RU2799538C1 - Preimplantation genetic testing method for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2 - Google Patents
Preimplantation genetic testing method for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799538C1 RU2799538C1 RU2022129268A RU2022129268A RU2799538C1 RU 2799538 C1 RU2799538 C1 RU 2799538C1 RU 2022129268 A RU2022129268 A RU 2022129268A RU 2022129268 A RU2022129268 A RU 2022129268A RU 2799538 C1 RU2799538 C1 RU 2799538C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- carried out
- stage
- detection
- amplification
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.The invention relates to preimplantation genetic testing of monogenic diseases. Currently, there are more than 350 million people in the world suffering from a rare disease (according to the RARE Project). The total number of such diseases, according to the estimates of the European Organization for Rare Diseases (EURORDIS), varies from 5 to 7 thousand. At the same time, about 80% of rare diseases have a genetic cause. The known genetic basis of the disease makes it possible to predict with high accuracy not only the health of an already born child, but also to assess the risk of having such a child by analyzing the genotypes of the parents, as well as to conduct genetic diagnostics at the earliest stages. Preimplantation genetic testing (PGT) of a monogenic disease is becoming a powerful tool for the prevention of such diseases.
Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования Блефарофимоза, птоза и синдрома обратного эпикантуса типа 1,2. Блефарофимоз, птоз и синдром обратного эпикантуса, тип 1,2 - это наследственная патология века и глазной щели, передающаяся по аутосомно-доминантному типу наследования. Блефарофимоз, птоз и синдром обратного эпикантуса типа 1,2 встречается с частотой 1 на 50000 населения. Это заболевание приводит к нарушению формирования глазного века с 2 сторон. Характерно опущение века (птоз), сужение глазной щели, инверсия эпикантуса, аномалии слезного протока, амблиопия. Перечисленным изменениям у женщин также может сопутствовать преждевременная недостаточность яичников. При аутосомно-доминантном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 50%.The present invention relates to a method for preimplantation genetic testing for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2. Blepharophimosis, ptosis, and epicanthus reversal syndrome type 1,2 is a hereditary pathology of the eyelid and palpebral fissure, transmitted in an autosomal dominant mode of inheritance. Blepharophimosis, ptosis, and epicanthus reversal syndrome type 1,2 occur at a rate of 1 in 50,000 population. This disease leads to a violation of the formation of the eyelid from 2 sides. Characterized by drooping of the eyelid (ptosis), narrowing of the palpebral fissure, inversion of the epicanthus, anomalies of the lacrimal duct, amblyopia. These changes in women may also be accompanied by premature ovarian failure. With an autosomal dominant type of inheritance of the disease, the probability of having a child with this disease in the family is 50%.
К заболеванию блефарофимоз, птоз и синдром обратного эпикантуса, тип 1,2 могут приводить патогенные генетические варианты в гене FOXL2 [Crisponi L, et al. Nat Genet. 2001 Feb; 27(2): 159-66], располагающемся на хромосоме 3. Этот ген кодирует белок Forkhead box protein L2, регулирующий процессы транскрипции. Его нормальное функционирование необходимо для нормального формирования гонад, яйцеклеток, а также век глаз.Blepharophimosis, ptosis, and epicanthus reversal syndrome type 1,2 can be caused by pathogenic genetic variants in the FOXL2 gene [Crisponi L, et al. Nat Genet. Feb 2001; 27(2): 159-66], located on chromosome 3. This gene encodes the Forkhead box protein L2 protein, which regulates transcription processes. Its normal functioning is necessary for the normal formation of the gonads, eggs, and eyelids.
