RU2804298C1 - Противолучевая композиция на основе хитино-глюканового комплекса гриба вешенки обыкновенной - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противолучевой композиции. Противолучевая композиция, содержащая хитино-глюкановый комплекс базидиального гриба Вешенки обыкновенной, сукцинат натрия и наполнитель - стеарат кальция, при следующем соотношении компонентов, мас.%: хитино-глюкановый комплекс базидиального гриба Вешенки обыкновенной 95,0-99,0; сукцинат натрия 0,9-2,5; стеарат кальция 0,1-4,1; причем хитино-глюкановый комплекс содержит смесь полисахаридов молекулярной массой 10-1000 кД, концентрация полисахаридов составляет 65-70 мас.%, в том числе бетаД-глюканов - 20-25 мас.%, остальное различные примеси - 5-15 мас.% и комплекс получен путем обработки грибного порошка Pleurotus ostreatus 80% водно-спиртовым раствором при температуре +76,0-78,0°С в течение 3 ч и удаления водно-спиртового раствора. Вышеописанная композиция предназначена для перорального введения, обладает противолучевой активностью, уменьшает выраженность миелосупрессивного эффекта. 3 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской радиологии и может быть использовано при развитии негативных состояний организма, вызванных как облучением, так и воздействием противоопухолевых химиопрепаратов.

Известные противолучевые средства (ПЛС) представлены различными классами химических веществ (Рождественский Л.М. Классификация противолучевых средств в аспекте их фармакологического сигнала и сопряженности со стадией развития лучевого поражения // Радиационная биология. Радиоэкология. 2017. Т.57, №2, с.117-135. DOI: 10.7868/S0869803117020126). Значительная часть этих веществ относится к химическим соединениям, использование которых для развития противолучевой защиты организма требует применения высоких доз, что индуцирует токсичные эффекты и, соответственно, не позволяет их использовать, в том числе, для снижения токсичности противоопухолевых химиопрепаратов. Поэтому актуален поиск таких соединений среди натуральных веществ или их метаболитов, а также их аналогов, полученных на основе химического или микробиологического синтеза или генно-инженерных технологий.

К группе веществ натурального происхождения относятся полипептиды, полисахариды, полинуклеотиды. К полипептидам относятся препараты, содержащие интерлейкин-1 (беталейкин), тромбопоэтин, флагеллин, к полисахаридам - хитозан в виде РС-10 и РС-11 (соли хитозана), транслам, полинуклеотидам - дезоксинат (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб.: Фолиант, 2008. 550 с.; Чертков К.С. Средства ранней терапии острой лучевой болезни. Радиационная медицина. Т. 1. Теоретические основы радиационной медицины / Под ред. акад. РАМН Л.А.Ильина. М.: ИздАТ, 2004. С. 728-739; Давыдова С.А., Трушина М.Н., Андрианова И.Е., Бутомо Н.В. и др. Итоги комиссионных испытаний препарата РС-10 как средства раннего лечения острой лучевой болезни. Избранные материалы “Бюллетеня радиационной медицины” / Под ред. Л.А.Ильина и А.С.Самойлова. Т. I. М.: ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им.А.И.Бурназяна ФМБА России, 2016. С.571-582). Достоинством этих препаратов, по сравнению с оксимодуляторами (аминотиолы, биогенные амины), является малая токсичность, недостатком - низкая противолучевая эффективность, а также инъекционный способ введения, снижающий комплаентность их применения в условиях пролонгированного лучевого воздействия.

