RU2802463C1 - Гидроксамовые кислоты, производные 4-аминохиназолина, обладающие противоопухолевой активностью - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к производным 4-аминохиназолинов, имеющим в составе N-гидроксикарбоксамидный фрагмент, присоединенный к 4-аминохиназолину через метиленциклогексильный фрагмент. Соединения по изобретению представляют гидроксамовые кислоты, производные 4-аминохиназолина общей формулы (I), где R представляет собой водород или галоген. Технический результат - соединения по изобретения селективно ингибируют гистоновую деанетилазу изоформы 6 по сравнению с гистоновой деацетилазой 1, а также обладают антиангиогенными свойствами. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 11 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к производным 4-аминохиназолинам. и касается непосредственно новых производных 4-аминохиназолинов, имеющих в составе N-гидроксикарбоксамидный фрагмент, присоединенный к 4-аминохиназолину через метиленциклогексильный фрагмент. Заявляемые соединения могут использоваться в медицине для лечения ряда заболеваний посредством ингибирования гистоновых деацетилаз, например, при лечении онкологических и нейродегенеративных заболеваний. Заявляемые соединения селективно ингибируют гистоновую деацетилазу изоформы 6 по сравнению с гистоновой деацетилазой 1.

Гистоновые деацетилазы (HDAC) представляют собой большое семейство эпигенетических металлоферментов, которые участвуют в транскрипции и регуляции генов, пролиферации, дифференцировке, миграции и гибели клеток, а также в ангиогенезе. В частности, нарушения экспрессии HDAC связаны с развитием многих типов рака и нейродегенеративных заболеваний, что делает их интересными молекулярными мишенями для разработки новых эффективных лекарств и средств визуализации, которые облегчают раннюю диагностику этих заболеваний. Таким образом, их избирательное ингибирование или деградация являются основой для новых методов лечения [Не X., Hui Z., Xu L. et al. Eur J Med Chem. 2022. 227:113946]. Одним из основных классов ингибиторов HDAC являются гидроксамовые кислоты.

Транексамовая кислота [транс-4-(аминометил) циклогексанкарбоновой кислоты, циклокапрона] - это синтетическое производное аминокислоты лизина, ингибирующее фибринолиз за счет блокирования связывания L-лизина на участке молекулы плазминогена. Транексамовая кислота является клинически используемым ингибитором фибринолиза без признаков цитотоксичности (препарат Транексам®) [Svahn С.М., Merenyi F., Karison L. Tranexamic acid derivatives with enhanced absorption //Journal of medicinat chemistry. - 1986. - T. 29. - №. 4. - C. 448-453] и используется в составе фармацевтических композиций, которые полезны для лечения и/или профилактики микробных инфекций, роста опухолей, метастазирования и других патологических состояний, модулированных фактором, ингибирующим миграцию макрофагов (MIF) [US 9617212, C07D 209/246, A61K 3/4035, A6LX 3/5.377, A61K 45/06, A61K 39/00, 2017].

Также было замечено, что 4-(Аминометил)циклогексанкарбоксилатный фрагмент, входящий в состав транексамовой кислоты, добавляет липофильность веществам, что является предпосылкой для лучшего взаимодействия с такими органами, как печень. Например, накопление в печени радиофармпрепаратов с использованием транексамового линкера происходит значительно меньше [Gu S, Kim HK, Lee GH. Kang BS, Chang Y, Kim TJ. Gd-complexes of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) conjugates of tranexamates as a new class of blood-pool magnetic resonance imaging contrast agents. J Med Chem. 2011 Jan 13;54(1):143-52].

Транексамовый линкер используется в ряде PSMA-нацеленных фармпрепаратов, применяемых для визуализации и терапии рака простаты. Наиболее известный из данных препаратов - PSMA-617 [Benesova М., Bauder-Wust U., Schafer М., Klika K.D., Mier W., Haberkorn U., Kopka K., Eder M. Linker Modification Strategies To Control the Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)-Targeting and Pharmacokinetic Properties of DOTA-Conjugated PSMA Inhibitors, Journal of medicinal chemistry 59(5) (2016) 1761-75].

