RU2671156C1 - Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy - Google Patents
Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2671156C1 RU2671156C1 RU2017129586A RU2017129586A RU2671156C1 RU 2671156 C1 RU2671156 C1 RU 2671156C1 RU 2017129586 A RU2017129586 A RU 2017129586A RU 2017129586 A RU2017129586 A RU 2017129586A RU 2671156 C1 RU2671156 C1 RU 2671156C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exon
- pcr
- amplification
- smn1
- gene
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 208000032471 type 1 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 title description 2
- 101150081851 SMN1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 26
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 31
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 208000022074 proximal spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 101150015954 SMN2 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 3
- 206010002027 Amyotrophy Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000007838 multiplex ligation-dependent probe amplification Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100031262 Deleted in malignant brain tumors 1 protein Human genes 0.000 description 1
- 101000626599 Desulfomicrobium norvegicum (strain DSM 1741 / NCIMB 8310) Type II restriction enzyme DdeI Proteins 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000844721 Homo sapiens Deleted in malignant brain tumors 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000032225 Proximal spinal muscular atrophy type 1 Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 101710122523 Survival of motor neuron protein Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- ZINJLDJMHCUBIP-UHFFFAOYSA-N ethametsulfuron-methyl Chemical compound CCOC1=NC(NC)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(=O)OC)=N1 ZINJLDJMHCUBIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к преимплантационной генетической диагностике моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам Европейской ассоциации по редким заболеваниям (European Organization for Rare Diseases (EURORDIS)) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.The invention relates to preimplantation genetic diagnosis of monogenic diseases. Currently, there are more than 350 million people suffering from a rare disease in the world (according to the RARE Project). The total number of such diseases according to the estimates of the European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) varies from 5 to 7 thousand. At the same time, about 80% of rare diseases have a genetic cause. The genetic basis of the disease allows with high accuracy to predict not only the health of an already born child, but also to assess the risk of having such a child when analyzing the genotypes of parents, as well as conduct genetic diagnostics at the earliest stages. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) of a monogenic disease is becoming a powerful tool for the prevention of such diseases.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации материала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (whole genome amplification - WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких мутаций для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации или деградации образца.The main problem in the genetic diagnosis of embryos is the small initial amount of biomaterial, since the biopsy contains from one to three cells. In this case, to increase the efficiency and accuracy of the analysis, it is important both to completely eliminate the possibility of contamination and to level out the possible effect of uneven and / or incomplete amplification, as well as degradation of the material. This requires the development of a test system with special characteristics. At the same time, the test system is developed taking into account the possibility of using different types of biomaterial - total DNA isolated from different tissues, the product of genome amplification (WGA), as well as single cells. The combination of universality with respect to biomaterial with stepwise amplification of target fragments allows the analysis of several mutations for one sample, including single cells, as well as to identify the situation of incomplete amplification or degradation of a sample.
ПГД моногенного заболевания проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Обязательно наличие заключения врача-генетика и генетической лаборатории, что выявлена определенная мутация в определенном гене, и именно данная мутация является причиной клинического проявления заболевания. ПГД моногенного заболевания рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленной мутацией, обуславливающей этот риск. ПГД позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО, такие, которые не несут мутацию, являющуюся причиной заболевания.PGD monogenic disease is carried out for families with a confirmed molecular genetic nature of the disease. It is imperative that there is a conclusion from a geneticist and a genetic laboratory that a certain mutation is identified in a particular gene, and this particular mutation is the cause of the clinical manifestation of the disease. PGD of a monogenic disease is recommended for families at high risk of having a baby with a severe (incurable) hereditary disease with an established mutation that causes this risk. PGD allows you to choose from all the embryos obtained during IVF, those that do not carry the mutation that causes the disease.