Противолучевая активность этих веществ базируется на процессах восстановления клеток в системе иммуногемопоэза и активации ими толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors, TLR) (Dainiak N., Waselenko J.K., Armitage J.O. et al. The hematologist and radiation casualties // Hematology. 2003. V. 1. P. 473-496; O’Neill L.A.J., Dinarello C.A. The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: crucial receptors for inflammation and host defense Immunol Today. 2000. (5):206-9; Заморина С.А., Раев М.Б. Toll-подобные рецепторы - подъем по тревоге. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2016. 2: 15с. [Электронный ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2016-2/Articles/SAZ-2016-2.pdf); Рождественский Л.М. Интерлейкин-1 - центральный провоспалительный цитокин плейотропного действия в аспекте лечения лучевых поражений в эксперименте и клинике // Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2001. Т. 46. № 4. С. 5-11).

Сигнал от этих рецепторов передается на транскрипционные факторы, в частности, на ядерный фактор (NF-kB), стимулирующий гены, индуцирующие экспрессию белков-эффекторов, обеспечивающих противолучевую защиту. Реализация этого механизма активирует систему врожденного иммунитета, которая усиливает пролиферацию клеток гранулоцитарного и лимфоидного ряда, поддерживающих гомеостаз организма. Ведущим адаптационным механизмом врожденного иммунитета является феномен «тренированного иммунитета», действие которого основано на метилировании гистонов миелоидных клеток, модулирующих не только иммунную защиту, но и переключающих клеточный метаболизм на аэробный гликолиз (Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen L-S, Grzybek M, Grinenko T, e.a. Modulation of Myelopoiesis Progenitors is an Integral Component of Trained Immunity. Cell (2018) 172(1-2):147-61). В результате изменений клеточного метаболизма происходит повышение миелопоэза в костном мозге, что уменьшает эффект миелоабляции, вызванный, химиотерапевтическими средствами. Это означает, что вещества рассматриваемой группы могут использоваться для получения противолучевых композиций, а также композиций, снижающих токсичность противоопухолевых химиопрепаратов. Однако вещества этой группы, в основном, применяются для снижения лучевого воздействия.

Например, известно применение препарата неомилитан (Способ профилактики лучевого пневмонита: патент RU2469731, Российская Федерация, заявка RU2011133459, заявл. 09.08.2011, опубл. 20.12.2012), включающего 1,4; 1,6-α-D-глюкан, который содержит глюкозу - не менее 98% и белок - не более 1,5%, имеет молекулярную массу 2 МДа и получен из экстракта, образующегося при нагревании мидий в воде в течение 1,0-2,0 час при +90-95°С, с последующей его очисткой путем отделения примесей осаждением, диализом на полых волокнах и хроматографией на анионите. Это средство является наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению.

Недостатком этой формы препарата является ингаляционный путь его введения, снижающий комплаентность его применения, например, на фоне лучевой терапии, а также не известна эффективность его применения для уменьшения выраженности миелосупрессивного эффекта. Также к недостаткам вышеприведенного технического решения можно отнести сложность получения основного компонента, обусловленную необходимостью осуществления глубинного культивирования и других сложных технологических процессов.

Технической проблемой является разработка простой в получении композиции, которая при пероральном способе введения обладает противолучевой активностью, а также индуцирует процесс снижения гематологической токсичности при использовании противоопухолевых химиопрепаратов.

Технический результат состоит в обеспечении возможности перорального введения композиции при сохранении ее противолучевой активности и возможности ее применения для уменьшения выраженности миелосупрессивного эффекта.

Для решения этой задачи предлагается композиция для перорального введения, содержащая: хитино-глюкановый комплекс гриба Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus), содержащий бета-Д-глюканы; сукцинат натрия (соль янтарной кислоты) и вспомогательное вещество - стеарат кальция (технологический наполнитель) при следующем содержании компонентов, мас. %:

Название компонента	Концентрация, мас. %:
1. Хитино-глюкановый комплекс гриба Вешенки обыкновенной (бета-Д-глюканы). 2. Сукцинат натрия. 3. Наполнитель	95,0-99,0 0,9-2,5 0,1-4,1

В качестве технологического наполнителя может использоваться стеарат кальция. Это вспомогательное вещество обычно применяют для получения капсулированных форм препаратов. В качестве источника бета-Д-глюканов использовался хитино-глюкановый комплекс гриба Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus). Этот комплекс содержит в качестве активного ингредиента смесь полисахаридов молекулярной массой 10-1000 кД. Концентрация полисахаридов составляет 65-70 мас.%, в том числе, бета-Д-глюканов - 20-25 мас.%, остальное различные примеси -5-15 мас.%.

