RU2777084C1

RU2777084C1 - Method for pre-implantation genetic testing of type 1 familial focal epilepsy

Info

Publication number: RU2777084C1
Application number: RU2021111925A
Authority: RU
Inventors: Артур Александрович Исаев; Екатерина Алексеевна Померанцева; Светлана Олеговна Жикривецкая; Елизавета Валерьевна Мусатова; Яна Владиславовна Софронова; Арина Леонидовна Кушнир
Original assignee: Акционерное общество "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО"
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2022-08-01

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: described is a method for diagnosing the monogenic disease familial focal epilepsy 1 in settings of pre-implantation genetic testing (PGT). For this purpose, the pathogenic variant NC_000022.11:g.32188751C>T (NM_001242896.1:c.715C>T, NP_001007189.1:p.Arg239Ter) is diagnosed in the DEPDC5 gene for use within the PGT of the monogenic disease familial focal epilepsy 1 with the possibility of direct and indirect diagnosis.

EFFECT: high specificity and effectiveness were revealed within the framework of the method, as well as versatility with respect to various biological samples: single cells, product of genome-wide amplification, total DNA isolated from different tissues.

1 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.The invention relates to preimplantation genetic testing of monogenic diseases. Currently, there are more than 350 million people in the world suffering from a rare disease (according to the RARE Project). The total number of such diseases, according to the estimates of the European Organization for Rare Diseases (EURORDIS), varies from 5 to 7 thousand. At the same time, about 80% of rare diseases have a genetic cause. The known genetic basis of the disease makes it possible to predict with high accuracy not only the health of an already born child, but also to assess the risk of having such a child by analyzing the genotypes of the parents, as well as to conduct genetic diagnostics at the earliest stages. Preimplantation genetic testing (PGT) of a monogenic disease is becoming a powerful tool for the prevention of such diseases.

Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования семейной фокальной эпилепсии 1 типа. Семейная фокальная эпилепсия 1 - это редкое заболевание, имеющее аутосомно-доминантный тип наследования и вариабельную пенетрантность. Семейная фокальная эпилепсия 1 встречается с частотой - не установлена. Это заболевание приводит к появлению в головном мозге очагов эпилептической активности различной локализации, влекущих за собой фокальные судорожные приступы, зачастую склонные к генерализации. При этом в одной и той же семье выраженность заболевания, его течение и область поражения головного мозга могут варьироваться. При аутосомно-доминантном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 50%.The present invention relates to a method for preimplantation genetic testing of type 1 familial focal epilepsy. Familial focal epilepsy 1 is a rare disorder with autosomal dominant inheritance and variable penetrance. Familial focal epilepsy 1 occurs with a frequency - not established. This disease leads to the appearance in the brain of foci of epileptic activity of various localization, leading to focal convulsive seizures, often prone to generalization. At the same time, the severity of the disease, its course and the area of brain damage can vary in the same family. With an autosomal dominant type of inheritance of the disease, the probability of having a child with this disease in the family is 50%.

К заболеванию семейная фокальная эпилепсия 1 могут приводить патогенные генетические варианты в гене DEPDC5 [S. Ishida et al., Nat Genet 45, 552-555 (2013)], располагающемся на хромосоме 22. Этот ген кодирует белковый комплекс GATOR1, который принимает важное участие в сигнальном пути, направленном на активацию молекулы-регулятора роста и выживания клетки.Familial focal epilepsy 1 can be caused by pathogenic genetic variants in the DEPDC5 gene [S. Ishida et al., Nat Genet 45, 552-555 (2013)], located on chromosome 22. This gene encodes the GATOR1 protein complex, which plays an important role in the signaling pathway aimed at activating the cell growth and survival regulator molecule.

