RU2795017C1 - Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 - Google Patents
Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795017C1 RU2795017C1 RU2022126133A RU2022126133A RU2795017C1 RU 2795017 C1 RU2795017 C1 RU 2795017C1 RU 2022126133 A RU2022126133 A RU 2022126133A RU 2022126133 A RU2022126133 A RU 2022126133A RU 2795017 C1 RU2795017 C1 RU 2795017C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- ins214epe
- mutation
- seq
- Prior art date
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 20
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 10
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 claims description 15
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 238000011160 research Methods 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 8
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 5
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 3
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 3
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012855 volatile organic compound Substances 0.000 description 3
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 2
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- NBDQGOCGYHMDSJ-NRFPMOEYSA-M sodium;(e,3r,5s)-7-[2-cyclopropyl-4-(4-fluorophenyl)quinolin-3-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-enoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 NBDQGOCGYHMDSJ-NRFPMOEYSA-M 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров и зонда определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2, имеющий следующий состав: прямой праймер 214-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер 214pure-R - SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд 214-Z2 - SEQ ID NO: 3. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амлифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:Ins214EPE. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и может применяться для идентификации геновариантов SARS-CoV-2 при эпидемиологических исследованиях.
Коронавирусная инфекция (COVID-19) это инфекционное заболевание, вызванное SARS-CoV-2. Вирус передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Изменения в структуре генома SARS-CoV-2 приводят к возникновению вариантов, которые ВОЗ обозначила как вызывающие интерес (VOIs, Variants of Interest), вызывающие озабоченность (VOCs, Variants of Concern) и линии VOC под мониторингом (VOC lineages under monitoring (VOC-LUM). Определение мутаций в геноме SARS-CoV-2 и их классификация на VOIs и VOCs и VOC-LUM является важным элементом молекулярно-генетического мониторинга штаммов новой коронавирусной инфекции. Мутации, детекция которых необходима, перечислены в докладах Технической консультативной группы по эволюции вируса SARS-CoV-2 (TAG-VE) ВОЗ [https://www.who.int/publications/m on-sars-cov-2-virus-evolution-(tag-ve)].
Для определения геновариантов вируса и проведения молекулярно-генетического мониторинга SARS-CoV-2 используются методы полногеномного и фрагментного секвенирования, которые являются дорогостоящими и трудоемкими. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].
Известны протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках:
- ORFlab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];
- RdRP, Е, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618 с_2];
- ORF1b-nsp14, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];
- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];
- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];
- N [https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];
- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2].
При этом, проведенный анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2 показал частое наличие мутаций (в особенности делеций) в геномах данного коронавируса. В связи с этим основным недостатком приведенных выше аналогов является риск получения ложно отрицательных результатов ОТ-ПЦР, обусловленных блокированием реакции при наличии мутаций в области амплифицируемого участка.
Из уровня техники известна тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Omicron методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией [Патент RU 2772362, дата подачи 31.12.2021]. Указанная тест-система включает олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой: прямой праймер Ins214EPESARS-CoV-2; обратный праймер Ins214EPESARS-CoV-2; флоуресцентный зонд Ins214EPESARS-CoV-2.
Мультиплексные наборы реагентов для определения геновариантов SARS-CoV-2 методом ПЦР, разработаны несколькими компаниями-производителями. Предложенная компанией ThermoFisher Scientific методика основана на использовании зондов типа TaqMan для определения сразу нескольких мутаций, специфичных для разных геновариантов [Identifying SARS-CoV-2 Variants of Concern through saliva-based RT-qPCR by targeting recurrent mutation sites. Rachel E. Ham, Austin R. Smothers, Rui Che, Keegan J. Sell, Congyue Annie Peng, Delphine Dean. doi: https://doi.org/10.1101/2022.03.02.222717851.
Наборы, в которых предусмотрена мультиплексная ПЦР-РВ после проведения обратной транскрипции, в том числе одноступенчатая, [1) Одноэтапный анализ RT-PCR Ins214EPE для обнаружения варианта Omicron (В.1.1.529) V.1. Никита Елынин, Кирилл Варченко, Ксения Комиссарова, Дарья Даниленко, Андрей Комиссаров, Дмитрий Лиознов. https://www.protocols.io/view/one-step-rt-pcr-ins214epe-assay-for-omicron-b-1-1-3by14b2e8vo5/v1; 2) Патент RU 2761025, 26.07.2021, 02.12.2021 3) Патент CN113817868, 08.07.2021, 21.12.2021; 4) Патент CN113215312, 28.04.2021, 06.08.2021; 5) Патент CN113005226, 07.02.2021, 22.06.2021; 6) Патент CN113278733, 21.05.2021, 20.08.2021; 7) IN202221016568, 24.03.2022, 08.04.2022; 8) IN202021026013, 19.06.2020, 10.06.2022] отличаются удобством для пользователя. Однако, использование данных наборов не предполагает быстрой возможности замены мишеней для детекции новых геновариантов, содержащих миссенс мутации или замены.