Транексамовая кислота была также предложена в виде фрагмента в составе расщепляемых in vivo сшивающих агентов (линкеров) для терапевтических конъюгатов в целях уменьшения побочных эффектов, удобства лечения и повышения эффективности лекарственных средств [US 2014294851 (А1), 2014-10-02.].

В известных исследованиях [Uesato S, Kitagawa М, Nagaoka Y, Maeda T, Kuwajima H, Yamori Т. Novel histone deacetylase inhibitors: N-hydroxycarboxamides possessing a terminal bicyclic aryl group. Bioorg Med Chem Lett. 2002 May 20; 12(10): 1347-9.] новых ингибиторов HDAC был синтезирован ряд N-гидроксикарбоксамидов с использованием транексамовой кислоты в качестве основного вещества, разработки позволили получить многообещающие соединения, которые проявляют значительную ингибирующую активность в отношении пролиферации раковых клеток и HDAC.

Известно также, что противоопухолевой активностью обладают соединения, содержащие метил-4-(аминометил)циклогексанкарбоксилатный фрагмент, например, метил 4-{[(6,7-диметокси-2-хлор-4-хинолинил)амино]метил}циклогексанкарбоксилат [WO 03055866, C07D 239/95, 2003].

Примеры соединений с присоединенными к 4-му положению хиназолинового фрагмента гидроксамовыми кислотами, являющихся двойными ингибиторами как HDAC, так и метилтрансферазы. описаны в опубликованной заявке США [US 2019322643, А61Р 35/00; C07D 401/12, 2019]. Гидроксаматная функция присоединена к хиназолиновому циклу через пиперидиновый фрагмент:

Ближайшими прототипами данного изобретения являются известные патенты [KR 102000035, C07D 239/94, 15.07.2019; WO 2013170757. C07D 239/94, 2013] в которых описаны гидроксамовые кислоты на основе 6-аминогексановой, 7-аминогептановой кислоты и 4-аминометилбензойной кислот, присоединенных к производным хиназолина по 4-му положению:

Представленные соединения заявлены в качестве ингибиторов HDAC и противоопухолевых агентов. Синтез аналогичных соединений описан также в других известных публикациях [Zhang Q. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2017. - Vol. 27. - P. 4885-4888; Hieu D.T. et al. Chemistry&Biodiversity. - 2018. Vol. 15, No 6. P.e 1800027].

Целью предлагаемого изобретения является расширение ассортимента лекарственных препаратов, которые могут использоваться в качестве ингибиторов гистондеацетилаз различных изоформ и применяться для лечения онкологических, нейродегенеративных и других заболеваний.

В целях создания более эффективных лекарственных препаратов нами предложены новые гидроксамовые килоты в качестве ингибиторов HDAC, селективных по отношению к HDAC6, на основе транексамовой кислоты, присоединенной к производным хиназолина по 4-му положению общей формулы:

где R представляет собой водород или галоген.

Также заявляемые соединения обладают антиангиогенными свойствами.

Предложенные соединения могут использоваться для лечения различных заболеваний, в том числе рака и нейродегенеративных заболеваний.

В качестве новых ингибиторов гистондеацетилаз предлагаются в частности следующие соединения:

N-гидрокси-4-((хиназолин-4-иламино)метил)циклогексанкарбоксамид

(соединение 1)

4-(((6-бромхиназолин-4-ил)амино)метил-N-гидроксициклогексанкарбоксамид (соединение 2)

Заявляемые соединения обладают цитотоксической активностью в микромолярном диапазоне на различных линиях опухолевых клеток. Активность соединений по отношению ферменту HDAC6 превышает или сравнима с активностью известного ингибитора гистондеацетилазы - Вориностата (SAHA), при этом необходимо отметить высокую селективность всех соединений к ферменту HDAC6 по сравнению с HDAC1. Заявляемые соединения также обладают высокой антиангиогенной активностью.