ПГТ семейной фокальной эпилепсии 1 типа проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 г. Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленным патогенными вариантом, обуславливающим этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенного варианта и, следовательно, без риска развития заболевания.PGT for type 1 familial focal epilepsy is performed for families with a confirmed molecular genetic nature of the disease. It is important to note that the substantiation of the pathogenicity and causation of genetic variants occurs before the PGT of a monogenic disease and is not included either in the goals and objectives of the PGT of a monogenic disease, or in the complex of measures for conducting PGT of a monogenic disease. Pathogenicity is assessed according to the international standard - according to the criteria described in 2015 by the American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP) in the search for the molecular genetic cause of the disease. PGT is recommended for families at high risk of having a child with a severe (incurable) hereditary disease with an established pathogenic variant that causes this risk. PGT allows you to choose from all embryos obtained by IVF (in vitro fertilization) embryos without a pathogenic variant and, therefore, without the risk of developing a disease.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.The main problem in the genetic diagnosis of embryos is the small initial amount of biomaterial, since the biopsy contains from one to three cells. In this case, to improve the efficiency and accuracy of the analysis, it is important both to completely exclude the possibility of contamination and to neutralize the possible effect of uneven and/or incomplete amplification, as well as degradation of the biomaterial. This requires the development of a test system with special characteristics. At the same time, the test system is being developed taking into account the possibility of using different types of biomaterial - total deoxyribonucleic acid (DNA) isolated from different tissues, the product of Whole Genome Amplification (WGA), as well as single cells. The combination of versatility with respect to the biomaterial with stepwise amplification of target fragments makes it possible to analyze several pathogenic variants for a single sample, including on single cells, and also to identify the situation of incomplete amplification, contamination, or sample degradation. Another feature of PGT is the lack of information about the biological characteristics of the embryo: unlike an adult, an embryo can have any chromosomal abnormalities that complicate the task of assessing the status of an embryo for a specific genetic variant. Therefore, a test system for PGT of a monogenic disease should make it possible to identify such cases and evaluate their impact on the reliability of the diagnostic result.

Описания близкого технического решения не обнаружено в общедоступных источниках.Description of a close technical solution was not found in public sources.

Представленный нами метод ПГТ семейной фокальной эпилепсии 1 типа решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.The PGT method of type 1 familial focal epilepsy presented by us solves the problem of developing a more accurate method for preimplantation genetic testing of this monogenic disease without the use of expensive devices and reagents, which could be used on various types of biomaterial: DNA isolated from different tissues, a product of whole genome amplification (WGA ), single cells.

Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенного варианта (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000022.11:g.32188751C>Т (NM_001242896.1:с.715C>Т, NP_001007189.1:p.Arg239Ter), в гене DEPDC5 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Связь фокальной эпилепсии с данным вариантом упоминается в литературе. [Baulac S, et al., Ann Neurol. 