Детекция дополнительных специфичных для возникающих геновариантов мишеней, так же, как и исключение из анализа мишеней для циркулирующих геновариантов позволяет повысить эффективность лабораторного исследования в целом. В связи с этим существует потребность в разработке олигонуклеотидов для выявления мутации S:Ins214EPE в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2: праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для проведения ПЦР-РВ.
Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление мутации S:Ins214EPE в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 с высокой степенью специфичности посредством олигонуклеотидов праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, которые позволяют эффективно определять мутацию S:Ins214EPE SARS-CoV-2 с использованием широко доступных методик и доступных материалов.
Технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения наличия мутации S:Ins214EPE SARS-CoV- в биологическом образце с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, имеющих следующий олигонуклеотидный состав:
Прямой праймер 214-F - SEQ ID NO: 1,
Обратный праймер 214pure-R - SEQ ID NO: 2,
Флуоресцентный зонд 214-Z2 - SEQ ID NO: 3.
Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего мутацию S:Ins214EPE в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, флуоресцентно-меченый конформационно-блокированный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент.
Заявляемые олигонуклеотиды разработаны на основе известной последовательности гена, кодирующего S-белок SARS-CoV-2, взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), в результате выбран фрагмент для детекции мутации S:Ins214EPE. К выбранному фрагменту были подобраны праймеры и зонд для амплификации 149/155 пар оснований: прямой праймер 214-F - SEQ ID NO:1; обратный праймер 214pure-R - SEQ ID NO:2 и флуоресцентный зонд 214-Z2 - SEQ ID NO:3.
Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках совершенствования молекулярно-генетического мониторинга вариантов SARS-CoV-2, проведенной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), как вируса SARS-CoV-2 дикого типа, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:ins214EPE (Omicron (В. 1.1.529)). Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, SnapGene Viewer, MEGA, Unipro UGENE. Составляют перечень мутаций, характерных для геновариантов. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченого зонда. Для детекции образцов, содержащих мутацию S:Ins214EPE, используют канал для детекции флуорофора R6G. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.
Анализ заявляемых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST продемонстрировал, что прямой праймер 214-F (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 214pure-R (SEQ ID NO: 2) амплифицируют участок, в котором располагается мутация S:Ins214EPE со 100% специфичностью.
В качестве биологического материала используются мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 (например, после проведения анализа на наборе реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL).
Выделение РНК из биологического материала проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК из биологического материала производят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения РНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор для выделения РНК. Оптимальная концентрация РНК - 103-105 копий в 10 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для проведения реакции ОТ может быть использован комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный набор. Готовый препарат кДНК может храниться при температуре от 2 до 8°С в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16°С в течение 6 мес.и при температуре не выше минус 68°С в течение года.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.
Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С) - праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.
Анализ данных проводится на основе детекции амплификатором уровня флуоресцентного сигнала испускаемого интеркалирующим красителем. При увеличении числа копий анализируемого участка детектируется экспоненциальный рост флуоресцентного сигнала. В результате наблюдается S-образная кривая в случае наличия специфичного флуоресцентному зонду сигнала, или ее отсутствие, в случае неспецифичной для зонда последовательности. Анализ кривых позволяет судить об отсутствии или наличии мутации в исследуемых образцах.
ПЦР-РВ проводится с применением заявляемых представленных в Таблице 1 олигонуклеотидов - праймеров и зонда, для детекции мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
ПЦР-РВ проводят при следующих условиях:
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(а) 10 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 - по 0,7 мМ;
- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3 - 0,2 мМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя.
(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl2, например, 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.
(d) полученная методом обратной транскрипции кДНК 10 мкл. Амплификацию проводят на приборе с возможностью флуоресцентной детекции, например, «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 2-5 каналами детекции в соответствии с инструкцией производителя.
Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G.
Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:Ins214EPE. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными, то есть содержат мутацию S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение олигонуклеотидов для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), как SARS-CoV-2 дикого типа SARS-CoV-2 из базы, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:ins214EPE (Omicron (В. 1.1.529, refseq OL672836 (NCBI)). Для поиска мутаций использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, Unipro UGENE, олигокалькулятор (Oligo Calculators) Integrated DNA Technologies, Inc. (Oligo Analyzer (idtdna.com)). Составляют перечень мутаций, характерных для геновариантов. Затем к значимым мутациям подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого 214-F и обратного 214pure-R праймеров, а также флуоресцентно-меченый зонд 214-Z2.
Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что прямой 214-F и обратный 214pure-R праймеры амлифицируют участок с мутацией S:Ins214EPE со 100% специфичностью.
Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 прямой праймер 214-F, обратный праймер 214pure-R, флуоресцентный зонд 214-Z2, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.
Пример 2. Детекция мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 методом ПЦР-РВ.
Определение мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 проводят методом ПЦР-РВ при следующих условиях:
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл. Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 10 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 - по 0,7 мкМ;
- флоуресцентный зонд SEQ ID NO: 3 - 0,2 мкМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.
(c) 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl2.
(d) полученная после реакции обратной транскрипции («РЕВЕРТА-L» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) кДНК - 10 мкл.
ПЦР-РВ проводили с флуоресцентной детекцией на приборе с 5 каналами детекции - «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).
Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-3 используют для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Пример 3. Обнаружение мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 выбрано 95 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.
Для исследования использовали клинический материал - мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 набором реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.
ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Амплификацию проводили на приборе «Real-time CFX96 Touch» («Bio-Rad», США) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:Ins214EPE. Для 77 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
Для данных 77 образцов наличие мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Отсутствие мутации в 18 образцах без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.
Таким образом, из всей выборки выявлено 77 образцов, содержащих мутацию S:Ins214EPE вируса SARS-CoV-2.
Пример 4. Обнаружение мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 выбрано 5 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.
В работе исследовали пробы клинического материала, мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 набором реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.
ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:Ins214EPE. Для 4 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
Для данных 4 образцов наличие мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Отсутствие мутации в 1 образце без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.
Таким образом, из всей выборки выявлено 4 образца, содержащих мутацию S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
Пример 5. Обнаружение мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.
Для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 выбрано 6 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.
В работе исследовали пробы клинического материала, мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 набором реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.
ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:Ins214EPE. Кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие мутацию S:Ins214EPE SARS-CoV-2.
Наличие других мутаций SARS-CoV-2 в данных 6 образцах подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США).
Заявляемое изобретение позволяет выявлять мутацию S:Ins214EPE в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амлифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:Ins214EPE.
Claims (3)
1. Набор праймеров и зонда определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2, имеющий следующий состав: прямой праймер 214-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер 214pure-R - SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд 214-Z2 - SEQ ID NO: 3.
2. Набор праймеров и зонда определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 по п. 1, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагменты референсных геномов SARS-CoV-2 дикого типа, Omicron (B.1.1.529).
3. Набор праймеров и зонда определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 по п. 1, где флуоресцентный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор R6G и гаситель флуоресценции BHQ1, позволяющий детектировать амплифицированный фрагмент.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2795017C1 true RU2795017C1 (ru) | 2023-04-27 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2772362C1 (ru) * | 2021-12-31 | 2022-05-19 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией |
| US20220202930A1 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220202930A1 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants |
| RU2772362C1 (ru) * | 2021-12-31 | 2022-05-19 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией |
| RU2779025C1 (ru) * | 2022-05-20 | 2022-08-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113817868A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒及其变异株的引物、探针组合物及试剂盒 | |
| CN112176112A (zh) | 一种禽流感病毒h5，h7，h9亚型三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用 | |
| WO2010102460A1 (zh) | 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒 | |
| JP4950656B2 (ja) | 核酸検出 | |
| RU2795017C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:Ins214EPE SARS-CoV-2 | |
| KR20110123604A (ko) | 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 ｐｃｒ 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법 | |
| RU2795016C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 | |
| RU2791958C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:N501Y SARS-CoV-2 | |
| CN119242860A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a体系检测汉坦病毒HTNV亚型的DNA片段、重组载体、试剂组合、试剂盒和应用 | |
| RU2795018C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 | |
| CN116179760A (zh) | 一种基于rpa的流感病毒h10n3快速检测试剂、试剂盒及使用方法 | |
| RU2795014C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delHV69-70 SARS-CoV-2 | |
| JP5205609B2 (ja) | ウイルス検出用オリゴヌクレオチドセット、ｅｂｖ、ｃｍｖ及びｈｈｖ−６の分析方法及び検出キット | |
| JP2022025456A (ja) | 多発性硬化症を検査する方法 | |
| RU2762759C1 (ru) | Способ пробоподготовки образцов изолятов коронавируса SARS-CoV-2 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации | |
| CN113549709A (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
| RU2795939C2 (ru) | Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом прямой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| US20250215512A1 (en) | Methods of treating dimorphic fungal diseases | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| CN120330382B (zh) | 一种多重探针引物组及其应用、试剂盒 | |
| Wang et al. | A multiple method for sensitively detecting 17 highly infectious bacteria and viruses with distinguished melting peaks | |
| RU2772362C1 (ru) | Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией | |
| KR102402765B1 (ko) | SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 멀티플렉스 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR102499837B1 (ko) | 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 |