RU2777663C1 - Количественный метод определения экспрессии аллелей GNAO1 здоровой формы и с мутацией c.607 G>A - Google Patents
Количественный метод определения экспрессии аллелей GNAO1 здоровой формы и с мутацией c.607 G>A Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777663C1 RU2777663C1 RU2021123397A RU2021123397A RU2777663C1 RU 2777663 C1 RU2777663 C1 RU 2777663C1 RU 2021123397 A RU2021123397 A RU 2021123397A RU 2021123397 A RU2021123397 A RU 2021123397A RU 2777663 C1 RU2777663 C1 RU 2777663C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gnao1
- transcripts
- polymorphism
- specific
- gapdh
- Prior art date
Links
- 102100000919 GNAO1 Human genes 0.000 title claims abstract description 93
- 101710041547 GNAO1 Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title description 5
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 30
- 102200154528 GNAO1 G203R Human genes 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 22
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 16
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 16
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 claims description 13
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 claims description 13
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 claims description 13
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 claims description 13
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 claims description 13
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 claims description 13
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 claims description 13
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 claims description 13
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 claims description 13
- 101710038747 EEF1A1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100006066 EEF1A1 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710005270 TEF1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101710038765 eft-4 Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 32
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 11
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 5
- 208000008581 Brain Disease Diseases 0.000 description 4
- 206010014623 Encephalopathy Diseases 0.000 description 4
- 206010014625 Encephalopathy Diseases 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 4
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 3
- 210000004263 Induced Pluripotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 3
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 2
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029305 Neurological disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001037 epileptic Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000017311 musculoskeletal movement, spinal reflex action Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности разработан количественный метод на основе ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов для определения уровней экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и клинического варианта c.607 G>A. Настоящее изобретение может быть использовано для оценки эффективности препаратов РНК-терапии, направленной на специфическое подавление экспрессии транскриптов GNAO1 с мутацией c.607 G>A. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области генетики и молекулярной биологии. Разработан количественный метод на основе ПЦР с использованием специфических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для определения уровней экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и клинического варианта c.607 G>A. Настоящее изобретение может быть использовано для оценки эффективности препаратов РНК-терапии, направленной на специфическое подавление экспрессии транскриптов GNAO1 с мутацией c.607 G>A.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Уровень техники
В 2013 году была обнаружена связь между мутациями в гене GNAO1 и орфанным неврологическим расстройством, получившим название GNAO1-ассоциированной энцефалопатии. Данное заболевание проявляется в младенчестве и характеризуется эпилептической энцефалопатией (OMIM 615473) и/или нарушением развития мозга с непроизвольными движениями (OMIM 617493). Ген GNAO1 экспрессируется преимущественно в мозге и кодирует белок Gαo1. На 2021 год в литературе описано 25 вариантов патогенных мутаций данного гена. Мутации у пациентов возникают de novo и имеют доминантное проявление. Одной из наиболее часто встречаемых мутаций является вариант с.607 G>A (полиморфизм rs587777057). Данная мутация встречается только в гетерозиготном состоянии и приводит к аминокислотной замене G203R вблизи ГТФ-связывающего центра белка.
Для изучения GNAO1-ассоциированной энцефалопатии с вариантом с.607 G>A, а также для тестирования препаратов РНК-направленной терапии (антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, искусственные микроРНК) необходим количественный метод оценки уровней экспрессии здорового и мутантного транскрипта GNAO1 в биологических образцах (биоптат кожи пациента, пациент-специфические нейроны, клеточные тест-системы). Разработка такого метода возможна на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.
Для оценки уровня экспрессии гена GNAO1 в исследуемых образцах компанией Bio-Rad было разработано два набора реагентов. a) “PrimePCR SYBR® Green Assay: GNAO1, Human” (qHsaCID0006500), поставляемая ПЦР-смесь содержит праймеры специфичные к транскрипту гена GNAO1. Детекция сигнала при использовании набора осуществляется за счет накопления флуоресцентного сигнала от ДНК-интеркалирующего красителя SYBR Green. б) “PrimePCR Probe Assay: GNAO1, Human” (qHsaCIP0026191), поставляемая ПЦР-смесь содержит праймеры специфичные к транскрипту гена GNAO1, а также ДНК-зонд, меченый одним из пяти флуорофоров на выбор. Оба набора применимы только для оценки общего уровня экспрессии гена GNAO1 в образцах и не позволяют дискриминировать транскрипты дикого типа и с мутацией с.607 G>A .
