RU2805084C1 - Способ получения гиалуроновой кислоты - Google Patents
Способ получения гиалуроновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2805084C1 RU2805084C1 RU2023107871A RU2023107871A RU2805084C1 RU 2805084 C1 RU2805084 C1 RU 2805084C1 RU 2023107871 A RU2023107871 A RU 2023107871A RU 2023107871 A RU2023107871 A RU 2023107871A RU 2805084 C1 RU2805084 C1 RU 2805084C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- precipitate
- hyaluronic acid
- minutes
- centrifugation
- raw material
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты, применяемой в медицине, косметологии и в ветеринарии. Предложен способ получения гиалуроновой кислоты. Обескровленные и промытые водой петушиные гребни или пупочные канатики гомогенизируют, затем проводят экстракцию сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90°C и соотношении сырье:физиологический раствор 1:5. Далее осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием, замораживают до -20-(-40)°C и выдерживают в течение 5 часов. Затем заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, нагревают до 80-90°C и выдерживают 15 мин при заданной температуре, осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, надосадочную жидкость сохраняют. С осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором. Полученную таким образом надосадочную жидкость объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед./мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков. Далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90°C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют. Изобретение позволяет увеличить выход гиалуроновой кислоты до 5,6% к исходной массе сырья и получить препарат недеполимеризованной и свободной от белков гиалуроновой кислоты с содержанием целевого вещества не менее 94%. 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к биохимическому способу получения гиалуроновой кислоты, применяемой в медицине, косметологии и в ветеринарии.
Известен способ получения гиалуроновой кислоты [Патент РФ № 2186786], включающий обескровливание петушиных гребней этиловым спиртом в соотношении 1:2, измельчение, водную экстракцию, отделение водной фракции, осаждение целевого продукта этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой продукта, отличающийся тем, что на стадии водной экстракции проводят обработку сырья раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50 °С и рН 6,8-7,0. Недостатком данного способа является низкий выход гиалуроновой кислоты и использование большого количества этанола и коллагеназы, имеющих высокую стоимость, что значительно удорожает конечный продукт.
Известен способ получения гиалуроновой кислоты [Патент РФ № 2115662], включающий обескровливание, промывание водой и гомогенизацию сырья с его дальнейшим пятикратным замораживанием до -20- -70 °C и экстракцией водой 95-100 °C в течение 15 минут с последующим объединением экстрактов, осаждением гиалуроновой кислоты при добавлении уксусной кислоты и лиофильной сушкой. К недостаткам способа можно отнести отсутствие стадии удаления белков и, как следствие, получение гиалуроновой кислоты в комплексе с ними. Помимо этого довольно продолжительная инкубация гиалуроновой кислоты при температуре близкой к 100 °С приводит к необратимым изменениям её конформации и деполимеризации.
Выбранный в качестве наиболее близкого аналога-прототипа способ получения гиалуроновой кислоты [Патент РФ № 2102400] предусматривает экстракцию измельченных петушиных гребней и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что проводят двухстадийную экстракцию сырья физиологическим раствором при 80-90 °С, экстракты объединяют, гиалуроновую кислоту осаждают 1-2%-ным водным раствором уксусной кислоты, осадок заливают дистиллированной водой, подщелачивают раствором едкого натра, нагревают до 80-90 °С, полученный раствор фильтруют, фильтрат лиофилизируют. Авторы указывают, что намеренно исключают стадию отделения белка, поскольку гиалуроновая кислота в комплексе с белками обладает большей стабильностью. Это действительно так, но присутствие белков значительно повышает вероятность появления аллергий при использовании препарата, полученного этим способом, в косметологии. Кроме того, недостатком способа является невысокий выход гиалуроновой кислоты.
Таким образом, технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа выделения гиалуроновой кислоты, позволяющего добиться высокого выхода не деполимеризованной и свободной от белков гиалуроновой кислоты.
Для решения поставленной технической задачи предложен способ получения гиалуроновой кислоты, характеризующийся тем, что обескровленные и промытые водой петушиные гребни или пупочные канатики гомогенизируют, затем проводят экстракцию сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90 °C и соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, далее осадок отделяют фильтрованием или центрифугированиеми, замораживают до -20 - -40 °C и выдерживают в течение 5 часов, затем заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, нагревают до 80-90 °C и выдерживают 15 мин при заданной температуре, осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, надосадочную жидкость сохраняют, а с осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором, полученную таким образом надосадочную жидкость объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед/мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков, далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90 °C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют.
