RU42953U1

RU42953U1 - Липосомальная нанокапсула с доксорубицином

Info

Publication number: RU42953U1
Application number: RU2004119799/22U
Authority: RU
Inventors: С.Н. Таргонский; Н.Б. Бажутин; А.В. Войтенко; В.Д. Порываев; В.В. Хомичёв
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Вектор-Медика"
Priority date: 2004-07-02
Filing date: 2004-07-02
Publication date: 2004-12-27

Abstract

Полезная модель относится к области прикладной биотехнологии, а именно к конструкциям липосомальных препаративных форм для лечения и профилактики заболеваний человека и животных. Полезная модель обеспечивает создание такой липосомальной формы доксорубицина, которая увеличивает время её циркуляции в кровяном русле в несколько раз. Липосомальная нанокапсула с доксорубицином представляет собой полую сферу, образованную двухслойной липидной оболочкой из фосфотидилхолина и димиристоилфосфотидилглицерина, содержащую внешний и внутренний гидрофильные липидные слои, между которыми расположена гидрофобная область двухслойной липидной оболочки, причем, нанокапсула дополнительно включает лактозу, распределенную во внешнем и внутреннем гидрофильных липидных слоях и внутреннем объёме сферы, и лекарственное средство доксорубицин, положительно заряженные молекулы которого расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев и прикреплены к отрицательно заряженным участкам молекул димиристоилфосфотидилглицерина. Внутренний и внешний гидрофобные слои липидной оболочки дополнительно содержат фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем 2000, причем, гибкие гидрофильные цепи молекул полиэтиленгликоля расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев при следующем содержании всех компонентов липосомальной нанокапсулы (мг/мл):

Фосфотидилхолин 1,36-13,6 Димиристоилфосфотидилглицерин 1,19-11,9 Лактоза 25,0-200,0

фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный

с полиэтиленгликолем 2000 0,51-5,10 доксорубицин 1,0-5,0

Description

Полезная модель относится к области прикладной биотехнологии, а именно к конструкциям липосомальных препаративных форм для лечения и профилактики заболеваний человека и животных.

К одному из типов нанокапсул относят липосомы, которые являются контейнерами для доставки лекарственных средств. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, что определяет их многие привлекательные качества. Они нетоксичны, биодергадируемы, при определенных условиях могут поглощаться клетками, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого.

Очень важное свойство липосом (как, впрочем и других наночастиц) стало основой для конструирования эффективных антираковых препаратов. Речь идет о соотношении размеров наночастиц и диаметра пор капилляров. Так как размер наночастиц больше диаметра пор капилляров, их объем распределения ограничивается компартаментом введения. Например, при внутривенном введении они не выходят за пределы кровотока, т.е. должны плохо проникать в органы и ткани. Следовательно, резко понижается токсическое действие субстанции, ассоциированной с наночастицами. С другой стороны, это свойство может служить основой для направленной доставки химиотерапевтических препаратов в солидные опухоли и очаги воспаления, так как капилляры, снабжающие эти области кровью, как правило, сильно перфорированы. Следовательно, наночастицы будут накапливаться в опухоли. Это явление получило название пассивное нацеливание. Таким образом, существует две причины, вследствие которых липосомальные препараты антиканцерогенных субстанций очень эффективны: уменьшение токсичности и пассивное нацеливание.

В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке появилось несколько липосомальных противораковых препаратов (Gregoriadis. G. (1995) ТIBЕСН. 13, 527-537), таких как антрациклины дауномицин и доксорубицин, а также винкристин, аннамицин и третиноин (Janoff A.S. (1992) Lab. Invest. 66, 655-658; . Gabizon A., Catane R., Uziely В., et al. (1994) Cancer Res. 54, 987 992; Gill P.S., Espina B.M., Muggia F., et al. (1995) J. Clin. Oncol. 13, 996-1003; Forssen E.A., Ross M.E. (1994) J. Lipisomes Res. 4, 481-512; Northfelt D.W., Kaplan L., Russell J., et al. (1995) in Stealth Liposomes (Lasic D.D., Martin F.J., eds). 257-266. CRC Press; Bogner J.R., Goebl F-D. (1995) in Stealth Liposomes (Lasic D.D., Martin F.J., eds). CRC Press. 267-278), многие препараты находятся на последних стадиях клинических испытаний.