Наиболее близким к настоящему изобретению является набор реагентов компании Thermo Fisher Scientific для аллель-специфической детекции полиморфизма rs587777057 методом мультиплекс-ПЦР с системой детекции TaqMan. Набор (“TaqMan™ SNP Genotyping Assay, human”, Assay ID: C_338418529_10) представляет собой пару праймеров, специфичных к геномному участку GNAO1 и два зонда с различными флуоресцентными метками для изоформ G и А полиморфизма rs587777057. Присутствие аллели GNAO1 дикого типа (изоформа G) детектируется в канале VIC, наличие клинического варианта с.607 G>A (изоформа А) регистрируется в канале FAM. Данный метод детекции полиморфизма rs587777057 предназначен для генотипирования образцов ДНК и не может быть применен для изучения транскриптов GNAO1, что является его существенным недостатком. Более того, данный метод подразумевает только качественную, но не количественную детекцию изоформ G/А полиморфизма rs587777057. И наконец, в наборе отсутствует универсальный зонд, детектирующий обе изоформы полиморфизма и выполняющий роль внутреннего положительного контроля прохождения реакции.
Техническая задача и технический результат
Задачей данного изобретения является разработка количественного метода на основе ПЦР для оценки уровня экспрессии G и А изоформ транскриптов GNAO1 при гетерозиготном полиморфизме rs587777057.
Настоящее изобретение заключается в создании набора праймеров и флуоресцентно-меченых зондов (ПЦР-набор №1) с системой детекции TaqMan, специфичных к транскриптам GNAO1 дикого типа (изоформа G), клинического варианта с.607 G>A (изоформа А) и обоим изоформам транскрипта в качестве внутреннего положительного контроля.
Изобретение также заключается в разработке способа количественной оценки уровня экспрессии изоформ транскриптов GNAO1 с полиморфизмом rs587777057 (G/A). Для количественности метода помимо ПЦР-набора №1 необходимо использовать ДНК-стандарты с известной концентрацией. Для количественного сравнения нескольких аналогичных биологических образцов разработаны праймеры и флуоресцентно-меченые зонды (ПЦР-набор №2), специфичные к транскриптам генов “домашнего хозяйства”. Оптимизированные условия реакции мультиплекс-ПЦР обеспечивают высокую специфичность и эффективность работы праймеров и зондов ПЦР-набора №1 и №2. Это в свою очередь определяет точность качественной и количественной оценки экспрессии изоформ транскриптов GNAO1 с полиморфизмом rs587777057 (G/A).
Данное изобретение может быть использовано в научных целях для изучения механизма GNAO1 c.607 G>A энцефалопатии и её моделирования, в диагностических целях для определения уровня экспрессии здорового и мутантного аллелей в тканях пациента с гетерозиготным полиморфизмом rs587777057, а также для разработки и оценки эффективности препаратов РНК-терапии (антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, искусственные микроРНК), направленных на аллель-селективное подавление экспрессии мутантного транскрипта GNAO1 с.607 G>A.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение представляет собой количественный метод на основе мультиплекс-ПЦР для оценки уровня экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A (полиморфизм rs587777057) в биологических образцах. Сущность разработанного метода заключается в использовании праймеров и зондов, высокоспецифичных к изоформам G и А транскриптов GNAO1 (ПЦР-набор №1), а также в способе количественной оценки экспрессии транскриптов, основанном на применении ДНК-стандартов и праймеров и зондов к генам “домашнего хозяйства” (ПЦР-набор №2).
