RU2762314C2 - Пробирка для ударной обработки шариками и способ экстракции дезорибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов - Google Patents
Пробирка для ударной обработки шариками и способ экстракции дезорибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2762314C2 RU2762314C2 RU2019126453A RU2019126453A RU2762314C2 RU 2762314 C2 RU2762314 C2 RU 2762314C2 RU 2019126453 A RU2019126453 A RU 2019126453A RU 2019126453 A RU2019126453 A RU 2019126453A RU 2762314 C2 RU2762314 C2 RU 2762314C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- balls
- beads
- bead
- paragraphs
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 36
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title abstract description 32
- 238000012545 processing Methods 0.000 title abstract description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title description 88
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title description 88
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 143
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 70
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 45
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 9
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 220
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 23
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 17
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 14
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 12
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 11
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 9
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 8
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 8
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 8
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 7
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical group [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 6
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical group O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- GFQYVLUOOAAOGM-UHFFFAOYSA-N zirconium(iv) silicate Chemical compound [Zr+4].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] GFQYVLUOOAAOGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical group [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 150000003891 oxalate salts Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 claims description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 239
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 26
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 140
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 75
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 65
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 38
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 34
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 27
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 23
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 21
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 21
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 21
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 20
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 17
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 16
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000003330 peritoneal dialysis fluid Substances 0.000 description 13
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 12
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 9
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 7
- 230000003116 impacting effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 6
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 241000588625 Acinetobacter sp. Species 0.000 description 5
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 5
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 5
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 5
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 5
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 5
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 4
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 241000158508 Corynebacterium amycolatum Species 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 4
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 4
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 4
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 4
- 241000142787 Pneumocystis jirovecii Species 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 4
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 4
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 4
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 4
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 4
- 241001147825 Actinomyces sp. Species 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 3
- 201000005019 Chlamydia pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 241000187681 Nocardia sp. Species 0.000 description 3
- 208000026681 Paratuberculosis Diseases 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N anhydrous guanidine Natural products NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000476 body water Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);zirconium(4+) Chemical compound [O-2].[O-2].[Zr+4] RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 208000030773 pneumonia caused by chlamydia Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 description 3
- ZUFONQSOSYEWCN-UHFFFAOYSA-M sodium;2-(methylamino)acetate Chemical compound [Na+].CNCC([O-])=O ZUFONQSOSYEWCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AEEZIRBYGITPDN-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecanoyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)OS([O-])(=O)=O AEEZIRBYGITPDN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBDIEUYACKKLIJ-UHFFFAOYSA-N 2-isocyanatoguanidine Chemical compound NC(=N)NN=C=O KBDIEUYACKKLIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 206010050337 Cerumen impaction Diseases 0.000 description 2
- 229910000669 Chrome steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N N(6)-dimethylallyladenine Chemical compound CC(C)=CCNC1=NC=NC2=C1N=CN2 HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 210000002939 cerumen Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 2
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M lithium perchlorate Chemical compound [Li+].[O-]Cl(=O)(=O)=O MHCFAGZWMAWTNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910001486 lithium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229940066491 mucolytics Drugs 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 2
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 2
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 2-amino-7-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one Chemical compound C1=CC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylamino-6-hydroxypurine Chemical compound N1C(N(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 5-(methylaminomethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CNCC1=CNC(=O)NC1=O MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 5-[(methoxyamino)methyl]-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CONCC1=CNC(=S)NC1=O WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSPHKCOAUOJLIO-UHFFFAOYSA-N 6-(aziridin-1-ylamino)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound N1C(=O)N=CC=C1NN1CC1 HSPHKCOAUOJLIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWJYOKZMYFJUOY-KQYNXXCUSA-N 9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-(methylamino)-7h-purin-8-one Chemical compound OC1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SWJYOKZMYFJUOY-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 244000208874 Althaea officinalis Species 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241001135529 Bordetella sp. Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588878 Eikenella corrodens Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical class [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 241000186360 Mycobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010034668 Peritoneal infections Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960001716 benzalkonium Drugs 0.000 description 1
- CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N benzododecinium Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 239000006047 digesta Substances 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002223 garnet Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000001035 marshmallow Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000001006 meconium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000009448 modified atmosphere packaging Methods 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbut-3-enyl)-2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(NCCC(C)=C)=C2NC=NC2=N1 XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical class NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920005606 polypropylene copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940045885 sodium lauroyl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- RUDFQVOCFDJEEF-UHFFFAOYSA-N yttrium(III) oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Y+3].[Y+3] RUDFQVOCFDJEEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052845 zircon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001928 zirconium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
- B01L3/5082—Test tubes per se
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
- G01N2001/2866—Grinding or homogeneising
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ лизиса клеток, содержащихся в крови с антикоагулянтом, включающий встряхивание крови в условиях, эффективных для лизиса грибкового патогена, в системе для ударной обработки шариками, которая включает (I) пробирку для образца или пробирку для сбора крови и (II) шарики, в отсутствие буфера для лизиса и какой-либо добавки. Изобретение обеспечивает повышение концентрации нуклеиновых кислот при их экстракции из патогенных микроорганизмов, содержащихся в биологическом образце. 35 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл. 3 пр.