Содержащиеся в хитино-глюкановом комплексе бета-Д-глюканы являются типичными патоген-ассоциированными молекулярными структурами (pathogen-associated molecular patterns - PAMP), которые взаимодействуют с генетически детерминированными рецепторами (Дектин-1, CR3 и др.). В результате этого взаимодействия происходит активация системы врожденного иммунитета, важным механизмом которой является феномен «тренированного иммунитета», что, в совокупности, способствует восстановлению миелопоэза после лучевого воздействия и средств химиотерапии. В качестве вещества, обладающего оксимодулирующим эффектом, использовали соль янтарной кислоты, что усиливает противовоспалительное действие заявляемой композиции.

Заявляемую композицию получают следующим образом. Плодовые тела базидиального гриба Pleurotus ostreatus подвергают сушке и измельчению до получения однородного порошка. Для выделения хитино-глюканового комплекса полученный грибной порошок обрабатывают 80,0% водно-спиртовым раствором при температуре +76,0-78,0°С в течение 3 ч. После удаления водно-спиртового раствора с помощью фильтрации формируют хитино-глюкановый комплекс гриба в виде сухого порошка. Выход конечного продукта, содержащего хитино-глюкановый комплекс этого вида гриба, составляет 740,0 ± 10,0 г из 1000 г исходного грибного порошка. Далее, в порошок хитино-глюканового комплекса вносят сукцинат натрия и наполнитель (стеарат кальция). После перемешивания указанных компонентов получают заявляемую композицию следующего состава (% масс.): хитино-глюкановый комплекс гриба Вешенки обыкновенной - 95,0-99,0; сукцинат натрия - 0,9-2,5; стеарат кальция - 0,1-4,1.

Такой способ получения композиции является более простым по сравнению с методом, требующим осуществления глубинного культивирования и других сложных технологических процессов.

Проведенные эксперименты с предлагаемой композицией показали возможность ее перорального применения для снижения негативного влияния лучевых поражений организма и гематологической токсичности химиопрепаратов. Примеры, приведенные ниже, демонстрируют промышленное применение заявляемой композиции.

Заявляемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Оптимизация количественного состава компонентов заявляемой композиции на основе оценки экспрессии цитокинов G-CSF и IL-6 в крови экспериментальных животных.

Оптимизацию количественного состава компонентов заявляемой композиции проводили на основе оценки экспрессии колониестимулирующего фактора гранулоцитов G-CSF и стимулятора лейкоцитопоэза IL-6 в крови животных. Эти цитокины могут использоваться в качестве биомаркеров при определении потенциальной эффективности радиозащитных средств (V.I.Krivokrysenko, A.N.Shakhov, V.K. Singh et al. Identification of granulocyte colony-stimulating factor and interleukin-6 as candidate biomarkers of CBLB502 efficacy as a medical radiation countermeasure // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2012. - Vol. 343, N 2. - Р. 497-508).

Эксперименты проведены на 176 белых беспородных мышах-самцах массой тела 18-20 г, выращенных в питомнике «Рапполово» (Ленинградская область). Животных содержали в стандартных условиях вивария с соблюдением светового режима и свободным доступом к воде и пище. Для кормления использовали полноценный гранулированный комбикорм, кормление и уход за животными осуществляли в первой половине дня. Все необходимые манипуляции выполняли с соблюдением правил гуманного обращения с лабораторными животными, используемыми в научных целях (Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. - Санкт-Петербург: Rus-LASA «НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными», 2012.-48с.).

