RU2801367C1 - Многофункциональные гибридные рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых заболеваний - Google Patents
Многофункциональные гибридные рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2801367C1 RU2801367C1 RU2022120651A RU2022120651A RU2801367C1 RU 2801367 C1 RU2801367 C1 RU 2801367C1 RU 2022120651 A RU2022120651 A RU 2022120651A RU 2022120651 A RU2022120651 A RU 2022120651A RU 2801367 C1 RU2801367 C1 RU 2801367C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- srh
- insdseq
- insdqualifier
- irgd
- antitumor
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title description 5
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 title 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 229960005540 iRGD Drugs 0.000 claims abstract description 47
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 abstract 1
- 230000036326 tumor accumulation Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 32
- 101710097160 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 102200082402 rs751610198 Human genes 0.000 description 6
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022871 N-end cysteine peptide tumor-homing peptide Proteins 0.000 description 3
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 3
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 3
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YHTTWXCDIRTOQX-FQJIPJFPSA-N (6S,9S,15S,18R,23R,26S,29S)-18-amino-6-(4-aminobutyl)-9,26-bis(carboxymethyl)-15-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-2,5,8,11,14,17,25,28-octaoxo-20,21-dithia-1,4,7,10,13,16,24,27-octazabicyclo[27.3.0]dotriacontane-23-carboxylic acid Chemical compound NCCCC[C@@H]1NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)CNC1=O)C(O)=O YHTTWXCDIRTOQX-FQJIPJFPSA-N 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 2
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 2
- 108010047852 Integrin alphaVbeta3 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 2
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 206010018001 Gastrointestinal perforation Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 description 1
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 108090000772 Neuropilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004207 Neuropilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000009989 Posterior Leukoencephalopathy Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010071066 Posterior reversible encephalopathy syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 1
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 1
- 206010053692 Wound complication Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000011292 agonist therapy Methods 0.000 description 1
- 208000002029 allergic contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.OC(O)=O HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940121434 eftozanermin alfa Drugs 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 102000044949 human TNFSF10 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000017570 negative regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 238000013413 tumor xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для терапии различных опухолевых заболеваний. Предложена гибридная белковая молекула SRH-DR5-B, содержащая на N-конце ингибирующий ангиогенез пептид, специфически связывающийся с VEGFR2, а на С-конце – рецептор-селективный вариант противоопухолевого цитокина TRAIL DR5-B, специфически связывающийся с рецептором смерти DR5. В другом варианте гибридного белка (SRH-DR5-B-iRGD) на С-конце белка SRH-DR5-B содержится пептид, специфически связывающийся с интегрином
Description
Область техники
Данное изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, к созданию новых мультифункциональных белков, вызывающих гибель опухолевых клеток за счет механизма апоптоза, одновременно ингибируя пролиферацию опухолевых клеток и ангиогенез в опухолевом микроокружении и может быть использовано для таргетной терапии солидных опухолей.
Уровень техники
Современные биоинженерные подходы позволяют создавать мультифункциональные белки для таргетной терапии рака, одновременно активирующие или блокирующие два и более сигнальных пути, участвующих в развитии опухолей.
Цитокин TRAIL (TNF-related-apoptosis inducing ligand) из семейства фактора некроза опухолей (ФНО) является многообещающим противоопухолевым препаратом, который индуцирует апоптоз раковых клеток, оставляя нормальные клетки интактными. У человека TRAIL запускает сигнал апоптоз через два рецептора, TRAIL-R1 и TRAIL-R2, также известные как рецепторы смерти DR4 и DR5 соответственно. Растворимый рекомбинантный человеческий TRAIL, экспрессированный и очищенный из бактериальных штаммов, вызывает выраженную регрессию опухоли без системной токсичности в опухолевых моделях на животных, что привело к клинической разработке новых препаратов, нацеленных на рецепторы смерти DR4 и DR5 (Holland, P.M. et al. Death Receptor Agonist Therapies for Cancer. Cytokine Growth Factor Reviews. 2014. Vol. 25, pp.185–193). Однако несмотря на высокую противоопухолевую активность на животных моделях, TRAIL показал очень ограниченные противоопухолевые свойства в клинических испытаниях (de Miguel, D. et al. Onto Better TRAILs for Cancer Treatment. Cell Death Differ. 2016. Vol. 23, pp. 733–747).