Ниже приводятся примеры осуществления изобретения.

Применяемые аналитические методы и оборудование.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Shimadzu. Колонка: Grom-Sil 12J ODS-4HE, 5 мкм, 250×4,6 мм. Условия: линейный градиент АВ: 5% В (0 мин) 100% В (20 мин). А - 0.01% ТФУ в воде, В - 0.01% ТФУ в ацетонитриле. Спектры ESI-MS регистрировали на приборе "Agilent LC/MS 1200" при ионизации пробы электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Пробы готовили в системе ацетонитрил/вода 1/1, концентрация 2 мг/мл. Условия анализа: поток 1 мл/мин, давление на нибулайзере 20 psi, температура 360°С, скорость потока осушающего газа 9 л/мин, напряжение 3500 В, целевая масса от 100 до 2000. Температуру плавления определяли на приборе марки "Melting Point М-565" (BUCHI). Спектры ЯМР ¹Н получены на Фурье ЯМР-спектрометре Bruker AVANCE III NanoBay 300 МГц (для ¹Н-ЯМР). Спектры регистрировали в режиме стабилизации по дейтерию, термостабилизация 25°С, внутренний стандарт - тетраметилсилан) в ДМСО-d6. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (δ), КССВ - в герцах. ТСХ проводили на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254, проявление в УФ и нингидрином.

Пример 1

Синтез 4-хлорхиназолина

В круглодонную колбу объемом 25 мл. снабженную обратным холодильником, загружают раствор хиназолин-4(3H)-она (731 мг, 5 ммоль) в тионилхлориде (10 мл) и каталитическое количество ДМФА (0.05 мл) и кипятят в течение 1 часа. Смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют серный эфир (50 мл), выпавшие кристаллы 4-хлорхиназолина отфильтровывают на фильтре Шотта и растворяют в хлороформе (30 мл), промывают водой (10 мл), 3%-ным раствором бикарбоната натрия (2×10 мл). Органический слой сушат над сульфатом натрия, упаривают в вакууме досуха. Получают 775 мг (94.2%) кристаллическое вещество белого цвета. Т. пл. 97.2 - 98.8°С. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 8.38 (s, 1Н), 8.12 (dd, J=7.6. 1.2, 1Н), 7.79 (t, J=8.0 1Н), 7.72 (d, J=7.9, 1Н), 7.54 (t, J=7.2, 1H).

Пример 2

Синтез 6-бром-4-хлорхиназолина

Получают аналогично Примеру 1 из 6-бромхиназолин-4(3H)-она (1125 мг, 5 ммоль). Получают 1.15 г (94.5%) кристаллическое вещество телесного цвета. Т.пл. 172.6-174.3°С. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц) 8.32 (s, 1Н) 8.26 (s, 1Н) 8.00 (dd, J=8.71, 2.38, 1Н) 7.67 (d, J=8.62, 1Н).