Однако недостатком выше приведенных аналогов - липосомальных препаратов является быстрое выведение липосом из крови, которое связано с поглощением их ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) печени и селезенки. Это происходит вследствие взаимодействия липосом с белками плазмы - опсонинами (в основном, компонентами комплемента). Опсонины "метят" липосомы, делают их мишенями для клеток РЭС.

Известна конструкция липосомы из фосфолипидов (Заявка на патент РФ №2002117912, МПК А 61 К 38/00, опубл. 10.02.2004 г.), которая стерически стабилизирована ковалентно связанными димиристилфосфаэтаноламином и полиэтиленгликолем 2000.

Недостатком данной липосомы является то, что она не содержит доксорубицина и предназначена только для аэрозольного введения в организм, а не для инъекций.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является липосомальная нанокапсула, представляющая собой двухслойную липидную оболочку с внутренней полостью. Двухслойная оболочка содержит фосфотидилхолин с лактозой, холестерином и витамином Е и состоит из внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев, включающих отрицательно заряженный компонент димиристоилфосфотидилглицерин. Между внешним и внутренним липидными слоями расположена гидрофобная

область двухслойной липидной оболочки. Кроме того, нанокапсула содержит лекарственное средство доксорубицин, положительно заряженные молекулы которого расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев и прикреплены к молекулам отрицательно заряженного димиристоилфосфотидилглицерина (Патент США №6060080, МПК А 61 К 9/127, опубл. 09.05.2000 г.)..

Однако недостатком выше приведенной липосомальной нанокапсулы - прототипа является также быстрое выведение липосом из крови, которое связано с поглощением их ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) печени и селезенки.

Техническим результатом предлагаемой полезной модели является создание такой липосомальной формы доксорубицина, которая увеличивала бы время её циркуляции в кровяном русле в несколько раз.

Указанный технический результат достигается тем, что в липосомальной нанокапсуле с доксорубицином, представляющей собой полую сферу, образованную двухслойной липидной оболочкой из фосфотидилхолина и димиристоилфосфотидилглицерина, содержащую внешний и внутренний гидрофильные липидные слои, между которыми расположена гидрофобная область двухслойной липидной оболочки, причем, нанокапсула дополнительно включает лактозу, распределенную во внешнем и внутреннем гидрофильных липидных слоях и внутреннем объёме сферы, и лекарственное средство доксорубицин, положительно заряженные молекулы которого расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев и прикреплены к отрицательно заряженным участкам молекул димиристоилфосфотидилглицерина, соглсно полезной модели, внутренний и внешний гидрофобные слои двухслойной липидной оболочки дополнительно содержат фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем 2000, причем, гибкие гидрофильные цепи молекул полиэтиленгликоля расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев при следующем содержании всех компонентов липосомальной нанокапсулы (мг/мл):

Причем, двухслойная липидная оболочка может дополнительно содержать холестерин и витамин Е при следующем содержании всех компонентов липосомальной нанокапсулы (мг/мл):

Фосфотидилхолин	1,36-13,6
Димиристоилфосфотидилглицерин	1,19-11,9
Холестерин	0,1-6,66
Лактоза	25,0-200,0
витамин Е	0,1-0,75

Технический результат достигается тем, что предлагаемая липосома стерически стабилизована добавлением гидрофильный полимер, такой как полиэтиленоксид, который ковалентно связан с фосфатидилэтаноламином. Такой подход является очень эффективным, поскольку модифицированные липосомы могут избежать поглощения РЭС.

Полезная модель поясняется следующими графическими материалами. На фиг.1 представлена заявляемая схема "стерически стабилизированной" липосомы,. а на графике фиг.2 приведены результаты экспериментальных исследований, где показано насколько увеличивается время циркуляции стерически стабилизированных липосом (заявляемый объект) и обычных липосом (прототип).

