrusförhållandet. I föreliggande uppfinning ska infallande ljus strålas vid en infallsvinkel 6 vilken tillfredsställer ett ej reflekterande till- stånd hos p-vågor. I en ellipsometrisk ekvation kan ett komplext faktorförhållande repre- senteras av ett förhållande mellan reflexionsfaktorn Rp för p-vågor och reflexionsfaktorn Rs för s-vågor (dvs. p = Rp/Rs). Tillståndet med ej reﬂekterande p-vågor avser ett tillstànd i vilket reflexionsfaktorn Rp för p-vågor har ett värde nära 0. Tillståndet med ej reflekte- rande p-vågor liknar ytplasmonresonanstillståndet för den konventionella SPR-sensorn och är ett tillstånd i vilket mätkänsligheten hos föreliggande uppfinning är ett maximum.

[87] Ljuskällan 310 strålar monokromatiskt ljus som har samma våglängdsband som infra- röda strålar, synliga strålar eller ultravioletta strålar eller strålar vitt ljus. Olika lampor, en ljusemitterande diod (LED), en laser eller en laserdiod (LD) kan vara ljuskällan 310. Här kan ljuskällan 310 innefatta en struktur som klarar att variera våglängden enligt strukturen hos ett optiskt system. Å andra sidan kan storleken hos en optisk signal i det reflekterade ljuset vara relativt liten nära det ovan beskrivna tillståndet med ej reflekterande p-vågor. I detta fall kan signalbrusförhållandet ökas genom strålning av ljus med en hög andel ljus med användning av en laser eller en laserdiod (LD), för att därvid uppnå en högkänslig mätning.

[88] Polarisatorn 320 innefattar en polarisationsskiva och polariserar ljuset som strålar från ljuskällan 310. Här innefattar komponenterna hos det polariserade ljuset p-vågor som är parallella med infallsytan och s-vågor som är vertikala till infallsytan.

[89] Kollimatorlinsen 330 tar emot ljuset från ljuskällan 310 och tillhandahåller parallellt ljus till polarisatorn 320. Vidare kan fokuseringslinsen 340 öka mängden infallande ljus genom konvergering av det parallella ljuset som passerar genom polarisatorn 320. Vidare fungerar den första kompensatorn 350 för fasfördröjning av de polariserade komponen- terna hos det infallande ljuset. 10 15 20 25 30 35 15

[90] Polarisationsdetekteringsenheten 400 fungerar, såsom visas i fig. 7, till att ta emot ljus som reflekteras av bindningsskiktet 160 genom reflexionsfönstret 144 och till att de- tektera en förändring i polarisationstillståndet hos det reflekterade ljuset. Polarisationsde- tekteringsenheten 400 innefattar en analysator 410, en fotodetektor 420 och en driftspro- cessor 430 (dvs. huvudsakliga element) och kan vidare innefatta en andra kompensator 440 och ett spektroskop 450. Här motsvarar analysatorn 410 polarisatorn 320 och innefat- tar en polarisationsskiva. Analysatorn 410 kan styra graden av polarisation hos reflekterat ljus eller riktningen hos en polarisationsyta genom att polarisera det reflekterade ljuset igen. Vidare kan analysatorn 410 vara roterbart utförd enligt strukturen hos ett optiskt sy- stem eller så kan den dessutom innefatta polarisationsmoduleringsmedel som kan utföra funktioner såsom fasändring eller släckning av polariserade komponenter.

[91] Fotodetektorn 420 fungerar för att erhålla optiska data genom detektering av polarise- rat reflekterat ljus och till att konvertera optisk data till en elektrisk signal. Här innefattar optiska data information över en förändring i polarisationstillståndet hos det reflekterade ljuset. Ett halvledarsystem av CCD-typ, en fotomultiplikator (PMT) eller en kiselfotodiod kan användas som fotodetektorn 420.

[92] Driftsprocessorn 430 fungerar till att inducera kvantifierade värden genom inhämtning av den elektriska signalen från fotodetektorn 420. Driftsprocessorn 430 har ett förutbe- stämt tolkningsprogram som använder en reflektometri och ellipsometri inneslutet däri.