Пример 3

Синтез метил 4((хиназолин-4-ил)метил)циклогексанкарбоксилата

В колбу, снабженную магнитной мешалкой, обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, термометром и капельной воронкой загружают 4-хлорхиназолин (2.0 г. 0.012 моля, 1 экв.) в 10 мл хлороформа, а затем к полученному раствору при 20-25°С при интенсивном перемешивании прибавляют по каплям смесь гидрохлорида метил 4-(аминометил)циклогексанкарбоксилата (2.5 г, 0.012 моля, 1 экв.), триэтиламина (12.1 г, 0.120 моля, 10 экв.) в 5 мл хлороформа. Затем реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 часов. Степень превращения исходных реагентов контролируют методом тонкослойной хроматографии, элюент - хлороформ : метанол - 10:1. Выпавший бесцветный осадок (гидрохлорид триэтиламина) отфильтровывают и промывают его на фильтре 10 мл хлороформа. Объединенный фильтрат последовательно промывают 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора NaCl, 10 мл воды, высушивают сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Полученный остаток 3.4 г (карамель оранжевого цвета) разбавляют 15 мл холодного эфира, выпавший из раствора осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме. Получают 3.1 г (85%) метил 4((хиназолин-4-ил)метил)циклогексанкарбоксилата, порошок телесного цвета. Т.пл. 136-138°С. Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц): 8.65 (с, 1Н), 7.88 (д, J=8.42, Н), 7.75 (т, J=7.71, Н), 7.49 (т, J=7.71, Н), 6.43 (уш. с, 1Н), 3.67 (с, 3Н), 3.59 (т.2 Н, J=6.3), 2.37-2.23 (м, 1Н), 2.13-1.90 (м, 4Н), 1.87-1.69 (м, 1Н), 1.55-1.35 (м, 2Н), 1.20-1.02 (м, 2Н), Найдено, %: С, 68.02: Н, 6.96; N, 14.14. C₁₇H₂₁N₃O₂. Вычислено, %: С, 68.20: Н, 7.07; N, 14.04.

Пример 4

Синтез метил 4-(((6-бромхиназолин-4-ил)амино)метил)циклогексанкарбоксилата

Получают аналогично Примеру 3 из 6-бром-4-хлорхиназолина (1.21 г, 5 ммоля). Получают 1.5 г (79%) метил 4-(((6-бромхиназолин-4-ил)амино)метил)-циклогексанкарбоксилата порошок желтого цвета. Т.пл. 167-169°С Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц): 8.69 (д, J=2.2, 1Н), 8.56 (с, 1Н), 8.44 (т, J=5.5, 1Н), 7.91 (дд, J=8.8, 2.1, 1Н), 7.11 (д, J=8.9, 1Н), 3.69 (с, 3Н), 3.61 (т, 2Н, J=6.3), 2.38-2.23 (м, 1Н), 2.14-1.91 (м, 4Н), 1.87-1.69 (м, 1Н), 1.56-1.36 (м, 2Н), 1.20-1.01 (м, 2Н). Найдено. %: С, 68.02; Н, 6.96; N, 14.14. C₁₇H₂₁N₃O₂. Вычислено, %: С, 68.20; Н, 7.07: N, 14.04.

Пример 5

Синтез N-гидрокси-4-((хиназолин-4-иламино)метил)циклогексан-1-карбоксиамида (соединение 1)

К раствору метилата натрия (324 мг, 6 ммоль) в 10 мл сухого метанола добавляют мелкоизмельченного хлоргидрата гидроксиламина (270 мг, 4 ммоль), перемешивают 30 минут. Отфильтровывают осадок, к фильтрату прибавляют раствор метил 4-((хиназолин-4-ил)метил)-циклогексанкарбоксилата (301 мг, 1 ммоль) в 5 мл метанола, перемешивают при комнатной температуре 24 часа (контроль прохождения реакции по ТСХ до исчезновения исходного эфира, элюент хлороформ : метанол - 10:1). Упаривают в вакууме метанол, добавляют 5 мл воды, затем добавляют 5%-ный раствор уксусной кислоты до рН 6. Отфильтровывают выпавший осадок, сушат на воздухе, получают N-гидрокси-4-((хиназолин-4-иламино)метил)циклогексан-1-карбоксиамид (соединение 1) в виде кристаллов светло-бежевого цвета 282 мг (94.0%). Т.пл. 200-202°С

Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц): 10.33 (уш.с, 1Н), 8.62 (с, 1Н), 8.43 (с, 1Н), 8.32-8.20 (м, 2Н), 7.79-7.70 (м, 1Н), 7.66 (дд, J=8.3, 1.4. 1Н), 7.53-7.43 (м, 1Н), 3.39 (т, J=6.3, 2Н), 2.02-1.88 (м, 1Н), 1.82 (д, J=13.1 Hz, 2Н), 1.76-1.60 (м, 2Н), 1.46-1.26 (м, 2Н), 1.04-0.88 (м, 2Н). Найдено, %: С, 64.10; Н, 6.74; N, 18.64. C₁₆H₂₀N₄O₂. Вычислено, %: С, 63.98; Н, 6.71: N, 18.65. ESI-MS, m/z 301.0 [M+H]⁺.