Настоящее изобретение относится к способу преимплатационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии. Мутации гена SMN1, и прежде всего его делеция связаны с развитием заболевания - спинальная мышечная атрофия (СМА) типа 1, которое характеризуется нарушением функции нервных клеток спинного мозга, приводящее к прогрессивному развитию слабости мышц, их атрофии, и в итоге, обездвиживанию пациента. Частота встречаемости этого заболевания очень высока. Каждый 35 человек является бессимптомным носителем мутации, приводящей к СМА, и больной ребенок рождается, когда встречаются 2 таких мутации, со стороны матери и со стороны отца. Это происходит примерно 1 раз на 6000 рождений - в семьях, где никто, как правило, не слышал про такую болезнь, где не было больных родственников, вредных факторов среды - ничего, что могло бы навести на мысль о высоком риске генетических проблем.The present invention relates to a method for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy. Mutations of the SMN1 gene, and primarily its deletion, are associated with the development of the disease - spinal muscle atrophy (CMA) type 1, which is characterized by impaired function of the nerve cells of the spinal cord, leading to the progressive development of muscle weakness, their atrophy, and, as a result, patient immobilization. The incidence of this disease is very high. Each 35 people is an asymptomatic carrier of a mutation leading to SMA, and a sick child is born when 2 such mutations occur, from the mother and the father. This happens about 1 time for 6000 births - in families where, as a rule, no one has heard about such a disease, where there were no sick relatives, harmful environmental factors - nothing that could suggest the high risk of genetic problems.
Причина болезни - мутация в гене, кодирующем белок SMN (survival of motor neuron protein, белок, способствующий выживанию моторных нейронов). Дефицит этого белка приводит к гибели моторных нейронов. Область, кодирующая белок SMN расположена на пятой хромосоме в локусе 5q13 и состоит из гена SMN1 и псевдогена SMN2. Псевдоген отличается от гена всего несколькими нуклеотидами в экзонах 7 и 8 и интронах 7 и 8, однако разница в 7 экзоне приводит к тому, что у 80-90% транскриптов SMN2 отсутствует седьмой экзон. Такой транскрипт не дает начала функциональному белку, и, следовательно, псевдоген SMN2 обеспечивает всего около одной десятой общего количества функционального белка в клетке. Иногда в геноме присутствуют несколько идущих подряд копий SMN2. Примерно 95% случаев спинальной мышечной амиотрофии 1-3 типов вызваны делецией только седьмого или седьмого и восьмого экзона гена SMN1. Остальные 5% - точечными мутациями в этом же гене. Если продукт гена SMN1 нефункционален, благодаря SMN2 все еще остается небольшое количество белка. Поэтому большее число копий SMN2 связано с более мягкой формой заболевания.The cause of the disease is a mutation in the gene encoding the SMN protein (survival of motor neuron protein, a protein that promotes the survival of motor neurons). Deficiency of this protein leads to the death of motor neurons. The region encoding the SMN protein is located on the fifth chromosome at the 5q13 locus and consists of the SMN1 gene and the pseudogen SMN2. The pseudogen differs from the gene in only a few nucleotides in exons 7 and 8 and introns 7 and 8, however, the difference in exon 7 leads to the fact that 80-90% of SMN2 transcripts lack a seventh exon. Such a transcript does not give rise to a functional protein, and therefore, the pseudogen SMN2 provides only about one tenth of the total amount of functional protein in the cell. Sometimes there are several consecutive copies of SMN2 in the genome. Approximately 95% of cases of spinal muscle amyotrophy of types 1-3 are caused by a deletion of only the seventh or seventh and eighth exon of the SMN1 gene. The remaining 5% are point mutations in the same gene. If the product of the SMN1 gene is non-functional, a small amount of protein still remains due to SMN2. Therefore, a greater number of copies of SMN2 is associated with a milder form of the disease.
По степени тяжести и времени появления симптомов развивающиеся в детстве спинальные мышечные амиотрофии делят на три типа.According to the severity and time of onset of symptoms, spinal muscular amyotrophies developing in childhood are divided into three types.
Первый тип - болезнь Верднига-Гоффмана - наиболее тяжелый вариант заболевания. Симптомы появляются в первые полгода жизни. Иногда болезнь можно заподозрить еще до рождения по слабому шевелению плода. Такие дети никогда не смогут держать голову или сидеть самостоятельно. У них возникают сложности с дыханием и приемом пищи. Прогноз неблагоприятен. Второй тип - промежуточный. Первые симптомы появляются в возрасте от полугода до полутора. Дети могут сидеть самостоятельно, стоять при поддержке и не испытывают сложностей при приеме пищи. Однако они имеют повышенный риск развития инфекций дыхательных путей. Третий тип - болезнь Кюгельбера-Веландера - характеризуется более мягким течением. Первые симптомы возникают после полутора лет. Больные способны самостоятельно сидеть, стоять и даже ходить.The first type is Verdnig-Hoffmann disease - the most severe variant of the disease. Symptoms appear in the first six months of life. Sometimes the disease can be suspected even before birth by a slight fetal movement. Such children can never hold their heads or sit on their own. They have difficulty breathing and eating. The forecast is unfavorable. The second type is intermediate. The first symptoms appear between the ages of six months and a half. Children can sit on their own, stand with support and have no difficulty eating. However, they have an increased risk of developing respiratory infections. The third type - Kugelber-Velander disease - is characterized by a milder course. The first symptoms occur after a year and a half. Patients are able to independently sit, stand and even walk.