Критерии включения животных в исследование: клинически здоровые животные после карантина в течение 14 суток. Критерии исключения животных из исследования: признаки наличия заболеваний или иных повреждений.

Заявляемую композицию перорально однократно вводили мышам в дозе 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь). Введение композиции проводили с помощью атравматичного желудочного зонда. Через 24 ч после введения композиции в крови животных определяли концентрации цитокинов G-CSF и IL-6. Оценку концентраций цитокинов проводили с использованием системы мультиплексного анализа Luminex 200, Merck (Millipore, Sigma-Aldrich, Supelco), анализ данных - с использованием ПО Bio-Plex Manager 6.1.

Взятие крови у животных проводили после их анестезии путем декапитации. Анестезию животным проводили в/м введением золетила 100 в дозе 3,1 мг/кг (в объеме 0,5 мл), которую рассчитали с использованием коэффициентов пересчета доз в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под ред. Р.Х.Хабриева. М.: Медицина, 2005). План и результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Корреляционный анализ связи между медианными значениями концентраций цитокина G-CSF и концентрациями (мас.%) сукцината натрия демонстрирует наличие отрицательного статистически значимого коэффициента корреляции (r = -0,73; p<0,01). Это означает, что с увеличением в заявляемой композиции концентрации (мас.%) сукцината натрия концентрация цитокина G-CSF в крови животных уменьшаются. Корреляционный анализ связи между медианными значениями концентраций цитокина G-CSF и концентрациями (мас.%) хитино-глюканового комплекса демонстрирует наличие положительного статистически значимого коэффициента корреляции (r = 0,83; p<0,01). Это означает, что с увеличением в заявляемой композиции концентрации (мас.%) хитино-глюканового комплекса концентрация цитокина G-CSF в крови животных увеличивается.

Корреляционный анализ связи между медианными значениями концентраций цитокина IL-6 и концентрациями (мас.%) сукцината натрия демонстрирует наличие отрицательного статистически значимого коэффициента корреляции (r = -0,70; p<0,01). Это означает, что с увеличением в заявляемой композиции концентрации (мас.%) сукцината натрия концентрация цитокина IL-6 в крови животных уменьшаются. Корреляционный анализ связи между медианными значениями концентраций цитокина IL-6 и концентрациями (мас.%) хитино-глюканового комплекса демонстрирует наличие положительного статистически значимого коэффициента корреляции (r = 0,80; p<0,01). Это означает, что с увеличением в заявляемой композиции концентрации (мас.%) хитино-глюканового комплекса концентрация цитокина IL-6 в крови животных увеличивается.

Таким образом, область максимальных концентраций цитокинов G-CSF и IL-6 фиксируется в крови животных в результате перорального применения заявляемой композиции, содержащей концентрации хитино-глюканового комплекса 95-99% (мас.%) и концентрации сукцината натрия 0,9-2,5% (мас.%). При этом максимальные значения концентраций G-CSF и IL-6 составляют 1760-1810 и 11,64-15,01, пг/мл, соответственно. Полученные максимальные значения концентраций цитокинов G-CSF и IL-6 в крови животных при указанных соотношениях в заявляемой композиции хитино-глюканового комплекса и сукцината натрия следует считать оптимальными.

