JP2009203204A - 睡眠障害の治療及び診断方法 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なナルコレプシー関連遺伝子を探索し、これに基づいて睡眠障害の治療及び診断方法を提供する。
【解決手段】本発明は、睡眠障害を有するヒト対象者を治療又は改善するための医薬組成物であって、この薬剤は前記対象者におけるβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性を調節する薬剤を含有する。
【選択図】図５

Description

本発明は、睡眠障害の治療及び診断方法に関し、より詳細には、ヒト対象者におけるβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の代謝活性を抑制することによる不眠症の治療、又は前記代謝活性を増強することによる過眠症の治療、並びにこれらの治療に用いる医薬組成物及びそのスクリーニング方法等に関する。

代表的な過眠症であるナルコレプシー は、日中に起こる反復性の耐え難い眠気（睡眠発作）、感情の強い動きを契機に突然筋肉の力を喪失する情動脱力発作、入眠直後にＲＥＭ睡眠が見られるＲＥＭ睡眠異常を特徴とする。１０歳代に発症することが多く、性差は見られず、日本人における有病率は０．１６−０．１８％、及び欧米では０．０２〜０．０６％である。また、一卵性双生児一致率は２０−３０％、第一近親発症率は１−２％と報告されており、一般人に比べて１０〜４０倍危険性が高い。したがって、ヒトのナルコレプシー は複数の遺伝要因と環境要因が相互に関与し合って発症にいたる多因子疾患と考えられている。

これまでに明らかにされた遺伝要因としてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ領域に存在するＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１−ＤＱＢ１^＊０６０２ハプロタイプがあり、日本人ナルコレプシー 患者のほぼ全例がこのハプロタイプを持つ（例えば、非特許文献１〜３）。しかし、このハプロタイプをもつ全てのヒトがナルコレプシー に罹患するわけではなく（健常者集団においても約１０％の頻度）、特にアフリカ系集団ではこのハプロタイプを持たない患者例も多い。従って、ＨＬＡ−ＤＲ−ＤＱハプロタイプはヒトナルコレプシー との極めて強い関連を示すものの、十分条件ではないと考えられている。

このことを示唆する他の知見として、ナルコレプシー患者のＨＬＡに対するλ値は２〜４と計算されている。このλ値は、第一近親者における相対的リスクよりも低い。これらの事実は、ＨＬＡ遺伝子以外の遺伝的因子がナルコレプシーに対する遺伝的素因に関係していることを示す。例えば、２３２４４個のマイクロサテライトマーカーを用いたゲノムワイドな関連解析によって、ＮＬＣ１−Ａ遺伝子がナルコレプシーに対する新規な耐性遺伝子として報告されている（例えば、特許文献１参照）。

近年、動物モデルを用いた研究により、イヌのヒポクレチン（オレキシン）受容体２遺伝子の障害が常染色体劣性のイヌのナルコレプシーを引き起こすことが報告されている。プレプロヒポクレチンをノックアウトしたマウスでもナルコレプシー様の行動や脳波を示す。ヒトでは、ナルコレプシー患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）においてヒポクレチン１が減少しているか又は検出できない。しかしながら、ヒトにおけるナルコレプシーは、１つのまれなケースを除き、ヒポクレチン神経伝達系の異常な変異は見受けられない。

特開２００６−２１７８８８号公報 Juji T, Satake M, Honda Y, Doi Y. HLA antigens in Japanese patients with narcolepsy. All the patients were DR2 positive. Tissue Antigens 1984;24(5):316-9. Langdon N, Welsh KI, van Dam M, Vaughan RW, Parkes D. Genetic markers in narcolepsy. Lancet 1984;2(8413):1178-80. Matsuki K, Juji T, Tokunaga K, Naohara T, Satake M, Honda Y. Human histocompatibility leukocyte antigen (HLA) haplotype frequencies estimated from the data on HLA class I, II, and III antigens in 111 Japanese narcoleptics. J Clin Invest 1985;76(6):2078-83.