ПГТ блефарофимоза, птоза и синдрома обратного эпикантуса типа 1,2 проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую, природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленным патогенными вариантом, обуславливающим этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенного варианта и, следовательно, без риска развития заболевания.PGT for blepharophimosis, ptosis, and epicanthus reversal syndrome type 1,2 is performed for families with a confirmed molecular genetic nature of the disease. It is important to note that the substantiation of the pathogenicity and causation of genetic variants occurs before the PGT of a monogenic disease and is not included either in the goals and objectives of the PGT of a monogenic disease, or in the complex of measures for conducting PGT of a monogenic disease. Pathogenicity is assessed according to the international standard - according to the criteria described in 2015 by the American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP) in the search for the molecular genetic cause of the disease. PGT is recommended for families at high risk of having a child with a severe (incurable) hereditary disease with an established pathogenic variant that causes this risk. PGT allows you to choose from all embryos obtained by IVF (in vitro fertilization) embryos without a pathogenic variant and, therefore, without the risk of developing a disease.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.The main problem in the genetic diagnosis of embryos is the small initial amount of biomaterial, since the biopsy contains from one to three cells. In this case, to improve the efficiency and accuracy of the analysis, it is important both to completely exclude the possibility of contamination and to neutralize the possible effect of uneven and/or incomplete amplification, as well as degradation of the biomaterial. This requires the development of a test system with special characteristics. At the same time, the test system is being developed taking into account the possibility of using different types of biomaterial - total deoxyribonucleic acid (DNA) isolated from different tissues, the product of Whole Genome Amplification (WGA), as well as single cells. The combination of versatility with respect to the biomaterial with stepwise amplification of target fragments makes it possible to analyze several pathogenic variants for a single sample, including on single cells, and also to identify the situation of incomplete amplification, contamination, or degradation of the sample. Another feature of PGT is the lack of information about the biological characteristics of the embryo: unlike an adult, an embryo can have any chromosomal abnormalities that complicate the task of assessing the status of an embryo for a specific genetic variant. Therefore, a test system for PGT of a monogenic disease should make it possible to identify such cases and evaluate their impact on the reliability of the diagnostic result.
Описания близкого технического решения не обнаружено в общедоступных источниках.Description of a close technical solution was not found in public sources.
Представленный нами метод ПГТ блефарофимоза, птоза и синдрома обратного эпикантуса типа 1,2 решает задачу разработки более точного способа, преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.The PGT method presented by us for blepharophimosis, ptosis, and epicanthus reversal syndrome type 1,2 solves the problem of developing a more accurate method, preimplantation genetic testing of this monogenic disease without the use of expensive devices and reagents, which could be used on various types of biomaterial: DNA isolated from different tissues, whole genome amplification product (WGA), single cells.
Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенного варианта (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000003.11:g.138665511_138665512del (NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) в гене FOXL2, встречавшегося ранее в литературе [Е. De Baere et al. Human Molecular Genetics, Volume 10, Issue 15, 15 July 2001, Pages 1591-1600] с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000003.11:g.138665511_138665512del (NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) типа делеция (отсутствие нескольких нуклеотидов, англ. Deletion, del) были подобраны праймеры, которые позволяют произвести детекцию мутации по разнице длин фрагментов с помощью капиллярного электрофореза. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена FOXL2 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2 и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2 гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген FOXL2, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген FOXL2 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 13 STR локусов для гена FOXL2: D3S137.38, D3S137.4, D3S1576, D3S137.8, D3S138.04, D3S138.6, D3S138.66, D3S138.68, D3S138.8, D3S1206, D3S138.9, D3S138.99, D3S1764. Праймеры для амплификации находятся на 3 хромосоме в районе координат 137387104-139188577 (в соответствии с hg19). Последовательности праймеров для амплификации указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-39. Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п. н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п. н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.The technical result was the creation of a test system for diagnosing a pathogenic variant (the nucleotide number in the reference sequence of genomic DNA is indicated by the prefix NC, the nucleotide number in the reference sequence of the coding transcript is indicated by the prefix NM): NC_000003.11:g.138665511_138665512del , p.Pro18fs) in the FOXL2 gene, which was previously found in the literature [E. DeBaere et al. Human Molecular Genetics, Volume 10, Issue 15, 15 July 2001, Pages 1591-1600] with a dual detection system - direct and indirect. Such a system is necessary when working with a small amount of biomaterial, since unstable amplification can lead to loss of information or reduced accuracy of the analysis. Direct diagnosis involves the analysis of the direct presence-absence of a pathogenic variant. In this case, for the genetic variant NC_000003.11:g.138665511_138665512del (NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) of the deletion type (absence of several