2015 Apr; 77(4):675-83] Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000022.11:g.32188751С>Т (NM_001242896.1:с.715С>Т, NP_001007189.1:p.Arg239Ter) типа однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена DEPDC5 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2-х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например, пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2-х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген DEPDC5, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген DEPDC5 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 14 STR локусов для гена DEPDC5: D22S3002, D22S3061, D22S3096, D22S3101, D22S3117, D22S3156, D22S3202, D22S1176, D22S3229, D22S3286, D22S3290, D22S3326, D22S3397, D22S3410. Праймеры для амплификации находятся на 22 хромосоме в районе координат 30024130-34108671 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п. н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более чем на 1°С.The technical result was the creation of a test system for the diagnosis of a pathogenic variant (the nucleotide number in the reference sequence of genomic DNA is indicated by the prefix NC, the nucleotide number in the reference sequence of the coding transcript is indicated by the prefix NM): NC_000022.11:g.32188751C>T (NM_001242896.1:c .715C>T, NP_001007189.1:p.Arg239Ter), in the DEPDC5 gene with a double detection system - direct and indirect. The association of focal epilepsy with this variant is mentioned in the literature. [Baulac S, et al., Ann Neurol. 2015 Apr; 77(4):675-83] Such a system is necessary when working with a small amount of biomaterial, since unstable amplification can lead to loss of information or reduced accuracy of the analysis. Direct diagnosis involves the analysis of the direct presence-absence of a pathogenic variant. In this case, for the genetic variant NC_000022.11:g.32188751C>T (NM_001242896.1:c.715C>T, NP_001007189.1:p.Arg239Ter) of the single nucleotide polymorphism (SNP) type, endonucleases were selected restriction, which allow detection of a pathogenic variant by PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), based on the difference in the sequence in the restriction site of different alleles. Indirect diagnosis consists in the analysis of the inheritance of molecular genetic markers linked to a mutation, i.e. inherited with it. To do this, at a distance of no more than 3 mB (which corresponds to 3% crossover on average) from the DEPDC5 gene, polymorphic loci called STR (short tandem repeat - short tandem repeat) were selected in each direction with a heterozygosity of at least 0.70 to ensure maximum informativity of indirect diagnostics. STRs are repeats of 2 or more nucleotides located one after another (for example, an adenine-cytosine (AC) pair repeated several times in a row: ACACACACA) and are present in large numbers in the human genome. The number of repeats in each of them may vary from individual to individual, and may also be different in the same person on 2 homologous chromosomes. Heterozygosity above 0.70 means that there is a high probability that in the same person the number of nucleotide repeats in a given STR on one chromosome will differ from the number of repeats in the same STR on a homologous chromosome, in other words, the alleles of this marker in this person will differ in length. When amplifying a fragment containing such a marker, amplicons of two different lengths will be obtained. By analyzing the number of repeats in several markers surrounding the pathogenic variant and examining how they are inherited in the tested family, linkage between the alleles of the markers and the pathogenic variant can be established. The diagnostic value of studying the number of repeats in these markers in embryos is that by which allele of each of the markers was inherited by the embryo, it can be judged whether the embryo inherited the DEPDC5 gene carrying the pathogenic variant, or whether it inherited the DEPDC5 gene on the other. , a homologous chromosome that does not contain a pathogenic variant. For each of these loci, primers were selected for amplification by the type of nested or semi-nested PCR in 2 rounds, which makes it possible to increase the accuracy and efficiency of amplification. The test system included 14 STR locuses for the DEPDC5: D22S3002, D22S3061 gene, D22S3096, D22S3101, D22S3117, D22S3156, D22S3202, D22S176, D22S3286, D22S3290, D22290, D22290, D222S32S Primers for amplification are located on chromosome 22 in the region of coordinates 30024130-34108671 (according to hg19). It is important to note that during the selection of primers, a number of special requirements were observed: the length of the product with external primers for the first round of PCR should not exceed 500 bp. (for production from fragments obtained by whole genome amplification), product length from internal primers for the second round of PCR from 120 to 350 bp, high specificity of external primers, annealing temperature does not differ by more than 1°C.