本発明者らの分析によれば、ヒトナルコレプシーの原因はＨＬＡ領域の遺伝的多型のみによるものではなく、他にも疾患感受性遺伝子が存在すると考えられる。また、ヒトにおけるナルコレプシーは、プレプロヒポクレチン及びヒポクレチン受容体遺伝子の変異によっては説明できない。したがって、本発明は、新規なナルコレプシー関連遺伝子を探索し、これに基づいて睡眠障害の治療及び診断方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、５０万個以上の一塩基多型（ＳＮＰｓ）と十分な数のナルコレプシー患者及び健常者試料を用いてゲノムワイドな関連解析を行ったところ、２２番染色体のＣＰＴ１Ｂ及びＣＨＫＢ遺伝子領域における１つのＳＮＰ（識別番号ｒｓ５７７０９１７）が、再現性よく強い関連性（オッズ比：１．７９、Ｐ＝４．４×１０^−７）を示すことを見出した。このＳＮＰがＣＰＴ１Ｂ及びＣＨＫＢ遺伝子の発現に影響を与えるか否かを調べたところ、ｒｓ５７７０９１７のリスクアレルを有する個人において有意に当該遺伝子の転写量が減少していることを見出した。そして、これらの知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、睡眠障害を有するヒト対象者を治療又は改善するための医薬組成物であって、前記対象者におけるβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の代謝活性を調節する薬剤を含有することを特徴とする。１つの側面において、前記睡眠障害が不眠症であり、かつ前記薬剤は、β−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性抑制剤である。前記薬剤は、対象者におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を抑制する化合物を含むことが好ましい。

他の側面では、前記睡眠障害が過眠症であり、かつ前記薬剤がβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性増強剤であることを特徴とする。前記ヒト対象者が、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型について少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンである遺伝子多型を有することが好ましい。また、前記薬剤が、対象者におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を増強する化合物を含むことが好ましく、さらに好ましくは、アセチル−Ｌ−カルニチン、ＣＤＰ−コリン、及び／又はホスファチジルコリンを含む医薬組成物である。

別の観点において、本発明は過眠症の素因の有無を判定する方法を提供する。当該方法は、ヒト対象者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出し、前記ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンであるとき、前記対象者が過眠症に感受性であることを示唆することを特徴とする。

さらに異なる観点では、本発明は過眠症治療薬の選択方法であって、過眠症患者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出し、前記ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンであるとき、前記患者がβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の代謝活性増強剤によって治療、又は改善されることを示唆する。

さらになお異なる観点において、本発明は不眠症治療薬のスクリーニング方法を提供し、当該方法は、細胞内においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を抑制する化合物を選択することを含む。過眠症治療薬をスクリーニングする場合には、細胞内においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を増強する化合物を選択することを特徴とする。前記細胞はヒト神経細胞であることが好ましい。

本発明は、新規な過眠症感受性遺伝子としてのＣＰＴ１Ｂ及びＣＨＫＢの発見に基づくものであり、これらの遺伝子産物の代謝活性の調節を通じて不眠症又は過眠症の新規診断方法や治療方法を提供することができる。

１ β−酸化経路の活性調節剤
本発明の睡眠障害の治療又は改善剤は、ヒトのゲノムワイド関連解析によって見出された知見により、過眠症の患者と、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）遺伝子の転写活性との遺伝的関連性に基づくものである。すなわち、後述する実施例において詳細に示されるように、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型が過眠症と有意な関連を示し、ｒｓ５７７０９１７のリスクアレルを有する個人においてＣＰＴ１Ｂ遺伝子の転写量が減少していることが明らかとなった。

ＣＰＴ１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質は、筋肉ミトコンドリアにおける長鎖脂肪酸β−酸化経路の律速酵素である。ヒトＣＰＴ１Ｂ遺伝子及びタンパク質の構造は公知であり、例えば、ＮＣＢＩ等の公的データベースにＧｅｎｅＩＤ： １３７５及びＭＩＭ：６０１９８７として登録されている。ＣＰＴ１Ｂは、長鎖脂肪酸アシルＣｏＡをカルニチンと結合させることによって、その細胞質からミトコンドリア内への輸送を触媒する（図１参照、The Role of the Carnitine System in Human Metabolism. DANIEL W. FOSTER. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1033: 116 (2004)から引用した）。β−酸化経路とは、動物細胞における脂肪酸の主たる酸化経路であり、脂肪酸のβ位を酸化してアシルＣｏＡ（脂肪酸アシル−補酵素Ａ複合体）からアセチルＣｏＡを取り出し脂肪酸アシルの炭素を２個ずつ減らし、最終産物もアセチルＣｏＡとなる酸化経路である。β−酸化と睡眠との関係については、後述する実施例におけるゲノムワイド関連解析の結果の他にも、その関連性を強く示唆するいくつかの報告がある。例えば、全身的にカルニチンが欠乏する若年性内臓脂肪肝のマウスを絶食させると、断片化された覚醒とＲＥＭ睡眠頻度が高くなり、歩行運動活性が減少することが報告されている（Yoshida et al., Neurosci. Res. 2006, Vol.55, pp.78-86）。このマウスの表現型は、ナルコレプシーのモデルマウスと極めて類似しており、ナルコレプシーの治療薬であるモダフィニルによって活性化される。また、ナルコレプシーでは、ヒポクレチンの神経伝達が損なわれていることが知られているが、絶食した若年性内臓脂肪肝のマウスもまた視床下部側頭におけるｃ−ｆｏｓ陽性ヒポクレチンニューロンの割合が減少しており、脳脊髄液中のヒポクレチン−１濃度が減少していた。

