CN110237276B - 一种纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纳米粒及其制备方法和应用。本方案的纳米粒包括脂质体和位于脂质体内的液态氟碳，所述脂质体的脂质双分子层上附着有盐酸阿霉素。该纳米粒可以在超声激发下发生相变，从而实现了对纳米粒聚集情况的实时监测，也可控制纳米粒中的药物进行定点释放。本技术方案可以应用于盐酸阿霉素的药物传递系统的制备和乳腺癌等癌症的治疗中。

Description

一种纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride，DOX)为两亲性蒽环类抗生素，对机体可产生广泛的生物化学效应，且具有强烈的细胞毒性和遗传毒性。DOX的作用机制主要是DOX分子嵌入脱氧核糖核酸(de-oxyribonucleicacid，DNA)从而抑制遗传物质的合成，DOX作用于肿瘤细胞可抑制癌症细胞的增殖，并导致肿瘤细胞的凋亡或者坏死。在临床上DOX被广泛应用于急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌等恶性肿瘤的治疗，是一种一线癌症化疗药物。但DOX存在如下缺点：由于DOX的毒性较强，可导致骨髓抑制和心肌毒性等较为严重的不良反应；并且DOX在体内半衰期较短，容易在体内转运过程中失活。因此，药学工作者一直致力于寻找降低DOX毒性，增加DOX半衰期和降低DOX清除率的有效方法，如：调整给药方案、对DOX进行表面修饰等。

中国发明专利CN1562065A(盐酸阿霉素脂质体制剂及其制备方法)公开了一种使用脂质体包裹DOX的方案。用脂质体包裹DOX可以减少DOX对正常组织的毒性，特别是减少DOX对骨髓和心肌的毒性，并且能够防止DOX在体内运转过程中过早地失活。但上述技术方案仍然存在以下的技术问题：该技术方案中的包裹DOX的脂质体进入生物组织后，无法实现对DOX的组织分布和聚集情况的实时监测，也无法实现DOX从脂质体中在肿瘤组织处的定点释放。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米粒，该纳米粒可以在超声激发下发生相变，从而实现了对纳米粒和纳米粒中的药物的聚集情况的实时监测，也可控制纳米粒中的药物进行定点释放。

为解决上述技术问题，本发明技术方案提供了一种纳米粒，所述纳米粒包括脂质体和位于脂质体内的液态氟碳，所述脂质体的脂质双分子层上附着有盐酸阿霉素。

采用上述技术方案，技术原理为：将盐酸阿霉素(DOX)附着在脂质体的脂质双分子层上，再用脂质体包裹液态氟碳。低强度聚焦超声(LIFU)作用下，液态氟碳发生气化(即相变)，液态氟碳的相变引起的微爆破的作用还可以推动脂质体膜上的DOX进入细胞，加强DOX的肿瘤杀伤作用。并且液态氟碳气化可以增强超声成像，实现了对药物释放和药物聚集的监控。另外，本方案未直接将液态氟碳和DOX包裹在脂质体囊泡内，从而避免了液态氟碳和DOX混合，减少了液态氟碳相变对DOX的肿瘤抑制效果的影响。在本技术方案中，脂质体是指由脂质双分子层形成的空心囊泡。