ПЦР-набор №1 для детекции транскриптов GNAO1 схематически представлен на Фигуре 1. Универсальная пара прямого (GNAO1_F) и обратного (GNAO1_R) праймеров обеспечивают амплификацию транскриптов GNAO1 независимо от изоформы полиморфизма rs587777057. Для дифференциации транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией были разработаны зонды GNAO1-G-FAM и GNAO1-A-VIC, строго специфичные к изоформам G и А полиморфизма rs587777057, соответственно. В качестве внутреннего контроля прохождения ПЦР, а также для детекции суммарного уровня транскриптов GNAO1, в наборе используется зонд GNAO1-ROX. Оптимизированные условия мультиплекс-ПЦР гарантируют высокую специфичность (фиг. 2) и эффективность (фиг. 3) работы праймеров и трех зондов в одной реакции и позволяют совместную качественную детекцию здоровых и мутантных транскриптов GNAO1 в биологических образцах (фиг. 4).
Последовательности ПЦP- набора №1:
GNAO1_F 5’-atcagctcaacgactctgcc-3’ (SEQ ID NO: 1)
GNAO1_R 5’-acgtcctcgaagcaatggat-3’ (SEQ ID NO: 2)
GNAO1-ROX 5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’ (ROX – SEQ ID NO: 3 – BHQ2)
GNAO1-G- FAM 5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’ (FAM – SEQ ID NO: 4 – BHQ1)
GNAO1-A-VIC 5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’ (VIC – SEQ ID NO: 5 – BHQ1);
где ROX, VIC, FAM – флуоресцентные метки разного цвета (флуорофоры), а BHQ1 и BHQ2 – гасители флуоресценции.
Оценка эффективной концентрации изоформ транскриптов GNAO1 в исследуемых образцах проводится по калибровочному графику, который строится путем анализа ПЦР-набором №1 серийных разведений ДНК-стандартов с известной концентрацией. В качестве ДНК-стандартов могут выступать любые две плазмидные конструкции известной длины, содержащие кодирующую рамку GNAO1 дикого типа и мутацией c.607 G>A. Известный нуклеотидный размер и концентрация ДНК-стандартов позволяет конвертировать регистрируемый сигнал в образцах в число копий транскриптов изоформы G и А на реакцию или 100 нг тотальной РНК.
Чтобы сравнивать экспрессию GNAO1 в нескольких образцах, полученных из одного типа клеток или тканей, эффективная концентрация изоформ G и А дополнительно нормализуется на относительное количество вносимого в ПЦР-реакцию материала. Для нормализации образцов был разработан ПЦР-набор №2, состоящий из праймеров и зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A.
Последовательности ПЦP- набора №2:
GAPDH_F 5’-tcggagtcaacggatttggt-3’ (SEQ ID NO: 6)
GAPDH_R 5’-ttcccgttctcagccttgac-3’ (SEQ ID NO: 7)
GAPDH-VIC 5’-VIC-tgattccacccatggcaaattcca-BHQ1-3’ (VIC – SEQ ID NO: 8 – BHQ1)
EF1A_F 5’-aaggatgttcgtcgtggcaa-3’ (SEQ ID NO: 9)
EF1F_R 5’-gccgtgtggcaatccaatac-3’ (SEQ ID NO: 10)
EF1A-ROX 5’-ROX-aaatgacccaccaatggaagcagc-BHQ2-3’ (ROX – SEQ ID NO: 11 – BHQ2);
где ROX, VIC – флуоресцентные метки разного цвета (флуорофоры), а BHQ1 и BHQ2 – гасители флуоресценции.
Описанный метод на основе мультиплекс-ПЦР позволяют проводить как качественный (Фиг. 4), так и количественный (Фиг. 5) анализ экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией с.607 G>A (полиморфизм rs587777057). В качества материала для исследований может выступать биоптат кожи пациента с полиморфизмом rs587777057, пациент-специфические культуры клеток, полученные по технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Фиг. 4 и 5), перевиваемые клеточные линии с транзиентной или стабильной экспрессией GNAO1. Также разработанный метод количественной детекции можно использовать для сравнения уровня экспрессии здорового и мутантного аллелей GNAO1 при различном воздействии. Например, для оценки эффективности препаратов РНК-терапии, направленной на аллель-селективное подавление экспрессии транскриптов GNAO1 с мутацией c.607 G>A.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Иллюстрация технического решения по детекции транскриптов гена GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A, а также суммарного уровня транскриптов GNAO1 (ПЦР набор №1). Схематически показан участок транскрипта GNAO1 (NM_020988.3) с однонуклеотидным полиморфизмом rs587777057. Белые стрелки условно показывают расположение прямого и обратного праймеров для ПЦР, специфичных к последовательности транскрипта GNAO1. Серые стрелки показывают положение зондов для ПЦР, меченых флуорофорами ROX, VIC, FAM для универсальной и селективной детекции транскриптов GNAO1.