さらに別の報告では、β−酸化経路の第一段階を触媒する短鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＳ遺伝子によってコードされる。）を欠損するマウスは、ＲＥＭ睡眠中のシータ（θ）波の周波数が低下し、グリオキシラーゼ−１（ＧＬＯ１）遺伝子の過剰発現を誘導する。β−酸化及びミトコンドリアの機能を改善するためのアセチル−Ｌ−カルニチンの投与は、この変異体マウスのシータ波とＧＬＯ１の過剰発現を顕著に回復させた(Tafti, M.et al., Nat. Genet. 2003, Vol.34, pp.320-325参照)。従って、β−酸化がヒポクレチンニューロンの活性、及びカルニチンシステムを介する睡眠−覚醒状態を調節することが可能である。ＣＰＴ１Ｂ遺伝子の転写量の低下は、β−酸化機能を低下させているかもしれない。よって、β−酸化の機能的減退は、ヒポクレチンニューロンの活性を低下させ、覚醒状態の維持を破壊するかもしれない。このようなβ−酸化活性を調節する１つの薬剤は、アセチル−Ｌ−カルニチン、又はＬ−カルニチンである。

その他のβ−酸化活性を調節する薬剤としては、ＣＰＴ１Ｂ活性化作用を有するものとして、ネオクロロゲン酸及びフェルロイルキナ酸などが知られている（特開２００６−３４２１４５号公報参照）。

β−酸化経路、又はその律速酵素であるＣＰＴ１Ｂ活性の抑制剤は、不眠症の改善又は睡眠導入剤として機能することができ、一方、β−酸化経路、又はその律速酵素であるＣＰＴ１Ｂ活性の増強剤は、過眠症の治療薬として使用することができる。

２ ＣＤＰ−コリン経路の活性調節剤
本発明は、ＣＤＰ−コリン経路の活性を調節することによって睡眠障害を治療又は改善するための薬剤を提供する。ヒトのゲノムワイド関連解析の結果によれば、過眠症患者の遺伝的多型と、コリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）遺伝子の転写活性との関連性もまた明らかとなった。すなわち、後述する実施例において詳細に示されるように、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型が過眠症と有意な関連を示し、ｒｓ５７７０９１７のリスクアレルを有する個人においてＣＨＫＢ遺伝子の転写量が減少しているという知見に基づく。

ＣＨＫＢ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ホスファチジルコリンの生合成のためのＣＤＰ−コリン経路における最初のリン酸化反応を触媒する。ヒトＣＨＫＢ遺伝子及びタンパク質の構造は公知であり、例えば、ＮＣＢＩ等の公的データベースにＧｅｎｅＩＤ： １１２０として登録されている。ＣＤＰ−コリン経路とは、図２に示したように、コリンの代謝経路の１つであり、コリンからホスファチジルコリンを合成する。ＣＤＰ−コリン及びホスファチジルコリンは、生体にとっての必須栄養素である。ＣＤＰ−コリンは、もっぱら脳循環・代謝改善薬として使用されている。ＣＤＰ−コリンはアセチルコリンの放出を増加させ、ヒポクレチンニューロンを活性化させることができる。ホスファチジルコリンは、哺乳動物細胞膜を構成する主要なリン脂質であり、その代謝回転は膜の構造と機能を維持するために重要である。ホスファチジルコリン合成の阻害は、脳におけるアポトーシスの引き金となる。ＣＨＫＢ遺伝子の転写レベルの減少は、コリンの代謝や、これらの重要な物質の産生を抑制する可能性がある。したがって、ＣＤＰ−コリン経路の代謝活性の低下は、脳のヒポクレチンニューーロンの機能障害に関係しているかもしれない。このようなナルコレプシーモデルにおいて、ＣＤＰ−コリン経路の活性を調節する候補薬剤は、ＣＤＰ−コリン及びホスファチジルコリンである。

ＣＤＰ−コリン経路、又はその律速酵素であるＣＨＫＢ活性の抑制剤は、不眠症の改善又は睡眠導入剤として機能することができ、一方、ＣＤＰ−コリン経路、又はその律速酵素であるＣＨＫＢ活性の増強剤は、過眠症の治療薬として使用することができる。

３ 医薬組成物
本発明のβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の代謝活性を調節する薬剤は、それ単独で、あるいは、薬剤学的又は獣医学的に許容される通常の担体又は希釈剤と共に、そのような治療の必要な被験者、例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。