有益效果：

现有技术使用脂质体直接对DOX进行包封，将DOX包裹在脂质体囊泡中，但是现有技术中的方法并不能实现对纳米粒聚集情况的实时监测和对药物定点释放的控制。发明人尝试在脂质体囊泡中添加了液态氟碳，但是，如果DOX和液态氟碳同时位于脂质体囊泡内，液态氟碳的相变和爆破作用会直接作用于DOX，会对DOX分子结构有一定影响，导致DOX的肿瘤杀伤作用减弱。另外，如果DOX和液态氟碳同时位于脂质体囊泡内，脂质体的脂质双分子层对DOX的释放也有一定的阻碍作用，使得DOX的释放效率变低。发明人于是放弃了将DOX包裹在脂质体中的方案，将DOX附着在脂质体的脂质双分子层上，再用脂质体的膜包裹液态氟碳。该方案避免了直接将液态氟碳和DOX在脂质体囊泡内混合，避免了液态氟碳的相变对DOX的肿瘤抑制效果的影响。另外，DOX附着在脂质体的膜上，减小了脂质体对DOX释放的抑制，液态氟碳的相变引起的微爆破的作用还可以推动脂质体膜上的DOX，促进DOX进入细胞，从而实现DOX对癌症细胞遗传物质的毒性作用。该方案也可实现DOX的定点释放和对药物释放、药物聚集的监控。一般认为DOX需被成面膜材料包裹才能实现增加体内停留时间和降低毒性的效果，发明人研究发现，将DOX附着在脂质双分子层上的技术方案也能同样解决上述问题。并且DOX附着在脂质双分子层上的技术方案结合脂质体包裹液态氟碳的技术方案，能够达到预料不到的技术效果(促进DOX释放，防止DOX失活等)。

综上所述，本技术方案有益效果为：

1.本技术方案中，脂质体包裹液态氟碳，液态氟碳在低强度聚焦超声(LIFU)作用下可发生相变，利用液态氟碳这一特性，可以实现DOX的定点释放和对DOX释放和聚集的监控；

2.本技术方案中纳米粒包括脂质体和位于脂质体内的液态氟碳，且脂质体的脂质双分子层上附着有DOX。该方案避免了液态氟碳与DOX直接接触，防止了液态氟碳相变对DOX的破坏作用，并且可利用液态氟碳相变增加DOX释放效率，增加DOX肿瘤杀伤效果。

进一步，所述脂质体的脂质双分子层由下列重量份的原料制成：氢化大豆卵磷脂5份、二棕榈酰磷脂酰甘油2份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺1.5份和胆固醇1.5份。

采用上述技术方案，使用上述重量份的原料制备脂质体，可形成稳定的且适宜于附着DOX和包裹液态氟碳的脂质体。

进一步，所述纳米粒的粒径为272.3-409.3nm。

采用上述技术方案，上述粒径的纳米粒，有较好的生物利用率，并能够较为高效的穿过血管壁抵达目的组织。

进一步，一种纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：将盐酸阿霉素、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇均溶于氯仿，得成膜液，减压蒸发所述成膜液，得干薄膜；

步骤(2)：在所述干薄膜中加入缓冲液，形成水化膜；

步骤(3)：对所述水化膜进行超声乳化，并同时在所述水化膜中滴加液态氟碳，经超声乳化后得纳米粒。

采用上述技术方案，技术原理为：

将氢化大豆卵磷脂等成膜材料溶于有机溶剂氯仿，然后使用减压蒸发掉有机溶剂氯仿，使成膜材料形成干薄膜。在本技术方案中，成膜材料为氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和胆固醇。除了在氯仿中加入成膜材料，还在氯仿中加入了抗癌药物DOX，DOX被附着在了干薄膜内。然后，使用缓冲液对干薄膜进行水化处理，使得HSPC分子和DPPG分子发生重新定向排列，形成脂质双分子层，DOX也附着在脂质双分子层中。最后，对水化膜进行超声乳化处理，在超声乳化的同时滴加液态氟碳，带有DOX的脂质双分子层包裹液态氟碳形成纳米粒，该纳米粒包括脂质体和位于脂质体内的液态氟碳，脂质体的磷脂双分子层上附着有DOX。在本技术方案中，脂质体是指由脂质双分子层形成的空心囊泡。HSPC和DPPG形成类似细胞膜的脂质双分子层结构。