Фигура 2. Селективность метода детекции GNAO1 дикого типа и с мутацией с.607 G>A с помощью набора специфических праймеров и зондов для мультиплекс-ПЦР (ПЦР набор №1). В качестве ДНК-стандартов использовались две плазмидные ДНК с известной концентрацией, содержащие кодирующую область GNAO1 дикого типа и с мутацией (pGNAO1 дикий тип и pGNAO1 с.607 G>A, соответственно). В реакцию с ПЦР мастер-миксом #1 вносили серийные, 10-кратные разведения ДНК-стандартов в диапазоне 0,05 нг - 0,5 фг на реакцию. Амплификацию проводили на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System; флуоресцентный сигнал регистрировали в каналах ROX, FAM, VIC. Приведены репрезентативные кривые накопления ПЦР-продукта. В канале ROX детектируется GNAO1 дикого типа и с мутацией. В каналах FAM и VIC строго селективно в выбранном диапазоне концентраций детектируются GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A, соответственно.
Фигура 3. Эффективность мультиплекс-ПЦР для детекции GNAO1 дикого типа и с мутацией с.607 G>A с помощью набора специфических праймеров и зондов. Проводили реакцию в ПЦР мастер-микс #1 и строили стандартную кривую по амплификации сигнала флуоресценции в каналах ROX, FAM, VIC с 10-кратными разведениями ДНК-стандартов (pGNAO1 дикий тип и pGNAO1 с.607 G>A) в диапазоне 0,05 нг - 0,5 фг на реакцию. Эффективность для каждого из зондов (GNAO1-ROX, GNAO1-G-FAM, GNAO1-A-VIC) рассчитывали по стандартной кривой. Показаны репрезентативные стандартные кривые и средние значения эффективности ПЦР-реакций для n=5 независимых экспериментов.
Фигура 4. Качественная детекция транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A методом ПЦР-мультиплекс. В качестве материала для исследования использовались нейроны, полученные по технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из биоптата кожи здорового донора и пациента с мутацией GNAO1 c.607 G>A. Подготовку образцов проводили согласно стандартной методике, качественный анализ экспрессии проводили c помощью ПЦР мастер-микса #1.
Фигура 5. Количественная оценка уровня экспрессии транскриптов в клетках, экспрессирующих GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A.
В качестве материала для исследования использовались нейрональные клетки, полученные из биоптата кожи здорового донора и пациента с гетерозиготной мутацией GNAO1 c.607 G>A. Подготовку образцов проводили согласно стандартной методике, анализ экспрессии GNAO1 и генов “домашнего хозяйства” c проводили помощью ПЦР мастер-микса #1 и #2 соответственно. Количество копий каждого из вариантов GNAO1 в реакции определяли по стандартной кривой, построенной с помощью серийных разведений ДНК-стандартов. Каждый образец нормализовали на количество вносимого в ПЦР-реакцию материала, определенный с помощью генов “домашнего хозяйства” и стандартной кривой с контрольным образцом. Уровень экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A в образцах выражена в копиях на 100 нг тотальной РНК.
Осуществление изобретения
Пример 1. Подготовка праймеров, зондов и ДНК-стандартов. Для количественного измерения уровня экспрессии здорового и мутантного транскриптов GNAO1 в биологических образцах использовались специфичные наборы праймеров и зондов для мультиплекс-ПЦР с системой детекции TaqMan, а также плазмидные ДНК-стандарты.