本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の何れのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、貼付剤、坐剤等の製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。局所的、経皮的、又は経粘膜的に適用するためには、軟膏として塗布するか皮膚用の徐放性貼付剤を貼るのが好ましい。

これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。

４ 診断方法
本発明はまた、過眠症の素因の有無を判定する方法及び過眠症治療薬の選択方法を提供する。本発明の過眠症の素因の有無を判定する方法は、ヒト対象者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出し、前記ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンであるとき、前記対象者が過眠症に感受性であることを示唆する。本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる一塩基多型(single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、及び連続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方を含むものとする。すなわち、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１又は複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１又は複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、又は当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが証明される場合、その変異を「遺伝子多型」という。

「対立遺伝子、又はアレル（allele）」とは、相同な遺伝子座を占める遺伝子に複数の種類がある場合の、個々の遺伝子のことをいい、特定の遺伝子座を占める２種類の対立遺伝子の組を「遺伝子型」と称する。「連鎖不平衡」とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。

本書において、「関連がある」との用語が、「過眠症と関連がある」などの文脈で使用される場合には、統計学的な関連を有することを指し、好ましくは統計学的な解析によりｐ値が０．０５以下程度の有意な関連を有することを指す。本発明における「過眠症」とは、ナルコレプシーおよびその他の中枢性過眠症を含む。また、過眠症の「素因」、「感受性」とは、現在過眠症であることのみならず、将来、過眠症になることも含む。

本明細書中において引用するＳＮＰ識別番号は、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）が提供するＳＮＰデータベース（ｄｂＳＮＰ）から入手することができる。例えば、ＳＮＰ識別番号（ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ）：ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型は、ヒト第２２番染色体２２ｑ１３．３３上のＣＰＴ１Ｂ遺伝子とＣＨＫＢ遺伝子の間に存在する。対立遺伝子としてはＴ／Ｃ（遺伝子の相補鎖ではＡ／Ｇ）であり、Ｔが祖先型と推定されている。一般的に、母集団が異なると頻度も異なるが、日本人集団においてはＴが多数（約８５％）でありＣが少数である。なお、本書において、塩基配列の記号について、アデニンは「Ａ」、グアニンは「Ｇ」、シトシンは「Ｃ」、チミンは「Ｔ」、ウラシルは「Ｕ」、プリン（アデニン又はグアニン）は「Ｒ」、ピリミジン（チミン／ウラシル又はシトシン）は「Ｙ」と略記する。

本発明の方法で用いられる「ヒトのゲノムＤＮＡを含む試料」は、好ましくはアジア人の被験者、さらに好ましくは日本人の被験者から単離されるあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を材料として調製される。該材料としては、末梢血から分離した白血球又は単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法にしたがって単離される。

例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行なうことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。

次に、得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、過眠症と関連がある遺伝子多型（本発明の場合は、全て一塩基多型）を検出する。使用可能な検出法として、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラー・ビーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、及びＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。以下、代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。

ＤＮＡチップ法
多型部位を含む種々のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップ（遺伝子チップ）を用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ＤＮＡ等とハイブリダイゼーションを行なう。オリゴヌクレオチドを光リソグラフィー技術により、アレイ上で合成し、１チップ上に数千から数十万個のプローブを配置させたもの（アフィメトリクス社製、ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）等）や、予め調製したｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドをピン又はインクジェット方式によりガラス上に固定化する方法等が知られている。

ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ジデオキシ法により解析する方法である（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５'末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。

ＴａｑＭａｎＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１３〜２０塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、５'末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３'末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。

サーマルサイクラーを用いたＤＮＡの増幅を伴わない種々の方法が開発されている。例えば、インベーダー（登録商標）法は、２種類のオリゴヌクレオチドを用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する特殊な酵素反応に基づく（例えば、米国特許５８４６７１７号等参照）。この他に、ＵＣＡＮ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法及びＳＭＡＰ法等があるがこれらに限定されず、他の公知の遺伝子多型検出法を本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。

また、本発明は過眠症治療薬の選択方法を提供し、当該方法は、過眠症患者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出し、前記ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンであるとき、前記患者がβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性増強剤に感受性であることを示唆する。

５ 不眠症又は過眠症治療薬のスクリーニング方法
本発明の不眠症治療薬のスクリーニング方法は、細胞内においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を抑制する化合物を選択することを含む。具体的なスクリーニング方法としては、例えば、ヒト又は哺乳動物に候補化合物を摂取させ、所定の時間経過後の血中ＣＰＴ１Ｂ又はＣＨＫＢの存在量、又は血液細胞中におけるこれらの酵素の発現量を測定し、そしてＣＰＴ１Ｂ又はＣＨＫＢの存在量又は発現量を低下させるような化合物を選択する方法である。上記遺伝子の発現レベルを測定するために、それらの遺伝子の転写産物の量や翻訳産物の活性を測定することができる。転写産物の量の測定は、試料中における、又は当該試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡから、前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせによる定量的ＰＣＲ分析を行うことができる。前記遺伝子に特異的なプローブによるノーザンブロットも適用されうる。ＤＮＡチップを用いることによって転写産物を測定することが好ましい場合もある。