Перечень иллюстраций:List of illustrations:
Фиг. 1 Семья А с диагнозом СМА 1.FIG. 1 Family A with a diagnosis of SMA 1.
Фиг. 2 Семья Б, в которой родилось 2 ребенка со СМА и носителями мутации являлись оба супруга.FIG. 2 Family B, in which 2 children with SMA and carriers of the mutation were born, both spouses.
Из уровня техники известна опубликованная заявка на получение патента на изобретение в Китае CN105112541A1, которая предлагает к защите способ детекции мутации в гене SMN1 с помощью композиции праймеров, специфично амплифицирующиеся с участками экзона 7 гена SMN1, а также анализа сцепленных с мутацией маркеров типа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Сниженная гетерозиготность и полиморфность косвенных маркеров приводит к снижению вероятности точной диагностики при ПГД, а использование платформы IontorrentProton значительно удорожает анализ, а также делает невозможным тестирование единичных клеток без этапа полногеномной амплификации. Таким образом, предложенный способ детекции отличается высокой стоимостью и продолжительностью проведения.The prior art discloses a patent application for invention in China CN105112541A1, which offers a method for detecting mutations in the SMN1 gene using a primer composition that specifically amplifies with exon 7 regions of the SMN1 gene, as well as analyzing mutation-linked markers such as single nucleotide polymorphisms ( SNP). Reduced heterozygosity and polymorphism of indirect markers reduces the likelihood of accurate diagnosis in PGD, and the use of the IontorrentProton platform significantly increases the cost of analysis, and also makes it impossible to test single cells without the stage of genome-wide amplification. Thus, the proposed detection method has a high cost and duration.
Задачей являлась разработка недорогого и точного способа преимплантационной генетической диагностики моногенного заболевания спинальная мышечная атрофия.The objective was to develop an inexpensive and accurate method for preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease spinal muscular atrophy.
Техническим результатом стало создание точной диагностики делеции экзона 7 гена SMN1, для чего была разработана система с двойной детекцией - прямой и косвенной. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия экзона 7. Для более точных результатов в тест-систему также включен анализ экзона 8 гена SMN1, так как именно его последовательность отличается от гена SMN2 и может выступать маркером количества копий гена SMN1, а также степени конверсии гена SMN1 в SMN2 при наличии таковой. Экзоны 7 и 8 гена SMN1 по последовательности очень схожи с экзонами 7 и 8 гена SMN2, отличаясь лишь 2 нуклеотидами: g.70247773C в 7 экзоне гена SMN1 соответствует g.69372353T в 7 экзоне гена SMN2, g.70248501G в 8 экзоне гена SMN1 соответствует g.69373081A в 8 экзоне гена SMN2. Для различения этих точек была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией. Для этого на расстоянии не более 1 Mb (что соответствует 1% кроссинговера в среднем) от гена SMN1 были выбраны полиморфные локусы, называемые короткие тандемные повторы (STR - single tandem repeat), с гетерозиготностью не менее 0,75. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу полугнездовой ПЦР, позволяющей повысить точность и эффективность анализа. В тест-систему были включены 15 STR локусов: D5S1408, D5S1414, D5S1417, D5S1556, D5S351, D5S435, D5S610, D5S629, D5S637, D5S68.3, D5S68.73, D5S68.77, D5S70.8, D5S70.9, D5S71.2. Праймеры для амплификации представлены на SEQ ID NO 1. The technical result was the creation of an accurate diagnosis of deletion of exon 7 of the SMN1 gene, for which a system was developed with double detection - direct and indirect. Such a system is necessary when working with a small amount of biomaterial, since unstable amplification can lead to loss of information or reduced accuracy of analysis. Direct diagnosis involves the analysis of the presence-absence of exon 7. For more accurate results, the exon 8 analysis of the SMN1 gene is also included in the test system, since its sequence differs from the SMN2 gene and can serve as a marker of the number of copies of the SMN1 gene, as well as the degree of gene conversion SMN1 to SMN2, if any. Exons 7 and 8 of the SMN1 gene are very similar in sequence to exons 7 and 8 of the SMN2 gene, differing only in 2 nucleotides: g.70247773C in exon 7 of the SMN1 gene corresponds to g.69372353T in 7 exon of the SMN2 gene, g.70248501G in 8 exon of SMN1 gene g.69373081A in exon 8 of the SMN2 gene. To distinguish between these points, a test system based on PCR-RFLP was developed. Indirect diagnosis involves analyzing the inheritance of molecular genetic markers linked to a mutation. For this, at a distance of no more than 1 Mb (which corresponds to 1% crossing over on average) from the SMN1 gene, polymorphic loci called short tandem repeats (STR - single tandem repeat) with heterozygosity of at least 0.75 were selected. For each of these loci, primers were selected for amplification according to the type of semi-nested PCR, which allows to increase the accuracy and efficiency of the analysis. 15 STR loci were included in the test system: D5S1408, D5S1414, D5S1417, D5S1556, D5S351, D5S435, D5S610, D5S629, D5S637, D5S68.3, D5S68.73, D5S68.77, D5S70.8, D5S70.9. 2. Amplification primers are shown in SEQ ID NO 1.
