RU2777086C1 - Method for pre-implantation genetic testing of epidermolysis bullosa - Google Patents
Method for pre-implantation genetic testing of epidermolysis bullosa Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777086C1 RU2777086C1 RU2021111928A RU2021111928A RU2777086C1 RU 2777086 C1 RU2777086 C1 RU 2777086C1 RU 2021111928 A RU2021111928 A RU 2021111928A RU 2021111928 A RU2021111928 A RU 2021111928A RU 2777086 C1 RU2777086 C1 RU 2777086C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- primers
- fout
- rout
- pcr
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 title abstract 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 101150056204 COL7A1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101100496573 Homo sapiens COL7A1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 5
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 22
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 6
- 102100024335 Collagen alpha-1(VII) chain Human genes 0.000 description 5
- 101000909498 Homo sapiens Collagen alpha-1(VII) chain Proteins 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101100114361 Arabidopsis thaliana COL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028698 Nail dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000617 arm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000001513 elbow Anatomy 0.000 description 1
- 208000004298 epidermolysis bullosa dystrophica Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 201000000744 recessive dystrophic epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 238000005287 template synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.The invention relates to preimplantation genetic testing of monogenic diseases. Currently, there are more than 350 million people in the world suffering from a rare disease (according to the RARE Project). The total number of such diseases, according to the estimates of the European Organization for Rare Diseases (EURORDIS), varies from 5 to 7 thousand. At the same time, about 80% of rare diseases have a genetic cause. The known genetic basis of the disease makes it possible to predict with high accuracy not only the health of an already born child, but also to assess the risk of having such a child by analyzing the genotypes of the parents, as well as to conduct genetic diagnostics at the earliest stages. Preimplantation genetic testing (PGT) of a monogenic disease is becoming a powerful tool for the prevention of such diseases.
Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования буллезного эпидермолиза. Буллезный Эпидермолиз - это аутосомно-рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз представляет собой тяжелое кожное заболевание, которое начинается при рождении и характеризуется повторяющимися пузырями на уровне sublamina densa под базальной кожной мембраной. Буллезный Эпидермолиз встречается с частотой от 1:30000 до 1:1000000. Это заболевание приводит к Рецессивному дистрофическому тяжелому генерализованному подтипу (ранее Аллопо-Сименса), характеризуется генерализованным образованием пузырей, эрозиями, атрофическими рубцами, ониходистрофией и утратой ногтей, псевдосиндактилией пальцев рук и ног. Поражение кожи носит обширный и устойчивый к терапии характер. Рецессивный дистрофический генерализованный другой подтип (ранее не-Аллопо-Сименса) характеризуется локализацией пузырей на руках, ногах, коленях и локтях, иногда на сгибах, на туловище. С возрастом развивается. При аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 25%.The present invention relates to a method for preimplantation genetic testing of epidermolysis bullosa. Epidermolysis bullosa, an autosomal recessive dystrophic epidermolysis bullosa, is a severe skin disease that begins at birth and is characterized by recurring blisters at the level of the sublamina densa under the basement membrane of the skin. Epidermolysis bullosa occurs with a frequency of 1:30,000 to 1:1,000,000. This disease results in the Recessive dystrophic severe generalized subtype (formerly Allopo-Siemens), characterized by generalized blistering, erosions, atrophic scarring, onychodystrophy and loss of nails, and pseudosyndactyly of the fingers and toes. The skin lesion is extensive and resistant to therapy. The recessive dystrophic generalized other subtype (formerly non-Allopo-Siemens) is characterized by localization of blisters on the arms, legs, knees and elbows, sometimes on the folds, on the torso. Develops with age. With an autosomal recessive type of inheritance of the disease, the probability of having a child with this disease in the family is 25%.
К заболеванию буллезный эпидермолиз могут приводить патогенные генетические варианты в гене COL7A1, располагающемся на хромосоме 3. [Shinkuma S. Clinical, cosmetic and investigational dermatology, 8, 275-284. 2015] Этот ген кодирует белок альфа цепь калагена 7, который функционирует как якорная фибрилла между наружным эпителием и нижележащей стромой.Epidermolysis bullosa can be caused by pathogenic genetic variants in the COL7A1 gene located on chromosome 3. [Shinkuma S. Clinical, cosmetic and investigational dermatology, 8, 275-284. 2015] This gene encodes the calagen 7 alpha chain protein, which functions as an anchor fibril between the outer epithelium and the underlying stroma.