За последнее десятилетие было разработано множество производных TRAIL с улучшенным агонистическим потенциалом для повышения его противоопухолевой эффективности (Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists—Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers. 2019. Vol. 11, pp. 954). В частности, был разработан ряд бифункциональных гибридных белков на основе TRAIL для одновременного нацеливания на рецепторы смерти и рецепторы, связанные с пролиферативной передачей сигналов. Обычно TRAIL и его производные экспрессируют стандартной индукцией IPTG в штаммах E. coli BL21(DE3), SHuffle® T7 Express, M15, TG1 и др. Для гибридных белков IL2-TRAIL и ADI (аргининдезиминаза)-TRAIL описана экспрессия путем аутоиндукции в штамме E. coli BL21(DE3). Эукариотическая экспрессия обычно используется для экспрессии TRAIL, слитого с различными антителами, которые плохо продуцируются в прокариотических системах экспрессии. Клетки CHO были использованы для продукции нескольких гибридных белков TRAIL с антителами (scFv:sTRAIL), в том числе белков со специфичностью к антигенам солидных опухолей EpCAM и EGFR и различным антигенам-мишеням лейкемии (CD7, CD19, CD33) (de Bruyn, M. Et al. Antibody-Based Fusion Proteins to Target Death Receptors in Cancer. Cancer Lett. 2013. Vol. 332, pp. 175–183). Среди более чем пяти десятков полученных гибридных белков на основе TRAIL, только ABBV-621 (лекарственное название Eftozanermin Alfa), одноцепочечный тример TRAIL, димеризованный через модифицированную часть Fc, в настоящее время проходит клинические испытания для лечения солидных и гематологических злокачественных новообразований (Phillips, D.C. et al. Cancer Res. 2021. Vol. 81, pp. 3402–3414).
Недостатком полученных гибридных препаратов является тот факт, что TRAIL связывается не только с рецепторами смерти DR4 и DR5, которые передают сигнал апоптоза, но и с рецепторами ловушками DcR1 и DcR2, которые ингибируют цитотоксическую активность цитокина. Кроме того, гибридные белки TRAIL c фрагментами антител не тримеризуются, что снижает их цитотоксическую активность.
Для преодоления этих проблем ранее был получен DR5-селективный мутантный вариант TRAIL – DR5-B, который связывается только с рецептором смерти DR5 и имеет повышенную цитотоксическую и противоопухолевую активность (Гаспарян М.Э. и др. Способ индукции гибели опухолевых клеток. Патент RU № 2620165; Гаспарян М.Э. и др. Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL. Патент RU № 2727059). Препарат DR5-B подавлял рост опухолей в ксенографтных моделях животных не более чем на 50%, что недостаточно для достижения клинического эффекта. Поэтому возникает необходимость в создании модифицированных вариантов DR5-B с дополнительными свойствами, в частности антиангиогенными, для улучшения потенциального противоопухолевого эффекта.
Активация ангиогенеза является одним из первых требований в опухолевой экосистеме для роста и диссеминации опухолей и стромальных клеток. VEGF является мощным ангиогенным агентом в опухолевых тканях, и роль рецепторов VEGF (VEGFR) широко изучалась в области неопластической васкуляризации. Однако препараты, воздействующие на путь VEGF/VEGFR, такие как бевацизумаб, сорафениб и сунитиниб, имеют побочные эффекты, включая артериальную гипертензию, артериальные тромбоэмболические явления, почечную дисфункцию, раневые осложнения, кровотечение, перфорацию желудочно-кишечного тракта и обратимый синдром задней лейкоэнцефалопатии (Chen H.X. et al. Adverse Effects of Anticancer Agents That Target the VEGF Pathway. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2009. Vol. 6, pp. 465–477). Поэтому, комбинация селективного ингибирования ангиогенеза с противоопухолевыми агентами, специфичными для раковых клеток, является многообещающей терапевтической стратегией.
TRAIL привлекает внимание, потому что экспрессия его рецепторов-мишени DR4 и DR5 намного выше в раковых клетках по сравнению с нетрансформированными клетками. Следовательно, доставка антиангиогенных веществ в микроокружение опухоли с помощью TRAIL может предотвращать побочные эффекты этих препаратов и селективно подавлять рост опухолей.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является бифункциональный рекомбинантный TRAIL, слитый с повторяющейся последовательностью антиангиогенного эффекторного пептида, полученной из экзона 6 лиганда VEGF, который продемонстрировал сильную противоопухолевую активность в моделях ксенотрансплантатов опухолей (Rozga P. et al. Novel Engineered TRAIL-based Chimeric Protein Strongly Inhibits Tumor Growth and Bypasses TRAIL Resistance. Int. J. Cancer. 2020. Vol. 147. Pp. 1117–1130). Недостатком данного препарата заключается в том, что он плохо растворим и стабилен только в растворе, содержащем 10% глицерола и 80 мМ сахарозы, что ограничивает его применение в клинике.
В другой работе TRAIL был инкапсулирован в антиангиогенный нанокомплекс как для улучшения распределения лекарства в опухоли, так и для повышения противоопухолевой эффективности (Uk Choi J. et al. Dual mechanistic TRAIL nanocarrier based on PEGylated heparin taurocholate and protamine which exerts both pro-apoptotic and anti-angiogenic effects. J Control Release 2021. Vol 336. Pp. 181-191). Нанокомплекс был получен путем включения TRAIL в конъюгат пегилированного гепарин-таурохолат (LHT7), который известен как мощный ингибитор ангиогенеза. Затем для получения стабильной формы нанокомплекса был добавлен протамин (PEG-LHT7/TRAIL/Protamine). Противоопухолевая эффективность нанокомплекса была значительно выше по сравнению с монотерапией TRAIL. Однако использование нанокомплекса такого рода в клинике представляется весьма ограниченным, так как исследования последних лет показали, что полиэтилен гликоль (PEG) обладает побочными эффектами, такие как ингибирование свертывания крови и аллергический контактный дерматит. Также существенным недостатком производных ПЭГ при введении их в организм является их ускоренный клиренс, особенно при повторных инъекциях, приводящий к накоплению производных ПЭГ во внутренних органах (Shi D. et al. To PEGylate or not to PEGylate: Immunological properties of nanomedicine's most popular component, polyethylene glycol and its alternatives. Review Adv. Drug Deliv. Rev. 2022. 180:114079).