上記遺伝子の翻訳産物の量及び／又は活性は、免疫アッセイ、酵素活性の測定及び／又は結合アッセイを用いて検出されうる。これらのアッセイは、抗ポリペプチド抗体又は抗ポリペプチド抗体に結合する二次抗体の何れかに結合する、酵素的、蛍光的、放射性、磁性、又は発光標識の使用により、前記翻訳産物と抗ポリペプチド抗体との間の結合量を測定することができる。ＣＰＴ１Ｂ及びＣＨＫＢの酵素活性の測定方法は公知であり、例えば、ＤＴＮＢ法によるＣＰＴ１Ｂ活性の測定（Takahashi, M. et al. “Carnitine Determination by an Enzymatic Cycling Method with Carnitine Dehydrogenase” CLIN CHEM, 40 (5), 817-821 (1994)）や、アイソトープ標識したリン酸を用いるＣＨＫＢ活性測定方法等が知られている。

あるいは、細胞内においてＣＰＴ１Ｂ遺伝子又はＣＨＫＢ遺伝子の転写を阻害する物質；及び細胞内においてＣＰＴ１Ｂ又はＣＨＫＢの翻訳を阻害するか又は翻訳されたタンパク質の分解を促進する物質をスクリーニングしてもよい。具体的には、ＣＰＴ１Ｂ遺伝子又はＣＨＫＢ遺伝子のプロモーター配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含む発現ベクターを用意し、前記発現ベクターを哺乳動物細胞に形質移入し、候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質移入細胞を培養し、そして前記レポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物を選択する方法である。

ここで、本発明のスクリーニング方法に使用しうる宿主細胞としては、哺乳動物細胞であれば特に限定されず、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３及びＮＢ−１等の細胞株を使用してもよい。好ましくはヒト細胞、より好ましくはヒト神経細胞、さらに好ましくはオレキシン産生神経細胞である。「神経細胞」とは、ニューロン、グリア細胞、シュワン細胞等の神経系の細胞を意味する。上記発現ベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等がある。得られた形質転換細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ_２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、血清の共存が望ましくない場合には目的に応じた無血清培地を使用してもよい。

一方、本発明の過眠症治療薬のスクリーニング方法は、細胞内においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を増強する化合物を選択することを含む。具体的なスクリーニング方法としては、例えば、ヒト又は哺乳動物に候補化合物を摂取させ、所定の時間経過後の血中ＣＰＴ１Ｂ又はＣＨＫＢの存在量を測定し、そしてＣＰＴ１Ｂ又はＣＨＫＢの存在量又は発現量を上昇させるような化合物を選択する方法である。これらの遺伝子の発現量や発現産物の量を測定する方法は上述したとおりである。

あるいは、細胞内においてＣＰＴ１Ｂ遺伝子又はＣＨＫＢ遺伝子の転写を活性化する物質をスクリーニングしてもよい。具体的には、ＣＰＴ１Ｂ遺伝子又はＣＨＫＢ遺伝子のプロモーター配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含む発現ベクターを用意し、前記発現ベクターをヒト細胞に形質移入し、候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質移入細胞を培養し、そして前記レポーター遺伝子の発現を増強する候補化合物を選択する方法である。

本発明において用いられるレポーター遺伝子は、細胞内で発現し検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。ホタルルシフェラーゼはＡＴＰの存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、光子を生成する化学ルミネッセンス反応を触媒する。ルシフェラーゼは単量体のタンパク質で翻訳後の修飾を必要としないから、遺伝子発現のレポーター遺伝子として適している。遺伝子発現の速度変化を迅速に検出し、感度を向上させるためにルシフェラーゼタンパク質の安定性を低下させたり、また、測定再現性を上げるために内部標準酵素とのデュアルレポーターシステム等が開発されている。さらに好ましい実施形態において、細胞を溶解することなくレポーター遺伝子の活性を迅速かつ簡便に検出することができる分泌型レポーター遺伝子を用いることができる。海洋性のカイアシ類からクローン化された分泌型Metridia longaルシフェラーゼ遺伝子は、Ｎ末端に分泌に必要なアミノ酸残基１７個のシグナルペプチドを含む２４ｋＤａのタンパク質をコードしている。この分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイシステム用のベクターはクロンテック社からｐＭｅｔＬｕｃ−レポーターベクターとして市販されている。