Пример 6

Синтез 4-(((6-бромхиназолин-4-ил)амино)метил-N-гидроксициклогексанкарбоксамида (соединение 2)

Получают аналогично примеру 6 из метил из 378 мг, 1 ммоля 4-(((6-бромхиназолин-4-ил)амино)метил)циклогексанкарбоксилата. Получают 267 мг (91.5%) кристаллы бежевого цвета. Т.пл. 212°С (разл.). Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ м.д., J, Гц): 10.33 (уш.с, 1Н), 8.62 (с, 1Н), 8.59 (д, J=2.2, 1Н), 8.46 (с, 1Н), 8.33 (т, J=5.5, 1Н), 7.87 (дд, J=8.8. 2.1. 1Н), 7.61 (д, J=8.9, 1Н), 3.41-3.35 (м, 2Н), 2.01-1.87 (м, 1Н), 1.83 (д, J=12.6, 2Н), 1.68 (уш.д., J=12.7, 3Н), 1.46-1.27 (м, 2Н), 1.06-0.87 (м, 2Н). Найдено, %: С, 50.75; Н, 4.98; N, 14.73. C₁₆H₁₉BrN₄O₂. Вычислено. %: С, 50.67; Н, 5.05; N, 14.77, ESI-MS, m/z 379.8 [М+Н]⁺.

Пример 7

Определение цитотоксической активности

Цитотоксическую активность заявляемых соединений определяли с помощью МТТ-теста. Концентрацию полумаксимального ингибирования (IC₅₀) для синтезированных веществ определяли на клетках рака толстой кишки НТС-116, карциномы легкого А549, рака предстательной железы РС-3, рака молочной железы MCF-7, рака почки SN-12

Для проведения исследования клетки опухолевых линий человека были нанесены в 96-луночный культуральный планшет (10⁴ клеток в каждой лунке) и после 24 часов инкубации к клеткам были добавлены методом раститровки различные концентрации 14 исследуемых соединений в диапазоне 100±0.1 мкМ. В качестве контроля сравнения использовали препарат Вориностат (SAHA), являющийся гидроксамовой кислотой. Планшет с внесенными веществами помещали в CO₂-инкубатор на 72 часа. После инкубации вносили в каждую лунку по 20 мкл рабочего раствора МТТ. Инкубировали планшет 3 часа в CO₂-инкубаторе. После инкубации заменить в каждой лунке среду на 200 мкл ДМСО.

После растворения кристаллов формазана определяли оптическую плотность каждой лунки при 570 нм, вычитали измеренное фоновое поглощение при 620 нм с помощью планшетного фотометра. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (IC₅₀), определяли на основе дозозависимых кривых и/или с помощью программного обеспечения (например, GraphPad Pricm 5.0 или OriginPro 9.0). Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Пример 8

Исследование влияния производных гидроксамовых кислот на активность ферментов HDAC1 и HDAC6

Делают навески исследуемых веществ и приготовляют растворы с исходной концентрацией 5×10^-3 М в подходящем растворителе (вода, спирт, ДМСО). Приготовляют стоковые растворы исследуемых веществ в растворителе для получения концентрационной зависимости с учетом того, что конечная концентрация вещества в инкубационной среде меньше в 4 раза (50 мкл раствора вещества в 200 мкл конечного объема пробы). В качестве эталонных веществ использовался известный ингибитор гистондеацетилазы препарат Вориностат (SAHA).