В другой работе описывается гибридный белок sTRAIL-iRGD состоящий из TRAIL, с пептидом CRGDKGPDC на С-конце (Huang Y. et al. sTRAIL-iRGD is a promising therapeutic agent for gastric cancer treatment Scientific Reports.2017. Vol. 7. pp. 579). Авторы обнаружили, что sTRAIL-iRGD интернализуется в культивируемых опухолевых клетках рака желудка и локализуется как в опухолевой массе in vivo, так и в трехмерных многоклеточных сфероидах in vitro и оказывает противоопухолевое действие на линии опухолевых клеток, многоклеточные сфероиды и мышиные модели с опухолевыми ксенотранплантатами. Основной недостаток данного гибридного белка заключается в том, что он связывается не только рецептором смерти DR5, но и с рецепторами ловушками TRAIL DcR1 и DcR2, которые ингибируют индуцируемый цитокином апоптоз.
Сущность изобретения
Технической проблемой решаемой предлагаемым изобретением является получение противоопухолевых многофункциональных рекомбинантных таргетных препаратов в виде гибридных белков, вызывающих апоптоз опухолевых клеток за счет активации сигнальных путей рецептора смерти DR5, при одновременном ингибировании ангиогенеза в микроокружении опухоли за счет ингибирования сигнальных путей рецептора VEGFR2, а также улучшение доставки и проникновения препаратов в опухолевые ткани за счет αvβ3-интегрин-связывающего пептида.
Указанная задача решается путем создания гибридного белка на основе DR5-селективного мутантного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL – DR5-B, содержащего на N-конце полипептидной цепи антиангиогенный пептид SRHTKQRHTALH, ингибирующий сигнальные пути, рецептора VEGFR2. В результате получают бифункциональный белок SRH-DR5-B.
В одном из предпочтительных вариантов изобретения гибридный белок SRH-DR5-B (SEQ ID NO 2) имеет общую формулу A-L1-X, где «А» представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ID NO 4, который своим С-концом присоединен к «L1»; «L1» представляет собой линкер, последовательность которого охарактеризована в SEQ ID NO 5, а «X» представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, охарактеризованную в SEQ ID NO 1.
В других вариантах изобретения L1 представляет собой линкер, гомологичный по меньшей мере на 70% последовательности SEQ ID NO 5.
В других вариантах изобретения «Х» представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO 1, при этом содержит замены аминокислотных остатков, способствующие повышению специфичности связывания с рецептором DR5.
В другом варианте, помимо пептида SRH на N-конце, на С-конце гибридного белка SRH-DR5-B содержится пептид iRGD (CRGDKGPDC), который способен аффинно связываться с интегрином αvβ3, гиперэкспрессированному во многих опухолях, и улучшать проникновение веществ в опухолевые ткани (Sugahara KN, et al. Cancer Cell 2009; 16:510). В результате получают белок SRH-DR5-B-iRGD. Добавленные пептиды соединяют с N- и С-концами белка DR5-B линкерными последовательностями.
В данном случае, в предпочтительном варианте изобретения гибридный белок SRH-DR5-B-iRGD (SEQ ID NO 3) имеет общую формулу A-L1-X-L2-B, где «А» представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ID NO 4, который своим С-концом присоединен к «L1»; «L1» представляет собой линкер, последовательность которого охарактеризована в SEQ ID NO 5, «X» представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, охарактеризованную в SEQ ID NO 1, «L2» представляет собой линкер, последовательность которого охарактеризована в SEQ ID NO 6, «B» представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ID NO 7.
В других вариантах изобретения «L2» представляет собой химическую связь или подходящий линкер формулы (L1L1L1L1L2)n, при этом L1 представляет собой остаток глицина или отсутствует, L2 представляет собой остаток серина или отсутствует, а n имеет целое значение от 1 до 4.
В других вариантах изобретения «В» представляет собой пептид, N-концом присоединенный к «L2», гомологичный по меньшей мере на 75% последовательности SEQ ID NO 4, и способный специфически связываться с интегрином αvβ3.