nucleotides, English Deletion, del), primers were selected that allow detection of the mutation by the difference fragment lengths using capillary electrophoresis. Indirect diagnosis consists in the analysis of the inheritance of molecular genetic markers linked to a mutation, i.e. inherited with it. To do this, at a distance of no more than 3 mB (which corresponds to 3% crossover on average) from the FOXL2 gene in each direction, polymorphic loci called STR (short tandem repeat - short tandem repeat) were selected with a heterozygosity of at least 0.70 to ensure maximum informativity of indirect diagnostics. STRs are repeats of 2 or more nucleotides located one after another (for example, an adenine-cytosine (AC) pair repeated several times in a row: ACACACACA) and are present in large numbers in the human genome. The number of repeats in each of them may vary from individual to individual, and may also be different in the same person on 2 homologous chromosomes. Heterozygosity above 0.70 means that there is a high probability that in the same person the number of nucleotide repeats in this STR on one chromosome will differ from the number of repeats in the same STR on the homologous chromosome, in other words, the alleles of this marker in this person will differ in length. When amplifying a fragment containing such a marker, amplicons of two different lengths will be obtained. By analyzing the number of repeats in several markers surrounding the pathogenic variant and examining how they are inherited in the tested family, linkage between the alleles of the markers and the pathogenic variant can be established. The diagnostic value of studying the number of repeats in these markers in embryos is that by which allele of each of the markers was inherited by the embryo, it can be judged whether the embryo inherited the FOXL2 gene carrying the pathogenic variant, or whether it inherited the FOXL2 gene from another , a homologous chromosome that does not contain a pathogenic variant. For each of these loci, primers were selected for amplification by the type of nested or semi-nested PCR in 2 rounds, which makes it possible to increase the accuracy and efficiency of amplification. The test system included 13 STR loci for the FOXL2 gene: D3S137.38, D3S137.4, D3S1576, D3S137.8, D3S138.04, D3S138.6, D3S138.66, D3S138.68, D3S138.8, D3S1206, D3S13 8 .9, D3S138.99, D3S1764. Primers for amplification are located on chromosome 3 in the region of coordinates 137387104-139188577 (according to hg19). The sequences of primers for amplification are indicated in the claims in the list of SEQ ID NO 1-39. It is important to note that during the selection of primers, a number of special requirements were observed: the length of the product with external primers for the first round of PCR should not exceed 500 bp. (for production from fragments obtained by whole genome amplification), product length from internal primers for the second round of PCR from 120 to 350 bp, high specificity of external primers, annealing temperature does not differ by more than 1°C.
Подготовительный этап ПГТPreparatory stage of the PGT
На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mМ, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mМ каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.At the preparatory stage, the test system is being developed: selection of amplification conditions that are optimal for primers to work, analysis of the efficiency and specificity of PCR amplification in both rounds, assessment of the universality of the test system for biosamples of various types (DNA, WGA product, single cells). When testing the test system, stock dilutions of primers were prepared with a concentration of 100 mM, and working dilutions of primer combinations (a combination of primer pairs for rounds 1 and 2 of PCR) with a concentration of 10 mM of each primer in solution. Since various types of matrices can be used as part of the diagnostics of clinical material, two biopsies of single cells were used in the development of the test system, which were in a special lysis buffer (1 × PCR Buffer, 0.1% Tween-20, 0.1% Triton X-100, 1 µg Proteinase K), two samples of the products of whole genome amplification of embryonic biopsies (WGA), as well as total DNA of family members isolated from blood, for compiling a pedigree and identifying the linkage of a pathogenic variant with alleles of polymorphic markers.
В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.In nested and semi-nested PCR, amplification is carried out in two steps. At the first stage, multiplex PCR is performed with all external primers for all loci included in the test system to enrich the sample with all target fragments. At the second stage, individual amplification of each fragment with internal primers is carried out.
Полугнездовая ПЦРSemi-nested PCR
Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. Последовательности праймеров для амплификации указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-39. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1xПЦP буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mМ каждого деоксинуклеотида, 0.15 μΜ каждого праймера, 2,5 U/μΙ ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.For the first stage, external highly specific primers were selected to amplify fragments from 300 to 500 bp. For the second stage, primers were selected to amplify fragments no longer than 350 base pairs, and labels were introduced for detection by fragment analysis. The sequences of primers for amplification are indicated in the claims in the list of SEQ ID NO 1-39. The PCR mixture for the first round of amplification contained 1xPCR buffer with Mg2+ (Evrogen, Russia), 0.1 mM of each deoxynucleotide, 0.15 μΜ of each primer, 2.5 U/μΙ HsTaq DNA polymerase (Evrogen, Russia), 6% dimethyl sulfoxide (DMSO), and 1 µl total DNA or 2.5 µl WGA or 5 µl lysis buffer with sample as template. The first stage of amplification was carried out according to the following protocol: the stage of denaturation at 94°C for 2 minutes, 30 cycles with a decrease in the annealing temperature of the primers from 62 to 45°C in each, the stage of completion of all templates at 72°C for 10 minutes. Next, the products of the 1st stage were placed into individual tubes with one pair of primers per specific locus.