有益效果：

为了将DOX附着在脂质体的膜上，发明人尝试了不同办法，因为如果DOX不能稳定附着在脂质体膜上，会导致DOX在非病灶组织提前脱离脂质体的脂质双分子层，不能实现DOX的定点释放以及对DOX释放的控制。在非病灶组织释放的DOX还会对正常组织产生毒性作用。发明人采用了HSPC作为成膜材料，可解决DOX不能稳定附着在脂质体的脂质双分子层上的问题。HSPC和DPPG可形成类似细胞膜的脂质双分子层结构，其中，HSPC具有较好的抗氧化能力、热稳定性和塑性。使用HSPC形成的脂质双分子层，脂质双分子层的流动性较弱，给DOX的附着提供更好地支撑。

另外，胆固醇分子为两性分子，其亲油性大于亲水性，胆固醇在脂质体制备中能提高脂质体的脂质双分子层的稳定性和进一步降低脂质双分子层的流动性。PEG-DSPE桥连于脂质双分子层上，可增强纳米粒外部的亲水性，避免纳米粒与血浆中的蛋白质或脂质结合，并抑制脂质体聚集，避免内质网对纳米粒的吞噬作用，进而增加纳米粒在血液中的循环时间。

综上所述，本技术方案的有益效果为：

1.由上述方法可以制得本方案的纳米粒，该纳米粒包括脂质体和位于脂质体内的液态氟碳，且脂质体的脂质双分子层上附着有DOX。该纳米粒具有可定点释放和可被监控的优点。将DOX直接与成膜材料混合，可使DOX附着在脂质体的脂质双分子层上。

2.使用HSPC作为成膜材料之一，可降低膜的流动性，增加DOX在脂质体膜上的附着稳定性。

3.胆固醇增加膜的稳定性和降低磷脂分子的流动性，使得DOX稳固附着在脂质体的双分子层上，避免DOX从脂质体上脱落。

4.PEG-DSPE抑制脂质体聚集，避免内质网对纳米粒的吞噬作用，进而增加纳米粒在血液中的循环时间,从而防止DOX在体内运转过程中过早地失活。

进一步，在步骤(1)中，将1重量份的盐酸阿霉素、3-20重量份的氢化大豆卵磷脂、1.2-8重量份的二棕榈酰磷脂酰甘油、0.8-6重量份的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和0.8-6重量份的胆固醇均溶于氯仿。

采用上述技术方案，采用上述重量比的原料可制备的稳定性较好的脂质体和具有较高DOX包封率的纳米粒。

进一步，在步骤(1)中，将1重量份的盐酸阿霉素、10重量份的氢化大豆卵磷脂、4重量份的二棕榈酰磷脂酰甘油、3重量份的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和3重量份的胆固醇均溶于氯仿。

采用上述技术方案，采用上述重量比的原料可制备的DOX包封率高的纳米粒，包封率可达85％以上。

进一步，在步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

采用上述技术方案，由于磷脂(在本方案中具体是HSPC)水化后，磷脂的头部会由于水化形成电离层。缓冲溶液的类型会对磷脂头部的电离层产生影响，从而影响到脂质体的稳定性。磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)可以在水化步骤中促进磷脂形成稳定的脂质体。