Учитывая тот факт, что в большинстве опухолей рецепторы DR5, VEGFR2 и NRP1, а также интегрин αvβ3 высоко экспрессируются в опухолевых клетках, можно указать, что предлагаемые в данном изобретении гибридные белки SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD являются перспективными таргетными противоопухолевыми средствами.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:
– на основе рецептор-селективного мутантного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL- DR5-B (SEQ ID NO 1) созданы новые гибридные белки SRH-DR5-B (SEQ ID NO 2) и SRH-DR5-B-iRGD (SEQ ID NO 3). SRH-DR5-B способен связываться одновременно с рецептором DR5 и VEGFR2, а SRH-DR5-B-iRGD способен связываться одновременно с рецептором DR5 и VEGFR2, а также с интегрином αvβ3.
– полученные препараты SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD не агрегируют, состоят из тримерных молекул, эффективно уничтожают опухолевые клетки в 2D или 3D моделях и могут быть использованы для терапии опухолевых заболеваний.
Краткое описание рисунков
Фигура 1. Схема гибридных белковых конструкций SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD.
Фигура 2. Экспрессия белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD в штамме E. coli SHuffle B. Дорожки: М – маркеры молекулярных масс; 1 – колба №1; 2 – колба №2. *Расчетная масса мономерных SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD составляет 21769Да и 23446 Да, соответственно.
Фигура 3. Очистка белков DR5-B, SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD. Пробы, содержащие 10–15 мкг белка, анализируют в 15% полиакриламидном геле. Дорожки: М – маркеры молекулярных масс; 1 – растворимая фракция цитоплазматических белков; 2 – фракция белков, не связанных с Ni-NTA агарозой; 3 – фракции белков, отмытые буфером, содержащим 20 мМ имидазол; 4 – белки элюированные буфером, содержащим 250 мМ имидазол, 5 – белковые фракции после очистки на сорбент SP cефароза; 6 – образцы белков после ночного диализа. *Расчетная масса мономерных DR5-B, SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD составляет 19624 Да, 21769Да и 23446 Да соответственно.
Фигура 4. Определение констант диссоциации (Kd) белков DR5-B, SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD к рецепторам DR5, VEGFR2 и интегрину αvβ3 с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Лиганды добавляют в лунки, предварительно покрытые рецепторами DR5 или VEGFR2, либо интегрином αvβ3 и связывание выявляют с помощью моноклональных антител против TRAIL. (A) Сродство белков к рецептору DR5. (Б) Сродство белков к рецептору VEGFR2. (В) Сродство белков к интегрину αvβ3. Значения Кd рассчитывают с помощью опции нелинейной регрессии в программном обеспечении GraphPad Prism 8.0.
Фигура 5. Цитотоксичность белков DR5-B, SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD в 2D-моделях опухолевых клеток. (A) Поверхностная экспрессия рецептора DR5 в опухолевых клетках, определяют с помощью проточной цитометрии. (Б) Клетки колоректальной карциномы человека (HT-29) и глиобластомы (T98G и U-87) инкубируют с лигандами в течение 24 и 48 часов, и жизнеспособность анализируют с помощью теста WST-1.
Фигура 6. Цитотоксичность белков DR5-B, SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD в 3D-культуре сфероидов опухолевых клеток. (A) Сфероиды клеток HT-29, T98G и U-87 получают в микролунках с агарозой через 48 часов после посева клеток. Анализ жизнеспособности клеток трехмерных опухолевых сфероидов после обработки лигандами в течение 24 и 48 часов, проводят с помощью теста WST-1. (Б) Эффективные дозы (ЭД50) рассчитывают с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0.
Подробное раскрытие изобретения
Описываемые в изобретении гибридные белки могут быть получены с использованием векторов, предназначенных для гетерогенной экспрессии рекомбинантных белковых молекул в клетках-продуцентах. Выбор промоторов и других регуляторных элементов, а также клеток-продуцентов и экспрессионных штаммов может варьироваться. Наиболее близкий вариант получения белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD в клетках E. coli описан в патенте № RU2687435C1 «Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка DR5-B человека».
Для создания белковых конструкций SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD методом генной инженерии конструируется ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность белков SRH-DR5-B (SEQ ID NO 2) и SRH-DR5-B-iRGD (SEQ ID NO 3) в составе плазмидного вектора pET32a и получают вектора pET32a/srh–dr5-b и pET32a/srh–dr5-b-irgd.
Указанная ДНК встраивается в подходящий генетический вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции в виде единой полипептидной цепи в клетках бактериальных штаммов либо эукариотических линий, предназначенных для экспрессии рекомбинантных белков. К примеру, полученные векторы трансформируются в штаммы E. coli, предназначенные для экспрессии белков, и культуры культивируют в течение 18 часов при 28°С. Экспрессию белка индуцируют с помощью ИПТГ (изопропил_β-D-1-тиогалактопиранозид). Очистка экспрессированного целевого белка осуществляется (но не ограничивается) с помощью стандартных методик. К примеру, очистку целевых белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD проводят из растворимой фракции клеточного лизата с помощью металл-аффинной и ионообменной хроматографии. Описываемый в изобретении способ позволяет получить высокоочищенные гибридные белки в количестве более 200 мг из 1 литра клеточной культуры.