Таблица 1. Оптимизация компонентного состава заявляемой композиции.
Содержание компонентов в заявляемой композиции, мас.%			Медианные концентрации цитокинов в крови мышей после введения композиции через 24 ч
Сукцинат натрия	Хитино-глюкановый комплекс	Стеарат кальция	Ме (H25÷H75) G-CSF, пг/мл	Ме (H25÷H75) IL-6, пг/мл
0,00	0,00	0,00	375 (334÷445)	0,00
99,00	0,50	0,50	323 (243÷495)	0,00
98,00	1,00	1,00	360 (290÷521)	0,00
95,00	2,50	2,50	340 (120÷392)	0,00
85,00	10,00	5,0	351 (152÷417)	0,00
70,00	25,00	5,0	365 (143÷437)	0,00
65,00	30,00	5,0	359 (185÷517)	0,00
60,00	35,00	5,0	370 (228÷610)	0,00
55,00	40,00	5,0	380 (255÷671)	0,00
45,00	50,00	5,0	390 (302÷583)	0,10 (0÷0,55)
40,00	55,00	5,0	432 (142÷740)	0,32 (0÷0,65)
30,00	60,00	10,00	410 (150÷689)	0,30 (0÷0,60)
25,00	70,00	5,00	429 (132÷689)	0,43 (0,1÷0,89)
15,00	80,00	5,00	565 (267÷803)	1,92 (0,2÷4,10)
10,00	85,00	5,00	820 (390÷934)	1,60 (1,1÷3,70)
5,00	90,00	5,00	1244 (415÷1680)	10,70 (4,1÷25,40)
2,50	95,00	2,50	1760 (614÷2059)	11,64 (3,7÷24,30)
2,00	96,00	2,00	1810 (570÷3290)	14,30 (5,9÷21,30)
2,00	97,00	1,00	1832 (632÷2723)	14,50 (5,1÷26,10)
1,00	98,00	1,00	1846 (601÷3050)	15,01 (5,1÷26,10)
0,95	98,00	0,95	1805 (589÷2980)	13,92 (6,7÷19,50)
0,9	99,00	0,10	1790 (550÷3108)	14,20 (8,1÷22,70)

Пример 2. Оценка противолучевой эффективности заявляемой композиции.

Изучение противолучевого действия заявляемой композиции, содержащей оптимизированный интервал концентраций хитино-глюканового комплекса 95-99% (мас.%) и сукцината натрия 0,9-2,5% (мас.%), проводили на основе оценки 30-ти суточной выживаемости мышей в интервале дозы облучения 6,5-8,0 Гр. Эксперименты проведены на 180 белых беспородных мышах-самцах массой тела 18-20 г.

Заявляемую композицию в дозе 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь) вводили животным внутрижелудочно (в/ж) за 0,5 ч до облучения и через 2 ч после облучения в следующих дозах: 6,5; 7,0; 7,5 и 8,0 Гр. Эту композицию применяли виде водного раствора, приготовленного ex tempore, который однократно в/ж вводили животным с помощью атравматичного желудочного зонда из расчета 0,5 мл / 20 г массы тела мыши.

Расчет средней смертельной дозы излучения проводили методом пробит-анализа по D. Finney (1985) [Finney DJ. The median lethal dose and its estimation. Arch Toxicol. 1985; 56(4):215-8. doi: 10.1007/BF00295156]. Облучение животных проводили с использованием рентгенотерапевтической установки РУМ-17 с мощностью дозы 0,328 Гр/мин в направлении спина - грудь с кожно-фокусным расстоянием 50,0 см. Одновременно облучали по 12-15 особей из разных групп, которых помещали радиально головой к центру в специальные пластиковые контейнеры. Результаты исследования представлены на фиг. 1. частности, на Фиг.1. показано влияние заявляемой композиции в пероральной (в/ж) дозе 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь) на 30-суточную выживаемость мышей после общего острого рентгеновского облучения в дозе: 6,5; 7,0; 7,5 и 8,0 Гр. Примечания к фигуре:* - отличия статистически значимы по сравнению с группой «облучение» (контроль), р<0,05; ** - то же, р < 0,01 (критерий Лог-Ранка).