Подготовительный этап ПГТPreparatory stage of the PGT

На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.At the preparatory stage, the test system is being developed: selection of amplification conditions that are optimal for primers to work, analysis of the efficiency and specificity of PCR amplification in both rounds, assessment of the universality of the test system for biosamples of various types (DNA, WGA product, single cells). When testing the test system, stock dilutions of primers were prepared with a concentration of 100 mM, and working dilutions of primer combinations (a combination of pairs of primers for rounds 1 and 2 of PCR) with a concentration of 10 mM of each primer in solution. Since various types of matrices can be used as part of the diagnosis of clinical material, two biopsies of single cells were used in the development of the test system, which are in a special lysis buffer (1 × PCR Buffer, 0.1% Tween-20, 0.1% Triton X-100, 1 μg Proteinase K), two samples of the products of whole genome amplification of embryo biopsies (WGA), as well as total DNA of family members isolated from blood, for compiling a pedigree and identifying the linkage of a pathogenic variant with alleles of polymorphic markers.

В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.In nested and semi-nested PCR, amplification is carried out in two steps. At the first stage, multiplex PCR is performed with all external primers for all loci included in the test system to enrich the sample with all target fragments. At the second stage, individual amplification of each fragment with internal primers is carried out.

Полугнездовая ПЦРSemi-nested PCR

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п. н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μΜ каждого праймера, 2,5 U/μΙ of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% DMSO и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-го этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.For the first stage, external highly specific primers were selected to amplify fragments from 300 to 500 bp. For the second stage, primers were selected to amplify fragments no longer than 350 base pairs, and labels were introduced for detection by fragment analysis. The PCR mixture for the first round of amplification contained 1×PCR Buffer with Mg2+ (Evrogen, Russia), 0.1 mM of each deoxynucleotide, 0.15 μΜ of each primer, 2.5 U/μΙ of HsTaq DNA-polymerase (Evrogen, Russia), 6% DMSO and 1 µl total DNA or 2.5 µl WGA or 5 µl lysis buffer with sample as template. The first stage of amplification was carried out according to the following protocol: the stage of denaturation at 94°C for 2 minutes, 30 cycles with a decrease in the annealing temperature of the primers from 62 to 45°C in each, the stage of completion of all templates at 72°C for 10 minutes. Next, the products of the 1st stage were placed into individual tubes with one pair of primers per specific locus.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1× PCR буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5×RediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μΜ каждого праймера, 1 U/μΙ ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μΙ ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).The PCR mixture for the second stage included 1× PCR buffer with Mg2+ (Evrogen, Russia), 0.5×RediLoad™ loading buffer (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM of each deoxynucleotide, 0.2 μM of each primer, 1 U/μΙ of DNA polymerase HsTaq (Evrogen, Russia), 6% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 1 μΙ PCR product of the first stage of amplification as a template. The second stage of amplification was carried out according to the following protocol: denaturation stage at 95°C for 2 minutes, 35 cycles: denaturation at 95°C for 30 seconds, primer annealing at 57°C for 30 seconds, template synthesis at 72°C for 1 minute, completion of all templates 72°C 5 minutes. Evaluation of the efficiency and specificity of amplification was performed using electrophoresis in 2% agarose gel. The result of electrophoresis in agarose gel allows you to determine the required degree of dilution of the amplification products for application to fragment analysis (amplification products of the DNA of family members).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).Fragment analysis of amplification products was performed using capillary electrophoresis on a 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Based on the results of fragment analysis, a pedigree is compiled and informative polymorphic STR loci for each family are noted, which will later be used in clinical diagnostics. Loci are divided into non-informative (the carrier of the pathogenic variant is homozygous for this locus), semi-informative (alleles for this marker are the same on some and parental chromosomes), informative (alleles of this marker are different on all chromosomes of the parents, which makes it possible to distinguish each of them when analyzing the genotype of the embryo ).

Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)Polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщепления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту.Restriction fragment length polymorphism (RFLP) is a method for studying genomic DNA by specific DNA cleavage with restriction endonucleases and further analysis of the size of the resulting fragments (restrictions) by gel electrophoresis. When using this method, fragments of different lengths are observed depending on differences in the nucleotide sequence at the restriction site, which makes it possible to detect single nucleotide variants if they are located at the restriction site. A more accurate detection of the pathogenic variant can be provided by Sanger sequencing, however, under PGT conditions, the PCR-RFLP method is more effective due to the reduced probability of allele drop out (ADO) and, as a result, an erroneous result in assessing the status of the embryo by pathogenicity. option.

Для детекции патогенного варианта NC_000022.11:g.32188751C>Т (NM_001242896.1:с.715C>Т, NP_001007189.1:p.Arg239Ter) была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:To detect the pathogenic variant NC_000022.11:g.32188751C>Т (NM_001242896.1:с.715C>Т, NP_001007189.1:p.Arg239Ter), a test system based on PCR-RFLP was developed. The amplification step is described in detail in the previous section. The following primers were used:

Внешние праймеры:External primers:

5'-TTAACCCAGAAGAGGAAGCTG-3' (Fout)5'-TTAACCCAGAAGAGGAAGCTG-3' (Fout)

5'-GGACCACAAGAGGCGAAT-3' (Rout)5'-GGACCCACAAGAGGCGAAT-3' (Rout)

Внутренние праймеры для детекции мутантного аллеля:Internal primers for mutant allele detection:

5'-AATTTCTCTTCTCAGCCTGAAC-3' (fin)5'-AATTTCTCTTCTCAGCCTGAAC-3' (fin)

5'-GTATAGCAAAGCACCCAAACA-3' (rin)5'-GTATAGCAAAGCACCCAAACA-3' (rin)

Внутренние праймеры для детекции нормального аллеля:Internal primers for normal allele detection:

5'-TTCAGATGAATTTCCTGAAATAGAC-3' (fin_mm_wt) в паре с rin.5'-TTCAGATGAATTTCCTGAAATAGAC-3' (fin_mm_wt) paired with rin.

Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза BseDI разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза DdeI разрезает только мутантный аллель варианта NC_000022.11:g.32188751C>T (NM_001242896.1:с.715С>Т, NP_001007189.1:p.Arg239Ter). Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.Further, the amplification products from the internal primers for the detection of the pathogenic variant were used in the restriction reaction. The BseDI endonuclease cuts only the wild-type allele, the DdeI endonuclease cuts only the mutant allele of the NC_000022.11:g.32188751C>T variant (NM_001242896.1:c.715C>T, NP_001007189.1:p.Arg239Ter). Detection was carried out using electrophoresis in 12% polyacrylamide gel.