В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1хПЦР буфер с Мg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μΜ каждого праймера, 1 U/μI ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μΙ ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).The PCR mixture for the second stage included 1xPCR buffer with Mg2+ (Evrogen, Russia), 0.5xRediLoad™ loading buffer (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM of each deoxynucleotide, 0.2 μΜ of each primer, 1 U/μI HsTaq DNA polymerase (Evrogen , Russia), 6% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 1 μΙ PCR product of the first stage of amplification as a template. The second stage of amplification was carried out according to the following protocol: denaturation stage at 95°C for 2 minutes, 35 cycles: denaturation at 95°C for 30 seconds, primer annealing at 57°C for 30 seconds, template synthesis at 72°C for 1 minute, completion of all templates 72°C 5 minutes. Evaluation of the efficiency and specificity of amplification was performed using electrophoresis in 2% agarose gel. The result of electrophoresis in agarose gel allows you to determine the required degree of dilution of the amplification products for application to fragment analysis (amplification products of DNA of family members).
Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона). Детекция патогенного варианта NC_000003.11: g.138665511_138665512del (NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) проводилась с помощью праймеров для амплификации:Fragment analysis of amplification products was performed using capillary electrophoresis on a 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Based on the results of the fragment analysis, a pedigree is compiled and informative polymorphic STR loci for each family are noted, which will later be used in clinical diagnostics. Loci are divided into non-informative (the carrier of the pathogenic variant is homozygous for this locus), semi-informative (alleles for this marker are the same on some and parental chromosomes), informative (alleles of this marker are different on all chromosomes of the parents, which makes it possible to distinguish each of them when analyzing the genotype of the embryo ). Detection of the pathogenic variant NC_000003.11: g.138665511_138665512del (NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) was carried out using amplification primers:
Внешние праймеры:External primers:
Прямой: 5'-CACCTTGATGAAGCACTCG-3',Direct: 5'-CACCTTGATGAAGCACTCG-3',
Обратный: 5'-TGTCATGATGGCCAGCTAC-3'Reverse: 5'-TGTCATGATGGCCAGCTAC-3'
Внутренние праймеры:Internal primers:
Прямой: 5'-(FAM)ACTTCGCGATGATGTACTGG -3' в паре с внешним обратным.Forward: 5'-(FAM)ACTTCGCGATGATGTACTGG -3' paired with external reverse.
Пример 1Example 1
Пациенты АPatients A
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием блефарофимоз, птоз и синдром обратного эпикантуса с гетерозиготным носительством патогенного варианта NC_000003.11:g.138665511_138665512del(NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) в гене FOXL2. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания блефарофимоз, птоз и синдром обратного эпикантуса, тип 1,2 в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.Family A turned to the Center for Genetic and Medical Research, in which a child with blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome was born with a heterozygous carrier of the pathogenic variant NC_000003.11:g.138665511_138665512del(NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) in the FOXL2 gene . The couple was recommended to undergo PGT for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2 as part of IVF to select embryos that did not inherit the disease.
Гаплотипирование семьиFamily haplotyping
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Амплификация фрагментов ДНК, содержащих полиморфные маркеры, производилась с помощью праймеров, перечисленных в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-39. Было проанализировано 13 STR локусов. Из них 9 оказались информативными по отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Аллели полиморфных маркеров, совпадающие у ребенка и родителя с заболеванием блефарофимоз, птоз и синдром обратного эпикантуса с заранее установленным носительством патогенного варианта NC_000003.11:g.138665511_138665512del(NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) в гене FOXL2, признаются сцепленными с патогенным вариантом и друг с другом. Аллели полиморфных маркеров, не совпадающие у таких родственников, признаются сцепленными друг с другом и с нормальным аллелем гена FOXL2. Так же устанавливаются группы сцепления и для родственников, не являющихся носителями патогенного варианта. Аллели полиморфных маркеров, совпадающие у здоровой матери и ребенка с заболеванием, признаются сцепленными друг с другом и с нормальным геном FOXL2. Не совпадающие с ребенком аллели полиморфных маркеров здоровой матери также признаются сцепленными друг с другом и с нормальным геном FOXL2. Косвенная диагностика позволяет сделать вывод о наследовании нормального или мутантного аллеля гена даже в случае выпадения аллеля или непрохождения реакции при амплификации фрагментов ДНК для прямой диагностики.At the first stage, biomaterial (peripheral blood) of family members was obtained to detect the pathogenic variant and identify linkage groups of alleles of polymorphic markers. Amplification of DNA fragments containing polymorphic markers was carried out using the primers listed in the claims in the list of SEQ ID NO 1-39. 13 STR loci were analyzed. Of these, 9 turned out to be informative on the father. Thus, embryo samples were tested only for informative markers. Alleles of polymorphic markers that match in a child and a parent with blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome with pre-established carriage of the pathogenic variant NC_000003.11:g.138665511_138665512del(NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) in the FOXL2 gene, recognized linked with the pathogenic variant and with each other. Alleles of polymorphic markers that do not match in such relatives are considered linked to each other and to the normal allele of the FOXL2 gene. Linkage groups are also established for relatives who are not carriers of the pathogenic variant. Alleles of polymorphic markers that match in a healthy mother and a child with a disease are recognized as linked to each other and to the normal FOXL2 gene. Alleles of polymorphic markers of a healthy mother that do not match with the child are also recognized as linked to each other and to the normal FOXL2 gene. Indirect diagnostics makes it possible to draw a conclusion about the inheritance of a normal or mutant allele of a gene even if the allele is lost or the reaction fails during amplification of DNA fragments for direct diagnostics.