Все 15 STR локусов находятся на 5 хромосоме в районе координат 68096973-71817906 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешний праймеров не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров от 120 до 300 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 0,5оС.All 15 STR loci are located on chromosome 5 in the coordinate region 68096973-71817906 (in accordance with hg19). It is important to note that when selecting primers, a number of special requirements were observed: the product length from the outer primers should not exceed 500 bp. (for operating time from fragments obtained during genome-wide amplification), the length of the product from internal primers is from 120 to 300 bp, the high specificity of external primers, the annealing temperature does not differ by more than 0.5 ° C.
Отработка тест-системы для ПГДDevelopment of a test system for PGD
На этапе отработки тест-системы проводится подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, универсальность тест-системы для биообразцов различного типа. При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда полугнездовой ПЦР) с концентрацией 10mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton Х-100, 1 мкг Proteinase K), два или три образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной.At the stage of testing the test system, amplification conditions are selected that are optimal for the primers to work, an analysis of the effectiveness and specificity of PCR amplification in both rounds, and the universality of the test system for various biological samples. When testing the test system, stock dilutions of primers with a concentration of 100mM and working dilutions of primer combinations (combination of primer pairs for rounds 1 and 2 of half-nested PCR) with 10mM concentration of each primer in solution were prepared. Since various types of matrices can be used as part of the clinical material diagnostics, two biopsies of single cells in a special lysis buffer (1 × PCR Buffer, 0.1% Tween-20, 0.1% Triton, were used to test the test system) X-100, 1 μg Proteinase K), two or three samples of the products of the genome-wide amplification of embryo biopsy (WGA), as well as the total DNA of family members isolated from the blood, to compose the family tree.
В рамках полугнездовой ПЦР (seminested-PCR) амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. Во втором раунде проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами. Полугнездовая ПЦР Для первого раунда были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н.As part of a semi-PCR (seminested-PCR) amplification is carried out in two stages. At the first stage, multiplex PCR is performed with all external primers for all loci included in the test system to enrich the sample with all target fragments. In the second round, individual amplification of each fragment with internal primers is carried out. Semi-nested PCR For the first round, highly specific external primers were selected to amplify fragments from 300 to 500 bp.