これらのスクリーニング方法に用いることのできる候補化合物は、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物（例えばケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアルケミストリー技術、又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージディスプレイ法などを応用して作成されたランダムペプチド群を含む。）等を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然物質又は動物組織抽出物などもスクリーニングの候補化合物として用いることができる。さらには、安全性の確認された既存の医薬品やサプリメントの成分などからスクリーニングしてもよい。

以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

［ゲノムワイド関連解析］
被験者
カタプレキシー（脱力発作）を有するナルコレプシー患者３８１人、及びその他の中枢性過眠症患者９３人は、東京又はその近郊地域に住む血縁関係の無い日本人であり、睡眠障害の専門家医師による診断を受けた。すべてのナルコレプシー患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊１５０１−ＤＱＢ１^＊０６０２ハプロタイプを有していた。コントロール（対照者）は、日本に住む血縁関係の無い健常日本人である。本実施例では、２２２人のナルコレプシー患者と３８９人のコントロールについてゲノムワイド関連解析を行い、続いて１５９人のナルコレプシー患者と１９０人のコントロールについて再現性を確認した。

遺伝子型の解析
５００５６８個のＳＮＰｓの遺伝子型は、GeneChip Human Mapping 500Kアレイセット（アフィメトリクス社）を用いて行った。このアレイセットは、それぞれ約２５００００個のＳＮＰｓを有する２つのチップ（ＳｔｙＩ及びＮｓｐＩ） からなる。各個人のゲノムＤＮＡ約２５０ｎｇを、製造業者のプロトコルに従って処理した。遺伝子型判定は、ＧＣＯＳ１．４及びＧＴＹＰＥ４．１ソフトウエアパッケージを用いて解析した。ＧＴＹＰＥ４．１解析に際し、遺伝子型判定アルゴリズムＢＲＬＭＭ (the Bayesian Robust Linear Model with Mahalanobis distance threshold)における信頼スコアを０．５とした。全体のcall rateは、ＳＴＹアレイでは９６．７％、ＮＳＰアレイでは９７．５％であった。再現性確認段階における遺伝子型判定は、ＤｉｇｉＴａｇ２アッセイ及びタックマン遺伝子型判定アッセイ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。高密度マッピング、および他の中枢性過眠症における遺伝子型判定はタックマン遺伝子型判定アッセイを用いて行った。

データクリーニング
遺伝子型判定が一貫して問題のＳＮＰｓを除去するために、データクリーニングを行った。患者群及びコントロール群で少なくとも９５％のcall rateを必要とした。次に、コントロール群の遺伝子型頻度がハーディーワインベルグ平衡（ＨＷＥ Ｐ＜０．００１）から隔たったＳＮＰｓを除去した。すべてのサンプルにおいてマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）が５％より小さいＳＮＰｓを除去した。ＨＬＡ領域に位置するＳＮＰｓは、ナルコレプシーと強い関連を示すＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ遺伝子との連鎖不平衡による２次的な関連を示した。したがって、この領域（６番染色体の位置：27,000,000-34,000,000; Build 35)のＳＮＰｓも除去した。また、性比を患者群とコントロール群との間で合わせていないためＸ染色体上のＳＮＰｓもまた除去した。最終的に全部で２４９１３３個のＳＮＰｓがデータクリーニングを通過した。

統計的解析
疾患と関連する多型は、各ＳＮＰのアレル頻度の差をχ二乗検定で評価した。複数のテストを調整するために、False positive report probability (FPRP) 法を採用した。

ＦＰＲＰ＝α（１−π）／［α（１−π）＋（１−β）π］
ここで、π: 試験された遺伝的変異が病気と真に関連する事前確率； 1-β: 統計的検定力 ；及びα: level or observed P valueである。

上記式において、少なくともＦＰＲＰが０．５、及び１−βが０．８と推定した。事前確率πについて２つの基準を設定した。（ｉ）ゲノム全体のＳＮＰｓためのπ＝２０／２４９，１３３；（ｉｉ）事前確率が増加すると予想される候補遺伝子及び領域のＳＮＰｓためのπ＝５ ×２０／２４９，１３３。このときαは、（ｉ）Ｐ＜６．４×１０^−５；（ｉｉ）Ｐ＜３．２×１０^−４と計算される。このαは、２４９１３３個のＳＮＰｓから候補ＳＮＰをスクリーニングするための閾値である。