ПГТ буллезного эпидермолиза проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 г. Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленными патогенными вариантами, обуславливающими этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенных вариантов в компаунд-гетерозиготе и, следовательно, без риска развития заболевания.Epidermolysis bullosa PGT is performed for families with a confirmed molecular genetic nature of the disease. It is important to note that the substantiation of the pathogenicity and causation of genetic variants occurs before the PGT of a monogenic disease and is not included either in the goals and objectives of the PGT of a monogenic disease, or in the complex of measures for conducting PGT of a monogenic disease. Pathogenicity is assessed according to the international standard - according to the criteria described in 2015 by the American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP) in the search for the molecular genetic cause of the disease. PGT is recommended for families at high risk of having a child with a severe (incurable) hereditary disease with established pathogenic variants that cause this risk. PGT allows you to select from all IVF (in vitro fertilization) embryos, embryos without pathogenic variants in the compound heterozygote and, therefore, without the risk of developing the disease.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.The main problem in the genetic diagnosis of embryos is the small initial amount of biomaterial, since the biopsy contains from one to three cells. In this case, to improve the efficiency and accuracy of the analysis, it is important both to completely exclude the possibility of contamination and to neutralize the possible effect of uneven and/or incomplete amplification, as well as degradation of the biomaterial. This requires the development of a test system with special characteristics. At the same time, the test system is being developed taking into account the possibility of using different types of biomaterial - total deoxyribonucleic acid (DNA) isolated from different tissues, the product of Whole Genome Amplification (WGA), as well as single cells. The combination of versatility with respect to the biomaterial with stepwise amplification of target fragments makes it possible to analyze several pathogenic variants for a single sample, including on single cells, and also to identify the situation of incomplete amplification, contamination, or sample degradation. Another feature of PGT is the lack of information about the biological characteristics of the embryo: unlike an adult, an embryo can have any chromosomal abnormalities that complicate the task of assessing the status of an embryo for a specific genetic variant. Therefore, a test system for PGT of a monogenic disease should make it possible to identify such cases and evaluate their impact on the reliability of the diagnostic result.
Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ буллезного эпидермолиза, предложенное Xavier Vendrell и коллегами [Xavier Vendrell et al., 2011] для детекции мутаций в гене COL7A1 с помощью мультплексной гнездовой ПЦР в 2 раунда на единичных клетках. А так же использование не только прямой диагностики мутации, но и косвенной диагностики с помощью анализа наследования аллелей полиморфных маркеров, сцепленных с патогенным вариантом. Такой подход позволяет повысить достоверность результата ПГТ-М за счет увеличения вероятности выявления случая ADO при непосредственном тесте на наличие патогенного варианта у эмбриона.The closest technical solution is epidermolysis bullosa PGT proposed by Xavier Vendrell and colleagues [Xavier Vendrell et al., 2011] for the detection of mutations in the COL7A1 gene using 2-round multiplex nested PCR on single cells. As well as the use of not only direct diagnosis of a mutation, but also indirect diagnosis by analyzing the inheritance of alleles of polymorphic markers linked to a pathogenic variant. This approach improves the reliability of the PGT-M result by increasing the probability of detecting an ADO case during a direct test for the presence of a pathogenic variant in an embryo.
Представленный нами метод ПГТ буллезного эпидермолиза решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.The PGT method of epidermolysis bullosa presented by us solves the problem of developing a more accurate method for preimplantation genetic testing of this monogenic disease without the use of expensive devices and reagents, which could be used on various types of biomaterial: DNA isolated from different tissues, whole genome amplification product (WGA), single cells.
Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000003.12:g.48592390-48592384del (c.1054_1060del, p.Gly352LeufsTer5) в гене COL7A1 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Данный вариант не упоминался ранее в литературе как причина буллезного эпидермолиза. Однако, так как вызываемая этим вариантом утрата функции кодируемого белка представляет собой известный механизм патогенеза буллезного эпидермолиза, не встречается у здоровых людей - он был расценен как патогенный. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000003.12:g.48592390-48592384del (c.1054_1060del, p.Gly352LeufsTer5) типа делеция (отсутствие нескольких нуклеотидов, англ. Deletion del) были подобраны праймеры, которые позволяют произвести детекцию мутации по разнице длин фрагментов с помощью капиллярного электрофореза. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена COL7A1 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например, пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2-х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген COL7A1, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген COL7A1 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 22 STR локусов для гена COL7A1: D3S4640, D3S4748, D3S4750, D3S4790, D3S4792, D3S4799, D3S4804, D3S2420, D3S4842, D3S4860, D3S1581, D3S4886, D3S4893, D3S4923, D3S4924, D3S4940, D3S3629, D3S4958, D3S4995, D3S3667, D3S5003, D3S5059. Праймеры для амплификации находятся на 3 хромосоме в районе координат 46403832-50594050 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более чем на 1°С.The technical result was the creation of a test system for the diagnosis of pathogenic variants (the nucleotide number in the reference sequence of genomic DNA is indicated by the prefix NC, the nucleotide number in the reference sequence of the coding transcript is indicated by the prefix NM): NC_000003.12:g. .Gly352LeufsTer5) in the COL7A1 gene with a dual detection system - direct and indirect. This variant has not been previously mentioned in the literature as a cause of epidermolysis bullosa. However, since the loss of function of the encoded protein caused by this variant is a known pathogenic mechanism for epidermolysis bullosa, it does not occur in healthy individuals - it has been regarded as pathogenic. Such a system is necessary when working with a small amount of biomaterial, since unstable amplification can lead to loss of information or reduced accuracy of the analysis. Direct diagnosis involves the analysis of the direct presence-absence of a pathogenic variant. In this case, for the genetic variant NC_000003.12:g.48592390-48592384del (c.1054_1060del, p.Gly352LeufsTer5) of the deletion type (the absence of several nucleotides, the using capillary electrophoresis. Indirect diagnosis consists in the analysis of the inheritance of molecular genetic markers linked to a mutation, i.e. inherited with it. To do this, at a distance of no more than 3 mB (which corresponds to 3% crossover on average) from the COL7A1 gene in each direction, polymorphic loci called STR (short tandem repeat - short tandem repeat) were selected with a heterozygosity of at least 0.70 to ensure maximum informativity of indirect diagnostics. STRs are repeats of 2 or more nucleotides located one after another (for example, an adenine-cytosine (AC) pair repeated several times in a row: ACACACACA) and are present in large numbers in the human genome. The number of repeats in each of them may vary from individual to individual, and may also be different in the same person on 2 homologous chromosomes. Heterozygosity above 0.70 means that there is a high probability that in the same person the number of nucleotide repeats in a given STR on one chromosome will differ from the number of repeats in the same STR on a homologous chromosome, in other words, the alleles of this marker in this person will differ in length. When amplifying a fragment containing such a marker, amplicons of two different lengths will be obtained. By analyzing the number of repeats in several markers surrounding the pathogenic variant and examining how they are inherited in the tested family, linkage between the alleles of the markers and the pathogenic variant can be established. The diagnostic value of studying the number of repeats in these markers in embryos is that by which allele of each of the markers was inherited by the embryo, one can judge whether the embryo inherited the COL7A1 gene carrying the pathogenic variant, or whether it inherited the COL7A1 gene on the other hand. , a homologous chromosome that does not contain a pathogenic variant. For each of these loci, primers were selected for amplification by the type of nested or semi-nested PCR in 2 rounds, which makes it possible to increase the accuracy and efficiency of amplification. В тест-систему были включены 22 STR локусов для гена COL7A1: D3S4640, D3S4748, D3S4750, D3S4790, D3S4792, D3S4799, D3S4804, D3S2420, D3S4842, D3S4860, D3S1581, D3S4886, D3S4893, D3S4923, D3S4924, D3S4940, D3S3629, D3S4958, D3S4995 , D3S3667, D3S5003, D3S5059. Primers for amplification are located on the 3rd chromosome in the region of coordinates 46403832-50594050 (according to hg19). It is important to note that during the selection of primers, a number of special requirements were observed: the length of the product with external primers for the first round of PCR should not exceed 500 bp. (for production from fragments obtained by whole genome amplification), product length from internal primers for the second round of PCR from 120 to 350 bp, high specificity of external primers, annealing temperature does not differ by more than 1°C.
Подготовительный этап ПГТPreparatory stage of the PGT
На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.At the preparatory stage, the test system is being developed: selection of amplification conditions that are optimal for primers to work, analysis of the efficiency and specificity of PCR amplification in both rounds, assessment of the universality of the test system for biosamples of various types (DNA, WGA product, single cells). When testing the test system, stock dilutions of primers were prepared with a concentration of 100 mM, and working dilutions of primer combinations (a combination of pairs of primers for rounds 1 and 2 of PCR) with a concentration of 10 mM of each primer in solution. Since various types of matrices can be used as part of the diagnosis of clinical material, two biopsies of single cells were used in the development of the test system, which are in a special lysis buffer (1 × PCR Buffer, 0.1% Tween-20, 0.1% Triton X-100, 1 μg Proteinase K), two samples of the products of whole genome amplification of embryo biopsies (WGA), as well as total DNA of family members isolated from blood, for compiling a pedigree and identifying the linkage of a pathogenic variant with alleles of polymorphic markers.
В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.In nested and semi-nested PCR, amplification is carried out in two steps. At the first stage, multiplex PCR is performed with all external primers for all loci included in the test system to enrich the sample with all target fragments. At the second stage, individual amplification of each fragment with internal primers is carried out.
Полугнездовая ПЦРSemi-nested PCR
Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п. н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μΜ каждого праймера, 2,5 U/μΙ of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-го этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.For the first stage, external highly specific primers were selected to amplify fragments from 300 to 500 bp. For the second stage, primers were selected to amplify fragments no longer than 350 base pairs, and labels were introduced for detection by fragment analysis. The PCR mixture for the first round of amplification contained 1×PCR Buffer with Mg2+ (Evrogen, Russia), 0.1 mM of each deoxynucleotide, 0.15 μΜ of each primer, 2.5 U/μΙ of HsTaq DNA-polymerase (Evrogen, Russia), 6% of DMSO and 1 µl total DNA or 2.5 µl WGA or 5 µl lysis buffer with sample as template. The first stage of amplification was carried out according to the following protocol: the stage of denaturation at 94°C for 2 minutes, 30 cycles with a decrease in the annealing temperature of the primers from 62 to 45°C in each, the stage of completion of all templates at 72°C for 10 minutes. Next, the products of the 1st stage were placed into individual tubes with one pair of primers per specific locus.
В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×PCR буфер с Мg2+ (Евроген, Россия), 0.5×RediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μΜ каждого праймера, 1 U/μΙ ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μΙ ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).The PCR mixture for the second stage included 1×PCR buffer with Mg2+ (Evrogen, Russia), 0.5×RediLoad™ loading buffer (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM of each deoxynucleotide, 0.2 μM of each primer, 1 U/μΙ of DNA polymerase HsTaq (Evrogen, Russia), 6% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 1 μΙ PCR product of the first stage of amplification as a template. The second stage of amplification was carried out according to the following protocol: denaturation stage at 95°C for 2 minutes, 35 cycles: denaturation at 95°C for 30 seconds, primer annealing at 57°C for 30 seconds, template synthesis at 72°C for 1 minute, completion of all templates 72°C 5 minutes. Evaluation of the efficiency and specificity of amplification was performed using electrophoresis in 2% agarose gel. The result of electrophoresis in agarose gel allows you to determine the required degree of dilution of the amplification products for application to fragment analysis (amplification products of DNA of family members).
Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона). Детекция патогенного варианта NC_000003.12:g.48592390-48592384del (c.1054_1060del, p.Gly352LeufsTer5), проводилась с помощью праймеров для амплификации: Внешние праймеры:Fragment analysis of the amplification products was performed using capillary electrophoresis on a 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Based on the results of the fragment analysis, a pedigree is compiled and informative polymorphic STR loci for each family are noted, which will later be used in clinical diagnostics. Loci are divided into non-informative (the carrier of the pathogenic variant is homozygous for this locus), semi-informative (alleles for this marker are the same on some and parental chromosomes), informative (alleles of this marker are different on all chromosomes of the parents, which makes it possible to distinguish each of them when analyzing the genotype of the embryo ). Detection of the pathogenic variant NC_000003.12:g.48592390-48592384del (c.1054_1060del, p.Gly352LeufsTer5) was carried out using amplification primers: External primers:
5'-CTCAGGACTCTACAGCCTTG-3' (Fout),5'-CTCAGGACTCTACAGCCTTG-3' (Fout),
5'-CGAGTACCAAGTGACTGTGA-3' (Rout),5'-CGAGTACCAAGTGACTGTGA-3' (Rout),
Внутренние праймеры:Internal primers:
5'-ACCATCCAGAATACCACAGC-3' (rin) в паре с Fout.5'-ACCATCCAGAATACCACAGC-3' (rin) paired with Fout.
Пример 1Example 1
Пациенты АPatients A
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием буллезный эпидермолиз с компаунд-гетерозиготным носительством патогенных вариантов g.48592390-48592384delGGTGCCA, в гене COL7A1. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания буллезный эпидермолиз в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.Family A turned to the Center for Genetico Medical Research, in which a child with epidermolysis bullosa was born with compound-heterozygous carriage of pathogenic variants g.48592390-48592384delGGTGCCA, in the COL7A1 gene. The couple was recommended to undergo PGT for epidermolysis bullosa as part of IVF to select embryos that did not inherit the disease.
Гаплотипирование семьиFamily haplotyping
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 22 STR локусов. Из них оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер пациентки: D3S4640 - 303/290, D3S4790 - 278/276, D3S4799 - 228/230, D3S4804 - 212/207, D3S4842 - 199/199, D3S4860 - 272/273, D3S1581 - 154/156, COL7A1:del7 - Mut/N, D3S4886 - 211/203, D3S3629 - 186/184, D3S4958 - 125/122, D3S4995 - 175/175, D3S5059 - 258/258; пациентка: D3S4640 - 303/301, D3S4790 - 278/278, D3S4799 - 228/228, D3S4804 - 212/212, D3S4842 - 199/206, D3S4860 - 272/273, D3S1581 - 154/156, COL7A1:del7 - Mut/N, D3S4886 - 211/211, D3S3629 - 186/178, D3S4958 - 125/116, D3S4995 - 175/179.D3S5059 - 258/264; ребенок с заболеванием: D3S4640 - 303/303, D3S4790 - 278/278, D3S4799 - 228/228, D3S4804 - 212/212, D3S4842 - 199/199, D3S4860 - 272/272, D3S1581 - 154/154, COL7A1:del7 - Mut/Mut, D3S4886 - 211/211, D3S3629 - 186/186, D3S4958 - 125/125, D3S4995 - 175/175, D3S5059 - 258/258.At the first stage, biomaterial (peripheral blood) of family members was obtained to detect the pathogenic variant and identify linkage groups of alleles of polymorphic markers. 22 STR loci were analyzed. Of these, they turned out to be informative on the mother and / or father. Thus, embryo samples were tested only for informative markers. The results obtained for informative markers (alleles indicated on one side of the "/" symbol are located on the same chromosome for different markers, that is, they form a linkage group): patient's partner: D3S4640 - 303/290, D3S4790 - 278/276, D3S4799 - 228/230 D3S4804 - 212/207 D3S4842 - 199/199 D3S4860 - 272/273 D3S1581 - 154/156 125/122, D3S4995 - 175/175, D3S5059 - 258/258; patient: D3S4640 - 303/301, D3S4790 - 278/278, D3S4799 - 228/228, D3S4804 - 212/212, D3S4842 - 199/206, D3S4860 - 272/273, D3S1581 - 154/156, COL7A - Mut7A: N, D3S4886 - 211/211, D3S3629 - 186/178, D3S4958 - 125/116, D3S4995 - 175/179. D3S5059 - 258/264; child with disease: D3S4640 - 303/303, D3S4790 - 278/278, D3S4799 - 228/228, D3S4804 - 212/212, D3S4842 - 199/199, D3S4860 - 272/272, D3S1581 - 154/154, COL7 Mut/Mut, D3S4886 - 211/211, D3S3629 - 186/186, D3S4958 - 125/125, D3S4995 - 175/175, D3S5059 - 258/258.
В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у партнера пациентки и у пациентки с патогенным вариантом были связаны следующие аллели STR-маркеров: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258.As a result of haplotyping, it was concluded that the following alleles of STR markers were associated in the patient's partner and in the patient with the pathogenic variant: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258.