Пример 1Example 1

Пациенты АPatients A

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием семейная фокальная эпилепсия 1 с гетерозиготным носительством патогенного варианта NC_000022.11:g.32188751C>Т (NM_001242896.1:c.715C>T, NP_001007189.1:p.Arg239Ter) в гене DEPDC5. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания семейная фокальная эпилепсия 1 в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.Family A applied to the Center for Genetics Research and Development, in which a child with familial focal epilepsy 1 was born with a heterozygous carrier of the pathogenic variant NC_000022.11:g.32188751C>T (NM_001242896.1:c.715C>T, NP_001007189.1:p.Arg239Ter) in the DEPDC5 gene. The couple was recommended to undergo PGT for familial focal epilepsy 1 as part of IVF to select embryos that did not inherit the disease.

Гаплотипирование семьиFamily haplotyping

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 14 STR локусов. Из них 9 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер пациентки: D22S3002 - 254/254, D22S3156 - 235/233, D22S3202 - 286/280, DEPDC5: - N/N, D22S1176 - 236/231, D22S3286 - 262/264, D22S3290 - 265/275, D22S3326 - 321/318, D22S3397 - 283/283, D22S3410 - 319/315; пациентка: D22S3002 - 254/256, D22S3156 - 229/225, D22S3202 - 284/280, DEPDC5: - mut/N, D22S1176 - 231/238, D22S3286 - 264/259, D22S3290 - 265/248, D22S3326 - 321/323, D22S3397 - 285/281, D22S3410 - 319/321.At the first stage, biomaterial (peripheral blood) of family members was obtained to detect the pathogenic variant and identify linkage groups of alleles of polymorphic markers. 14 STR loci were analyzed. Of these, 9 were informative for the mother and/or father. Thus, embryo samples were tested only for informative markers. The results obtained for informative markers (alleles indicated on one side of the "/" symbol are located on the same chromosome for different markers, that is, they form a linkage group): patient's partner: D22S3002 - 254/254, D22S3156 - 235/233, D22S3202 - 286/280, DEPDC5: - N/N, D22S1176 - 236/231, D22S3286 - 262/264, D22S3290 - 265/275, D22S3326 - 321/318, D22S3397 - 283/283, D22S3410 - 319/315; patient: D22S3002 - 254/256, D22S3156 - 229/225, D22S3202 - 284/280, DEPDC5: - mut/N, D22S1176 - 231/238, D22S3286 - 264/259, D22S3290 - 265/248, D22S233 , D22S3397 - 285/281, D22S3410 - 319/321.

В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у пациентки с патогенным вариантом были связаны следующие аллели STR-маркеров: D22S3002 - 254, D22S3156 - 229, D22S3202 - 284, D22S1176 - 231, D22S3286 - 264, D22S3290 - 265, D22S3326 - 321, D22S3397 - 285, D22S3410 - 319.As a result of haplotyping, it was concluded that the following alleles of STR markers were associated with the pathogenic variant in the patient: D22S3002 - 254, D22S3156 - 229, D22S3202 - 284, D22S1176 - 231, D22S3286 - 264, D22S3290 - 265, D22S3326 D2 - 329 - 285, D22S3410 - 319.