进一步，在步骤(3)中，对所述水化膜进行超声乳化的超声功率为100W，超声乳化的持续时间为8min。

采用上述技术方案，上述超声乳化功率和超声乳化时间可以保证纳米粒粒径均一，且粒径大小适合于进行体内药物传递。并且在上述超声乳化条件下，液态氟碳不会出现气化现象。

进一步，所述液态氟碳为全氟己烷。

采用上述技术方案，全氟己烷为常见的一种液态氟碳，易于获取，安全性较好。

进一步，一种纳米粒在治疗乳腺癌的药物中的应用。

采用上述技术方案，将载有DOX和液态氟碳的纳米粒应用到治疗腺癌的药物中，可加大乳腺癌的治疗效率。

附图说明

图1为实验例1的透射电镜图；

图2为实验例1的Lip-PFH-DOX纳米粒粒径分布图；

图3为实验例1的Lip-PFH-DOX纳米粒电位分布图；

图4为实验例2的Lip-PFH-DOX纳米粒体外药物释放曲线图；

图5为实验例3的CCK-8检测结果(使用空白纳米粒(Lip-PFH)与细胞孵育24h)；

图6为实验例3的CCK-8检测结果(使用空白纳米粒(Lip-PFH)与细胞孵育48h)；

图7为实验例3的CCK-8检测结果(使用载药纳米粒(Lip-PFH-DOX)与细胞孵育24h)；

图8为实验例3的CCK-8检测结果(使用载药纳米粒(Lip-PFH-DOX)与细胞孵育48h)；

图9为实验例4的流式细胞术检测结果图(使用空白纳米粒(Lip-PFH)与细胞孵育24h)；

图10为实验例4的流式细胞术检测结果图(使用空白纳米粒(Lip-PFH)与细胞孵育48h)；

图11为实验例4的流式细胞术检测结果图(使用载药纳米粒(Lip-PFH-DOX)与细胞孵育24h)；

图12为实验例4的流式细胞术检测结果图(使用载药纳米粒(Lip-PFH-DOX)与细胞孵育48h)；

图13为实验例5的体外超声显像图(超声辐照10min，超声功率3w)；

图14为实验例5的体外超声显像图(超声辐照10min，超声功率5w)；

图15为实验例5的体外超声显像图(超声辐照10min，超声功率10w)；

图16为实验例5的体内超声显像图(超声辐照10min，超声功率3w)；

图17为实验例5的体内超声显像图(超声辐照10min，超声功率5w)；

图18为实验例5的体内超声显像图(超声辐照10min，超声功率10w)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1：纳米粒的制备

1.主要试剂及仪器

氢化大豆卵磷脂(HSPC)，胆固醇，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000—DSPE)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)(以上均为日本油脂株式会社生产)，DOX(Sigma公司，美国)，cck-8试剂盒(TAKARA，日本)，Annexin-V/PI凋亡试剂盒(碧云天公司，上海)、全氟己烷(PFH，Sigma公司，美国)。

旋转蒸发器(RE-52A型，上海亚荣生化)，低功率聚焦超声(low intensityfocused ultrasound：LIFU)诊断仪(重庆医科大学影像研究所研制)，Z光粒径测量仪(etasizer Nano ZS90，Malvern)，紫外可见光分光光度计(UV2500UV-VIS，日本岛津公司)，高效液相色谱仪(TSP，美国)，百胜彩色超声诊断仪(Mylab90型，意大利)。

2.制备过程

步骤(1)：将DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE,胆固醇，按照质量比例(0.5:5:2:1.5:1.5)溶解在10ml氯仿中，将上述溶液装入圆底烧瓶，瓶口密封。其中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE和胆固醇的质量总和为10mg。待DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE,胆固醇完全溶解后，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪减压蒸发2h，蒸干氯仿，转速为80rpm。旋蒸结束后，圆底烧瓶底部形成均匀脂膜(即为干薄膜)。

步骤(2)：在圆底烧瓶里的干薄膜中加入磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)20ml，将圆底烧瓶置于恒温箱内缓慢振荡直至水化完全。

步骤(3)：在冰浴条件下，对水化的干薄膜进行声振乳化(超声功率100W，超声时间8min)，乳化过程中同时逐滴加入液态氟碳(具体为全氟己烷，PFH)10ml，超声乳化结束后，得到混悬液，混悬液中含有载药和液态氟碳的纳米粒(命名为：Lip-PFH-DOX)。该纳米粒(Lip-PFH-DOX)的特征和性质具体见实验例1。将制备而得的纳米粒Lip-PFH-DOX放置冰箱保存，以备后续实验使用。超声过程中，采用冰浴的方式，可防止滴加的PFH在超声乳化过程中发生气化。