В результате гаплотипирования и определения групп сцепления для семьи А из примера были получены результаты, представленные в таблице 1. Аллели, указанные на одной строке, располагаются на одной хромосоме, то есть, представляют группу сцепления. Таким образом для каждого члена семьи представлено 2 группы сцепления, соответствующие каждой из двух третьих хромосом. N в таблице обозначает аллель дикого типа, mut - мутантный аллель. Цифрами записаны длины ампликонов в парах нуклеотидов; их длины зависят от количества повторов в маркере STR. Патогенный вариант NC_000003.11:g.138665511_138665512del(NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) в гене FOXL2 в таблице обозначен коротко - FOXL2 c.53delCA.As a result of haplotyping and determination of linkage groups for family A from the example, the results presented in Table 1 were obtained. The alleles indicated on the same line are located on the same chromosome, that is, they represent the linkage group. Thus, for each member of the family, there are 2 linkage groups corresponding to each of the two third chromosomes. N in the table denotes the wild-type allele, mut is the mutant allele. Numerals indicate the lengths of amplicons in base pairs; their lengths depend on the number of repeats in the STR marker. Pathogenic variant NC_000003.11:g.138665511_138665512del(NM_023067.4:c.53_54del, p.Pro18fs) in the FOXL2 gene is shortly denoted in the table - FOXL2 c.53delCA.
Таблица 1. Результаты гаплотипирования семьи А. В скобках приведены аллели, для которых не удалось установить сцепление в рамках разработки тест-системыTable 1. Results of haplotyping of family A. Alleles for which linkage could not be established as part of the development of the test system are shown in parentheses.
В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у партнера пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D3S137.38 - 206, D3S137.4 - 263, D3S1576 - 296, D3S137.8 - 281, D3S138.04 - 146, D3S138.6 - 242, D3S138.8 - 259 D3S138.9 - 197.As a result of haplotyping, it was concluded that the following alleles of STR markers were linked in the patient's partner with the pathogenic variant: D3S137.38 - 206, D3S137.4 - 263, D3S1576 - 296, D3S137.8 - 281, D3S138.04 - 146, D3S138.6 - 242, D3S138.8 - 259 D3S138.9 - 197.
Преимплантационное генетическое тестированиеPreimplantation genetic testing
В цикле ЭКО было получено 7 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).In the IVF cycle, 7 embryos were obtained, a biopsy was performed on the 5th day of development (in the IVF clinic), the biopsy in WGA buffer (1xPBS (Invitrogen, USA), 1% polyvinylpyrrolidone (PVP) (Fertipro, Belgium)) was sent to the Genetico ". To control contamination at different stages of working with a sample, the laboratory developed a system of controls: control of contamination of the biopsy buffer, control of contamination during transportation (one test tube with buffer is not opened by the embryologist), control of contamination of each sample (sample of the medium from the last wash drop of biopsy material). All these controls, together with the samples, go through the stage of whole genome amplification, after which the smallest amount of DNA contaminating the controls will be noticeable. Genome-wide amplification was performed using the commercial SurePlex kit (Illumina, USA).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты представлены в таблице 2.The product of genome-wide amplification, as well as the DNA of all family members, was amplified at stage 1 in multiplex PCR with primers for the detection of the pathogenic variant and primers for polymorphic markers informative for the A family in accordance with the protocol for the test system developed as part of the preparatory stage. At stage 2, amplification was performed for each marker separately in accordance with the developed protocol for the test system. In this way, the linkage groups inherited by each embryo were established. The results obtained are presented in table 2.