Для второго раунда были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа на приборе ABI3130XL. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1xPCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO and 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94оС в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45оС в каждом, этап достройки всех матриц 72оС 10 минут. Далее продукты 1-ого раунда были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.В состав ПЦР смеси для второго раунда входили 1xPCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ Loading Buffer (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μM каждого праймера, 1U/μl of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO and 1 μl ПЦР-продукта первого раунда амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95оС в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95оС 30 секунд, отжиг праймеров - 57оС 30 секунд, синтез матрицы - 72оС 1 минута, этап достройки всех матриц 72оС 5 минут.For the second round, primers were selected for amplification of fragments with a length of not more than 350 base pairs, and labels were also introduced for detection by fragment analysis on an ABI3130XL instrument. The PCR mixture for the first round of amplification contained 1xPCR Buffer with Mg2 + (Eurogen, Russia), 0.1 mM of each deoxynucleotide, 0.15 μM of each primer, 2.5 U / μl of HsTaq DNA-polymerase (Eurogen, Russia), 6% of DMSO and 1 μl of total DNA or 2.5 μl of WGA or 5 μl of lysis buffer with the sample as a template. The first stage of amplification was carried out according to the following protocol: stage of denaturation of 94 ° C for 2 minutes, 30 cycles with a decrease in the annealing temperature of the primers from 62 to 45 ° C in each, stage of completion of all matrices 72 ° C for 10 minutes. Next, the products of the 1st round were distributed into individual tubes with one pair of primers at a specific locus. The PCR mixture for the second round included 1xPCR Buffer with Mg2 + (Eurogen, Russia), 0.5xRediLoad ™ Loading Buffer (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM of each deoxynucleotide, 0.2 μM of each primer, 1U / μl of HsTaq DNA polymerase (Eurogen, Russia), 6% of DMSO and 1 μl of the PCR product of the first round of amplification as a template. The second amplification step was carried out according to the following protocol: denaturation step of 95 ° C for 2 minutes, 35 cycles: denaturation of 95 ° C for 30 seconds, annealing of primers - 57 ° C for 30 seconds, matrix synthesis - 72 ° C for 1 minute, the completion phase of all matrices was 72 ° C for 5 minutes.
Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации с ДНК членов семьи). Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные маркеры для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике.Evaluation of the efficiency and specificity of amplification was performed using electrophoresis in 2% agarose gel. The result of agarose gel electrophoresis allows to determine the degree of dilution of amplification products for application to fragment analysis (amplification products with DNA of family members). Fragment analysis of amplification products was performed using capillary electrophoresis on a 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Based on the results of the fragment analysis, a pedigree is compiled and informative markers for each family are marked, which will be further used in clinical diagnosis.
Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).Polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза).Restriction fragment length polymorphism (RFLP) is a method for examining genomic DNA by cutting DNA using restriction endonucleases and further analyzing the size of the resulting fragments (restriction) by gel electrophoresis (DNA electrophoresis).
При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет при помощи ПДРФ идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК, в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. В виду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения.When using this method, fragments of various lengths are observed depending on differences in the nucleotide sequence at the restriction site, which allows using RFLP to identify some differences in the DNA nucleotide sequence, when they are located at the restriction site. Since DNA sequencing technologies can characterize DNA very accurately, RFLP was developed as the first and cheapest method for mass application.
Для детекции мутации была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ, которая позволяет различить экзоны 7 и 8 генов SMN1 и SMN2 и, таким образом, выявить полное отсутствие экзонов 7 и 8 гена SMN1 в образце. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры: g.70247773C (экзон 7) 
Пример 1.Example 1
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой носителями мутации являлись оба супруга. В таком случае риск для потомства составляет 50% (вероятность рождения ребенка с данным заболеванием). Им было рекомендовано проведение ПГД СМА в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, имеющих хотя бы одну копию гена SMN1.Family A appealed to the Genetico SRHM, in which both spouses were carriers of the mutation. In this case, the risk to the offspring is 50% (the probability of having a baby with this disease). He was recommended to conduct PGA SMA as part of IVF for the selection of embryos having at least one copy of the SMN1 gene.
