RU869332C - Штамм BREVIBACTERIUM SP. Е 531-продуцент @ -лизина - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к микробиоло1-ической промышленности и касаетс  нового штамма бактерий, продуцирующего L-лизин. используемый в качестве кормовой добавки. Известен штамм Brevlbacterlum flavum RC-115-продуцент L-лизина, Штамм RC-115 характеризуетс  потребность в аминокислотах (треонине и метионцне ) .и высоким урЬвнем образовани  лизина в лабррато.рны1 услови х. При ферментации о колбах штамм продуцирует 2034 г/л L-лизина, влабораторныхферментерах на мелассной среде с дробной добавкой сахарозы - 45-60 г/л L-лизин. Однако в пройзводг/твенных услови х в ферментерах емкостью 30 и 50 м средний уровень образовани  лизина у штамма не превышает 25 г/л. Помимо этого недостатком штамм  RC115  вл етс  высока  зависимость образовани  лизина от колебаний количества треонина и питательной среде, где источниками треонина  вл етс  основное сырье меласса , а также кукурузный экстракт или замен ющие его различные гидролизаты белковых веществ. Треонин  вл етс  необходимым ростовым фактором дл  продуцента , но его избыток в среде ингибирует процесс лизинообразовани . Цель изобретени  получение штаммапрбдуцента L-лизина, у которого высока  способность к сверхсинтезу лизина-сохра-; н етс  в производственных услови х неза- висимо от объема ферментационных аппаратев)л примен емого в производстве сырь . Предлагаемый штамм Brevlbacterlum sp. Е 531 получен путем многоступенчатой селекции из штамма Brivlbacterlum sp. 22 Л с применением двух мутагенных факторов: раствора нитрозогуанидина (НГ) и паров диэтилсульфата (ДЭС). Селекци  проведена по следующей схеме: отбор на среде НГ НГ НГ с аналогом ДЭС 22Ле 132РЕ 193СС28NC E5 Начина  со второго этапа селекции, отбор продуктивных штаммов вели на среде повышенным до 13% по сахару содержанием мелассы, подавл ющим синтез лизина у исходного штамма 22Л. На предпоследнем этапе селекции был проведен отбор мутантов , устойчивых к ингибированию аналогом лизина 5-(2-аминоэтил)-1-цистеином (ASLQ в сочетании с треонином. В результате был получен новый штамм Brevibacterium sp. Е 531. Основные отличи  штамма Е 531 от штамма прототипа RC-115 заключаютс  в более высоком уровне лизинообразовани  в различных услови х ферментации и в устойчивости к аналогу лизина, что обеспечивает штамму меньшую зависимость синтеза лизина от содержани  в среде треонина. Ниже приведены результаты изучени  вли ни  аналога лизина (АЭЦ) и треонина на рост штаммов Е 531, RC-115 и 22Л. В табл. 1 представлены данные, показывающие оптическую плотность суспензии клеток трех штаммов после 15 ч роста в минимальной среде с гомосерином (0.1 мг/мл), в которую добавлены АЭЦ и треонин в соотношении 1:1. Как видно из табл. 1, рост штамма Е531 в меньшей степени ингибируетс  аналогом анализа в сочетании с треонином по сравнению с исходным штаммом прототипом RC115 . Из таблицы также видно, то рост нового штамма п первые 15 ч значительно опережает рост двух других штаммов. У известных аналогорезистентных штаммов продуцент лизина устойчивость роста клеток к ингибированию аналога лизина (АЭЦ) обусловлена мутационным изменением ключевого фермента синтеза лизина уб-аспартокиназы, которое заключаетс  в том,- что указанный фермент Становитс  менее чувствительным к подавлению его активности смесью лизина и треонина. Определение уровн  активности аспартокиназы и чувствительности фермента к ингибированию лизином и треонином проведено у нового штамма Е531 и его исходного штамма 22Л (табл. 2j Как видно из представленных в табл. 2 данных, удельна  активность аспартокиназы нового штамма Е531 в 1,5 раза выше активности исходного штамма 22Л. Лизин и треонин, вз тые в отдельности, не оказывают существенного вли ни  на активность фермента обоих штаммов, тогда как эквимол рна  смесь этих аминокислот на 90% подавл ет активность фермента у штамма 22Л, но только на 55% у штамма Е531. Таким образом, ключевой фермент биосинтеза лизина у штамма Е531 характеризуетс  более высоким уровнем удельной активности и меньшей чувствительностью к ингибированию смесью лизина и треонина. Эти Свойства аспартокиназы  вл ютс , очевидно, причиной более высокого уровн  лизинообразовани  у штамма Е531 по сравнению с родительским штаммом и штаммом-прототипом RC-115 при ферментации на средах с повышенным сол ржлн11 м треонина . В табл. 3 представлены данные, показывающие вли ние добавки трернина к ферментационной среде, содержащей мелассу и кукуруэн ы и экстракт, на выход лизина после 65 ч ферментации. Как видно из данных табл. 3, увеличение содержани  треонина в среде приводит к резкому