Driftsprocessorn 430 kan inducera kvantifierade värden, såsom bindningskoncentrationen hos prover, och tjockleken, bindningskonstant, disassociationskonstant och brytningsin- dex hos bindningsskiktet 160 genom extrahering och tolkning av de optiska data som om- vandlats till den elektriska signalen. Här är det att föredra att driftsprocessorn 430 induce- rar de kvantifierade värdena genom att hitta den ellipsometriska konstanten Lp eller A av- seende en fasdifferens hos en ellipsometri för att förbättra mätkänsligheten.

[93] Den andra kompensatorn 440 fungerar till att styra de polariserade komponenterna hos det reflekterade ljuset genom fasfördröjning. Den andra kompensatorn 440 kan vara utförd roterbar, eller så kan den dessutom innefatta andra polarisationsmoduleringsmedel.

[94] Spektroskopet 450 kan användas i fall där ljuskällan 310 är en ljuskälla med vitt ljus.

Spektroskopet 450 gör det reflekterade ljuset spektroskopiskt, separerar det reflekterade ljuset som har en våglängd i ett snävt område, och sänder det till fotodetektorn 420. Här kan fotodetektorn 420 erhålla optiska data avseende en fördelning av reflekterat ljus med användning av en 2-dimensionell bildsensor, såsom ett halvledarsystem av CCD-typ.

[95]

[96] [Förfarande för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken hos molekylär växelverkan] 10 15 20 25 30 35 16

[97] Nedan beskrivs förfarandet och principerna för kvantifiering av bindnings- och disas- sociationskinetiken hos molekylär växelverkan.

[98] Fig. 12 är ett ﬂödesschema som illustrerar förfarandet för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken för molekylär växelverkan enligt föreliggande uppfinning. Så- som visas i ﬁg. 12 genomgår kvantifieringsförfarandet enligt föreliggande uppfinning ett första steg S100 till ett femte steg S500.

[99] I det första steget S100, såsom i fig. 7, löser provinsprutningsenheten 200 upp pro- verna (ej visat) av biomaterial, innefattande små molekyler, i buffertlösningen 210 och sprutar in dem i mikroflödesvägarna 150 hos strukturen 100 av mikroflödesvägar. Här kan provinsprutningsenheten 200 spruta in buffertlösningen 210, inkluderande prover av olika koncentrationer, i respektive mikroflödesvägar 150 av multipla kanaler. Vidare kan provinsprutningsenheten 200 spruta in buffertlösningen 210 med ett intervall för respekti- ve mikroflödesväggar 150. Vidare kan provinsprutningsenheten 200 spruta in buffertlös- ningen i några av mikroflödesvägarna 150 och sedan inte använda de återstående mikro- flödesvägarna 150.

[100] I det andra steget S200 är proverna (ej visade) av biomaterial bundna till det tunna dielektriska skiktet 130, och formar på så sätt bindningsskiktet 160. Till skillnad från ovan- stående kan proverna bindas till mångfalden av olika självsammansatta monoskikt 132 som är bildade i strukturen 100" av mikroflödesvägar av en enda kanal som visas i fig. 11, och bildar således bindningsskiktet 160 som har olika bindningskaraktäristika.

[101] I det tredje steget S300 polariseras förutbestämt ljus som strålas ut från ljuskällan 310 medelst polarisatorn 320 och faller sedan in på bindningsskiktet 160 genom infalls- fönstret 142 hos strukturen 100 av mikroflödesvägar. Här har det polariserade infallande ljuset polariserade komponenter av p-vågor och s-vågor. Å andra sidan måste det infal- lande ljuset ha en infallsvinkel 9 som tillfredsställer ett ej reflekterande tillstånd för p-vågor.

[102] I det tjärde3 steget S400 faller det reflekterade ljuset som reflekteras av bindnings- skiktet 160 in på polarisationsdetekteringsenheten 400 genom reﬂexionsfönstret 144 hos strukturen 100 av mikroflödesvägar. Här är det reflekterade ljuset i ett elliptiskt polariserat tillstånd.