Гибель облученных животных на 30-сутки эксперимента показывает, что наиболее значимое радиозащитное действие заявляемой композиции наблюдается при ее профилактическом применении (за 0,5 ч до облучения животных). По сравнению с группой контроля, этот способ применения заявляемой композиции приводит к статистически значимому (р<0,05) повышению выживаемости животных на 30-сутки наблюдения при дозах облучения: 7,0; 7,5 и 8,0 Гр. При этой схеме применения композиции и дозах облучения 7,0 и 7,5 Гр выживаемость животных, по сравнению с контрольной группой, увеличивается в 2,0 и 3,0 раза, соответственно. Применение заявляемой композиции по терапевтической схеме (через 2,0 ч после облучения животных) также демонстрирует статистическую достоверность (р<0,05) ее применения, по сравнению с группой контроля. При этом выживаемость животных на 30-сутки эксперимента при дозах облучения 7,0 и 7,5 Гр увеличивается в 2,0 и 1,5 раза, соответственно.

Таким образом, оценка противолучевой эффективности заявляемой композиции на модели острого лучевого синдрома у мышей, подвергнутых рентгеновскому облучению в дозах (6,5; 7,0; 7,5; 8,0 Гр) и пероральному однократному способу ее применения в дозе 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь), показала, что эта композиция обладает противолучевым защитным действием, повышая продолжительность жизни летально облученных животных. Применение заявляемой композиции для профилактических целей имеет более выраженный радиозащитный эффект, чем ее использование в качестве средства терапии лучевых поражений, что свидетельствует необходимости дальнейшей оптимизации терапевтической схемы ее применения.

Пример 3. Оценка влияния заявляемой композиции на количество эндогенных колониеобразующих единиц на селезенке облученных животных.

Одним из методических подходов, оценивающих состояние кроветворной системы организма в условиях радиационного воздействия, является определение жизнеспособности гемопоэтических клеток-предшественников. Для оценки жизнеспособности этих клеток был использован тест эндогенного колониеобразования по J.E.Till, E.A. McCulloch, 1961 [Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 1961;14:213-22] в модификации Н.В.Бутомо, 1992 [Практикум по военной токсикологии, радиобиологии и медицинской защите: ч. 1. Военная радиобиология / под ред. проф. Н.В.Бутомо и проф. Г.А.Софронова. СПб., 1992., 100 с.]. Тест основан на подсчете количества эндогенных колониеобразующих единиц на селезенке (эндогенные КОЕ-с) на 9 сутки после облучения. Образование эндогенных КОЕ-с, способствующих восстановлению пула клеток крови путем экстрамедуллярного гемопоэза, происходит в результате заселения стволовых клеток костного мозга в селезенки мышей, выживших после облучения.

Эксперимент проводили при облучении двух групп мышей в дозе 7,8 Гр. Животным контрольной группы (1) с профилактической целью не вводили в/ж заявляемую композицию, содержащую хитино-глюкановый комплекс 95-99% (мас.%) и сукцинат натрия 0,9-2,5% (мас.%). Животным опытной группы (2) с профилактической целью вводили в/ж заявляемую композицию, содержащую указанные компоненты. Доза однократного введения заявляемой композиции составляла 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь). На 9-е сутки после облучения селезенки мышей двух групп заливали свежеприготовленной жидкостью Буэна (насыщенный 1,2% раствор пикриновой кислоты, концентрированный формальдегид (35-40%), ледяная уксусная кислота) в соотношении 15:5:1. Через 24 ч под бинокулярной лупой на свободной поверхности селезенки подсчитывали количество эндогенных колоний. Оценку статистической достоверности между значениями эндогенных КОЕ-с в исследуемых группах животных проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Результаты эксперимента представлены на фиг.2. В частности, на фиг.2. показано Количество эндогенных селезеночных колоний (ось ординат) на 9 сутки после облучения у мышей без в/ж введения заявляемой композиции (1) и с в/ж введением заявляемой композиции (2) с профилактической целью. Критерий Манна-Уитни (р = 0,024).