Способ получения гиалуроновой кислоты осуществляется следующим образом.
Обескровленные петушиные гребни или пупочные канатики промывают проточной водой и гомогенизируют.
Затем проводят экстракцию полученного сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90 °C при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5.
Полученный осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием и замораживают до -20 - -40 °C с выдержкой при указанной температуре в течение 5 часов, а надосадочную жидкость (экстракт) сохраняют.
Затем осадок вновь заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5 и нагревают до 80-90 °C и выдерживают 15 мин при заданной температуре. Осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, а надосадочную жидкость сохраняют. С осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором, полученную таким образом надосадочную жидкость (экстракт) объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед/мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков.
Далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90 °C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют.
Осуществление способа получения гиалуроновой кислоты подтверждается следующими примерами.
Пример 1. В качестве сырья используют петушиные гребни, которые промывают от загрязнений холодной водой, затем водой с температурой 50 °C.
0,5 кг отмытых от крови петушиных гребней измельчают в гомогенизаторе, заливают 2,5 л физиологического раствора, перемешивают и нагревают до 90 °С, затем выдерживают при этой температуре в течение 15 минут при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, экстракт сохраняют, а осадок замораживают при -40 °С в течение 5 часов. Процедуру экстракции физиологическим раствором и замораживания повторяют еще 4 раза при тех же параметрах. Получившиеся в результате экстракты объединяют, доводят фосфатным буфером рН до 7, прибавляют 150 мг трипсина и выдерживают 2 ч при 37 °С. После чего добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 50 мл, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. Осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0, нагревают до 80 °C, фильтруют, фильтрат лиофилизируют.
Получают 28 г гиалуроновой кислоты, что составляет 5,6 % от массы исходного сырья.
Пример 2. В качестве сырья используют пупочные канатики, которые промывают от загрязнений холодной водой, затем водой с температурой 50 °C.
0,5 кг отмытых от крови канатикорв измельчают в гомогенизаторе, заливают 2,5 л физиологического раствора, перемешивают и нагревают до 90 °С, затем выдерживают при этой температуре в течение 15 минут при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, экстракт сохраняют, а осадок замораживают при -40 °С в течение 5 часов. Процедуру экстракции физиологическим раствором и замораживания повторяют еще 4 раза при тех же параметрах. Получившиеся в результате экстракты объединяют, доводят фосфатным буфером рН до 7, прибавляют 150 мг трипсина и выдерживают 2 ч при 37 °С. После чего добавляют 1%-ный раствор уксусной кислоты в количестве 50 мл, оставляют до полного формирования осадка, надосадочную жидкость удаляют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. Осадок заливают 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивают и раствором едкого натра доводят pH до значения 7,0 нагревают до 80 °C, фильтруют, фильтрат лиофилизируют.
Получают 25 г гиалуроновой кислоты, что составляет 5,0 % от массы исходного сырья.
В табл. 1 и 2 представлены характеристики заявляемого способа в сравнении с прототипом и полученной гиалуроновой кислоты.
Как видно из табл. 1, 2, получаемый по предлагаемому способу препарат не содержит белков, а его выход относительно исходной массы сырья увеличен, что говорит о большей экономической целесообразности и применимости конечного продукта в косметологии вследствие отсутствия белков-аллергенов, по сравнению с гиалуроновой кислотой, получаемой по способу-прототипу.