Описание конструкции липосомальной нанокапсулы:

Липосомальная нанокапсула 1 (фиг.1) представляет собой полую сферу, образованную двухслойной липидной оболочкой из фосфотидилхолина и

димиристоилфосфотидилглицерина, содержащую внешний 2 и внутренний 3 гидрофильные липидные слои, между которыми расположена гидрофобная область 4 двухслойной липидной оболочки. Кроме того, нанокапсула 1 дополнительно включает:

- лактозу, распределенную во внешнем 2 и внутреннем 3 гидрофильных липидных слоях и внутри полости 5 двухслойной липидной оболочки;

- фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем 2000, причем, гибкие гидрофильные цепи 6 молекул полиэтиленгликоля расположены на поверхностях гидрофильных слоев;

- лекарственное средство доксорубицин, положительно заряженные молекулы 7 которого расположены на поверхностях внешнего 2 и внутреннего 3 гидрофильных липидных слоев и прикреплены к отрицательно заряженным участкам молекул 8 димиристоилфосфотидилглицерина.

Кроме того, двухслойная липидная оболочка нанокапсулы 1 может дополнительно содержать холестерин и витамин Е.

Ниже приведены примеры составов заявляемой липосомальной формы с доксорубицином (мг/мл):

Пример 1.

Фосфотидилхолин	13,6
Димиристоилфосфотидилглицерин	11,9
Лактоза	85,0

с полиэтиленгликолем 2000	5,10
доксорубицин	5,0

Пример 2.

Фосфотидилхолин	1,36
Димиристоилфосфотидилглицерин	1,19
Лактоза	200,0

с полиэтиленгликолем 2000	0,51
доксорубицин	1,0

Пример 3.

Фосфотидилхолин	13,6
Димиристоилфосфотидилглицерин	11,9
Холестерин	6,66
Лактоза	25,0
витамин Е	0,75

с полиэтиленгликолем 2000	5,10
доксорубицин	5,0

Пример 4.

Фосфотидилхолин	7,0
Димиристоилфосфотидилглицерин	6,5
Холестерин	0,1
Лактоза	100,0
витамин Е	0,1

с полиэтиленгликолем 2000	3,0
доксорубицин	2,0

Пример 5.

Фосфотидилхолин	9,50
Димиристоилфосфотидилглицерин	3,56
Холестерин	3,33
Лактоза	100,0
витамин Е	0,15

с полиэтиленгликолем 2000	1,03
доксорубицин	1,0

Пример 6. Технология получения липосомальной нанокапсулы с

доксорубицином

Все компоненты липосомы растворяют в смеси этанола с хлороформом, упаривают на роторном испарителе, удаляют следы растворителя под вакуумом,

регидратируют раствором доксорубицина в растворе лактозы до образования однородной эмульсии и давят на экструдере последовательно через мембраны с размером пор 1000, 800, 400, 200 и 100 нм по нескольку раз сквозь каждую мембрану. Потом продукт фильтруют через фильтр с размером пор 220 нм для стерилизации, разливают по флаконам по 10 мл и лиофилизируют. При этом получают сухую пористую массу красного цвета, однородную по объему флакона. В готовом сухом препарате примерное содержание основных компонентов (в зависимости от размера липосомальных нанокапсул) доксорубицина - 10 мг, липидов - 100 мг, лактозы - 1 г.

Пример 7. Приготовление раствора липосомального Доксорубицина ля внутривенных инфузий

Для приготовления раствора в сухой препарат доксорубицина добавляют 20 мл холодного 5%-ного раствора глюкозы. Раствор глюкозы для инфузий предварительно охлаждают в холодильнике до температуры около 4°С. Раствор интенсивно перемешивают до получения однородной полупрозрачной дисперсии, не содержащей видимых примесей или агломератов. Флакон с раствором помещают в водяную баню с температурой 40-50°С и прогревают 5-10 минут. При этом происходит регистрируемое визуально просветление раствора с образованием мелких пузырьков. После прогрева препарат готов для применения. Процедура разведения сухого препарата доксорубицина холодным раствором глюкозы с последующим прогревом необходима для получения дисперсии мелких липосом (до 0,2 мкм), обеспечивающих высокое терапевтическое действие препарата.