[103] I det femte steget S500 detekterar polarisationsdetekteringsenheten 400 det polari- serade tillståndet hos det reflekterade ljuset . i synnerhet tar analysatorn 410 först emot det elliptiskt polariserade reflekterade ljuset från bindningsskiktet 160 och överför endast ljus enligt en polarisationskaraktäristik.

[104] Därefter erhåller fotodetektorn 420 förutbestämda optiska data genom detektering av en förändring i de polariserade komponenterna hos det reflekterade ljuset, omvandlar 10 15 20 25 30 35 17 dessa optiska data till en elektrisk dignal och överför den elektriska signalen till driftspro- cessorn.

[105] Därefter inducerar driftsprocessorn 430, vilken har ett program som använder en däri befintlig reflektometri eller ellipsometri, kvantifierade värden, såsom bindningskon- centrationen, bindnings- och disassociationskonstanter och brytningsindex hos proverna genom att extrahera och tolka de optiska data som omvandlats till elektrisk signal. Här, i föreliggande uppfinning, inducerar driftsprocessorn 430 de kvantifierade värdena genom att hitta amplitudförhållandet Lp och fasdifferensen A i en ellipsometri. Värdena för fasdiffe- rensen A har en utmärkt känslighet som är 10 gånger större än värdet för amplitudförhål- landet Lp, förutom vinklar mycket nära den ej reﬂekterande vinkeln för p-vågor. Mätkäns- ligheten kan förbättras genom mätning av värdet på fasdifferensen A. Emellertid före- kommer, vid den ej reflekterande vinkeln för p-vågor, nästan ingen förändring i fasdiffe- rensen A och känsligheten hos värdena för amplitudförhållandet Lp är mycket förbättrade. I synnerhet är en förändring i värdet för amplitudförhållandet Lp vid den ej reflekterande vin- keln för p-vågor fördelaktig för kvantitativ mätning eftersom den har en linjär förändring som reaktion på endast en förändring i tjockleken eller brytningsindex hos ett bindnings- material oberoende av det tunna dielektriska skiktet vilket är ett substratmaterial.

[106]

[107] [Exempel på experiment]

[108] Fig. 13 är ett diagram som visar en förändring i de ellipsometriska konstanterna och följaktligen i brytningsindex hos buffertlösningen i det fall där det runna dielektriska skiktet är format på ett kiseloxidskikt. l ﬁg. 13 hade ljuskällan 310 en våglängd på 532 nm och ett kiseloxidskikt på 2 nm i tjocklek användes som det tunna dielektriska skiktet 130. I fig. 13 kan man se att en infallsvinkel som korresponderar till ett ej reflekterande tillstånd hos p- vågorna är ungefär 72° vid vilken värdena hos de ellipsometriska konstanterna Lp och A förändras abrupt. Man kan också se att i de fall när bindningsskiktet 160 inte är format (0 nm), förekommer nästan ingen förändring i värdena hos de ellipsometriska konstanterna Lp och A enligt en förändring (1 ,333, 1,334) i brytningsindex hos buffertlösningen 210. Det innebär att endast bindnings- och disassociationskinetiken som är inbyggda i proverna kan mätas eftersom det tunna dielektriska skiktet 130 som tillhandahåller en stabil ljuska- raktäristik används.

[109] Vidare är i fallet där brytningsindex hos buffertlösningen 210 är reguljär (1,333) och tjockleken hos bindningsskiktet 160 ändras från 0 nm till 1 nm, en förändring i värdet för amplitudförhållandet Lp känsligt vid den ej reflekterande vinkeln för p-vågor, och känslighe- ten hos fasdifferensen A är utmärkt förutom vid vinklar mycket nära den ej reflekterande vinkeln för p-vågor. 10 15 20 25 30 18