以上のようなデータクリーニング及び統計的手法を用いて、日本人由来の２２２人のナルコレプシー患者及び３８９人のコントロールにおける５００５６８ＳＮＰｓについて遺伝子型を解析した。偽陽性のシグナル数を減少させるために行ったデータクリーニングによって全部で２４９１３３個のＳＮＰｓを選択した。これらの各ＳＮＰについて、患者とコントロールの間でのアレル頻度を、χ二乗検定を用いて比較した。複数回のテストを調整するために、偽陽性報告確率（ＦＰＲＰ）の基準を用いた以下の２つの閾値を設定した：
（ｉ）ゲノム全体のＳＮＰｓのためのＰ＜６．４×１０^−５；
（ｉｉ）候補遺伝子及び領域のＳＮＰｓためのＰ＜３．２×１０^−４
その結果、これらの閾値を超えるものとして、表１に示す３０個のＳＮＰｓを同定した。

［再現性の確認］
再現性を確認するために、表１に示した３０個のＳＮＰｓについて、日本人由来の１５９人のナルコレプシー患者と１９０人のコントロールからなる独立したサンプルセットを用いて遺伝子型を解析した。すべてのＳＮＰｓについて遺伝子型を決定することができた。アレル頻度の差をχ二乗検定で評価し、P < 1.7 × 10^-3 (corresponding to P = 0.05 after Boneferroni correction for 30 tests)を有意とした。その結果、表１及び表２に示したように、第２２番染色体上のＳＮＰ認識番号ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰにおいて、再現性が認められた（Ｐ＝５．２×１０^−４；オッズ比＝１．９７；９５％信頼区間：１．３４−２．９０)。ゲノムワイド解析段階のＰ値は１．４×１０^−４（オッズ比＝１．７４；９５％信頼区間：１．３１−２．３１）であり、これらを組み合わせた全体のＰ値は４．４×１０^−７（オッズ比＝１．７９；９５％信頼区間：１．４３−２．２５）となった。オッズ比とは、要因（ｒｓ５７７０９１７）と結果（ナルコレプシー）との関連性の強さを示す指標であり、０〜無限大に分布し、１は無相関、１より大きい場合にはリスクが高いことを意味する。信頼区間とは９５％の確率で真の値が存在する範囲である。

［高密度マッピング］
タグＳＮＰｓは、ＨＡＰＬＯＶＩＥＷ ３．３．２で実行されるＴａｇｇｅｒアルゴリズム（ｒ^２＝０．８）を用いてＨａｐＭａｐＪＰＴ（日本人データ）から選択した。連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックは、ＨＡＰＬＯＶＩＥＷ ３．３．２で実行されるsolid spineの方法を用いてＤ‘＞０．８で決定した。ハプロタイプ解析は、ＨＡＰＬＯＶＩＥＷ ３．３．２を用いて行った。
ゲノムワイド解析の段階における２２２人のナルコレプシー患者と１９０人のコントロールを用い、高密度マッピングのために、主にタグＳＮＰｓと、既知の非同義ＳＮＰｓとの遺伝子型解析を行った。その結果を図３に示す。この高密度マッピングによって規定されたＬＤブロックは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）遺伝子と、コリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）遺伝子とをカバーした（図３参照）。識別番号ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰは、非同義ＳＮＰｓを含む他のマーカーよりも強く関連していた。ハプロタイプ解析の結果は、リスクハプロタイプがｒｓ５７７０９１７のマイナーアレル（Ｃアレル）によって標識されていることが分かった（図４参照）。識別番号ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰは、日本人由来の個人のＨａｐＭａｐデータからの当該ブロックにおいて、３つのＳＮＰｓ（ｒｓ２２６９３８１、ｒｓ５７７０９１１、及びｒｓ２２６９３８２）と強いＬＤ（ｒ^２＞０．８５）を有する。

そこで、ｒｓ５７７０９１７、ｒｓ２２６９３８１、ｒｓ５７７０９１１、及びｒｓ２２６９３８２のＳＮＰｓについて再現性確認段階のサンプルセットを用いて遺伝子型解析を行った。再現性確認段階においても、これら４つのＳＮＰｓ間で強いＬＤが認められた（ｒ^２＞０．９３）。 これらの結果は、ナルコレプシーとの関連性は、ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰ自身によるか、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型によって引き起こされていることが示された。

［他の中枢神経過眠症の解析］
続いて、ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰが他の中枢性過眠症の発症のためのリスクマーカーにもなるか否かを調べるために、ナルコレプシー以外の中枢性過眠症を有する９３人の患者と、ゲノムワイド及び再現性確認両方における５７９人のコントロールについて、ｒｓ５７７０９１７の遺伝子型を解析した。表３に示したように、有意な差異が認められた（片側検定におけるＰ＝０．０２７；オッズ比＝１．４６；９５％信頼区間：０．９９−２．１６）。ナルコレプシーとの相関の強さ（オッズ比＝１．７９）は他の中枢性過眠症のそれよりも大きいが、この結果より、ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰが中枢性過眠症全体と関連していることが示された。