снижению продуктивности родительского штамма и штамма-прототипа. У штамма Е531 синтез лизина в меньшей степени , подвержен отрицательному вли нию треонина. Кроме уменьшени  зависимости от отрицательного действи  треонина, снижение чувствительности аспартокиназы к ингибированию смесью лизина и треонинд обусловливает и другое полезное свойство, нового штамма, а именно более высокую стабильность сггособности продуцировать лизин. Так, реверси  к дикому типу у штамма 22Л одновременно с утратой ауксотрофных свойств (потребностьв гомосерине или треонине и метионине) приводит к полной утрате способности выдел ть, лизин. В то же врем  прототрофные ревертанты штамма Е531 сохран ют способность прюду-цировать в среднем 40-50% лизина от у|зовн  родительского штамма. . Приобретение в процессе многоэтапной селекции свойства штамма Е531 обеспечивают ему более высокий уровень продуктивности по сравнению со штаммами 22Л и RC-115. В табл. 4 приведены данные , характеризующие уровень образовани  лизина у трех штаммов в лабораторных услови х на средах разного состава . Как свидетельствуют эти данные, новый читамм Е531 на всех использованных вйри антах ферментационных сред обладает болеевысокой способностью К лизинообразованию по сравнению с исходным штаммом 22Л, а также штаммом прототип .ом. Следует отметить, что повышение в среде концентрации мелассы и, соответственно , сахара не приводит к снижению, уровн  образовани  лизина у нового штамма , как это имеет место у штамма 22Л и на вариантах сред 1 и 3-у штамма прототипа. Стабильно высрк1 й уровень образовани  лизина характеризует штамм Е531 не только в лабораторных услови х, но и в производственнь1х услови х при ферментации в ферментах большей емкости (50 и 100 м. Штамм Brevlbacterium sp. Е531 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИГенетика , и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-1959.. Культурально-морфологическа  характеристика штамма Brevlbacterium sp. Е531. Морфологи  клеток: клетки овальные, размером 0,5-2,0 х 0,3-1,0 мк, спор не образуют , неподвижные, грамположйтельные. Рост на м со-пептонном агаре. Через 7 суток роста образует округлые колонии диаметром 4-4,5 мм, матовые, желтовато-кремовые; пигмент в среду не выдел ют, noBeptxHocTb гладка , форма выпукла , край р вный, структура однородна , консистенци  тестообразна , дает равномерную суспензию в воде. При посеве штрихом через 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность матова , полна , цвет желтовато-кремовый . При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный. Рост на минеральной среде Гловера с глюкозой, биотином, тиамином и гомосерином . На вторые сутки образует округлые колонии диаметром 1,5-2,6 мм, светло-кремовые, пигментв среду не выдел ет , поверхность слегка бугриста , профиль выпуклый, с несколькими концентричными складками, край ровный, структура колонии однородна , консистенци  тестообразна , дает равномерную суспензию в воде. штриха на вторые сутки умеренный, плотный, цвет светло-кремовый . Отношение к источникам углерода. Сбраживает с образованием кислот глюкозу , сахарозу, мальтозу, фруктозу, инозит. Не образует кислот на лактозе, галактозе, арабинозё , рамнозе, ксилозе этаноле, метаноле , манните, сорбите, глицерине, дульците. Айсимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, инозитксилозу, рамнозу , этанол, уксусную кислоту, глицерин, дильцит,  нтарную кислоту, сорбит. Таким образом, новый штамм Brevlbactorlum sp. Е531 характеризуетс  высоким и стабильным уровнем образовани  лизина в различных услови х ферментации и обладает пониженной чувствительностьк к колебани м состава питательной среды, что при промышленном при/иенении штамма должно способствоватъ повышению стабильности производственного процесса и увеличить обьг ем продукта с существующих производственных мощностей на заводах отрасли, производ щих L-лизин. Использование штамма Brevlbacterium ln РЦ11 ППИЯЯанГ Мв rnPnVinillMy ППММРПЯУ Пример 1. Культуру штамма Brevfbacterium sp. 351, выращенную при в течение 1 сут на м со-пелтонном агаре, петлей засевают в колбы емкостью 750 мл, содержащие по ЗТЗ Мл посевной срёды .следующего coctaea, %: меласса - 8,0; гидролизат белково-витаминного концеит4 )ата (БКВ) - 11.0; рН среды - 7.0. Колбы .