实施例2

本实施例基本同实施例1，不同之处在于步骤(1)：将DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE,胆固醇，按照质量比例(0.5:5:2:1.5:1.5)溶解在10ml氯仿中，并将0.5ml司盘-85加入氯仿中，将上述溶液装入圆底烧瓶，瓶口密封。其中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE,胆固醇的质量总和为10mg。待DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE,胆固醇完全溶解后，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪减压蒸发2h蒸干氯仿，转速为80rpm。旋转蒸发操作结束后，圆底烧瓶底部形成均匀脂膜(即为干薄膜)。司盘-85是注射剂中常用的表面活性剂，但在本实施例中，不是利用司盘-85作为药物助悬剂的作用。司盘-85的加入可以提高DOX在脂质体上的包封率和稳定性(对包封率的解释和测试结果具体见实验例2)。发明人分析产生以上作用的原理如下：加入表面活性剂司盘-85，司盘-85的疏水基团可插入膜内，亲水基团伸入水相，可改变脂质体膜表面电荷分布情况，从而电荷的作用下对DOX分子产生更强的吸附作用。

实施例3

本实施例基本同实施例1，不同点在于，步骤(1)中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE和胆固醇的质量比为1.667:5:2:1.5:1.5。

实施例4

本实施例基本同实施例1，不同点在于，步骤(1)中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE和胆固醇的质量比为1:5:2:1.5:1.5。

实施例5

本实施例基本同实施例1，不同点在于，步骤(1)中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE和胆固醇的质量比为0.625:5:2:1.5:1.5。

实施例6

本实施例基本同实施例1，不同点在于，步骤(1)中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE和胆固醇的质量比为0.417:5:2:1.5:1.5。

实施例7

本实施例基本同实施例1，不同点在于，步骤(1)中，DOX,HSPC，DPPG，PEG2000—DSPE和胆固醇的质量比为0.25:5:2:1.5:1.5。

对比例1

本对比例基本同实施例1，不同点在于步骤(1)：将DOX,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，DPPG，PEG2000—DSPE,胆固醇，按照质量比例(0.5:5:2:1.5:1.5)溶解在10ml氯仿中，装入圆底烧瓶，瓶口密封。即：使用DSPE替代HSPC，其他步骤和参数均与实施例1相同。

实验例1：纳米粒的特征以及物理性质

将实施例1制备而得的纳米粒放置在10ml离心管，观察其有无聚集和沉淀生产。在透射电镜下观察纳米粒的形态，并用马尔文粒径仪测量该纳米粒的粒径和电位。

实施例1制备而得的Lip-PFH-DOX纳米粒，分散性好，在透射电镜下观察大小均一(图1)，外层可见黑色颗粒分布，即为附着的DOX。通过马尔文粒径仪测得该纳米粒的粒径约为272.3-409.3nm(图2)，电位值为10.04-25.36mV(图3)。

实验例2：包封率和体外药物释放

1.包封率：DOX的包封率是指被纳米粒(具体说是脂质体的脂质双分子层)吸附的DOX占DOX投入总量的百分数。绘制DOX溶液的吸光度标准曲线，通过标准曲线计算出包封率。用DOX对照品作标准曲线，取纳米悬液2ml，4℃条件下离心后取上清，用紫外分光光度计测量(最大吸收波长480nm)。其中，包封率(％)＝1-游离药物质量浓度/总质量浓度×100％。对实施例1-7和对比例1中制备的Lip-PFH-DOX纳米粒进行包封率检测。

不同比例的DOX和HSPC制备而成的Lip-PFH-DOX纳米粒有不同的包封率。当比例在1：10(DOX质量：HSPC质量)时，DOX的包封率达到最大值86.8±2.55％(见表1)。在步骤(2)中加入司盘-85(实施例2)可增加DOX的包封率，将HSPC替换为DSPE(对比例1)降低了DOX的包封率。

2.药物释放量：本实验共两个实验组，每组3个重复：(1)Lip-PFH-DOX组；(2)Lip-PFH-DOX+LIFU组。其中，LIFU为低强度聚焦超声，Lip-PFH-DOX纳米粒来源于实施例1。精密吸取Lip-PFH-DOX 2ml，置于透析袋中。分别吸取100ml葡萄糖溶液为外液进行体外药物释放实验，然后Lip-PFH-DOX+LIFU组给予超声辐照促进药物释放。分别在透析进行5h，24h,48h和72h后，取2ml透析外液。最后通过高效液相色谱法(HPLC)测定药物在不同时间点的释放率。