Преимплантационное генетическое тестированиеPreimplantation genetic testing

В цикле ЭКО было получено 4 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).In the IVF cycle, 4 embryos were obtained, a biopsy was performed on the 5th day of development (in the IVF clinic), a biopsy in WGA buffer (1 × PBS (Invitrogen, USA), 1% polyvinylpyrrolidone (PVP) (Fertipro, Belgium)) was sent to the laboratory "Genetics". To control contamination at different stages of working with a sample, a system of controls has been developed in the laboratory: contamination control of the biopsy buffer, contamination control during transportation (one tube with buffer is not opened by the embryologist), contamination control of each sample (a sample of the medium from the last wash drop of biopsy material). All these controls, together with the samples, go through the stage of whole genome amplification, after which the smallest amount of DNA that contaminated the controls will be noticeable. Genome-wide amplification was performed using the commercial SurePlex kit (Illumina, USA).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом, были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: D22S3002 - 254/256, D22S3156 - 235/225 D22S3202 - 286/280, DEPDC5: - ND22S1176 - 236/238, D22S3286 - 262/259 D22S3290 - 265/248, D22S3326 - 318/323 D22S3397 - 283/281, D22S3410 - ADO/321; эмбрион2: D22S3002 - 254/256, D22S3156 - 235/225, D22S3202 - 286/ADO, DEPDC5: - N, D22S1176 - 236/238, D22S3286 - 262/259, D22S3290 - 265/248, D22S3326 - 321/323, D22S3397 - 283/281, D22S3410 - 319/321; эмбрион3: D22S3002 - 254, D22S3156 - 233/229, D22S3202 - ADO/284, DEPDC5: - FA, D22S1176 - 231, D22S3286 - 264, D22S3290 - 275/265, 277, D22S3326 - 318/321, D22S3397 - 283/285, D22S3410 - 315/ADO; эмбрион4: D22S3002 - 254, D22S3156 - 233/229, D22S3202 - 280/284, DEPDC5: - FA, D22S1176 - 231, D22S3286 - 264, D22S3290 - 275/265, D22S3326 - 318/321, D22S3397 - 283/285, D22S3410 - 315/319.The product of whole genome amplification, as well as the DNA of all family members, was amplified at stage 1 in multiplex PCR with primers for the detection of the pathogenic variant and primers for polymorphic markers informative for family A in accordance with the protocol for the test system developed as part of the preparatory stage. At stage 2, amplification was performed for each marker separately in accordance with the developed protocol for the test system. Thus, the linkage groups inherited by each embryo were established. The results: Embrion1: D22S3002 - 254/256, D22S3156 - 235/225 D22S3202 - 286/280, DEPDC5: - ND22S1176 - 236/238, D22S3286 - 262/22S3290 - 265/248, D222S332/323 DE22. /281, D22S3410 - ADO/321; embryo2: D22S3002 - 254/256, D22S3156 - 235/225, D22S3202 - 286/ADO, DEPDC5: - N, D22S1176 - 236/238, D22S3286 - 262/259, D22S3290 - 265/248, D22S33 D1226 - 283/281, D22S3410 - 319/321; embryo 3: D22S3002 - 254, D22S3156 - 233/229, D22S3202 - ADO/284, DEPDC5: - FA, D22S1176 - 231, D22S3286 - 264, D22S3290 - 275/265, 277, D22S3326 - 318/3223 , D22S3410 - 315/ADO; эмбрион4: D22S3002 - 254, D22S3156 - 233/229, D22S3202 - 280/284, DEPDC5: - FA, D22S1176 - 231, D22S3286 - 264, D22S3290 - 275/265, D22S3326 - 318/321, D22S3397 - 283/285, D22S3410 - 315/319.

По результатам прямой и косвенной диагностики 2 эмбриона (эмбрионы 1-й 2) не унаследовали заболевание, у 2 эмбрионов (эмбрион 3 и 4) выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. С согласия родителей для эмбрионов, не унаследовавших заболевание, провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов 1 эмбрион (эмбрион 1) был рекомендован к переносу. Эмбрион 2 был рекомендован с информированного согласия в связи с затрудненностью интерпретации результатов скрининга хромосомных аномалий у данного образца.According to the results of direct and indirect diagnostics, 2 embryos (embryos 1st 2) did not inherit the disease, in 2 embryos (embryos 3 and 4) a haplotype corresponding to the inherited disease was detected. With the consent of the parents, preimplantation genetic screening for chromosomal abnormalities was performed for embryos that did not inherit the disease. Based on the results of all tests performed, 1 embryo (embryo 1) was recommended for transfer. Embryo 2 was recommended with informed consent due to the difficulty in interpreting the results of screening for chromosomal abnormalities in this sample.