Результаты эксперимента на фиг.2 показывают, что на 9 сутки после облучения у животных контрольной группы (1) происходит снижение количества эндогенных селезеночных КОЕ, а у животных опытной группы (2) наблюдается статистически значимое повышение этого параметра (р<0,05). Это свидетельствует о том, что профилактическое применение заявляемой композиции стимулирует процессы гемопоэза, одним из механизмов которого является формирование эндогенных селезеночных колоний при заселении выживших после облучения гемопоэтических стволовых клеток, мигрировавших из костного мозга. Процесс формирования эндогенных селезеночных колоний у облученных животных демонстрирует оптимизирующее действие заявляемой композиции на периферический орган кроветворения - селезенку, что также свидетельствует о возможности ее применения в качестве противолучевого средства.

Пример 3. Влияние заявляемой композиции на количество клеток костного мозга у мышей после лучевого воздействия.

При костномозговой форме острой лучевой болезни критической системой для исхода лучевого поражения является костный мозг, степень поражения которого во многом определяет дальнейшую судьбу облученного организма. В связи с этим, оценка функционального состояния костного мозга облученных мышей была проведена в различные сроки после облучения животных в дозе 7,0 Гр.

Животным контрольной группы (1) с профилактической целью не вводили в/ж заявляемую композицию. Животным опытной группы (2) с профилактической целью вводили в/ж заявляемую композицию. Доза однократного введения заявляемой композиции составляла 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь). Количественную оценку клеток миелокариоцитов проводили в костном мозге бедренных костей животных [Иммунология: практикум. Учеб. пособие / под ред. Л.В. Ковальчук и др. СПб., 2010. 176 с.]. Костный мозг из бедренных костей животных вымывали охлажденной до +0,0-2,0°С среды 199 в бюксы, после чего многократно промывали костномозговой канал до, практически, полного удаления клеток. Полученную суспензию клеток гомогенизировали с помощью магнитной мешалки. Количество ядерных клеток подсчитывали в камере Горяева. Результаты исследования представлены на фиг.3. В частности, на фиг.3 показано количество миелокариоцитов (n) в костном мозге мышей, n×10⁶/бедро, после острого облучения в дозе 7,0 Гр. 1 - контрольная группа. 2 - опытная группа. Примечания к фигуре: * - отличия статистически значимы в сравнении с исходным значением, р<0,05; ** - то же, р<0,005; # - отличия статистически значимы в сравнении с группой «контроль»,р<0,05; # # - то же, р<0,005. Критерий Манна-Уитни, (р=0,028; p=0,027).

Результаты на фиг.3 демонстрируют, что воздействие рентгеновского излучения в двух группах животных (1, 2) через 24 ч приводит к быстрому снижению миелокариоцитов до 40,0-50,0% относительно их исходного уровня. Однако на 3 и 5 сутки после облучения наблюдается значительное увеличение числа миелокариоцитов в костном мозге бедренных костей мышей, которым с профилактической целью однократно в/ж вводили заявляемую композицию. Медианные значения миелокариоцитов (Ме (Н25; Н75)) в этой группе животных составили 104,6 (76,5; 105,0)×10⁶/бедро и 107,5 (103,0; 108,5)×10⁶/бедро, соответственно.

У облученных животных, которым с профилактической целью не вводили в/ж заявляемую композиции на 3 и 5 сутки после облучения значительного увеличения числа миелокариоцитов в костном мозге бедренных костей не происходит. Медианные значения миелокариоцитов (Ме (Н25; Н75)) в этой группе животных составили 35,7 (28,7; 41,5)×10⁶/бедро и 72,5 (36,3; 73,8)×10⁶/бедро, соответственно. Статистические различия полученных значений миеклокариоцитов между группами, а также относительно их исходных значений достоверны (p>0,05).

Таким образом, однократное профилактическое в/ж применение заявляемой композиции стимулирует восстановление костномозгового кроветворения в период после лучевого воздействия, что свидетельствует о ее гемостимулирующей активности и возможности ее применения в качестве радиопротекторного средства.

Пример 4. Влияние заявляемой композиции на содержание лейкоцитов в периферической крови мышей после введения цитостатика.