Таблица 1 Характеристики заявляемого способа в сравнении с прототипом |
||
Характеристики | Известный способ (прототип) | Предлагаемый способ |
Выход гиалуроновой кислоты, % к исходной массе сырья | 3,5-4,8 | 5,0-5,6 |
Содержание белка, % | 0,4-0,5 | не более 0,05 |
Содержание нуклеиновых кислот, мкг/мл | следы | следы |
Содержание основного вещества | не менее 90 | не менее 94 |
Таблица 2 Характеристика гиалуроновой кислоты, получаемой предлагаемым способом |
|
Наименование показателя | Значение показателя |
Внешний вид | Сублимированный порошок |
Цвет | Светло-кремовый |
Растворимость | Растворяется в воде при нагревании не менее 60 °С |
Содержание основного вещества, % | не менее 94 |
рН 0,5% водного раствора при 20-25 °С | 7,0±0,2 |
Массовая доля влаги, % | не более 6 |
Токсичность | не токсичен |
Содержание белка, % | не более 0,05 |
Содержание нуклеиновых кислот, мкг/мл | следы |
Осуществление предлагаемого способа позволяет увеличить выход гиалуроновой до 5,6% к исходной массе сырья и получить препарат не деполимеризованной и свободной от белков гиалуроновой кислоты, с содержанием целевого вещества не менее 94%.
Claims (1)
- Способ получения гиалуроновой кислоты, характеризующийся тем, что обескровленные и промытые водой петушиные гребни или пупочные канатики гомогенизируют, затем проводят экстракцию сырья физиологическим раствором в течение 15 мин при 80-90°C и соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, далее осадок отделяют фильтрованием или центрифугированиеми, замораживают до -20–(-40)°C и выдерживают в течение 5 часов, затем заливают физиологическим раствором при соотношении сырье:физиологический раствор 1:5, нагревают до 80-90°C и выдерживают 15 мин при заданной температуре, осадок вновь отделяют фильтрованием или центрифугированием, надосадочную жидкость сохраняют, а с осадком еще три раза повторяют процедуру замораживания - экстракции горячим физиологическим раствором, полученную таким образом надосадочную жидкость объединяют, добавляют фосфатный буфер до pH 7 и гидролизуют белок, содержащийся в экстракте, трипсином 250 USP ед./мг в течение 2 ч при 37°C в количестве 0,03% к начальной массе петушиных гребней или пупочных канатиков, далее гиалуроновую кислоту, освобожденную от белков, осаждают 1-2 об.% водным раствором уксусной кислоты, выпавший осадок отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут, затем осадок растворяют в дистиллированной воде при соотношении осадок:вода 1:2 и нейтрализуют раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3, подогревают до 80-90°C и фильтруют, фильтрат замораживают и далее лиофилизируют.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2805084C1 true RU2805084C1 (ru) | 2023-10-11 |
Family
ID=
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2583096A (en) * | 1949-01-15 | 1952-01-22 | Searle & Co | Process for the production of high viscosity hyaluronic acid |
SU950735A1 (ru) * | 1980-10-28 | 1982-08-15 | Саратовский Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.Н.Г.Чернышевского | Способ получени гиалуроновой кислоты |
CN1082057A (zh) * | 1992-08-13 | 1994-02-16 | 汪建 | 一种制备化妆品用透明质酸的工艺 |
JP2510264B2 (ja) * | 1987-12-10 | 1996-06-26 | バイオマトリックス アイエヌシイ | ハイラン製剤および動物組織からの回収方法 |
US5589357A (en) * | 1993-06-30 | 1996-12-31 | Bristol-Myers Squibb Company | Milk protein partial hydrolysate and process for preparation thereof |
RU2102400C1 (ru) * | 1995-08-08 | 1998-01-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ получения гиалуроновой кислоты |
RU2114862C1 (ru) * | 1996-05-31 | 1998-07-10 | Воронежская государственная технологическая академия | Способ получения гиалуроновой кислоты |
RU2115662C1 (ru) * | 1997-07-21 | 1998-07-20 | Самойленко Игорь Иннокентьевич | Способ получения гиалуроновой кислоты |
RU2013119273A (ru) * | 2013-04-26 | 2014-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Институт системных биотехнологий" (ООО "Институт системных биотехнологий") | Способ получения гиалуроновой кислоты из куриных гребней |