Description
1. Предпосылки создания изобретения
Генетическое тестирование и диагностика инфекционных заболеваний играют важную роль в области клинической микробиологии. Для преодоления систематических ошибок и ограничений, присущих методологиям, основанным на использовании культур, все более широко применяют генетическое тестирование с целью обнаружения микроорганизмов, содержащихся в образце. Для того чтобы можно было проводить такое генетическое тестирование, клетки необходимо подвергать лизису для осуществления экстракции ДНК и/или РНК из микроорганизмов в максимально возможной концентрации.
Zhongtang Yu с соавторами в «Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples», BioTechniques, т. 36(5), 2004, cc. 808-812 описали метод выделения ДНК из образцов продуктов пищеварения и фекалий. Согласно указанному методу сначала смешивают 0,25 г образца жидкости, взятой из желудочно-кишечной системы коровы, которая предположительно содержит микроорганизмы, а именно бактерии, с 1 мл буфера, содержащего 500 мМ хлорид натрия, 50 мМ Трис гидрохлорид, рН 8,0, 50 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту и 4% додецилсульфата натрия. Затем в образец жидкости вносят 0,4 г стерильных циркониевых шариков. После этого полученную таким образом смесь, находящуюся в пробирке для образца, подвергают колебаниям с помощью устройства Mini-Bead Beater™ в течение трех минут таким образом, чтобы шарики разрушали клеточные стенки микроорганизмов. При осуществлении этого процесса происходит высвобождение содержащейся в клетках ДНК. Буфер служит также для защиты ДНК от расщепления ДНКазами, которые содержатся в образце жидкости. После осуществления ударной обработки шариками из образца удаляют примеси посредством осаждения ацетатом аммония. Нуклеиновые кислоты получают путем осаждения изопропанолом. На следующей стадии метода ДНК расщепляют последовательно РНКазой и протеиназой K и затем очищают с использованием колонки.
Недостаток метода заключается в его относительной сложности. Поскольку образец жидкости разбавляют путем добавления буфера, то происходит снижение концентрации ДНК в образце. Поэтому метод обладает лишь ограниченной точностью определения и чувствительностью.
Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных устройствах и методах осуществления лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот из микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости.
2. Краткое изложение сущности изобретения
Настоящая заявка относится к усовершенствованным пробиркам для ударной обработки шариками и к системам и способам ударной обработки шариками. В контексте настоящего описания понятие «пробирка для ударной обработки шариками» и понятие «пробирка для образца» используются взаимозаменяемо. Не вдаваясь в конкретную теорию, при создании изобретения было сделано предположение, что ударная обработка шариками дает возможность нуклеиновым кислотам растворяться в растворе. Настоящее изобретение в частности основано на открытии того, что применение ударной обработки шариками в методах экстракции нуклеиновых кислот приводит к потере нуклеиновых кислот вследствие абсорбции на шариках и что такую потерю можно предупреждать путем применения блокирующего агента в соответствующем количестве для блокирования сайтов связывания на шариках. Настоящее изобретение основано также на установленном факте того, что хотя некоторые буферы для лизиса, которые ранее применяли при осуществлении ударной обработки шариками, могут содержать реагенты, которые действуют в качестве блокирующих агентов, такие реагенты можно применять в количестве, намного меньшем того, в котором их обычно применяли. В контексте настоящего описания понятие «буфер для лизиса» относится к буферному раствору, который применяют для разрушения свободных клеток. Буферы для лизиса могут содержать, например, буфер (например, Трис-HCl) и одну или несколько солей (например, NaCl, KCl) и/или детергентов (например, додецилсульфат натрия).