Преимплантационное генетическое тестированиеPreimplantation genetic testing
В цикле ЭКО было получено 5 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США). In the IVF cycle, 5 embryos were obtained, a biopsy was performed on the 5th day of development (in the IVF clinic), the biopsy in WGA buffer (1 × PBS (Invitrogen, USA), 1% polyvinylpyrrolidone (PVP) (Fertipro, Belgium)) was sent to the laboratory "Genetics". To control contamination at different stages of working with a sample, the laboratory developed a system of controls: control of contamination of the biopsy buffer, control of contamination during transportation (one test tube with buffer is not opened by the embryologist), control of contamination of each sample (sample of the medium from the last wash drop of biopsy material). All these controls, together with the samples, go through the stage of whole genome amplification, after which the smallest amount of DNA that contaminated the controls will be noticeable. Genome-wide amplification was performed using the commercial SurePlex kit (Illumina, USA).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: D3S4640 - 303/301, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212D3S4842 - 199/206, D3S4860 - 272/ADO, D3S1581 - 154/ADO, COL7A1:del7 - mut/ND3S4886 - 211, D3S3629 - 186/178D3S4958 - 125/116, D3S4995 - 175/179 D3S5059 - 258/264; эмбрион2: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, COL7A1:del7 - mut, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258; эмбрион3: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, COL7A1:del7 - mut, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258; эмбрион4: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, COL7A1:del7 - mut, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258 эмбрион5: D3S4640 - 290/303, D3S4790 - 276/278, D3S4799 - 230/228, D3S4804 - 207/212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 273/272, D3S1581 - 156/154, COL7A1:del7 - N/mut, D3S4886 - 203/211, D3S3629 - 184/186, D3S4958 - 122/125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258.The product of whole genome amplification, as well as the DNA of all family members, was amplified at stage 1 in multiplex PCR with primers for the detection of the pathogenic variant and primers for polymorphic markers informative for family A in accordance with the protocol for the test system developed as part of the preparatory stage. At stage 2, amplification was performed for each marker separately in accordance with the developed protocol for the test system. In this way, the linkage groups inherited by each embryo were established. Results obtained: embryo 1: D3S4640 - 303/301, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212D3S4842 - 199/206, D3S4860 - 272/ADO, D3S1581 - 154/ADO, COL7A1:del7 - mut/ND3S4182 - 186/178D3S4958 - 125/116, D3S4995 - 175/179 D3S5059 - 258/264; эмбрион2: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, COL7A1:del7 - mut, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059-258; эмбрион3: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, COL7A1:del7 - mut, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059-258; эмбрион4: D3S4640 - 303, D3S4790 - 278, D3S4799 - 228, D3S4804 - 212, D3S4842 - 199, D3S4860 - 272, D3S1581 - 154, COL7A1:del7 - mut, D3S4886 - 211, D3S3629 - 186, D3S4958 - 125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258 embryos - N/mut, D3S4886 - 203/211, D3S3629 - 184/186, D3S4958 - 122/125, D3S4995 - 175, D3S5059 - 258.
По результатам прямой и косвенной диагностики 2 эмбриона не унаследовали заболевание (эмбрион 1 и эмбрион 5), у 3 эмбрионов выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию (эмбрион 2, 3, 4). С согласия родителей для эмбрионов, не унаследовавших заболевание, провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов 2 эмбриона были рекомендованы к переносу.According to the results of direct and indirect diagnostics, 2 embryos did not inherit the disease (embryo 1 and embryo 5), 3 embryos had a haplotype corresponding to the inherited disease (embryo 2, 3, 4). With the consent of the parents, preimplantation genetic screening for chromosomal abnormalities was performed for embryos that did not inherit the disease. According to the results of all tests performed, 2 embryos were recommended for transfer.
--->--->
Перечень последовательностей праймеровPrimer sequence listing
D3S4640