Перечень последовательностей праймеровPrimer sequence listing

D22S3002
SEQ ID NO 1: 5’-CATCGTCAACCAACCACA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 2: 5’-CTACCTTATTACAACCCAGCCT-3’ (Rout);
SEQ ID NO 3: 5’-CAATGCCACATACATGAATCA-3’ (Rin),
D22S3061
SEQ ID NO 4: 5’-GTGCAGCAGATCCTTCTTAAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 5: 5’-CTGTGGGTAAGTGCTCCATA-3’ (Rout);
SEQ ID NO 6: 5’-TGGAATCAACCCCTTCAG-3’ (Rin),
D22S3096
SEQ ID NO 7: 5’-AATTGTAGCTCTCTGGGGAGT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 8: 5’-AGCTTCTAGGTGCTTGCAA-3’ (Rout);
SEQ ID NO 9: 5’-GTTCAGAGAGGGCAGAGTG-3’ (Rin),
D22S3101
SEQ ID NO 10: 5’-AAGCACAGCCCTTTACAATC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 11: 5’-AAATCCCAGTCACGTCCTC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 12: 5’-CTTCATCCTGATTTGCTGAG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 13: 5’-CAGAGAAAGCCTGGATCAT-3’ (Rin),
D22S3117
SEQ ID NO 14: 5’-GCCATGATCCTAGCCATT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 15: 5’-AAACAACTGGGCTAGAGGAC-3’ (Rout);
SEQ ID NO 16: 5’-CATGGCAGTGGGTGTTATAA-3’ (Rin),
D22S3156
SEQ ID NO 17: 5’-GGTTGCAGATCCCTCAA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 18: 5’-CAGCTTCCAGGTTCCTTACT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 19: 5’-TCCAGTTCTGAACAGCATGT-3’ (Fin),
D22S3202
SEQ ID NO 20: 5’-TGAACAAAACCTCCCCAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 21: 5’-AGATGGCAGCCGTAGATTAG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 22: 5’-CTCTCAAGCCACCTGTCTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 23: 5’-CAGGGTTGTGGTGGAAAG-3’ (Rin),
D22S1176
SEQ ID NO 24: 5’-GGCTTCCGAAGTCTATGTCT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 25: 5’-ACAGAGCAGCTTTGAATCCTA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 26: 5’-TGTGTTGGGCTTGAATTACA-3’ (Fin),
D22S3229
SEQ ID NO 27: 5’-TCCTTAGCCTCCAACAAGAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 28: 5’-CTAGGTCTGTGAAGGGGTAGA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 29: 5’-TCTCCAAACATCACCAGC-3’ (Fin),
D22S3286
SEQ ID NO 30: 5’-GAGAGCACCTTCGATTCTCT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 31: 5’-GTATTCTGGGCAGTAGTAGAGC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 32: 5’-GGCATGAATGAGCACTACA-3’ (Fin),
D22S3290
SEQ ID NO 33: 5’-TCCTCTTGAAGCCGGTTAT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 34: 5’-CCGGTAGAACTTTGCTTCA-3’ (Rout);
SEQ ID NO 35: 5’-GAGACGGGAGGTGAAATTC-3’ (Rin),
D22S3326
SEQ ID NO 36: 5’-GCTTGAAGGATCTGCTGAG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 37: 5’-GGTACCTTGCAGAATCTCG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 38: 5’-GGACATTGATGAAACACCA-3’ (Fin),
D22S3397
SEQ ID NO 39: 5’-TACGTATAGCAGTGGTCCAGTA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 40: 5’-AGTGCTCTTTTGTATGGCAT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 41: 5’-GATGTCTGGAGGAAATAAACC-3’ (Fin),
D22S3410
SEQ ID NO 42: 5’-ACACAGTCCACTCCATCATC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 43: 5’-TTAAAAGTGTAGCTGTCGTCCT-3’ (Rout);
SEQ ID NO 44: 5’-GAGGCTGTTGAAGAATGCT-3’ (Rin)D22S3002
SEQ ID NO 1: 5'-CATCGTCAACCAACCACA-3'(Fout);
SEQ ID NO 2: 5'-CTACCTTATTACAACCCAGCCT-3'(Rout);
SEQ ID NO 3: 5'-CAATGCCACATACATGAATCA-3' (Rin),
D22S3061
SEQ ID NO 4: 5'-GTGCAGCAGATCCTTCTTAAC-3'(Fout);