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2583096A (en) * | 1949-01-15 | 1952-01-22 | Searle & Co | Process for the production of high viscosity hyaluronic acid |
SU950735A1 (ru) * | 1980-10-28 | 1982-08-15 | Саратовский Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.Н.Г.Чернышевского | Способ получени гиалуроновой кислоты |
JP2510264B2 (ja) * | 1987-12-10 | 1996-06-26 | バイオマトリックス アイエヌシイ | ハイラン製剤および動物組織からの回収方法 |
CN1082057A (zh) * | 1992-08-13 | 1994-02-16 | 汪建 | 一种制备化妆品用透明质酸的工艺 |
US5589357A (en) * | 1993-06-30 | 1996-12-31 | Bristol-Myers Squibb Company | Milk protein partial hydrolysate and process for preparation thereof |
RU2102400C1 (ru) * | 1995-08-08 | 1998-01-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ получения гиалуроновой кислоты |
RU2114862C1 (ru) * | 1996-05-31 | 1998-07-10 | Воронежская государственная технологическая академия | Способ получения гиалуроновой кислоты |
RU2115662C1 (ru) * | 1997-07-21 | 1998-07-20 | Самойленко Игорь Иннокентьевич | Способ получения гиалуроновой кислоты |
RU2013119273A (ru) * | 2013-04-26 | 2014-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Институт системных биотехнологий" (ООО "Институт системных биотехнологий") | Способ получения гиалуроновой кислоты из куриных гребней |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
AVIVA SHEIDLIN ET AL. "Evaluation of Hyaluronan from Different Sources: Streptococcus zooepidemicus, Rooster Comb, Bovine Vitreous, and Human Umbilical Cord", Biomacromolecules 2004, 5, 6, pp.2122-2127, Publication Date: October 15, 2004, https://doi.org/10.1021/bm0498427. МЕРКУЛОВА А.А. Вторичные ресурсы птицеперерабатывающего производства (гребни кур) как источник получения биологически активной субстанции гиалуроновой кислоты / А. А. Меркулова, А. И. Сапожникова // Инновационные решения в товароведении сырья, продукции и рециклинг вторичных ресурсов АПК: Материалы круглого стола, Москва, 24 апреля 2017 года. - Москва: ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина, 2017. - сс. 11-15. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5774999B2 (ja) | 水生動物からのコラーゲン抽出物 | |
US4108849A (en) | Process for extracting and processing glycoproteins, mucopolysaccharides and accompanying substances | |
EP2188315B1 (en) | Method of preparing fibre-containing pectin product and pectin products hereof | |
US6946551B2 (en) | Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane | |
US20040023923A1 (en) | Cold water soluble beta-glucan product and process for preparing the same | |
WO2001064756A1 (fr) | Sulfate de chondroitine tire du saumon | |
KR20220019275A (ko) | 식물성 콘드로이틴 설페이트 및 히알루론산에 대한 식물성 출발 물질의 확인 및 선별, 및 식품, 보충제, 의료 기기 또는 약물에 사용되는 성분을 수득하기 위한 이러한 식물성 출발 물질의 변환 | |
CN110538312A (zh) | 一种皮肤创伤修复软膏及其制备方法 | |
RU2403288C1 (ru) | Способ получения высокополимерной рнк из сухих пекарских дрожжей | |
RU2805084C1 (ru) | Способ получения гиалуроновой кислоты | |
KR101916759B1 (ko) | 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법 | |
KR101700927B1 (ko) | 고순도 마린콜라겐의 제조 방법 | |
CN100390203C (zh) | 在外科或治疗性治疗哺乳动物的方法中或在诊断方法中使用的高支化支链淀粉 | |
US2488565A (en) | Preparation of hyaluronidase | |
RU2621311C1 (ru) | Способ получения протеогликана | |
US1922484A (en) | Extracting oil from animal tissue and the lipoid substances by papain digestion | |
WO2023082523A1 (zh) | 一种提高罗非鱼头骨制备硫酸软骨素提取率的方法 | |
FI74475C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya, ur klebsiella pneumoniae extraherade glykoproteiner. | |
CN112143767B (zh) | 一种双齿围沙蚕蛋白源ace抑制肽的制作方法 | |
US20030166608A1 (en) | Polysaccharide products from durian: process for isolation and purification and their applications | |
CN115120618A (zh) | 具有改善免疫应答作用的软骨提取物、其制备方法及其用途 | |
RU2435862C1 (ru) | Способ получения высокополимерной рнк из отработанных пивных дрожжей | |
RU2562595C2 (ru) | Способ получения продукта, обладающего биологически активными свойствами, из голотурий | |
RU2563816C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора | |
US2099708A (en) | Therapeutic product and method of making same |