SEQ ID NO 1: 5’-AGTAAACCTTCAAGAGCCCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 2: 5’-TAGTCCATGCCCTTACCCT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 3: 5’-ACAGTGCATGAATTGAGGAG-3’ (Fin), D3S4640
SEQ ID NO 1: 5'-AGTAAACCTTCAAGAGCCCA-3'(Fout);
SEQ ID NO 2: 5'-TAGTCCATGCCCTTACCCT-3' (Rout)
SEQ ID NO 3: 5'-ACAGTGCATGAATTGAGGAG-3' (Fin),
D3S4748
SEQ ID NO 4: 5’-CTTACGAAGAAGCCCAACTG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 5: 5’-ATAAACTAGCCAGGCACGG-3’ (Rout);
SEQ ID NO 6: 5’-CAGGAGTTTTAAGACCAGCCT-3’ (Rin), D3S4748
SEQ ID NO 4: 5'-CTTACGAAGAAGCCCAACTG-3'(Fout);
SEQ ID NO 5: 5'-ATAAACTAGCCAGGCACGG-3'(Rout);
SEQ ID NO 6: 5'-CAGGAGTTTTAAGACCAGCCT-3' (Rin),
D3S4750
SEQ ID NO 7: 5’-CCCAATGGGAACACACTAG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 8: 5’-CTGCTTGTTGTTGATGTATGTG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 9: 5’-AGGCTATGCATTTAACCATCAT-3’ (Fin), D3S4750
SEQ ID NO 7: 5'-CCCAATGGGAACACACTAG-3'(Fout);
SEQ ID NO 8: 5'-CTGCTTGTTGTTGATGTATGTG-3' (Rout)
SEQ ID NO 9: 5'-AGGCTATGCATTTAACCATCAT-3' (Fin),
D3S4790
SEQ ID NO 10: 5’-CCAGACAGCTCTTCTGTCAT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 11: 5’-GTCTCAAACTCCTAGCCACA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 12: 5’-CAACTCCTTGCCCAGAG-3’ (Fin), D3S4790
SEQ ID NO 10: 5'-CCAGACAGCTCTTCTGTCAT-3'(Fout);
SEQ ID NO 11: 5'-GTCTCAAACTCCTAGCCACA-3' (Rout)
SEQ ID NO 12: 5'-CAACTCCTTGCCCAGAG-3' (Fin),
D3S4792
SEQ ID NO 13: 5’-TGCTGTGAGCTATGATCAGG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 14: 5’-ATTCAGGAGCTGAGGTAGGA-3’ (Rout);
SEQ ID NO 15: 5’-TGCCCAAGTATATGCTATCTACA-3’ (Rin), D3S4792
SEQ ID NO 13: 5'-TGCTGTGAGCTATGATCAGG-3'(Fout);
SEQ ID NO 14: 5'-ATTCAGGAGCTGAGGTAGGA-3'(Rout);
SEQ ID NO 15: 5'-TGCCCAAGTATATGCTATCTACA-3' (Rin),
D3S4799
SEQ ID NO 16: 5’-CTGGAGCAAATCAACATGGG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 17: 5’-CCTGACATTTCATTGCTGCA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 18: 5’-GATCGCGTGACATTCCAAAA-3’ (Fin), D3S4799
SEQ ID NO 16: 5'-CTGGAGCAAATCAACATGGG-3'(Fout);
SEQ ID NO 17: 5'-CCTGACATTTCATTGCTGCA-3' (Rout)
SEQ ID NO 18: 5'-GATCGCGTGACATTCCAAAA-3' (Fin),
D3S4804
SEQ ID NO 19: 5’-GGCCTCAGCCTACTATTTTACA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 20: 5’-TGAGCTTTCAGTGGCATTATC-3’ (Rout);
SEQ ID NO 21: 5’-TCCCATCTGTTCACCTATGTT-3’ (Rin), D3S4804
SEQ ID NO 19: 5'-GGCCTCAGCCTACTATTTTACA-3'(Fout);
SEQ ID NO 20: 5'-TGAGCTTTCAGTGGCATTATC-3'(Rout);
SEQ ID NO 21: 5'-TCCCATCTGTTCACCTATGTT-3' (Rin),
D3S2420
SEQ ID NO 22: 5’-ACGTGGTAAAAACCCTGTCT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 23: 5’-GACAATAGTCCAGGAGCCTC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 24: 5’-CTACAAGTGCGAAACTCTGC-3’ (Fin), D3S2420
SEQ ID NO 22: 5'-ACGTGGTAAAAACCCTGTCT-3'(Fout);
SEQ ID NO 23: 5'-GACAATAGTCCAGGAGCCTC-3' (Rout)
SEQ ID NO 24: 5'-CTACAAGTGCGAAACTCTGC-3' (Fin),
D3S4842
SEQ ID NO 25:5’-TATTCCTCCTGCCTAATGGA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 26: 5’-ACGCTCATTACTCCCATGTT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 27: 5’-TGTTGCACGTGACAAGATTC-3’ (Fin), D3S4842
SEQ ID NO 25:5'-TATTCCTCCTGCCTAATGGA-3'(Fout);
SEQ ID NO 26: 5'-ACGCTCATTACTCCCATGTT-3' (Rout)
SEQ ID NO 27: 5'-TGTTGCACGTGACAAGATTC-3' (Fin),
D3S4860
SEQ ID NO 28: 5’-ACTGACCACTGGACTTCCTC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 29: 5’-CTGGGTCTTTATGCTGCAA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 30: 5’-CTCTTCCCAGTCCCTGTATCT-3’ (Fin), D3S4860
SEQ ID NO 28: 5'-ACTGACCACTGGACTTCCTC-3'(Fout);
SEQ ID NO 29: 5'-CTGGGTCTTTATGCTGCAA-3' (Rout)
SEQ ID NO 30: 5'-CTCTTCCCAGTCCCTGTATCT-3' (Fin),
D3S1581
SEQ ID NO 31: 5’-TCATGGCTTTTTCCTCCTCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 32: 5’-AGTGAGCCATGATTGCACTA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 33: 5’-ACTCTTCCCAGTCCCTGTAT-3’ (Fin), D3S1581
SEQ ID NO 31: 5'-TCATGGCTTTTTCCTCCTCA-3'(Fout);
SEQ ID NO 32: 5'-AGTGAGCCATGATTGCACTA-3' (Rout)
SEQ ID NO 33: 5'-ACTCTTCCCAGTCCCTGTAT-3' (Fin),
D3S4886
SEQ ID NO 34: 5’-TATCCCAAACCTCAGGTGAC-3’ (Fout);
SEQ IDNO 35: 5’-TTACAGGTGTGTGCCATGAT-3’ (Rout);
SEQ ID NO 36: 5’-TAGGATTACATGGGCGTGAG-3’ (Rin), D3S4886
SEQ ID NO 34: 5'-TATCCCAAACCTCAGGTGAC-3'(Fout);
SEQ IDNO 35: 5'-TTACAGGTGTGTGCCATGAT-3'(Rout);
SEQ ID NO 36: 5'-TAGGATTACATGGGCGTGAG-3' (Rin),
D3S4893
SEQ ID NO 37: 5’-TTGTGGTGAGTCAAAATCGC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 38: 5’-AAAAGTTACCTGGGTGTGGT-3’ (Rout);
SEQ ID NO 39: 5’-GGTGAACTGAGATTGAGCCA-3’ (Rin), D3S4893