SEQ ID NO 5: 5'-CTGTGGGTAAGTGCTCCATA-3'(Rout);
SEQ ID NO 6: 5'-TGGAATCAACCCCTTCAG-3' (Rin),
D22S3096
SEQ ID NO 7: 5'-AATTGTAGCTCTCTGGGGAGT-3'(Fout);
SEQ ID NO 8: 5'-AGCTTCTAGGTGCTTGCAA-3'(Rout);
SEQ ID NO 9: 5'-GTTCAGAGAGGGCAGAGTG-3' (Rin),
D22S3101
SEQ ID NO 10: 5'-AAGCACAGCCCTTTACAATC-3'(Fout);
SEQ ID NO 11: 5'-AAATCCCAGTCACGTCCTC-3' (Rout)
SEQ ID NO 12: 5'-CTTCATCCTGATTTGCTGAG-3'(Fin);
SEQ ID NO 13: 5'-CAGAGAAAGCCTGGATCAT-3' (Rin),
D22S3117
SEQ ID NO 14: 5'-GCCATGATCCTAGCCATT-3'(Fout);
SEQ ID NO 15: 5'-AAACAACTGGGCTAGAGGAC-3'(Rout);
SEQ ID NO 16: 5'-CATGGCAGTGGGTGTTATAA-3' (Rin),
D22S3156
SEQ ID NO 17: 5'-GGTTGCAGATCCCTCAA-3'(Fout);
SEQ ID NO 18: 5'-CAGCTTCCAGGTTCCTTACT-3' (Rout)
SEQ ID NO 19: 5'-TCCAGTTCTGAACAGCATGT-3' (Fin),
D22S3202
SEQ ID NO 20: 5'-TGAACAAAACCTCCCCAC-3'(Fout);
SEQ ID NO 21: 5'-AGATGGCAGCCGTAGATTAG-3' (Rout)
SEQ ID NO 22: 5'-CTCTCAAGCCACCTGTCTG-3'(Fin);
SEQ ID NO 23: 5'-CAGGGTTGTGGTGGAAAG-3' (Rin),
D22S1176
SEQ ID NO 24: 5'-GGCTTCCGAAGTCTATGTCT-3'(Fout);
SEQ ID NO 25: 5'-ACAGAGCAGCTTTGAATCCTA-3' (Rout)
SEQ ID NO 26: 5'-TGTGTTGGGCTTGAATTACA-3' (Fin),
D22S3229
SEQ ID NO 27: 5'-TCCTTAGCCTCCAACAAGAC-3'(Fout);
SEQ ID NO 28: 5'-CTAGGTCTGTGAAGGGGTAGA-3' (Rout)
SEQ ID NO 29: 5'-TCTCCAAACATCACCAGC-3' (Fin),
D22S3286
SEQ ID NO 30: 5'-GAGAGCACCTTCGATTCTCT-3'(Fout);
SEQ ID NO 31: 5'-GTATTCTGGGCAGTAGTAGAGC-3' (Rout)
SEQ ID NO 32: 5'-GGCATGAATGAGCACTACA-3' (Fin),
D22S3290
SEQ ID NO 33: 5'-TCCTCTTGAAGCCGGTTAT-3'(Fout);
SEQ ID NO 34: 5'-CCGGTAGAACTTTGCTTCA-3'(Rout);
SEQ ID NO 35: 5'-GAGACGGGAGGTGAAATTC-3' (Rin),
D22S3326
SEQ ID NO 36: 5'-GCTTGAAGGATCTGCTGAG-3'(Fout);
SEQ ID NO 37: 5'-GGTACCTTGCAGAATCTCG-3' (Rout)
SEQ ID NO 38: 5'-GGACATTGATGAAACACCA-3' (Fin),
D22S3397
SEQ ID NO 39: 5'-TACGTATAGCAGTGGTCCAGTA-3'(Fout);
SEQ ID NO 40: 5'-AGTGCTCTTTTGTATGGCAT-3' (Rout)
SEQ ID NO 41: 5'-GATGTCTGGAGGAAATAAACC-3' (Fin),
D22S3410
SEQ ID NO 42: 5'-ACACAGTCCACTCCATCATC-3'(Fout);
SEQ ID NO 43: 5'-TTAAAAGTGTAGCTGTCGTCCT-3'(Rout);
SEQ ID NO 44: 5'-GAGGCTGTTGAAGAATGCT-3' (Rin)

Claims

A method for preimplantation genetic testing of type 1 familial focal epilepsy, involving the detection of the inheritance of the pathogenic variant NC_000022.11:g.32188751C>T (NM_001242896.1:c.715C>T, ΝΡ_001007189.1:p.Arg239Ter) in the DEPDC5 gene, including a dual system detection - direct and indirect, where direct detection is carried out using primers: GTATAGCAAAGCACCCAAACA-3' (rin), 5'-TTCAGATGAATTTCCTGAAATAGAC-3' (fin_mm_wt), and indirect detection is carried out using primers to analyze the inheritance of molecular genetic polymorphic type markers (STR) linked to a pathogenic variant selected from SEQ ID No. 1 -44, while using primers directed to those STRs whose alleles are different on all chromosomes of the parents, where the outer primers are designated as Fout (forward primer) and Rout (reverse primer), and the inner primers as Fin (forward primer) and Rin ( reverse n primer), while the diagnosis is carried out in two stages of semi-nested PCR: at the first stage, multiplex PCR is carried out with external primers for STR and the DEPDC5 gene, at the second stage, individual PCR of each fragment is performed with internal primers for STR, as well as by PCR-RFLP to determine pathogenic variant of the DEPDC5 gene.