Гомогенность и тримеризацию полученных препаратов исследуют с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 10/300 GL, при скорости потока 0,5 мл/мин. Показывают, что очищенные препараты SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD высоко гомогенны и состоят в основном из тримерных молекул.
Исследуют аффинность очищенных гибридных белков к рецепторам DR5 и VEGFR2, а также к интегрину αvβ3 методом иммуноферментного анализа либо другими валидированными методами. Показывают, что белки SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD связываются с рецептором DR5 и VEGFR2 в наномолярных концентрациях, а белок SRH-DR5-B-iRGD связывается также с интегрином αvβ3.
Биологическая активность гибридных белков исследуется на моделях опухолей in vitro и in vivo, в частности на 3D-моделях мультиклеточных сфероидов, полученных из опухолевых клеточных линий. Повышенное противоопухолевое действие полученных препаратов SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD подтверждают результатами сравнительного анализа с DR5-B.
Следующие примеры даны с целью раскрытия характеристик настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем изобретения.
Пример 1. Экспрессия гибридных белков в штамме E. coli SHuffle B.
Ранее нами была сконструирована векторная плазмида pET32a/sdr5-b для прямой экспрессии белка DR5-B (SEQ ID NO 1). Плазмидный вектор для экспрессии гибридного белка SRH-DR5-B сконструируют путем вставки последовательности ДНК
agtagacatacaaaacaaagacacactgcactc, кодирующей пептид SRHTKQRHTALH (SEQ ID NO 4), и catggtggagcagcaggaggtgctgggagtggtggc, кодирующей линкер GGAAGGAGSGG (SEQ ID NO 5), в плазмидный вектор pET32a/sdr5-b непосредственно перед ДНК, кодирующей белок DR5-B, с помощью полимеразной цепной реакции. Получают плазмидный вектор pET32a/srh–dr5-b. Для получения экспрессирующей конструкции для белка SRH-DR5-B-iRGD, с помощью полимеразной цепной реакции в плазмидный вектор pET32a/srh–dr5-b вводят последовательности ДНК ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt, кодирующую линкер GGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO 6), и tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc, кодирующую пептид CRGDKGPDC (SEQ ID NO 7), непосредственно после ДНК, кодирующей белок DR5-B. В результате получают плазмидный вектор pET32a/srh–dr5-b-irgd. Схема конструкций белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD приведена на Фиг. 1.
Пример 2. Способ экспрессии рекомбинантных гибридных белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD.
Для экспрессии гибридных белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD полученные плазмидные вектора pET32a/srh–dr5-b и pET32a/srh–dr5-b-irgd трансформируют в компетентные клетки штамма E. coli SHuffle B. Экспрессируют белки в богатой среде TB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина в 2-литровых пластиковых колбах с отбойниками при концентрации индуктора T7 промотора ИПТГ 0.05 мМ. Максимальная экспрессия наблюдается при культивации клеток при 28°С в течение 18-20 часов при ротации платформы инкубатора 180 об/мин. Собирают клетки центрифугированием ночной культуры при 5000 х g в течение 10 минут при 4°С. Осадок клеток ресуспендируют в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия (рН 8.0) и повторно центрифугируют. Осадок клеток хранят при –80°С. Экспрессию белка в культуре клеток оценивают с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза в 15% геле с окрашиванием краской кумасси бриллиантовый синий R-250, нанося по 15 мкл ночной культуры на полосу (Фиг. 2). Уровень экспрессии белка, оцениваемый методом гель-денситометрии, составляет 192 ± 8 мг и 185 ± 5 мг в 200 мл клеточной культуры для белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD, соответственно.
Пример 3. Способ очистки гибридных белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD.
Осадки клеток из ночных культур (200 мл) ресуспендируют в лизис-буфере, содержащем 300 mM NaCl, 50 мМ фосфата натрия (рН 8.0) и разрушают под давлением 2000 psi на установке «French press» (Spectronic Instruments, Inc., США). Разрушенную клеточную массу центрифугируют при 25000 об/мин в течение 25 мин при 4°С. На первом этапе очистки растворимую клеточную фракцию наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Ni-NTA агарозой (Qiagen, США) предварительно уравновешивая колонку в лизис-буфере. После нанесения белка колонку промывают пятикратным объемом лизис-буфера, содержащим 20 мM имидазола. Связанные белки элюируют лизис-буфером, содержащим 250 мM имидазола. Очищенный белковые растворы диализируют против буфера, содержащего 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (pH7,5) в течение 24 часов при 4°С. Дополнительно очищают белки с помощью ионообменной хроматографии на сорбенте SP сефарозе (GE Healthcare, Швеция). Очищенные белковые препараты диализируют против 150 мМ NaCl в течение 24 часа при 4°С, стерилизуют фильтрованием через мембрану PVDF (поливинилиденфторид) с порами 0,22 мкм, лиофилизируют и хранят при -20°С.