SEQ ID NO 37: 5'-TTGTGGTGAGTCAAAATCGC-3'(Fout);
SEQ ID NO 38: 5'-AAAAGTTACCTGGGTGTGGT-3'(Rout);
SEQ ID NO 39: 5'-GGTGAACTGAGATTGAGCCA-3' (Rin),
D3S4923
SEQ ID NO 40: 5’-ACACTCCAGTCTAGGCAATG-3’
(Fout); SEQ ID NO 41: 5’-ATGGTATACTTTGGGCTGGG-3’ (Rout);
SEQ ID NO 42: 5’-CAGGAGAATGGTGTGAGCC-3’ (Rin), D3S4923
SEQ ID NO 40: 5'-ACACTCCAGTCTAGGCAATG-3'
(Fout); SEQ ID NO 41: 5'-ATGGTATACTTTGGGCTGGG-3'(Rout);
SEQ ID NO 42: 5'-CAGGAGAATGGTGTGAGCC-3' (Rin),
D3S4924
SEQ ID NO 43: 5’-AGGGCTTAAATGAAACGCAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 44: 5’-AATAAATAGGGCCAGGTGCA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 45: 5’-GACAGTCTCACTCTAGCCAC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 46: 5’-GCCGGTGGATCATCTGAG-3’ (Rin),D3S4924
SEQ ID NO 43: 5'-AGGGCTTAAATGAAACGCAC-3'(Fout);
SEQ ID NO 44: 5'-AATAAATAGGGCCAGGTGCA-3' (Rout)
SEQ ID NO 45: 5'-GACAGTCTCACTCTAGCCAC-3'(Fin);
SEQ ID NO 46: 5'-GCCGGTGGATCATCTGAG-3' (Rin),
D3S4940
SEQ ID NO 47: 5’-ACTGGTTGCACGGGAAG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 48: 5’-CGGCCAGTTAAAAGGAGG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 49: 5’-GCTCGTTCATCTGGGTGTA-3’ (Fin), D3S4940
SEQ ID NO 47: 5'-ACTGGTTGCACGGGAAG-3'(Fout);
SEQ ID NO 48: 5'-CGGCCAGTTAAAAGGAGG-3' (Rout)
SEQ ID NO 49: 5'-GCTCGTTCATCTGGGTGTA-3' (Fin),
D3S3629
SEQ ID NO 50: 5’-CCAGCCCTTATTTCTTCTCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 51: 5’-GGCTAGACAGGGAAACTGAA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 52: 5’-CAAGAATTTCTCCTGCCACT-3’ (Fin), D3S3629
SEQ ID NO 50: 5'-CCAGCCCTTATTTCTTCTCA-3'(Fout);
SEQ ID NO 51: 5'-GGCTAGACAGGGAAACTGAA-3' (Rout)
SEQ ID NO 52: 5'-CAAGAATTTCTCCTGCCACT-3' (Fin),
D3S4958
SEQ ID NO 53: 5’-ACCAAGAATTTCTCCTGCCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 54: 5’-CTTGCAGGAAGAGGCATAGA-3’ (Rout);
SEQ ID NO 55: 5’-AGCAGCGAGGATTGGAATTA-3’ (Rin), D3S4958
SEQ ID NO 53: 5'-ACCAAGAATTTCTCCTGCCA-3'(Fout);
SEQ ID NO 54: 5'-CTTGCAGGAAGAGGCATAGA-3'(Rout);
SEQ ID NO 55: 5'-AGCAGCGAGGATTGGAATTA-3' (Rin),
D3S4995
SEQ ID NO 56: 5’-GCTAAGTCAACTGGCAACTG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 57: 5’-GCCAAGGTTCATTCATAGC-3’ (Rout);
SEQ ID NO 58: 5’-GCCTTTGGAGAGAGTGAGAA-3’ (Rin), D3S4995
SEQ ID NO 56: 5'-GCTAAGTCAACTGGCAACTG-3'(Fout);
SEQ ID NO 57: 5'-GCCAAGGTTCATTCATAGC-3'(Rout);
SEQ ID NO 58: 5'-GCCTTTGGAGAGAGTGAGAA-3' (Rin),
D3S3667
SEQ ID NO 59: 5’-TTGGAAATCTTGCGCACAAA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 60: 5’-AAGCCCAGAATACACATCCA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 61: 5’-TTGTTTGGAGAAAAAGGCTGT-3’ (Fin), D3S3667
SEQ ID NO 59: 5'-TTGGAAATCTTGCGCACAAA-3'(Fout);
SEQ ID NO 60: 5'-AAGCCCAGAATACACATCCA-3' (Rout)
SEQ ID NO 61: 5'-TTGTTTGGAGAAAAAAGGCTGT-3' (Fin),
D3S5003
SEQ ID NO 62: 5’-CAGAGCAAAGTACCTGTTGGA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 63: 5’-CCAGAAAGTAAAACGGGGA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 64: 5’-TGGAATTAGGAAAACAGGACC-3’ (Fin), D3S5003
SEQ ID NO 62: 5'-CAGAGCAAAGTACCTGTTGGA-3'(Fout);
SEQ ID NO 63: 5'-CCAGAAAGTAAAACGGGGA-3' (Rout)
SEQ ID NO 64: 5'-TGGAATTAGGAAAACAGGACC-3' (Fin),
D3S5059
SEQ ID NO 65: 5’-GCTCGAAGGTGACATTTCTC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 66: 5’-AAAGGTTCTGGTTGGTGTGT-3’ (Rout);
SEQ ID NO 67: 5’-TGCCTCACTACTCCTGGAAT-3’ (Rin)D3S5059
SEQ ID NO 65: 5'-GCTCGAAGGTGACATTTCTC-3'(Fout);
SEQ ID NO 66: 5'-AAAGGTTCTGGTTGGTGTGT-3'(Rout);
SEQ ID NO 67: 5'-TGCCTCACTACTCCTGGAAT-3' (Rin)
<---<---
Claims (5)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2777086C1 true RU2777086C1 (en) | 2022-08-01 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2853340C1 (en) * | 2023-12-27 | 2025-12-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | METHOD FOR DETERMINING EPIDERMOLYSIS BULLOSA-ASSOCIATED MUTATION rs775288140 IN TYPE VII COLLAGEN GENE (COL7A1) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2352947C1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-04-20 | Государственное учреждение Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Method of diagnostics of autoimmune violent dermatoses |