Перед инфузией препарат дополнительно разводят глюкозой до требуемой концентрации.

Пример 8. Результаты исследования липосомального препарата на токсичность

На токсичность проверялась две группы лабораторных мышей, одной из которых вводили субстанцию доксорубицина, а другой - липосомальную форму, изготовленную в соответствии с заявляемой полезной моделью. Данные приведены ниже в таблице.

Таблица Данные по проверке заявляемого препарата на токсичность
Форма препарата	Тест-доза (на мышь)	Способ введения	Срок наблюдения	Результат
Доксорубицин субстанция	0.1 мг	внутривенно	48 час	Живые все
			10 суток	Живые все
Доксорубицин липосомиров. (заявляемый препарат)	0.4 мг	внутривенно	48 час	Живые все
			10 суток	Живые все

После инъекций животных в обеих группах наблюдали 10 суток. Все животные в эксперименте остались живы, что подтверждает низкую токсичность данных препаративных форм..

Пример 9. Данные по исследованию липосом в кровяном русле

Заявляемые стерически стабилизированные липосомы (Лс с ПЭГ) и традиционный липосомальный препарат-прототип (Лс без ПЭГ) исследовались на длительность нахождения указанных препаратов в кровяном русле мышей. Данные приведены на графике фиг.2. Липосомы как бы становятся невидимыми для клеток ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС). Приведенный график показывает, что время циркуляции стерически стабилизированных липосом (Лс с ПЭГ) увеличивается в 5 и более раз. Быстрое выведение стандартных липосом (Лс без ПЭГ) из крови связано с поглощением их ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) печени и селезенки. Это происходит вследствие взаимодействия липосом с белками плазмы - опсонинами (в основном, компонентами комплемента). Опсонины "метят" липосомы, делают их мишенями для клеток РЭС. Клетки РЭС не могут достичь поверхности стерически стабилизированных липосом (1) из-за избыточного осмотического давления в примембранном пространстве, создаваемом гибкими цепями (6) иммобилизованных полимеров ПЭГ.

Claims

1. Липосомальная нанокапсула с доксорубицином, представляющая собой полую сферу, образованную двухслойной липидной оболочкой из фосфотидилхолина и димиристоилфосфотидилглицерина, содержащую внешний и внутренний гидрофильные липидные слои, между которыми расположена гидрофобная область двухслойной липидной оболочки, причем нанокапсула дополнительно включает лактозу, распределенную во внешнем и внутреннем гидрофильных липидных слоях и внутреннем объеме сферы, и лекарственное средство доксорубицин, положительно заряженные молекулы которого расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев и прикреплены к отрицательно заряженным участкам молекул димиристоилфосфотидилглицерина, отличающаяся тем, что внутренний и внешний гидрофобные слои двухслойной липидной оболочки дополнительно содержат фосфотидилэтаноламин, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем 2000, причем гибкие гидрофильные цепи молекул полиэтиленгликоля расположены на поверхностях внешнего и внутреннего гидрофильных липидных слоев при следующем содержании всех компонентов липосомальной нанокапсулы, мг/мл:

Фосфотидилхолин 1,36-13,6

Димиристоилфосфотидилглицерин 1,19-11,9

Лактоза 25,0-200,0

с полиэтиленгликолем 2000 0,51-5,10

Доксорубицин 1,0-5,0

2. Липосомальная нанокапсула по п.1, отличающаяся тем, что двухслойная липидная оболочка дополнительно содержит холестерин и витамин Е при следующем содержании всех компонентов липосомальной нанокапсулы, мг/мл:

Фосфотидилхолин 1,36-13,6

Димиристоилфосфотидилглицерин 1,19-11,9

Холестерин 0,1-6,66

Лактоза 25,0-200,0

Витамин Е 0,1-0,75

с полиэтиленгликолем 2000 0,51-5,10

Доксорубицин 1,0-5,0