помещают на круговую качалку и выращива ют посевной материал в течение 21 ч при зо°с;::,, .,. . . / .; , .; . Готовым посевным материалом (по 2 мл) засевают колбы ёмкостью 750 мл, содержащие по 20 мл фермёнтационной среды еле- дующего состава, %: меласса 24.0; гцдролйзат БВК-6,0. хлрридаммони -2.5 гидрофосфат калий -0.2; мел- 1;0;рН среды 7.0. Ферментационна  среда, разлита  в кОлбы, перед посевом стерилизуетс  «втоклавированием . После посева колбы устан ав л и ва ют на к ру го вую качал ку и инкубируют при30 С. Через i66 ч после начала ферментации в культурной жидкости накапливаетс  Цлйзин в концентраций 47,1 г/л (RO монохлоргидрату), В этих услови х лри йспользЬввнии щтамМа ВС-115нак$пливаётс  З2.в г/л L-лизМина. П м е р 2, Культуру iuтамм:а Bfievltecterium Sp. ES31 вмращивают, как ri зано в примере 1, в пс11севной :реде, имеющей Соста1в, %:мёлассаг8.0; кукурузный экстракт6 .0. хлорид аммоний-1,0. рНередь 7.0. V Готовый посевной Материал (по 2 мл) использукит Дл  ггосева фёрментаЦионнрйГJ среды. грцготбвЛеннЬй пЬ примеру 1, но содёржа1|цёи вместо гидролизат БВЦкукурузныйэкстг )акт в концентрации 4%. УелоВИЯ ферментации те же. что и Ьг|исанные Ь примере 66 ч после нйчаЛаферментации в кул ьтурной жидкости накапливаетСи lL-лизин в концентрации 46,0 г/л. В этих услови х при использовании штамма RС115 накапливаетс  38,4 г/л L-лизина. Примерз. Приготовление посевного материала штамма Bnatylbacterlumsp. Е531 и УСЛОВИЯ ферментации те же. что в примере 2, но в составе ферментации среДы вместо кукуруэного экстракта содержитс  гидролизат хлопкового шрота в концентрации 8.0%, Через 65 ч после начала ферментации в культурной жидкости образуетс  1-лизиН в концентрации 38.9 г/л. В зтих услови х лри использовании. штаМма RC-115 образуетс  18,1 г/л L-лизина. П р -и М е р 4. Культуру штамма erevlbacterfum sp. Е531. выращенную при в течение суток на м со-пептонном агаре, петлей засевают в колбы емкостью мл. содержащие по 70 мл посевной среды следующего состава. %; меласса - 12.0; гидролизат БВК - 8.0; мел - 2.0; гидррфосфат аммони  - 0.1; рН среды 6.8-7.2. Колбы прмещают на круговую качалку и выращивают посевной материал в течение 21 с при Приготовленным посевным материалом объемом 1 л засевают 2,5 м стерильной посевной среды того же состава, помещенную в ферментер емкостью5 м. Ферментероборудован барботе ром дл  распределени  воздуха и рубашкой дли охлаждени . Выращивание культуры в ферментере провод т при 30-32С в течение 21 ч с непрерывной аэрацией (2-3 м врздуха в Мин). Выращенной культурой обьемом 2.5 м засевают 30 -м ферментационной среды, приготовленной в ферментере емкостью 50 м . Ферментер оборудован барботажным врздухораспределением. Ферментационна  среда имеет следующий состав. %; меласса .2б ,0; гидролизат БВК-4,5; хлорид аммони  1 ,2; мел г 0,7,- гидрофосфат аммони -0.1; рН Среды 6,8-7,2 устанавливают амиачной водой. Ферментацию п|ровод т при 30-32°С с непрерывной аэрацией (28-36 М воздуха в 1 мин). Через 22 ч после начала ферментации к фер-. ментационной СрёДё добавл ют 2 т стерилизованной мелассы. После 8. ч ферментации концентраци  L-лизина В культурной жидкости составл ет 49 т/л.; П р им е р 5. Посевной материал шТамма Breylbacterlum sp. Е531 готов т по примеру 4. Ферментацию .провод т в ферментере емкостью 50 оборудованным аэратом типа диффузор. После 60 ч ферментации концентраци  L-лизина в кyльtypнoй жидкости составл ет 42 г/л. П РИМ е р 6. Посевной материал штамма BTevlbacterlum sp. Е531 объемом 5 м готов т по примеру 4. Ферментацию провод т в ферментере ёмкостью 100 м с контактным устройством массопередачи типа 1Г1ерфорированных тарелок. В ферментер помещают 60 м ферментационной среды, имеющей состав, как указано в примере 4. но концентраци  мелассы составл ет 28%, Ферментацию провод т при 30-32°С с непрерывной аэрацией (55-66 м воздуха в 1 мин). После 40 ч ферментации концентраци  К-лизина составл ет 45 г/л. ШтамМ Brevlnacterium sp. Е531 в отличии от известных характеризуетс  устойчивостью к $-(2-аминоэтил)-цистенну и высоким уровнем образовани  лизина, до 49 г/л а производственных,услови х, ферментёрах большей емкости. (56) Авторское свидетельство СССР № 671384. кл. С 12 D 13/nfi 1Q7R

10 Таблица 1

869332

х) Активность фермента выражена в % к активности в отсутствие аминокислот,

Вли ние добавки .треонина на уровень образовани  лизина

.Таблица4

.«-

Сравнительна  характеристика способности к образованию лизина у нового штамма Е531

и штаммов 22Л и RC-115 в лабораторных услови х (колбы емк. 750 мл, объем среды 20 мл,

продолжительность ферментации: вар. 1,2-68 ч, вар. 3.4-90ч)

Та блица 2

.SТаблицаЗ

)Гйдролизат хлопкового шрота, ) Гидролизат БВК,

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм Brevlbacterium sp. Е 531 Депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюйногр

   Продолжение табл.

   научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов г.Москвы, регистрационный номер ЦМПМ В-1959)-продуцент L-лизина.