[110] Fig. 14 ä ett diagram som visar en förändring i de ellipsometriska konstanterna Lp och A enligt en förändring i tjockleken hos bindningsskiktet i prover i fall där det tunna di- elektriska skiktet är format på ett kiseloxidskikt. Fig. 14 visar ett fall i vilket brytningsindex hos buffertlösningen 210 är reguljärt (1 ,333) och tjockleken hos bindningsskiktet 160 är 0 nm till 3 nm. I ﬁg. 14 kan man se att det förekommer en förändring i värdet på de ellips- ometriska konstanterna Lp och A vid en infallsvinkel på ungefär 72° korresponderar till det ej reflekterande tillståndet för p-vågor. I ﬁg. 14 kan man se att vid den ej reﬂekterande vin- keln för p-vågor är en förändring i värdet för amplitudförhållandet Lp känsligt och känslig- heten hos fasdifferensen A är utmärkt förutom vid vinklar mycket nära den ej reflekterande vinkeln för p-vågor.

[111] Fig. 15 är ett diagram som visar en förändring i de ellipsometriska konstanterna Lp och A enligt en förändring i tjockleken hos bindningsskiktet i prover i fall där substratet 120 är tillverkat av ett glasmaterial och där det tunna dielektriska skiktet inte används (0 nm). I fig. 15 hade ljuskällan 310 en våglängd på 532 nm och ett glasskikt (SF 10) användes som substratet 120. I ﬁg. 15 kan man se att en infallsvinkel som korresponderar till ett ej reflekterande tillstånd hos p-vågorna är ungefär 52,5 vid vilken värdena hos de ellipsomet- riska konstanterna Lp och A förändras plötsligt. På samma sätt som ovanstående experi- menten kan man se att värdena hos de ellipsometriska konstanterna Lp och A förändras enligt en förändring i tjockleken hos bindningsskiktet 160 (1 nm till 4 nm). Vidare kan man i fig. 15 se att vid den ej reflekterande vinkeln för p-vågor är en förändring i värdet för amplitudförhållandet Lp känsligt och känsligheten hos fasdifferensen A är utmärkt förutom vid vinklar mycket nära den ej reflekterande vinkeln för p-vågor.

[112] Fig. 16 är ett diagram som visar en förändring i de ellipsometriska konstanterna Lp och A enligt en förändring i tjockleken hos ett kiseloxidskikt eller ett absorptionsmaterial i fall där substratet är tillverkat av kisel (Si). I fig. 16 kan man se att vid den ej reflekterande vinkeln för p-vågor förekommer nästan ingen förändring i fasdifferensen A och det före- kommer en märkbar förändring i värdet på amplitudförhållandet Lp. Här kan man se att en förändring i värdet på amplitudförhållandet Lp har en linjär förändring som reaktion på en förändring i tjockleken eller brytningsindex hos ett tunt skikt som är bundet till ett sub- stratmaterial. Om våglängden för det infallande ljuset och brytningsindex hos ett medium är känt, är kvantitativ mätning möjlig baserat på värdena för amplitudförhållandet Lp. Följ- aktligen kan, om anordningen och förfarandet för kvantifiering av bindnings- och disasso- ciationskinetiken för molekylär växelverkan enligt föreliggande uppfinning används, en biosensor som klarar att kvantitativ analysera endast en förändring enligt endast en bind- 19 ningskaraktäristik utnyttjas till skillnad från SPR-sensorn vilken är känslig för en förändring i den omgivande miljön.

Claims

10 15 20 25 30 35 20 PATENTKRAV

1. Anordning för kvantifiering av bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär växelverkan, innefattande: en struktur (100) för mikroflödesvägar, innefattande ett under- lag (110), ett substrat (120) som är format på underlaget (110) och tillverkat av en halvle- dare eller av ett dielektriskt material, ett tunt dielektriskt skikt (130) format på substratet (120), en omhöljningsenhet (140) som är utförd så att den har ett infallsfönster (142) re- spektive ett reﬂexionsfönster (144) anordnade på den ena och på den andra sidan och är anordnade på underlaget (110), och mikroflödesvägar (150) som är bildade i underlaget (110) och mellan underlaget (110) och omhöljningsenheten (140); en provinsprutningsen- het (200) för bildande av ett bindningsskikt (160) av prover på det tunna dielektriska skik- tet (130) genom insprutning av en buffertlösning (210), innefattande proverna av ett bio- material in i mikroflödesvägarna (150); en polarisationsalstringsenhet (300) för strålning av infallande ljus, polariserat genom infallsfönstret (142), till bindningsskiktet (160) vid en infallsvinkel 9 som tillfredsställer ett tillstånd av ej reflekterande p-våg; och en polarisa- tionsdetekteringsenhet (400) för detektering av en förändring i polarisationen hos reflekte- rat ljus i bindningsskiktet (160) vilken faller in genom reflexionsfönstret (144).