Разработка родословнойPedigree development
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) супругов и их погибшего от СМА 1 типа ребенка для детекции мутации и выявления групп сцепления полиморфных маркеров (см. Фиг. 1). Было проанализировано 15 STR локусов. Из них 12 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам: партнер пациентки - D5S435 126/139, D5S629 145/145, D5S1417 121/119, D5S68.3 301/282, D5S1414 175/161, D5S68.73 305/305, SMN1 ex. 7 -/+, SMN1 ex. 8 -/+, D5S1408 231/227, D5S70.9 130/136, D5S610 167/172, D5S637 137/135, D5S71.2 161/175, D5S351 298/298, пациентка - D5S435 139/135, D5S629 145/152, D5S1417 121/123, D5S68.3 301/292, D5S1414 175/167, D5S68.73 305/307, SMN1 ex. 7 -/+, SMN1 ex. 8 -/+, D5S1408 231/227, D5S70.9 130/136, D5S610 167/172, D5S637 137/140, D5S71.2 161/169, D5S351 302/302, ребенок - D5S435 139/139, D5S629 145/145, D5S1417 121/121, D5S68.3 301/301, D5S1414 175/175, D5S68.73 305/305, SMN1 ex. 7 -/-, SMN1 ex. 8 -/-, D5S1408 231/231, D5S70.9 130/130, D5S610 167/167, D5S637 137/137, D5S71.2 161/161, D5S351 298/302.At the first stage, biomaterial (peripheral blood) of the spouses and their child who died from SMA type 1 was obtained for the detection of mutations and identification of adhesion groups of polymorphic markers (see Fig. 1). 15 STR loci were analyzed. Of these, 12 were informative by mother and / or father. Thus, embryo samples were tested only for informative markers. The results obtained by informative markers: patient's partner - D5S435 126/139, D5S629 145/145, D5S1417 121/119, D5S68.3 301/282, D5S1414 175/161, D5S68.73 305/305, SMN1 ex. 7 - / +, SMN1 ex. 8 - / +, D5S1408 231/227, D5S70.9 130/136, D5S610 167/172, D5S637 137/135, D5S71.2 161/175, D5S351 298/298, patient - D5S435 139/135, D5S629 145/152 , D5S1417 121/123, D5S68.3 301/292, D5S1414 175/167, D5S68.73 305/307, SMN1 ex. 7 - / +, SMN1 ex. 8 - / +, D5S1408 231/227, D5S70.9 130/136, D5S610 167/172, D5S637 137/140, D5S71.2 161/169, D5S351 302/302, child - D5S435 139/139, D5S629 145/145 , D5S1417 121/121, D5S68.3 301/301, D5S1414 175/175, D5S68.73 305/305, SMN1 ex. 7 - / -, SMN1 ex. 8 - / -, D5S1408 231/231, D5S70.9 130/130, D5S610 167/167, D5S637 137/137, D5S71.2 161/161, D5S351 298/302.
ПГД CMAPGD CMA
В цикле ЭКО был получен 1 эмбрион, проведена его биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% PVP (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию Генетико. Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).In the IVF cycle, 1 embryo was obtained, its biopsy was performed on the 5th day of development (in the IVF clinic), the biopsy in the WGA buffer (1xPBS (Invitrogen, USA), 1% PVP (Fertipro, Belgium)) was sent to the Genetico laboratory. To control the contamination at different stages of work with the sample, the laboratory developed a control system: control the contamination of the biopsy buffer, control the contamination during transportation (one tube with the buffer cannot be opened by the embryologist), control the contamination of each sample (sample of the medium from the last wash drop of biopsy material). All these controls, together with the samples, go through the stage of genome-wide amplification, after which the smallest amount of DNA contaminating the controls will be noticeable. Full genome amplification was performed using a commercial SurePlex kit (Illumina, USA).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали в 1 раунде в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции мутации и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. 2 раунд проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были выявлены группы сцепления, унаследованные эмбрионом, а также проведен анализ на наличие у него хотя бы одной копии гена SMN1. Полученные результаты: D5S435 126/139, D5S629 145/145, D5S1417 119/121, D5S68.3 282/301, D5S1414 161/175, D5S68.73 305, SMN1 ex. 7 +/-, SMN1 ex. 8 +/-, D5S1408 227/231, D5S70.9 136/130, D5S610 172/167, D5S637 135/137, D5S71.2 175/161, D5S351 298/302.The product of full genome amplification, as well as the DNA of all family members, was amplified in round 1 in multiplex PCR with primers for mutation detection and primers for family A informative polymorphic markers in accordance with the developed protocol for the test system. Round 2 was carried out for each marker separately in accordance with the developed protocol for the test system. Thus, cohesion groups inherited by the embryo were identified, and an analysis was made for the presence of at least one copy of the SMN1 gene. The results obtained: D5S435 126/139, D5S629 145/145, D5S1417 119/121, D5S68.3 282/301, D5S1414 161/175, D5S68.73 305, SMN1 ex. 7 +/-, SMN1 ex. 8 +/-, D5S1408 227/231, D5S70.9 136/130, D5S610 172/167, D5S637 135/137, D5S71.2 175/161, D5S351 298/302.
По результатам прямой и косвенной диагностики у эмбриона обнаружено носительство мутации без риска клинических проявлений заболевания. С согласия родителей для эмбриона провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий, который не выявил нарушений. По результатам всех проведенных анализов эмбрион был рекомендован к переносу. Перенос оказался результативным, беременность закончилась рождением здорового ребенка.According to the results of direct and indirect diagnostics, an embryo revealed a carriage of a mutation without the risk of clinical manifestations of the disease. With the consent of the parents, preimplantation genetic screening of chromosomal abnormalities was performed for the embryo, which did not reveal any abnormalities. According to the results of all analyzes performed, the embryo was recommended for transfer. The transfer was successful, the pregnancy ended in the birth of a healthy baby.