| RU2730667C2 (en) * | 2018-12-26 | 2020-08-24 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Gene-therapeutic dna-vector based on gene-therapeutic dna-vector vtvaf17, carrying target gene selected from group of genes krt5, krt14, lamb3, col7a1, to increase level of expression of these target genes, method for production and use thereof, strain escherichia coli scs110-af/vtvaf17-krt5, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-krt14, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-lamb3, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-col7a1, carrying gene-therapeutic dna vector, method for production thereof, method for industrial production of gene-therapeutic dna vector |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2352947C1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-04-20 | Государственное учреждение Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Method of diagnostics of autoimmune violent dermatoses |
| RU2730667C2 (en) * | 2018-12-26 | 2020-08-24 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Gene-therapeutic dna-vector based on gene-therapeutic dna-vector vtvaf17, carrying target gene selected from group of genes krt5, krt14, lamb3, col7a1, to increase level of expression of these target genes, method for production and use thereof, strain escherichia coli scs110-af/vtvaf17-krt5, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-krt14, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-lamb3, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-col7a1, carrying gene-therapeutic dna vector, method for production thereof, method for industrial production of gene-therapeutic dna vector |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| C. Has и др. Clinical practice guidelines for laboratory diagnosis of epidermolysis bullosa. British Journal of Dermatology, 2020, номер 182, pp.574-592. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2853340C1 (en) * | 2023-12-27 | 2025-12-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | METHOD FOR DETERMINING EPIDERMOLYSIS BULLOSA-ASSOCIATED MUTATION rs775288140 IN TYPE VII COLLAGEN GENE (COL7A1) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101777161B1 (en) | A Multiplex SNP marker composition and a method for diagnosis or prediction of canine hip dysplasia using same marker | |
| KR20130041767A (en) | Normal-tension glaucoma susceptibility gene and method for using the same | |
| RU2777086C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of epidermolysis bullosa | |
| RU2799538C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for blepharophimosis, ptosis and epicanthus reversal syndrome type 1,2 | |
| RU2795796C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for achondroplasia | |
| RU2777091C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of breast and ovarian cancer | |
| RU2775416C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of duchenne/becker muscular dystrophy | |
| RU2772938C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of familial hypertrophic cardiomyopathy | |
| RU2777084C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of type 1 familial focal epilepsy | |
| RU2795824C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of type 1 hereditary multiple osteochondromas | |
| RU2671156C1 (en) | Method of preimplantation genetic diagnostics of type 1 spinal muscular atrophy | |
| RU2854361C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of dilated cardiomyopathy type 1d | |
| RU2837158C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of marfan syndrome | |
| RU2777081C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of louis-bar syndrome | |
| RU2791878C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of non-syndromic sensorineural hearing loss | |
| RU2792147C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for fanconi anemia | |
| RU2799541C1 (en) | Method of preimplantation genetic testing of hereditary zonular cataract | |
| RU2795481C1 (en) | Preimplantation genetic testing method for alport syndrome | |
| KR102269653B1 (en) | A SNP marker composition and a method for diagnosis or prediction of osteochondrodyplasia in cats | |
| RU2854362C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of variant erythrokeratoderma | |
| RU2808833C1 (en) | Method of preimplantation genetic testing of facioscapulohumeral muscular dystrophy | |
| RU2769300C1 (en) | Test system for pre-implantation genetic testing of type 1 spinocerebellar ataxia | |
| RU2816650C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of smith-lemli-opitz syndrome | |
| RU2831940C1 (en) | Method for preimplantation genetic testing of stargardt disease | |
| RU2842535C1 (en) | Method for pre-implantation genetic testing of phenylketonuria |