- Для селективной детекции транскриптов GNAO1 был разработан ПЦР набор №1 (Фиг. 1): прямой праймер GNAO1_F (5’-atcagctcaacgactctgcc-3’; SEQ ID NO: 1), обратный праймер GNAO1_R (5’-acgtcctcgaagcaatggat-3’; SEQ ID NO: 2), универсальный зонд GNAO1-ROX (5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’; SEQ ID NO: 3) и селективные зонды GNAO1-G-FAM (5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’; SEQ ID NO: 4) и GNAO1-A-VIC (5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’; SEQ ID NO: 5) для здорового и мутантного транскриптов соответственно. Олигонуклеотиды были синтезированы и очищены компанией ДНК-синтез (Россия). Лиофилизированную ДНК ресуспендировали в стерильной воде для ПЦР до конечной концентрации 100 мкМ и хранили при температуре -20°C.
- Для определения количества копий транскриптов GNAO1 в образце использовались ДНК-стандарты. Для этого были созданы плазмидные конструкции с кодирующей областью гена GNAO1 (CCDS10756.1) дикого типа и мутацией с.607 G>A (pGNAO1 и pGNAO1 с.607 G>A, соответственно). Размер каждой из конструкций составляет 5079 пар нуклеотидов, а один нг плазмиды эквивалентен 1.8×10^8 копиям гена.
- Для нормализации вносимого в ПЦР реакцию материала использовался ПЦР набор №2, состоящий из праймеров и зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A. Для детекции GAPDH: прямой праймер GAPDH_F (5’-tcggagtcaacggatttggt-3’; SEQ ID NO: 6), обратный праймер GAPDH_R (5’-ttcccgttctcagccttgac-3’; SEQ ID NO: 7), зонд GAPDH-VIC (5’-VIC-tgattccacccatggcaaattcca-BHQ1-3’; SEQ ID NO: 8); для детекции EF1A: прямой праймер EF1A_F (5’-aaggatgttcgtcgtggcaa-3’; SEQ ID NO: 9), обратный праймер EF1F_R (5’-gccgtgtggcaatccaatac-3’; SEQ ID NO: 10), зонд EF1A-ROX (5’-ROX-aaatgacccaccaatggaagcagc-BHQ2-3’; SEQ ID NO: 11).
Пример 2. Подготовка образцов для анализа
В качестве материала для исследования могут быть использованы образцы биоптата кожи пациента с гетерозиготной заменой GNAO1 с.607 G>A и полученные из биоптата клеточные культуры (фибробласты, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нейрональные предшественники, нейроны разной степени дифференцировки), а также перевиваемые клеточные культуры с транзиентной или стабильной экспрессией мутантного и здорового варианта GNAO1.
- Выделение тотальной РНК проводится с использованием коммерческих наборов для выделения РНК по методике, рекомендуемой производителем с учетом особенностей образца и его количества.
- Концентрация выделенной РНК измеряется спектрофотометрически.
- РНК обрабатывается ДНКазой I c помощью коммерческого набора и протокола, совместимого с последующими стадиями обратной транскрипции и амплификации. Инактивация ДНКазы I проводится согласно рекомендациям производителя.
- Синтез кДНК с РНК-матрицы проводится с использованием коммерческого набора для обратной транскрипции согласно рекомендациям производителя. Реакция проводится в объеме 20 мкл, содержащем 100 нг/мкл РНК, 1 мкМ Олиго(dT)15 праймер (SB001; Евроген), случайный декануклеотидный праймер (SB002; Евроген), смесь dNTP 1 mM каждого (PB006S; Евроген), 2 mM DTT, обратная транскриптаза ММLV, 1 x буфер производителя (SK022L; Евроген), инкубация при 37°С в течение 1 часа. Инактивация 10 мин при 70°С. Образцы кДНК разбавляются в 5 раз стерильным буфером TE (PB026S; Евроген) и хранятся при -20°С до анализа.
Пример 3. Проведение ПЦР в реальном времени
Для количественного измерения уровней экспрессии аллелей GNAO1 в экспериментальных образцах проводится мультиплекс-ПЦР в реальном времени с использованием наборов праймеров и зондов, специфичных к транскриптам GNAO1 и транскриптам генов “домашнего хозяйства”, а также ДНК-стандартов.