Эксперимент выполнялся в 96-луночном планшете. Добавляют 50 мкл раствора исследуемых соединений в лунки планшета, согласно схеме соответствующего эксперимента.

Фермент HDAC разбавляют с использованием буфера HDAC-Glo™ до желаемой концентрации. Вносят 50 мкл фермента HDAC в каждую лунку 96-луночного планшета, где уже находятся растворы исследуемых соединений, полученные на предыдущей стадии. Оставляют не менее 3-х лунок без HDAC, для формирования буферного фона, не менее 3-х лунок с HDAC и растворителем, для получения максимального сигнала активности фермента.

Содержимое планшета перемешивают при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, используя орбитальный шейкер при 500-700 об/мин, чтобы обеспечить однородность.

Смесь фермент/исследуемое вещество инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут (но не более 2 часов).

Готовят реагент HDAC-Glo™: 10 мл буфера HDAC-Glo™ добавляют к субстрату HDAC-Glo и осторожно перемешивают. Затем в эту смесь добавляют 10 мкл реагента-проявителя и также осторожно перемешивают.

Равный объем реагента HDAC-Glo™ добавляют в каждую лунку планшета (100 мкл для 96-луночного).

Смешивают содержимое ячеек при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, используя орбитальный шейкер при 500-700 об/мин, чтобы обеспечить однородность. Затем содержимое инкубируют при комнатной температуре в течение 15-45 минут.

По истечению необходимого времени инкубации измеряют люминесценцию на многофункциональном планшетном анализаторе EnVicion.

Обработка полученных первичных данных, определение IC₅₀

Так как амплитуды кривых могут различаться от повторения к повторению, полученные абсолютные значения хемилюминесценции нормировали для каждого отдельного повторения. За нулевое значение брали минимальное измеренное значение внутри одной серии разведений, за 100% - максимальное достигнутое значение. Нормированные три повторения вместе аппроксимировали кривой у=у(х). задающейся формулой:

где, у - нормированная интенсивность люминесценции, х - десятичный логарифм концентрации исследуемого вещества.

Параметры Bottom, Top, HillSlope и lgIC₅₀ подбираются так, чтобы сумма квадратов отклонений экспериментальных точек от аппроксимирующей кривой была минимальна. Обработка данных выполнена с использованием пакета GraphPad Prism 6. Полученные значения IC₅₀ приведены в Таблице 2.

Пример 9

Определение способности блокирования миграционной активности опухолевых клеток

Возможность визуализировать клетки во время их миграции занимает важное место при изучении ингибирующего действия новых соединений in vitro. Анализ методом заживления раны имеет простой протокол и может применяться для большинства доступных типов клеток. Типичный анализ заживления ран измеряет миграцию клеток в рану (область без клеток), которая генерируется центральной тонкой линейной царапиной по всей поверхности плотного монослоя клеток. Созданная область раны стимулирует различные клеточные реакции, в основном коллективную миграцию клеток. Динамику миграции клеток к этому разрыву (заживление) или рост клеток по направлению к центру разрыва можно изучать количественно с использованием покадровой микроскопии.