Концентрацию белков в ходе очистки определяют по методу Бредфорд. Концентрацию очищенных белковых препаратов определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм с учетом молярного коэффициента экстинкции 25900 М–1см–1, определенного по аминокислотной последовательности с помощью программы ProtParam на сервере ExPASy (www.expasy.org). Чистоту белков в ходе очистки анализируют с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза в 15% геле с окрашиванием краской кумасси бриллиантовый синий R-250 (Фиг. 3). Чистота препаратов SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD в данном примере составляет не менее 98%. Выход очищенных белков составляет 20-25 мг из 200 мл культуры клеток. Гомогенность полученных препаратов исследуют с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, Швеция), при скорости потока 0,5 мл/мин с использованием системы быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC) AKTA (GE Healthcare, Швеция). Показывают, что очищенные препараты SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD высоко гомогенны и состоят из тримерных молекул.
Для сравнительного анализа физико-химических свойств, а также биологической активности аналогичным образом очищают белок DR5-B.
Пример 4. Аффинность гибридных белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD к рецепторам DR5, VEGFR2 и интегрину αvβ3.
Аффинность гибридных белков к таргетным рецепторам определяют методом иммуноферментного анализа. Для этого коммерческие препараты рецептора DR5 (100 нг/лунку), рецептора VEGFR2 (50 нг/лунку) и интегрина αvβ3 (50 нг/лунку) растворенные в 0,1 М растворе карбонат-бикарбоната (рН 9,4) наносят на лунки 96-луночного планшета и инкубируют планшеты в течение 16 часов при 4°С. Планшеты трижды промывают PBST (фосфатно-солевой буфер + 0,05% Tween) и лунки блокируют раствором 2% БСА (бычьей сывороточный альбумин) в PBST в течение 1 часа при 37 °C. После блокировки добавляют белки DR5-B, SRH-DR5-B или SRH-DR5-B-iRGD в концентрациях от 0,032 до 2500 нМ в двукратном разбавлении и инкубируют планшеты в течение 1 часа при 37 °С. Количество связанных молекул лигандов детектируют с помощью моноклональных антител к TRAIL (MAB375, R&D Systems, США) с последующей инкубацией с антимышиными поликлональными козьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HAF007, R&D Systems, США). Не связавшиеся антитела промывают трижды буфером PBST, после чего добавляют колориметрический субстрат OPD (о-фенилендиамин дигидрохлорид). После 15 мин инкубации с субстратом при 37 °С реакцию останавливают 1 N раствором H2SO4.
Оптическую плотность в лунках определяют спектрофотометрически при длине волны 450 нм с помощью планшетного ридера iMark (Bio-Rad, США). Значения константы диссоциации (Kd) рассчитывают с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., США) с использованием опции нелинейной регрессии. Показывают, что белки SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD проявляют высокую аффинность (Kd = 1,791 нМ и 1,759 нМ) к рецептору DR5, что сопоставимо с аффинностью DR5-B (Kd = 1,121 нМ) (Фиг. 4А). Гибридные белки также связываются с рецептором VEGFR2 в наномолярных концентрациях (Kd = 1,251нМ и 2,054 нМ для SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD, соответственно), тогда как DR5-B не проявляет сродство к этому рецептору (Фиг. 4Б). Показывают, что сродство к интегрину αvβ3 проявляет только белок SRH-DR5-B-iRGD (Kd = 2,500 нМ) благодаря наличию пептида iRGD (Фиг. 4В).
Пример 5. Выявление цитотоксической активности белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD на 2D моделях опухолевых клеток.
Определяют уровень поверхностной экспрессии рецептора DR5 в опухолевых клетках глиобластомы T98G и U87MG, а также колоректальной карциномы HT-29. Для этого клетки высевают в 6-луночный планшет при плотности 2 х 105 клеток на лунку в 2 мл питательной среды и инкубируют в течение 24 ч во влажной атмосфере 5% СО2 при 37 °С. Клетки открепляют от культуральных планшетов раствором 0.25% Versene, промывают охлажденным фосфатным буфером (PBS) и ресуспендируют в буфере PBS с 1% БСА. Суспензии клеток инкубируют в течение 1 часа при 4°С с 5 мкг/мл моноклональных антител против DR5 (клон DR5-01-1, GeneTex, США). Далее клетки дважды промывают и инкубируют со вторичными антителами (20 мкг/мл) Dylight 488 (GeneTex Inc., США) в течение 1 часа при 4 °С. Клетки дважды промывают и ресуспендируют в буфере FACS с добавлением пропидия йодида. Мышиный IgG1 (15H6, GeneTex, США) используют в качестве изотипического контроля. Экспрессию DR5 на клеточной поверхности анализируют на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter, США). Показывают высокий уровень экспрессии рецептора DR5 на поверхности всех линий клеток (T98G, U87MG, HT-29) (Фиг. 5А).