- ПЦР мастер-микс #1 состоит из 400 nM праймеров и 200 nM зондов для селективной детекции транскриптов GNAO1 (ПЦР набор №1, описанный в примере 1); 3 mM MgCl2 и однократной реакционной смеси для ПЦР (Synthol, артикул M-428).
- К 20 мкл ПЦР мастер-микса #1 добавляют 5 мкл экспериментального или стандартного образца. В качестве экспериментального образца используют кДНК, полученную в примере 2; вносимое количество образца соответствует примерно 100 нг исходной РНК на реакцию. В качестве стандартного образца используют серийные 10-кратные разведения ДНК-стандартов, описанные в примере 1; вносимое количество образца находится в диапазоне 0,05 нг - 0,5 фг плазмиды на реакцию, что соответствует 9x10^6 - 90 копий GNAO1 на реакцию.
- ПЦР мастер-микс #2 состоит из 400 nM праймеров и 200 nM зондов для детекции транскриптов генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A (ПЦР набор №1, описанный в примере 1); 5 mM MgCl2 и однократной реакционной смеси для ПЦР (Synthol, артикул M-428).
- К 20 мкл ПЦР мастер-микса #2 добавляют 5 мкл экспериментального или стандартного образца. В качестве экспериментального образца используют кДНК, полученную в примере 2; вносимое количество образца соответствует примерно 100 нг исходной РНК на реакцию. В качестве стандартного образца используют серийные 5-кратные разведения контрольной кДНК; вносимое количество образца соответствует примерно 0.8, 2, 20 и 100 нг исходной РНК на реакцию.
- Стандартные и экспериментальные образцы анализируются в трех технических повторностях каждый.
- Реакции ПЦР замешиваются в 96-луночных тонкостенных планшетах (SSI-3401-00, SSI) и заклеиваются оптически-прозрачной пленкой UltraFlux® Standard (SSI-3622-00, SSI).
- ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories), используя следующую программу амплификации: денатурация 95°С - 3 мин; далее 40 циклов: 95°С – 20 сек, 60°С – 40 сек, считывание флуоресцентного сигнала. Для ПЦР мастер-микса #1 детекция сигнала проводится в каналах FAM (мишень - GNAO1 дикого типа), VIC (GNAO1 c.607 G>A), ROX (суммарный GNAO1). Для ПЦР мастер-микса #2 детекция сигнала проводится в каналах VIC (мишень - GAPDH), ROX (EF1A).
Пример 4. Специфичность и эффективность метода
Специфичность и эффективность работы набора праймеров и зондов для аллельной детекции GNAO1 в условиях ПЦР мастер-микса #1 и режима амплификации из примера 3 оценивали по ДНК-стандартам (pGNAO1 и pGNAO1 с.607 G>A) из примера 1.
- Специфичность детекции транскриптов GNAO1 c мутацией с.607 G>A и дикого типа зондами GNAO1-A-VIC (5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’) и GNAO1-G-FAM (5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’) соответственно сохраняется в диапазоне от 90 копий до 9x10^6 копий кодирующей области GNAO1 на реакцию (Фиг. 2).
- Данные порогового цикла (Сq) для серийных разведений ДНК-стандартов использовали для построения калибровочных кривых и определения эффективности мультиплекс-ПЦР для аллельной детекции GNAO1. Для зондов GNAO1-A-VIC (5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’), GNAO1-G-FAM (5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’) и GNAO1-ROX (5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’) составляет 105,4%, 107,6% и 101,2% соответственно (среднее по n=5 независимых экспериментов) (Фиг. 3).
Эффективность работы набора праймеров и зондов для детекции транскриптов генов “домашнего хозяйства” в условиях ПЦР мастер-микса #2 и режима амплификации из примера 3 оценивали с помощью стандартной кДНК, полученной из контрольного образца в примере 2.
- Данные порогового цикла (Сq) для серийных разведений контрольной ДНК использовали для построения калибровочных кривых и определения эффективности реакции. Эффективность мультиплекс-ПЦР для совместной детекции транскриптов GAPDH и EF1A составляет 91±4% и 89±5% (среднее по n=5 независимых экспериментов), соответственно.
Пример 5. Количественный обсчет результатов.