Пример 2.Example 2
В ЦГРМ Генетико обратилась семья Б, в которой родилось 2 ребенка со СМА и носителями мутации являлись оба супруга (см. Фиг. 2). В таком случае риск для потомства составляет 50% (вероятность рождения ребенка с данным заболеванием). Им было рекомендовано проведение ПГД СМА в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, имеющих хотя бы одну копию гена SMN1. Однако пара забеременела естественным путем, поэтому проводилась инвазивная пренатальная диагностика.Genetiko contacted the CGRM family B, in which 2 children were born with SMA and both spouses were carriers of the mutation (see Fig. 2). In this case, the risk to the offspring is 50% (the probability of having a baby with this disease). He was recommended to conduct PGA SMA as part of IVF for the selection of embryos having at least one copy of the SMN1 gene. However, the couple became pregnant naturally, so an invasive prenatal diagnosis was performed.
Пренатальная диагностикаPrenatal diagnosis
В лабораторию поступил плодный материал (ворсины хориона, полученных при аспирации в клинике ЭКО на 10-11 неделе естественной беременности пациентки), а также кровь родителей. Из биоматериалов была выделена ДНК и проведена прямая и косвенная диагностика с помощью тест-системы, разработанной для ПГД СМА: ПЦР в 2 раундах в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Были выявлены группы сцепления, унаследованные плодом, а также проведен анализ наличия хотя бы одной копии гена SMN1 с помощью ПЦР-ПДРФ в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. В рамках пренатальной диагностики доступно большее количество биоматериала плода, чем при ПГД. Это позволяет использовать для диагностики метод MLPA (коммерческий набор SALSA MLPA Р021 SMA (MRC-Holland, Нидерланды)), который детектирует не только наличие хотя бы одной копии гена, но и позволяет оценить количество копий экзонов 7 и 8 обоих генов SMN1 и SMN2. Такая диагностика подтвердила результат, полученный с помощью разработанной тест-системы и выявила наличие двух копий гена SMN1. Беременность не была прервана, родился здоровый ребенок.The fetal material (chorionic villi obtained by aspiration in the IVF clinic at 10-11 weeks of the patient’s natural pregnancy) and the blood of the parents arrived at the laboratory. DNA was extracted from biomaterials and direct and indirect diagnostics was carried out using a test system developed for PGA SMA: PCR in 2 rounds in accordance with the developed protocol for the test system. The linkage groups inherited by the fetus were identified, and an analysis was made of the presence of at least one copy of the SMN1 gene using PCR-RFLP in accordance with the developed protocol for the test system. As part of prenatal diagnosis, a greater amount of fetal biomaterial is available than with PGD. This makes it possible to use the MLPA method (commercial SALSA MLPA Р021 SMA kit (MRC-Holland, Netherlands)) for diagnostics, which detects not only the presence of at least one copy of the gene, but also allows one to estimate the number of copies of exons 7 and 8 of both genes SMN1 and SMN2. Such diagnostics confirmed the result obtained using the developed test system and revealed the presence of two copies of the SMN1 gene. Pregnancy was not interrupted, a healthy baby was born.