Монослой клеток почечно-клеточного рака SN-12C во флаконах покрывают раствором Версена (3 мл на 25 см²). Флаконы инкубируют при 37°С, в течение 5 минут для снятия клеток с поверхности флакона. К клеткам добавляют полную среду DMEM и тщательно перемешивают при помощи серологических пипеток. Суспензию клеток помещают в пробирки на 15 мл и осаждают центрифугированием при 250g. После осаждения клеток удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют осадок клеток на шейкере. Полученную суспензию клеток разводят в полной среде DMEM и определяют содержание живых эндотелиальных клеток в суспензии в камере Горяева при окрашивании красителем Трипановым синим. Клетки SN-12C в концентрации 2×105 клеток/мл в объеме 4 мл полной среды DMEM вносят в лунки 6-луночного культурального планшета и инкубируют до образования монослоя в течение 24 часов. Затем монослой нарушают путем соскабливания части клеток по прямой (наконечником 200 мкл). Остатки клеток с края «царапины» удаляют путем однократной промывки клеток 2 мл среды DMEM. Готовят навеску объекта испытания. при помощи аналитических весов и разводят в ДМСО до концентрации раствора 50 мг/мл. Полученный раствор объекта испытания разводят в полной среде до исследуемых нецитотоксических концентраций и вносят в лунки планшета. В качестве положительного контроля используют клетки в полной среде DMEM. В качестве препаратов сравнения использовалит известные препараты Вориностат и Сунитиниб. После окончания инкубирования, планшеты промывают PBS дважды, окрашивают монослой клеток красителем трипановый синий и делают серию микрофотографий области раны на инвертированном микроскопе с фотоаппаратом. Результаты ингибирования миграционной активности оценивают как процент прироста мигрирующих клеток в опыте по отношению к интактному контролю (Таблица 2).

Пример 10

Определение влияния на инвазивный потенциал опухолевых клеток SN-12C

Анализы клеточной миграции через слой матриксных белков, проводимые в камерах с полупроницаемыми мембранами позволяют оценить инвазивный потенциал клеток и его ингибирование под действием производных гидроксамовых кислот. Клетки двигаются в ответ на хемотаксический градиент, вызванный добавлением сыворотки или других хемотаксические факторы в нижний отдел камеры.

Опухолевые клетки высеивали на поверхность полупроницаемой мембраны камеры Бойдена с 8 мкм порами, покрытой полимеризованным Матригелем (1,0 мг/мл), для имитации условий естественного микроокружения, которые позволяют только прохождение клеток к аттрактанту, размещенному в нижней камере.

Растворы объектов испытаний в нецитотоксической концентрации вносили в камеры Бойдена к суспензии опухолевых клеток. В нижнюю камеру вносли 700 мкл среды DMEM с 20% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). В качестве положительного контроля использовали клетки в среде DMEM без добавления испытуемого объекта. По истечении 24 ч инкубации клетки, фиксировали в 4% формалине, проводили пермеабилизацию клеток метанолом и окрашивали красителем Гимза. Результаты ингибирования инвазивного потенциала оценивали, как отношение количества клеток в опытных группах к интактному контролю (Таблица 2).

Пример 11

Определение влияния производных гидроксамовых кислот на способность опухолевых клеток формировать сосудистоподобные структуры (СПС)

Анализ формирования сосудистоподобные структур является одним из наиболее широко используемых анализов in vitro для моделирования стадии реорганизации ангиогенеза и тестирования новых ингибиторов ангиогенеза.

Для проведения исследования 24-луночный культуральный планшет покрывали Матригелем (8.7 мг/мл) и инкубировали 1 час при комнатной температуре для его полимеризации. Опухолевые клетки (5×10⁵ клеток/мл) инкубировали в культуральной среде с добавлением нецитотоксических концентраций испытуемых соединений в течение 30 минут при 37°С. Затем клетки наносили на лунки, покрытые Матригелем. и инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 16 часов. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубируемые в культуральной среде без добавления испытуемого соединения.

После окончания инкубации делали серию фотоснимков образовавшейся сети сосудоподобных структур при помощи цифровой фотокамеры и оценивали длину сосудоподобных структур из эндотелиальных или опухолевых клеток в составе замкнутой сети при помощи программы ImageJ v. 1.51 (NIH, США, freeware) или аналогичной (Таблица 2).

Гидроксамовые кислоты, производные 4-аминохинозалина, обладающие противоопухолевой активностью.

Claims (5)

1. Гидроксамовые кислоты, производные 4-аминохиназолина общей формулы:

где R представляет собой водород или галоген.

2. Соединения по п. 1, селективно ингибирующие гистоновую деацетилазу изоформы 6 по сравнению с гистоновой деацетилазой изоформы 1.

3. Соединения по п. 1, обладающие антиангиогенными свойствами.