Количественное определение уровня экспрессии аллелей GNAO1 в экспериментальных образцах определяли следующим образом:
- Эффективную концентрацию транскриптов GNAO1 дикого типа, с мутацией и их суммарного уровня в экспериментальных образцах определяли по стандартным кривым из примера 4, построенных для серийных разведений ДНК-стандартов и зондов GNAO1-G- FAM, GNAO1-A-VIC и GNAO1-ROX соответственно.
- Копии транскриптов GNAO1 в разных образцах нормализовали на относительное количество вносимого в ПЦР-реакцию материала, определенное с помощью с праймеров/зондов к генам “домашнего хозяйства” и стандартной кривой для контрольного образца кДНК из примера 4.
- Уровень экспрессии транскриптов GNAO1 в экспериментальных образцах выражали в копиях GNAO1 на 100 нг тотальной РНК (Фиг. 5).
Claims (26)
1. Набор праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, специфичных к транскриптам GNAO1, предназначенный для селективной детекции в биологическом образце транскриптов GNAO1 дикого типа (или изоформы G полиморфизма rs587777057), клинического варианта GNAO1 с мутацией с.607 G>A (или изоформы А полиморфизма rs587777057), а также транскриптов GNAO1 обеих изоформ (G полиморфизма rs587777057 и A полиморфизма rs587777057),
и состоящий из:
– прямого GNAO1_F и обратного GNAO1_R праймеров, обеспечивающих амплификацию транскриптов GNAO1 независимо от изоформы полиморфизма rs587777057;
– селективных флуоресцентно-меченых зондов GNAO1-G-FAM и GNAO1-A-VIC, строго специфичных к изоформам G и А полиморфизма rs587777057 соответственно;
– универсального флуоресцентно-меченого зонда GNAO1-ROX, используемого для внутреннего контроля прохождения ПЦР и для детекции суммарного уровня транскриптов GNAO1.
2. Набор праймеров и зондов по п.1, содержащий:
– в качестве прямого праймера последовательность 5’-atcagctcaacgactctgcc-3’;
– в качестве обратного праймера последовательность 5’-acgtcctcgaagcaatggat-3’;
– в качестве универсального флуоресцентно-меченого зонда для детекции суммарного уровня транскриптов GNAO1 последовательность 5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’;
– в качестве селективного флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к изоформе G полиморфизма rs587777057, последовательность 5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’;
– в качестве селективного флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к изоформе A полиморфизма rs587777057, последовательность 5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’.
3. Способ количественного определения уровня экспрессии изоформ транскриптов GNAO1 с полиморфизмом rs587777057 в биологическом образце на основе мультиплекс-ПЦР в реальном времени, включающий следующие стадии:
1) качественная детекция с определением количества копий транскриптов GNAO1 в образце с помощью набора по пп.1, 2 и с помощью ДНК-стандартов в каналах FAM (для GNAO1 дикого типа или изоформы G полиморфизма rs587777057), VIC (для GNAO1 с мутацией c.607 G>A или изоформы А полиморфизма rs587777057) и ROX (для изоформ GNAO1 G полиморфизма rs587777057 и A полиморфизма rs587777057);
2) нормализация копий транскриптов GNAO1 на относительное количество вносимого в ПЦР-реакцию материала с помощью набора праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A, при этом набор содержит:
– прямой GAPDH_F и обратный GAPDH_R праймеры, специфичные к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH;
– прямой EF1A_F и обратный EF1F_R праймеры, специфичные к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1F;
– флуоресцентно-меченый зонд GAPDH-VIC, специфичный к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH;
– флуоресцентно-меченый зонд EF1A-ROX, специфичный к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1A.
3) Определение уровня экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A в образцах, выраженных в копиях на 100 нг тотальной РНК.