2. Anordning enligt krav 1, varvid det tunna dielektriska skiktet (130) innefattar ett halvle- daroxidskikt eller ett glasskikt tillverkat av ett transparent material.

3. Anordning enligt krav 2, varvid det tunna dielektriska skiktet (130) har en tjocklek på 0 till 1000 nm.

4. Anordning enligt krav 1, varvid strukturen (100) av mikroflödesvägar innefattar: en mångfald av inflödesvägar (152) och en mångfald av utflödesvägar (154) vilka är bildade på den ena respektive den andra sidan av underlaget (110), och mikroflödesvägarna ( 150) hos mångfalden av kanaler är konfigurerade så att de har ett flertal barriärribbor (146) formade på en insida av omhöljningsenheten (140) och så att de förbinder inflödes- vägarna (152) respektive utflödesvägarna (154).

5. Anordning enligt krav 1, varvid strukturen (100) av mikroflödesvägar bildar mikroflödes- vägen (150) för en enda kanal, och en mångfald av olika självsammansatta monoskikt (132) till vilka proven är bundna bildas dessutom på det tunna dielektriska skiktet (130).

6. Anordning enligt krav 4, varvid: var och en av infallsfönstret (142) och reflexionsfönstret (144) hos omhöljningsenheten (140) har en krökt skalform med en förutbestämd krökning, 10 15 20 25 30 35 21 och det infallande ljuset och det reflekterande ljuset faller in på infallsfönstret (142) re- spektive reflexionsfönstret (144), i en vertikal vinkel eller vid en nästan vertikal vinkel med en storlek så att ett polariserat tillstånd för var och en av det infallande ljuset och det re- flekterande ljuset inte förändras så mycket.

7. Anordning enligt krav 4, varvid: var och en av infallsfönstret (142) och reflexionsfönstret (144) hos omhöljningsenheten (140) har en plan arkform, och det infallande ljuset och det reflekterande ljuset faller in på infallsfönstret (142) respektive reflexionsfönstret (144), i en vertikal vinkel eller vid en nästan vertikal vinkel med en storlek så att ett polariserat till- stånd för var och en av det infallande ljuset och det reflekterande ljuset inte förändras så mycket.

8. Anordning enligt krav 4, varvid omhöljningsenheten (140) är integrerat tillverkad av glas eller ett transparent syntetiskt hartsmaterial.

9. Anordning enligt krav 1, varvid bindningsskiktet (160) är ett flerlagrigt skikt, innefattande ett självsammansatt monoskikt (132) som är lämpligt för bindning av egenskaper hos olika biomaterial, ett ﬁxeringsmaterial, och olika biomaterial inklusive molekyler som är bundna till fixeringsmaterialet.

10. Anordning enligt krav 1, varvid polarísationsalstringsenheten (300) innefattar: en ljus- källa (310) för strålning av förutbestämt ljus, och en polarisator (320) för polarisering av det strålade ljuset.

11. . Anordning enligt krav 10, varvid ljuskällan (310) strålar ut monokromatiskt ljus eller vitt ljus.

12. Anordning enligt krav 10, varvid ljuskällan (310) är en laser eller en laserdiod som har en våglängdsvariabel struktur.

13. Anordning enligt krav 10, varvid polarisationsalstringsenheten (300) innefattar åtmin- stone en av: en kollimatorlins (330) för tillhandahållande av parallellt ljus till polarisatorn (320), en fokuseringslins (340) för ökning av en mängd av det infallande ljuset genom konvergering av det parallella ljuset som passerar genom polarisatorn (320), och en första kompensator (350) för fasfördröjning av polariserade komponenter hos det infallande lju- set. 10 15 20 25 30 35 22

14. Anordning enligt krav 13, varvid polarisatorn (320) och den första kompensatorn (350) är roterbart utförda eller dessutom utrustade med andra medel för polarisationsmodule- ring.