Исследование влияния заявляемой композиции на гематологические показатели периферической крови проведены на модели лейкопении у мышей, вызванной 5-фторурацилом (5-ФУ). Доза для внутрибрюшинного (в/б) введения 5-ФУ составляла 150,0 мг/кг. Доза заявляемой композиции для в/ж введения составляла 500 мг/кг (~10,0 мг/мышь). В эксперименте использовали здоровых мышей линии С57Вl/6 весом 20-22 г. Измерения количества лейкоцитов в периферической крови животных проводили на гематологическом анализаторе MicroCC-20Plus-Vet (High Technology, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Взятие крови у животных производили в вакуумные пробирки с антикоагулянтом.

Животным группы 1 заявляемую композицию вводили по следующей схеме: первое введение композиции проводили за 7 дней (-7) до в/б введения 5-ФУ; второе введение композиции осуществляли через 7 дней после ее первого введения и в этот же день животным в/б однократно вводили 5-ФУ (0). Животным группы (2) проводили только однократное в/б введение 5-ФУ (0). Определение количества лейкоцитов в крови животных указанных групп проводили в момент однократного введения 5-ФУ (0), на 1, 4 и 7 сутки после применения препаратов. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2. Значения количества лейкоцитов в периферической крови мышей после применения заявляемой композиции и 5-ФУ
Время наблюдения, сутки	Группа 1, лейкоциты, n×109/л, Ме (Н25; Н75)	Группа 2, лейкоциты, n×109/л, Ме (Н25; Н75)	Достоверность различий (p), критерий Манна-Уитни (MU)
0	10,2 (9,2; 10,8)	10,9 (8,4; 11,3)	>0,05
1	3,7 (3,3; 4,3)	3,2 (2,8; 4,1)	>0,05
4	6,8 (5,9; 7,1)	2,9 (2,6; 3,2)	<0,05
7	8,9 (8,3; 9,4)	6,3 (5,7; 6,5)	<0,05
Примечание: отличия статистически значимы между группами 1 и 2.

Результаты в таблице 2 демонстрируют, что при моделировании у животных состояния лейкопении с помощью в/б введения цитостатика 5-ФУ, вызывает значительное снижение количества лейкоцитов в периферической крови относительно их исходных значений у животных 2-х групп. При этом наиболее выраженное уменьшение количества лейкоцитов в крови в группах 1 и 2 происходит через 1 сутки после введения 5-ФУ, 3,7 (3,3; 4,3) и 3,2 (2,8; 4,1), соответственно. Однако, по сравнению с группой животных 2, у животных в группе 1 после применения цитостатика на 4 и 7 сутки наблюдается статистически значимая (p<0,05) динамика повышения уровня лейкоцитов, которая 7 суткам достигает, практически, исходных значений.

Таким образом, двукратное в/ж применение заявляемой композиции по, практически, лечебно-профилактической схеме, достоверно снижает гематологическую токсичность, вызванную цитостатическим препаратом, что подтверждает возможность ее использования в условиях противоопухолевой химиотерапии.

Claims (3)

1. Противолучевая композиция, содержащая хитино-глюкановый комплекс базидиального гриба Вешенки обыкновенной, сукцинат натрия и наполнитель - стеарат кальция, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
2. хитино-глюкановый комплекс базидиального гриба Вешенки обыкновенной 95,0-99,0 сукцинат натрия 0,9-2,5 стеарат кальция 0,1-4,1,
3. причем хитино-глюкановый комплекс содержит смесь полисахаридов молекулярной массой 10-1000 кД, концентрация полисахаридов составляет 65-70 мас.%, в том числе бетаД-глюканов - 20-25 мас.%, остальное различные примеси - 5-15 мас.% и комплекс получен путем обработки грибного порошка Pleurotus ostreatus 80% водно-спиртовым раствором при температуре +76,0-78,0°С в течение 3 ч и удаления водно-спиртового раствора.