4. Способ по п.3, в котором набор праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A, содержит:
– в качестве прямого праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH - GAPDH_F, последовательность 5’-tcggagtcaacggatttggt-3’;
– в качестве обратного праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH - GAPDH_R, последовательность 5’-ttcccgttctcagccttgac-3’;
– в качестве прямого праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1F - EF1A_F, последовательность 5’-aaggatgttcgtcgtggcaa-3’;
– в качестве обратного праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1F - EF1F_R, последовательность 5’-gccgtgtggcaatccaatac-3’;
– в качестве флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH - GAPDH-VIC, последовательность 5’-VIC-tgattccacccatggcaaattcca-BHQ1-3’;
– в качестве флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1A - EF1A-ROX, последовательность 5’-ROX-aaatgacccaccaatggaagcagc-BHQ2-3’.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2777663C1 true RU2777663C1 (ru) | 2022-08-08 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2733754C2 (ru) * | 2015-05-20 | 2020-10-06 | Те Брод Инститьют Инк. | Общие неоантигены |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2733754C2 (ru) * | 2015-05-20 | 2020-10-06 | Те Брод Инститьют Инк. | Общие неоантигены |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nakamura K. et al. De Novo mutations in GNAO1, encoding a Gαo subunit of heterotrimeric G proteins, cause epileptic encephalopathy, The American Journal of Human Genetics, 2013, Т. 93. No. 3, pp. 496-505. Ananth A. L. et al. Clinical course of six children with GNAO1 mutations causing a severe and distinctive movement disorder, Pediatric neurology, 2016, Т. 59, pp. 81-84. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Depienne et al. | Screening for genomic rearrangements and methylation abnormalities of the 15q11-q13 region in autism spectrum disorders | |
| Blair et al. | Positional cloning, association analysis and expression studies provide convergent evidence that the cadherin gene FAT contains a bipolar disorder susceptibility allele | |
| US20020061524A1 (en) | Alterations in the long QT syndrome genes KVLQT1 and SCN5A and methods for detecting same | |
| US6355433B1 (en) | Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension | |
| BRPI0617341A2 (pt) | processo para o diagnàstico de doenÇas tromboembàlicas e doenÇas coronarianas | |
| JP2008524999A (ja) | 精神障害を治療するための組成物及び方法 | |
| Hashimoto et al. | The breakpoint cluster region gene on chromosome 22q11 is associated with bipolar disorder | |
| US20110269688A1 (en) | Genetic Alterations Associated with Schizophrenia and Methods of Use Thereof for the Diagnosis and Treatment of the Same | |
| RU2777663C1 (ru) | Количественный метод определения экспрессии аллелей GNAO1 здоровой формы и с мутацией c.607 G>A | |
| CN101809168A (zh) | Clec1b用于鉴定心血管和血栓形成风险的用途 | |
| JP5427352B2 (ja) | ヒト体脂肪量と関連する遺伝子多型に基づく肥満発症リスクの判定方法 | |
| JP2008525000A (ja) | 統合失調症及び関連障害を治療するための組成物及び方法 | |
| Götting et al. | Assessment of a rapid-cycle PCR assay for the identification of the recurrent c. 3421C> T mutation in the ABCC6 gene in pseudoxanthoma elasticum patients | |
| TWI351436B (en) | Method for detecting a risk of the development of | |
| US20220349008A1 (en) | Novel genetic markers for postural orthostatic tachycardia syndrome (pots) and methods of use thereof for diagnosis and treatment of the same | |
| US20020045171A1 (en) | Method of profiling genes as risk factors for attention deficit hyperactivity disorder | |
| BRPI0806599A2 (pt) | Marcador e plataforma de diagnóstico para elaboração de fármaco em infarto do miocárdio e falência cardíaca | |
| Ivanova et al. | mRNA analysis revealed a novel pathogenic EIF2S3 variant causing MEHMO syndrome | |
| WO2015037681A1 (ja) | 抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法及び判定用キット | |
| US20020143162A1 (en) | Methods | |
| JP4444576B2 (ja) | ２型糖尿病関連遺伝子 | |
| AU2002244949B2 (en) | Genomic DNAS participating in rheumatoid arthritis, method of diagnosing the same, method of judging onset riks thereof and diagnostic kit for detecting the same | |
| JPWO2006068111A1 (ja) | ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型に関連する表現型の判定方法 | |
| JP2009203204A (ja) | 睡眠障害の治療及び診断方法 | |
| JP2002533135A (ja) | ヒトにおけるピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素２（ｐｄｋ２）の一塩基多型 |