15. Anordning enligt krav 1, varvid polarisationsdetekteringsenheten (400) innefattar: en analysator 410 som är utförd att polarisera det reflekterade ljuset, en fotodetektor (420) som är utförd att erhålla förutbestämda data genom detektering av det polariserade reflek- terade ljuset, och en driftsprocessor (430) som är elektriskt förbunden med fotodetektorn (420) och är utförd att inducera kvantifierade värden baserat på optisk data.

16. Anordning enligt krav 15, varvid fotodetektorn (420) innefattar någon av ett halvledar- system av CCD-Iyp, en fotomultiplikator och en kiselfotodiod.

17. Anordning enligt krav 15, varvid driftsprocessorn (430) inducerar de kvantifierade vär- dena, inklusive en bindningskoncentration, en bindningskonstant och en disassociations- konstant för proverna, genom att hitta en ellipsometrisk konstant tp eller A.

18. Anordning enligt krav 15, varvid polarisationsdetektorenheten (400) dessutom innefat- tar åtminstone en av: en andra kompensator (440) för fasfördröjning av polariserade kom- ponenter hos det reflekterade ljuset, och ett spektroskop (450) för att göra ett spektrum av det reflekterade ljuset.

19. Anordning enligt krav 18, varvid analysatorn (410) och den andra kompensatorn (440) är roterbart utförda eller dessutom utrustade med andra medel för polarisationsmodule- ring.

20. Förfarande för kvantifiering bindnings- och disassociationskinetiken vid molekylär väx- elverkan, varvid förfarandet innefattar: ett första steg S100 hos en provinsprutningsenhet (200) med insprutning av en buffertlösning (210), inklusive prover av små molekylära bio- material, till mikroflödesvägar (150) hos en struktur (100) av mikroflödesvägar; ett andra steg S200 där prover binds till ett tunt dielektriskt skikt (130) hos mikroflödesvägstrukturen (100), för att så bilda ett bindningsskikt (160), ett tredje steg S300 för en polarisationsalst- ringsenhet (300) som polariserar förutbestämt ljus och gör det polariserade ljuset så att det faller in på bindningsskiktet (160) med en infallsvinkel på för att tillfredsställa ett ej re- flekterande tillstånd av p-vågor genom ett infallsfönster (142) hos strukturen (100) av mik- 10 15 20 23 roflödesvägar; ett fjärde steg S400 varvid reflekterat ljus hos bindningsskiktet (160) infaller på en polarisationsdetekteringsenhet (400) genom ett reflexionsfönster (144) hos struktu- ren (100) av mikroflödesvägar; och ett femte steg S500 varvid polarisationsdetekterings- enheten (400) detekterar ett polarisationstillstånd hos det reflekterade ljuset med använd- ning av en ellipsometri eller en reflektometri.

21. Förfarande enligt krav 20, varvid i det första steget S100, sprutas buffertlösningen 210 inkluderande proverna av olika koncentrationer in i respektive mikroflödesvägar (150) hos strukturen (100) av mikroflödesvägar innefattande multipla kanaler.

22. Förfarande enligt krav 20, varvid i det andra steget S200, binds proverna till en mång- fald av olika självsammansatta monoskikt (132) som är bildade på det tunna dielektriska skiktet (130), för att så bilda de olika bindningsskikten (160).

23. Förfarande enligt krav 20, varvid det femte steget S500 innefattar: ett steg med en analysator (410) som polariserar det reflekterade ljuset, ett steg varvid en fotodetektor (420) erhåller förutbestämd optisk data genom detektering av det polariserade reflektera- de ljuset, och ett steg varvid en driftsprocessor (430) inducerar kvantifierade värden, inne- fattande en bindningskoncentration, en bindningskonstant och en disassociationskonstant hos proven, genom att hitta en ellipsometrisk konstant qi eller A hos ellipsometrin baserat på dessa optiska data.