Lip-PFH-DOX纳米粒在超声波刺激下，可发生液气相变，球发生破裂，促进DOX从球内快速释放，到达定点释放效果。从图4中可见，Lip-PFH-DOX纳米粒在5h时DOX逐渐释放，48h后达到高峰。与Lip-PFH-DOX组相比，Lip-PFH-DOX+LIFU组释放率明显增高，证明了低强度聚焦超声对该纳米粒具有促进药物释放作用。

表1.各实施例、对比例的包封率对比

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

实施例6

实施例7

对比例1

包封率

86.80±2.55％

92.30±3.27％

42.40±2.59％

46.40±3.28％

67.40±3.28％

78.60±2.63％

74.21±2.63％

77.32±2.63％

实验例3：细胞毒性及增殖实验

体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，取对数期生长细胞接种于96孔板。细胞随机分成4组，即为：组(1)Lip-PFH纳米粒组，培养24h；组(2)Lip-PFH纳米粒组，培养48h；组(3)Lip-PFH-DOX纳米粒组，培养24h；组(4)Lip-PFH-DOX纳米粒组，培养48h。Lip-PFH-DOX纳米粒由实施例1的方法制备。Lip-PFH纳米粒是指，直接由脂质体包裹PFH，不将DOX附着在脂质体膜上，制备方法基本同实施例1，不同点在于实施例1的步骤(1)，在该步骤中不在氯仿中加入DOX。每组中均设有6个纳米粒的质量浓度梯度：0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,每个浓度梯度占5个孔。在接种细胞的次日加入不同纳米粒(Lip-PFH纳米粒和Lip-PFH-DOX纳米粒)0.2ml于孔板中，分别培养24h和48h。PBS冲洗96孔板3次后，在每个孔中加入CCK-8试剂10μl，继续培养1h后于酶标仪测定在450nm处的吸光度。最后通过以下公式进行计算：

细胞存活率＝[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100％

实验结果如图5-8所示，其结果显示，当空白纳米粒(组(1)和组(2))的最大浓度达100μg/ml后，细胞存活率仍可达98％，表明不包载DOX的空白纳米球的生物安全性好。当细胞与不同浓度的Lip-PFH-DOX纳米粒细胞孵育24h后，细胞存活率随Lip-PFH-DOX纳米粒浓度下降。尤其在组(4)，当浓度为100μg/ml时，存活率降低至50％左右，这表明包载了DOX的纳米粒对细胞仍有显著杀伤作用。

实验例4：细胞调亡实验

取对数期生长细胞，以1×10⁵个/孔接种于6孔板孵育。细胞随机分成4组，即为：组(1)Lip-PFH纳米粒组，培养24h；组(2)Lip-PFH纳米粒组，培养48h；组(3)Lip-PFH-DOX纳米粒组，培养24h；组(4)Lip-PFH-DOX纳米粒组，培养48h。Lip-PFH-DOX纳米粒由实施例1的方法制备。Lip-PFH纳米粒是指，直接由脂质体包裹PFH，不将DOX附着在脂质体膜上，制备方法基本同实施例1，不同点在于实施例1的步骤(1)，在该步骤中不在氯仿中加入DOX。于接种的24h后,依照组别，分别向孔内加入0.2ml纳米粒(Lip-PFH或Lip-PFH-DOX，两种纳米粒的质量浓度均为10μg/ml)。细胞和纳米粒孵育24h或者48h后，PBS洗细胞，然后胰酶消化细胞后使用Annexin-V/PI凋亡试剂盒进行染色，最后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

结果如图9-12所示，组(1)和组(2)，细胞的凋亡数量极少，而在组(4)，48h后大量细胞发生凋亡，CCK-8细胞毒性实验结果相符，进一步验证了包载了DOX的脂质体(Lip-PFH-DOX纳米粒)可成功杀死肿瘤细胞。