Цитотоксическую активность гибридных белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD исследуют методом WST-1 теста. Клетки HT-29 культивируют в среде RPMI, а клетки U-87 и T98G в среде DMEM с добавлением 10% FBS в увлажненной атмосфере с 5% CO2 при 37 °C. Клетки открепляют раствором 0.25% трипсин-ЭДТА и меняют среду каждые 3–4 дня. Далее клетки наносят на 96-луночный планшет (1 х 105 клеток на лунку) и инкубируют 24 часа. Далее в каждую лунку добавляют препараты в различных разведениях и планшеты переносят в СО2-инкубатор на 24 или 48 ч. Жизнеспособность клеток определяют с помощью реагента WST-1 (Sigma-Aldrich, США), добавляя по 10 мкл в каждую лунку. После инкубации в течение 4 часов при 37 °C с WST-1 измеряют поглощение с помощью планшетного спектрофотометра iMark (Bio-Rad, USA) при длине волны 450 нм с вычитанием фона при 655 нм. Жизнеспособность клеток определяют в % по сравнению с контролем по уравнению: (ОП образца – ОП фон)/(ОП контроль – ОП фон) × 100%. Эффективные дозы (ЭД50) определяют, как концентрацию лекарственного средства, приводящую к 50%-ному ингибированию роста клеток с помощью нелинейной регрессии в программном обеспечении GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., США) в соответствии со встроенной формулой ингибирования доза-реакция. Показывают, что белки SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD эффективнее убивают опухолевые клетки линий U87MG и HT-29, по сравнению с препаратом DR5-B (Фиг. 5Б).
Пример 6. Анализ цитотоксической активности белков SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD на мультиклеточных 3D сфероидных структурах опухолевых клеток.
Мультиклеточные опухолевые сфероиды получают путем посева клеток (5×103 клеток на лунку) в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые 1,5% агарозой. Планшеты инкубируют при 37°С, образование сфероидов наблюдается через 48–72 ч. После образования сфероидных структур размером 200-300 мкм в лунки добавляют по 10 мкл препаратов DR5-B, SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD, разведенных в среде роста, и планшеты переносят в СО2-инкубатор на 24 или 48 ч. Жизнеспособность клеток определяют с помощью реагента WST-1, как описано на примере 5 (Фиг. 6А). Определяют эффективные дозы (ЭД50) препаратов после 48 часов инкубации с клетками (Фиг. 6Б) как концентрацию лекарственного средства, приводящую к 50%-ному ингибированию роста клеток с помощью нелинейной регрессии в программом обеспечении GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., США) в соответствии с встроенной формулой ингибирования доза-реакция. Показывают, что эффективные дозы препаратов SRH-DR5-B и SRH-DR5-B-iRGD в разы меньше по сравнению с эффективными дозами препарата DR5-B. Также демонстрируют, что препарат SRH-DR5-B-iRGD эффективнее убивает опухолевые клетки глиобластомы U-87 и T98G по сравнению с препаратом SRH-DR5-B.
--->
Перечень последовательностей
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
dtdVersion="V1_3" fileName="Многофункциональные гибридные
рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых
заболеваний.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.1"
productionDate="2023-04-18">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022120651</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-07-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>https://www1.fips.ru/registers-doc-view/fips_
servlet</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022 120 651</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-07-27</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Институт биоорганической химии им.
академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic
Chemistry RAS </ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Многофункциональные гибридные
рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых
заболеваний</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>7</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>168</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..168</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHS
FLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTNFKFREEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWS
KDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNERLLDMHHEASFFGAFLVG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>191</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..191</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>SRHTKQRHTALHGGAAGGAGSGGVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSP
NSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTNFKFREEIKENTKNDKQMVQY
IYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNERLLDMHHEASFFGAFL
VG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>212</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..212</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>SRHTKQRHTALHGGAAGGAGSGGVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSP
NSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTNFKFREEIKENTKNDKQMVQY
IYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNERLLDMHHEASFFGAFL
VGGGGGSGGGGSGGCRGDKGPDC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>SRHTKQRHTALH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GGAAGGAGSGG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GGGGSGGGGSGG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Human</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>CRGDKGPDC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (17)
1. Противоопухолевый гибридный белок SRH-DR5-B, специфично связывающийся с рецептором DR5, конструкция которого имеет общую формулу:
A-L1-X,
где A представляет собой VEGFR2-специфичный пептид, который своим С-концом присоединен к L1;
L1 представляет собой линкер;
X представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL.
2. Противоопухолевый гибридный белок по п. 1, в конструкции которого А представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ID NO 4.
3. Противоопухолевый гибридный белок по п. 1, в конструкции которого линкер L1 представляет собой последовательность, гомологичную по меньшей мере на 70% последовательности SEQ ID NO 5.
4. Противоопухолевый гибридный белок по п. 1, в конструкции которого Х имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO 1, при этом гибридный белок cелективно связывается с рецептором DR5.
5. Противоопухолевый гибридный белок по п. 1 с аминокислотной последовательностью, представленной на SEQ ID NO 2.