Общество с ограниченной ответственностью «Центр Генетики и Репродуктивной Медицины «ГЕНЕТИКО»Limited Liability Company “Center for Genetics and Reproductive Medicine“ GENETICO ”
Способ преимплантационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии типа 1Method for preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy type 1
Праймеры для амплификацииAmplification primers
SEQ ID NO 1SEQ ID NO 1
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017129586A RU2671156C1 (en) | 2017-08-21 | 2017-08-21 | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017129586A RU2671156C1 (en) | 2017-08-21 | 2017-08-21 | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2671156C1 true RU2671156C1 (en) | 2018-10-29 |
Family
ID=64103106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017129586A RU2671156C1 (en) | 2017-08-21 | 2017-08-21 | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2671156C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2769300C1 (en) * | 2021-03-29 | 2022-03-30 | Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Test system for pre-implantation genetic testing of type 1 spinocerebellar ataxia |
| RU2796350C1 (en) * | 2021-12-16 | 2023-05-22 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" (ФГБНУ "МГНЦ") | Molecular genetic system for detection of deletion smn1 exon 7 suitable for neonatal screening |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
| EP2021499A2 (en) * | 2005-12-16 | 2009-02-11 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements |
| CN106676190A (en) * | 2017-03-02 | 2017-05-17 | 陈万金 | Spinal muscular atrophy related gene mutation detection kit and application thereof |
| CN106834502A (en) * | 2017-03-06 | 2017-06-13 | 明码（上海）生物科技有限公司 | A kind of spinal muscular atrophy related gene copy number detection kit and method based on gene trap and two generation sequencing technologies |
| RU2636457C2 (en) * | 2016-04-13 | 2017-11-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ГНЦДК" Минздрава России) | Oligonucleotide biochip for identification of genetic determinant of neisseria gonorrhoeae resistance to antimicrobial preparations, set of oligonucleotides used for immobilisation on biochip |
-
2017
- 2017-08-21 RU RU2017129586A patent/RU2671156C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
| EP2021499A2 (en) * | 2005-12-16 | 2009-02-11 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements |
| RU2636457C2 (en) * | 2016-04-13 | 2017-11-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ГНЦДК" Минздрава России) | Oligonucleotide biochip for identification of genetic determinant of neisseria gonorrhoeae resistance to antimicrobial preparations, set of oligonucleotides used for immobilisation on biochip |
| CN106676190A (en) * | 2017-03-02 | 2017-05-17 | 陈万金 | Spinal muscular atrophy related gene mutation detection kit and application thereof |
| CN106834502A (en) * | 2017-03-06 | 2017-06-13 | 明码（上海）生物科技有限公司 | A kind of spinal muscular atrophy related gene copy number detection kit and method based on gene trap and two generation sequencing technologies |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807604C2 (en) * | 2019-09-05 | 2023-11-17 | Иллюмина, Инк. | Methods and systems for diagnostics according to whole genome sequencing data |
| RU2769300C1 (en) * | 2021-03-29 | 2022-03-30 | Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Test system for pre-implantation genetic testing of type 1 spinocerebellar ataxia |
| RU2796350C1 (en) * | 2021-12-16 | 2023-05-22 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" (ФГБНУ "МГНЦ") | Molecular genetic system for detection of deletion smn1 exon 7 suitable for neonatal screening |
| RU2816650C1 (en) * | 2023-11-24 | 2024-04-02 | Публичное акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Method for preimplantation genetic testing of smith-lemli-opitz syndrome |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11542556B2 (en) | Single nucleotide polymorphism in HLA-B*15:02 and use thereof | |
| CA2887218A1 (en) | System for amplification of a fetal dna species | |
| US20220228214A1 (en) | Assay for quantitating the extent of methylation of a target site | |
| US20100092959A1 (en) | Single nucleotide polymorphisms as genetic markers for childhood leukemia | |
| JP6346557B2 (en) | Method for detecting HLA-A * 31: 01 allele | |
| RU2671156C1 (en) | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy | |
| KR20130041767A (en) | Normal-tension glaucoma susceptibility gene and method for using the same | |
| JP6053681B2 (en) | Method and kit for diagnosing glaucoma in dogs | |
| KR102269653B1 (en) | A SNP marker composition and a method for diagnosis or prediction of osteochondrodyplasia in cats | |
| Griffin et al. | What is Karyomapping and where does it fit in the world of preimplantation genetic diagnosis (PGD)? | |
| RU2777086C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of epidermolysis bullosa | |
| RU2777091C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of breast and ovarian cancer | |
| RU2772938C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of familial hypertrophic cardiomyopathy | |
| RU2799538C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2 | |
| RU2795796C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for achondroplasia | |
| RU2777081C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of louis-bar syndrome | |
| RU2775416C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of duchenne/becker muscular dystrophy | |
| RU2769300C1 (en) | Test system for pre-implantation genetic testing of type 1 spinocerebellar ataxia | |
| RU2777084C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of type 1 familial focal epilepsy | |
| RU2791878C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of non-syndromic sensorineural hearing loss | |
| RU2795824C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of type 1 hereditary multiple osteochondromas | |
| RU2792147C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for fanconi anemia | |
| RU2816650C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of smith-lemli-opitz syndrome | |
| RU2742956C1 (en) | Method of preimplantation genetic testing of metachromatic leukodystrophy | |
| RU2795483C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of type 4 osteopetrosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190822 |
|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -MM4A- IN JOURNAL 17-2020 |