实验例5：体内外增强超声显像实验

体外增强超声显像：称取一定量的琼脂，加入适量的脱气水，微波炉加热，搅拌至气泡消失，然后将EP管底部插入琼脂凝胶内并固定，待凝胶冷却凝固后取出EP管制得带孔的凝胶模型。向凝胶孔内加入200μl纳米粒(浓度0.01mg/ml)(Lip-PFH-DOX纳米粒由实施例1的方法制备)，随后使用不同能量的LIFU(3W,5W,10W三个LIFU能量梯度)辐照10min(工作5s,暂停5s，循环进行直至10min结束)，超声辐照后采集获得的超声图片。

实验结果如图13-15所示，Lip-PFH-DOX纳米粒在超声辐照作用下，可发生液气相变从而增强超声显影。通过采用不同能量的LIFU超声辐照发现，在3W时，超声辐照10min后纳米粒没有发生变化，因此在造影模式下没有超声信号；在5W时，有微弱信号产生；当能量达到10W，大量纳米粒发生相变，产生明显的超声信号。

体内增强超声显像：建立裸鼠人乳腺癌MDA-MB-231模型，经尾静脉注射200μl(浓度0.01mg/ml)的纳米粒(Lip-PFH-DOX纳米粒由实施例1的方法制备)，以一定强度的LIFU(3W,5W,10W三个LIFU能量梯度)辐照肿瘤部位10min促使纳米粒发生相变，观察肿瘤部位超声成像增强情况。

结果如图16-18所示，通过尾静脉注射该纳米粒后，在肿瘤上方采用LIFU超声刺激，同时观察肿瘤内部超声信号的变化。结果表明，注射进入体内的纳米粒在EPR作用下聚集于肿瘤区域，通过超声辐照，瘤内超声信号可明显增强。EPR作用即实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect)，实体瘤(一种肿瘤)相对于正常组织，某些尺寸的分子或颗粒更趋向于聚集在肿瘤组织中。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种纳米粒，其特征在于，所述纳米粒包括脂质体和位于脂质体内的液态氟碳，所述脂质体的脂质双分子层上附着有盐酸阿霉素，所述脂质体的脂质双分子层的原材料由氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇组成；

所述纳米粒由如下方法制备：

步骤（1）：将盐酸阿霉素、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇均溶于氯仿，得成膜液，减压蒸发所述成膜液，得干薄膜；

步骤（2）：在所述干薄膜中加入缓冲液，形成水化膜；

步骤（3）：对所述水化膜进行超声乳化，并同时在所述水化膜中滴加液态氟碳，经超声乳化后得纳米粒；

在步骤（1）中，将1重量份的盐酸阿霉素、10重量份的氢化大豆卵磷脂、4重量份的二棕榈酰磷脂酰甘油、3重量份的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和3重量份的胆固醇均溶于氯仿。

2.根据权利要求1所述的一种纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的粒径为272.3-409.3nm。

3.根据权利要求2所述的一种纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）：将盐酸阿霉素、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和胆固醇均溶于氯仿，得成膜液，减压蒸发所述成膜液，得干薄膜；

步骤（2）：在所述干薄膜中加入缓冲液，形成水化膜；

步骤（3）：对所述水化膜进行超声乳化，并同时在所述水化膜中滴加液态氟碳，经超声乳化后得纳米粒。

4.根据权利要求3所述的一种纳米粒的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，将1重量份的盐酸阿霉素、10重量份的氢化大豆卵磷脂、4重量份的二棕榈酰磷脂酰甘油、3重量份的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和3重量份的胆固醇均溶于氯仿。

5.根据权利要求3所述的一种纳米粒的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求3所述的一种纳米粒的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，对所述水化膜进行超声乳化的超声功率为100W，超声乳化的持续时间为8min。

7.根据权利要求6所述的一种纳米粒的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述液态氟碳为全氟己烷。

8.根据权利要求1或2所述的纳米粒在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

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