6. Противоопухолевый гибридный белок SRH-DR5-B-iRGD, специфично связывающийся с рецептором DR5, конструкция которого содержит общую формулу:
A-L1-X-L2-B,
где A-L1-X представляет собой гибридный белок по одному (любому) из пп. 1-5;
L2 представляет собой химическую связь или линкер формулы (L1L1L1L1L2)n, при этом L1 представляет собой остаток глицина или удален, L2 представляет собой остаток серина или удален, а n имеет целое значение от 1 до 4;
В представляет собой пептид, N-концом присоединенный к L2, гомологичный по меньшей мере на 75% последовательности SEQ ID NO 7 и способный специфически связываться с интегрином .
7. Противоопухолевый гибридный белок по п. 6, в конструкции которого линкер L2 представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ ID NO 6.
8. Противоопухолевый гибридный белок по п. 6, в конструкции которого B представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ID NO 7.
9. Противоопухолевый гибридный белок по п. 6, который имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ ID NO 3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2023/000214 WO2024025435A1 (ru) | 2022-07-27 | 2023-07-13 | Многофункциональные гибридные рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых заболеваний |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2801367C1 true RU2801367C1 (ru) | 2023-08-08 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAGOLOVICH A. V. et al. Optimized Heterologous Expression and Efficient Purification of a New TRAIL-Based Antitumor Fusion Protein SRH-DR5-B with Dual VEGFR2 and DR5 Receptor Specificity, Int J Mol Sci, 2022, vol. 23, N. 11, 5860. YAGOLOVICH A. V. et al. Genetically Modified DR5-Specific TRAIL Variant DR5-B Revealed Dual Antitumor and Protumoral Effect in Colon Cancer Xenografts and an Improved Pharmacokinetic Profile, Translational Oncology, 2020, vol. 13, N. 4, 100762. MERT U., SANLIOGLU A.D. Intracellular localization of DR5 and related regulatory pathways as a mechanism of resistance to TRAIL in cancer, Cell Mol Life Sci, 2017, vol. 74, N. 2, pp. 245-255. ЧИЧВАРИН В.А. и др. Влияние модифицированного фактора некроза опухоли trail на мультиформную глиобластому, Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: Сборник тезисов. XXXIII ЗИМНЯЯ МЕЖДУНАРОДНАЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛА, Москва, 08-11 февраля 2021, Москва: Институт биоорганической химии им. академиков М. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101658247B1 (ko) | 모듈 인식 도메인을 통한 항체 표적화 | |
| US20200093933A1 (en) | Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives | |
| JP2007530021A (ja) | Ｔｎｆリガンドファミリーメンバーの組換えポリペプチドおよびその使用 | |
| KR20220016942A (ko) | 재조합 fap 결합 단백질 및 이의 용도 | |
| JP2018519803A (ja) | 抗がん性融合ポリペプチド | |
| JP2023509666A (ja) | 分子の細胞内送達用の多量体化送達システム | |
| Wang et al. | RGD and NGR modified TRAIL protein exhibited potent anti-metastasis effects on TRAIL-insensitive cancer cells in vitro and in vivo | |
| Poźniak et al. | Modular self-assembly system for development of oligomeric, highly internalizing and potent cytotoxic conjugates targeting fibroblast growth factor receptors | |
| KR101575194B1 (ko) | 인간 페리틴 유래 융합폴리펩티드 | |
| Isakova et al. | Dual targeting of DR5 and VEGFR2 molecular pathways by multivalent fusion protein significantly suppresses tumor growth and angiogenesis | |
| WO2022022709A1 (zh) | 一种SIRPα-Fc融合蛋白 | |
| RU2801367C1 (ru) | Многофункциональные гибридные рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых заболеваний | |
| Schmidt et al. | Expression of an oncogenic mutant EGF receptor markedly increases the sensitivity of cells to an EGF‐receptor‐specific antibody‐toxin | |
| CN101070350A (zh) | 针对cd13的靶向肽与力达霉素构成的强化融合蛋白ngr－ldp－ae | |
| CN104628863A (zh) | 一种双靶点双弹头抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用途 | |
| Rong et al. | Site-specific dinitrophenylation of single-chain antibody fragments for redirecting a universal CAR-T cell against cancer antigens | |
| WO2024025435A1 (ru) | Многофункциональные гибридные рекомбинантные белковые препараты для терапии опухолевых заболеваний | |
| Shin et al. | Spatially organized nanoassembly of single-chain TRAIL that induces optimal death receptor clustering and cancer-specific apoptosis | |
| US20080175896A1 (en) | Tweak-pseudomonas exotoxin a fusion protein for cancer therapy | |
| CN109400711B (zh) | 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 | |
| JP6050319B2 (ja) | 活性ポリペプチドの結合親和力及び結合特異性を増強させる蛋白質骨格モジュール | |
| JP2017095417A (ja) | 抗癌剤 | |
| CN105985447A (zh) | 一种白蛋白结合型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 | |
| CN120058969B (zh) | 一种在细胞外具有可控穿孔活性的gsdmd融合蛋白及其应用 | |
| US11952402B2 (en) | Fusion protein containing trail and IgG binding domain and the uses thereof |