Таблица 2. Результаты ПГТ-М для семьи A. ADO - выпадение аллеля. FA - амплификация не прошлаTable 2. Results of PGT-M for family A. ADO - allele dropout. FA - amplification failed
По результатам прямой и косвенной диагностики 5 эмбрионов (эмбрион 2, 4-7) не унаследовали заболевание, у 2 эмбрионов (эмбрион 1 и 3) выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. С согласия родителей для эмбрионов, не унаследовавших заболевание, провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов эмбрион 4 был рекомендован к, переносу. Остальные эмбрионы не были рекомендованы в связи с различными хромосомными аномалиями.According to the results of direct and indirect diagnostics, 5 embryos (embryo 2, 4-7) did not inherit the disease, in 2 embryos (embryo 1 and 3) a haplotype corresponding to the inherited disease was detected. With the consent of the parents, preimplantation genetic screening for chromosomal abnormalities was performed for embryos that did not inherit the disease. Based on the results of all tests carried out, embryo 4 was recommended for transfer. The remaining embryos were not recommended due to various chromosomal abnormalities.
Claims (2)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2799538C1 true RU2799538C1 (en) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001029254A3 (en) * | 1999-10-19 | 2002-01-10 | Univ Gent | Identification of bpesc1, a gene disrupted by a balanced chromosomal translocation t(3;4) (q23;p15.2) in a patient with bpes |
RU2742956C1 (en) * | 2020-07-17 | 2021-02-12 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Method of preimplantation genetic testing of metachromatic leukodystrophy |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001029254A3 (en) * | 1999-10-19 | 2002-01-10 | Univ Gent | Identification of bpesc1, a gene disrupted by a balanced chromosomal translocation t(3;4) (q23;p15.2) in a patient with bpes |
RU2742956C1 (en) * | 2020-07-17 | 2021-02-12 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Method of preimplantation genetic testing of metachromatic leukodystrophy |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YANG L., LI T., XING Y. Identification of a novel FOXL2 mutation in a single family with both types of blepharophimosis‑ptosis-epicanthus inversus syndrome. Mol Med Rep. 2017 Oct;16(4):5529-5532. WANG Y., WU Q., CAO W., HUANG L., LIU W., LI C., LI N. Clinical and genetic studies of 17 Han Chinese pedigrees and 31 sporadic patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome. Mol Vis. 2022 Oct 6;28:352-358. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20080311565A1 (en) | Methods and Kits for Detecting Germ Cell Genomic Instability | |
Colosimo et al. | Application of MLPA assay to characterize unsolved α-globin gene rearrangements | |
Capucchio et al. | Degenerative myelopathy in German Shepherd Dog: comparison of two molecular assays for the identification of the SOD1: c. 118G> A mutation | |
JP2002510962A (en) | Male infertility Y deletion detection instrument | |
JPWO2013129542A1 (en) | Method for detecting HLA-A * 31: 01 allele | |
RU2799538C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2 | |
RU2791878C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of non-syndromic sensorineural hearing loss | |
RU2777081C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of louis-bar syndrome | |
KR20130041767A (en) | Normal-tension glaucoma susceptibility gene and method for using the same | |
RU2777086C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of epidermolysis bullosa | |
RU2777091C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of breast and ovarian cancer | |
RU2795796C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for achondroplasia | |
RU2777084C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of type 1 familial focal epilepsy | |
RU2671156C1 (en) | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy | |
RU2772938C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of familial hypertrophic cardiomyopathy | |
RU2769300C1 (en) | Test system for pre-implantation genetic testing of type 1 spinocerebellar ataxia | |
RU2775416C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of duchenne/becker muscular dystrophy | |
RU2799541C1 (en) | Method of preimplantation genetic testing of hereditary zonular cataract | |
RU2742956C1 (en) | Method of preimplantation genetic testing of metachromatic leukodystrophy | |
RU2792147C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for fanconi anemia | |
RU2816650C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of smith-lemli-opitz syndrome | |
RU2777078C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of cystic fibrosis | |
RU2795481C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for alport syndrome | |
RU2748289C1 (en) | Canavan disease preimplantation genetic testing method | |
RU2796834C1 (en) | Preimplantation method of martine-bell syndrome genetic testing |