［ＣＰＴ１Ｂ及びＣＨＫＢ遺伝子の発現解析］
高密度マッピングの結果より、識別番号ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰ、又はこれと強いＬＤを示す多型が、過眠症との関連性を有することが明らかとなった。ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰは、ＣＰＴ１Ｂ遺伝子の開始コドンの約１０００ｂｐ上流、及びＣＨＫＢ遺伝子の最後のコドン約２５０ｂｐ下流に位置していた。識別番号ｒｓ５７７０９１１のＳＮＰは、ＣＰＴ１Ｂ遺伝子のイントロンに位置し、ｒｓ２２６９３８１及びｒｓ２２６９３８２のＳＮＰｓはＣＨＫＢ遺伝子のイントロンに位置していた。これら４つのＳＮＰｓは前記２つの遺伝子のエクソンには存在しなかった。したがって、原因となるＳＮＰがＣＰＴ１Ｂ又はＣＨＫＢ遺伝子の転写量に影響を与えることが示唆される。これを証明するために、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。

被験者からの全血５ｍｌをPAXgene Blood RNA tubes (Becton Dickinson)に採取した。PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN)を用いて製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡを単離した。溶出した全ＲＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼＩ(DNase I)で処理し、濃縮された全ＲＮＡを得るためにRNeasy MinElute Cleanup kit (QIAGEN)を用いて洗浄した。ｃＤＮＡの第一鎖は、スーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システムと６塩基のランダムプライマー（インビトロジェン社）とを用いて合成した。目的遺伝子の相対的な量は、Taqman Gene Expression Assays （アプライドバイオシステムズ社）を用い、製造業者のプロトコルに従って測定した。発現量は、β−アクチン及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を標準化因子として評価した。

相対的な遺伝子発現量の分布を、ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰについてのＴＴホモ接合性の健常者１４人と、ＴＣへテロ接合性の健常者１０人との間でMann-Whitney U testを用いて比較した。その結果を図５に示す。ＣＰＴ１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡへの転写は、ＴＴ型に対してＴＣ型で有意な減少が認められた（Ｐ＝０．００３）。ＣＨＫＢ遺伝子においてもＴＴ型に対してＴＣ型で有意な減少が認められた。したがって、ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰについてＣアレルを有する個人のＣＰＴ１Ｂ及びＣＨＫＢ遺伝子の転写量は、Ｔアレルを有する個人のそれらよりも低下していることが明らかとなった。

β−酸化を含む脂肪酸の代謝経路を模式的に表した図である。 ＣＤＰ−コリン経路を含むコリンの代謝経路を模式的に表した図である。 ＣＰＴ１Ｂ遺伝子及びＣＨＫＢ遺伝子のための連鎖不平衡（Ｄ‘）対を示す図である。 ＣＰＴ１Ｂ遺伝子及びＣＨＫＢ遺伝子についてのハプロタイプ構造を示す。 ｒｓ５７７０９１７のＳＮＰ遺伝子型によるＣＰＴ１Ｂ遺伝子及びＣＨＫＢ遺伝子の発現量を示す。

Claims (12)

1. 睡眠障害を有するヒト対象者を治療又は改善するための医薬組成物であって、前記対象者におけるβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性を調節する薬剤を含有する医薬組成物。
2. 前記睡眠障害が不眠症であり、かつ前記薬剤がβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性抑制剤である請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記薬剤が、対象者におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を抑制する化合物を含む請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記睡眠障害が過眠症であり、かつ前記薬剤がβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性増強剤である請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記ヒト対象者が、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型について少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンである遺伝子多型を有する請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記薬剤が、対象者におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を増強する化合物を含む請求項４又は５に記載の医薬組成物。
7. 前記薬剤が、アセチル−Ｌ−カルニチン、L―カルニチン、ＣＤＰ−コリン、及び／又はホスファチジルコリンを含む請求項４又は５に記載の医薬組成物。
8. ヒト対象者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出し、前記ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンであるとき、前記対象者が過眠症に感受性であることを示唆する、過眠症の素因の有無を判定する方法。
9. 過眠症患者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＮＰ識別番号ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出し、前記ｒｓ５７７０９１７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がシトシンであるとき、前記患者がβ−酸化経路、又はＣＤＰ−コリン経路の活性増強剤によって治療、又は改善されることを示唆する過眠症治療薬の選択方法。
10. 細胞内においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を抑制する化合物を選択することを含む不眠症治療薬のスクリーニング方法。
11. 細胞内においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｂ（ＣＰＴ１Ｂ）、又はコリンキナーゼβ（ＣＨＫＢ）活性を増強する化合物を選択することを含む過眠症治療薬のスクリーニング方法。
12. 前記細胞はヒト神経細胞である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。

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