Кроме того, настоящее изобретение основано также на установленном факте того, что некоторые биологические образцы, такие как кровь, сами по себе содержат блокирующие агенты и, следовательно, их можно подвергать ударной обработке шариками в отсутствии добавок, таких как буферы для лизиса. Так, например, кровь можно подвергать ударной обработке шариками непосредственно после сбора в поступающую в продажу пробирку для сбора крови, например, путем добавления шариков, используемых для ударной обработки шариками, в пробирку для сбора и осуществления интенсивного встряхивания пробирки для сбора. Примеры поступающих в продажу пробирок для сбора включают пробирки с сиреневой крышкой, содержащие ЭДТК, пробирки со светло-синей (голубой) крышкой, содержащие цитрат натрия, пробирки с серой крышкой, содержащие оксалат калия, или пробирки с зеленой крышкой, содержащие гепарин. В альтернативном варианте часть крови можно переносить в пробирку для образца для ударной обработки шариками.
Конкретные объекты изобретения относятся к системам для ударной обработки шариками, которые целесообразно применять, когда предназначенные для ударной обработки шариками образцы, которые в исходном состоянии не содержат блокирующие агенты или содержат блокирующие агенты в количествах, меньших тех, которые обеспечивают эффективную блокаду абсорбции нуклеиновых кислот шариками. Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, включают сухие блокирующие агенты. При создании изобретения неожиданно было установлено, что при применении систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, для осуществления лизиса микроорганизмов и экстракции дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) и/или рибонуклеиновых кислот (РНК) из микроорганизмов, содержащихся в жидком образце, можно достигать большего уровня экстракции ДНК и/или РНК, чем при использовании соответствующей пробирки для ударной обработки шариками, которая не содержит блокирующего агента.
Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, позволяют также избегать необходимости объединять образец с раствором для лизиса перед осуществлением ударной обработки шариками, что дает возможность выделять нуклеиновые кислоты в больших количествах благодаря отсутствию разведения образца.
Другие объекты изобретения относятся к способам осуществления ударной обработки шариками для осуществления лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот из биологических образцов. Способы включают осуществление ударной обработки шариками биологических образцов в отсутствии буфера для лизиса. В способах ударной обработки шариками можно применять предлагаемые в изобретении системы для ударной обработки шариками или стандартные системы для ударной обработки шариками. При применении стандартных систем для ударной обработки шариками в некоторых вариантах осуществления изобретения в системы для ударной обработки шариками добавляют один или несколько блокирующих агентов. В других вариантах осуществления изобретения, в частности в тех случаях, когда биологический образец в естественных условиях включает один или несколько блокирующих агентов, перед осуществлением ударной обработки шариками блокирующий агент не добавляют.
В некоторых вариантах осуществления изобретения система для ударной обработки шариками, предлагаемая в изобретении, состоит из пробирки для образца, которая содержит элемент, представляющий собой контейнер, с внутренней полостью, отверстие для внесения образца жидкости, содержащей микроорганизмы, во внутреннюю полость, и присоединенную или не присоединенную крышку для закрытия отверстия, где во внутреннюю полость помещено множество макроскопических частиц, которые приспособлены для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости, когда образец жидкости вносят во внутреннюю полость и пробирку для ударной обработки шариками подвергают механическим колебаниям. Примеры систем для ударной обработки шариками описаны ниже в разделе 4.1 и вариантах осуществления изобретения с номерами 1-24 и 90-98. Примеры пробирок для образцов, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, описаны в разделе 4.1.1, примеры блокирующих агентов, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, описаны в разделе 4.1.2, а примеры шариков, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, описаны в разделе 4.1.3.
Изобретение относится также к способу осуществления лизиса микроорганизмов для экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и/или рибонуклеиновой кислоты (РНК) из микроорганизмов, в котором получают образец жидкости, предположительно содержащий микроорганизмы, в котором в образец жидкости вносят множество частиц, способных перемещаться друг относительно друга, и образец жидкости с содержащимися в нем частицами подвергают колебаниям, в результате чего частицы могут механически разрушать клеточные стенки микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости. Примеры образцов, из которых можно экстрагировать ДНК, описаны в разделе 4.2, а примеры стадий предварительной обработки образцов, которые можно применять для приготовления образцов перед осуществлением экстракции нуклеиновых кислот, описаны в разделе 4.3. Примеры способов экстракции нуклеиновых кислот из образцов, например, из образцов, описанных в разделе 4.2, или образцов, которые подвергали предварительной обработке согласно процедуре, описанной в разделе 4.3, описаны ниже в разделе 4.4 и в вариантах осуществления изобретения с номерами 25-81 и 99-104. Наборы, которые можно применять для осуществления экстракции нуклеиновых кислот согласно способам, предлагаемым в изобретении, описаны ниже в разделе 4.7 и в вариантах осуществления изобретения с номерами 82-89.
3. Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - вид сбоку на приведенную в качестве примера систему (1) для ударной обработки шариками, содержащую пробирку (2) для образца и запорную крышку (6);
на фиг. 2 - вид сверху на систему для ударной обработки шариками, представленную на фиг. 1;
на фиг. 3 - вид снизу на систему для ударной обработки шариками, представленную на фиг. 1;
на фиг. 4 - продольное сечение через центральную плоскость системы для ударной обработки шариками, представленной на фиг. 1, с удаленной с пробирки для образца запорной крышкой, на котором показано отверстие (4), через которое можно осуществлять доступ во внутреннюю полость (3) пробирки для образца. Показаны находящиеся во внутренней полости шарики (7) и лиофилизированный блокирующий агент (8);
на фиг. 5 - продольное сечение через центральную плоскость системы для ударной обработки шариками, которая представлена на фиг. 1, заполненную образцом жидкости (5);
на фиг. 6 - интенсивность измеренного сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из С. albicans после ударной обработки шариками. Calbil 44 и Calbi54 представляют собой два различных целевых гена С. albicans, a HC01-Rat87 представляет собой ген, применяемый в качестве отрицательного контроля. В данном исследовании продемонстрировано, что мочевина оказывает блокирующее воздействие при осуществлении ударной обработки шариками, облегчая выделение ДНК С. albicans из жидкости, полученной при перитонеальном диализе (ПД-жидкость);
на фиг. 7 - интенсивность сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из С. albicans после ударной обработки шариками. Calbil 44 и Calbi54 представляют собой два различных целевых гена С. albicans, a HC01-Rat87 представляет собой ген, применяемый в качестве отрицательного контроля. В данном исследовании продемонстрировано, что РНК оказывает блокирующее воздействие при ударной обработки шариками, облегчая выделение ДНК С. albicans из ПД-жидкости;
на фиг. 8 - интенсивность сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из С. albicans после ударной обработки шариками. Calbil 44 и Calbi54 представляют собой два различных целевых гена С. albicans, a HC01-Rat87 представляет собой ген, применяемый в качестве отрицательного контроля. В качестве матрицы включали ДНК С. albicans в количестве, соответствующем максимальному теоретическому выходу после экстракции. В данном исследовании продемонстрировано, что ДНК С. albicans можно выделять путем ударной обработки крови шариками в отсутствии добавок;
на фиг. 9 - интенсивность сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из S. aureus после ударной обработки шариками. Выявленные гены применяют для обнаружения эубактерий (Eub), грам-отрицательных бактерий (Gng), грам-положительных бактерий (Gpo), стафилококков (AHStaph), энтеробактерий (Entb), S. aureus (Sau), микоплазмы (Myco). N03 Rat 87 представляет собой отрицательный контроль, а СС представляет собой внутренний контроль. В качестве матрицы включали ДНК С. albicans в количестве, соответствующем максимальному теоретическому выходу после экстракции. В данном исследовании продемонстрировано, что ДНК С. albicans можно выделять путем ударной обработки крови шариками в отсутствии добавок;
на фиг. 10 - интенсивность измеренного сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из Е. coli после ударной обработки шариками. Выявленные гены применяют для обнаружения эубактерий (Eub), грам-отрицательных бактерий (Gng), грам-положительных бактерий (Gpo), Е. coli (Есо), стафилококков (AHStaph), энтеробактерий (Entb). N03 Rat 87 представляет собой отрицательный контроль, а СС представляет собой внутренний контроль. В качестве матрицы включали ДНК Е. coli в количестве, соответствующем максимальному теоретическому выходу после экстракции. В данном исследовании продемонстрировано, что ДНК Е. coli можно выделять путем ударной обработки крови шариками в отсутствии добавок.
4. Подробное описание изобретения
Ударная обработка шариками представляет собой процесс гомогенизации, применяемый для лизиса клеток с целью высвобождения их содержимого, включая их нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). Образцы помещают в пробирки, содержащие соответствующие размалывающие шарики и подвергают интенсивному (высокоэнергетическому) перемешиванию. Затем образцы, как правило, центрифугируют и отделяют лизат от указанных выше шариков. Как правило, образцы подвергают ударной обработке шариками в присутствии буфера для лизиса для облегчения высвобождения ДНК из клеток.
Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам и системам для ударной обработки шариками. Способы ударной обработки шариками можно осуществлять без использования буфера для лизиса, что упрощает процесс клеточного лизиса и экстракции нуклеиновых кислот и позволяет избегать разведения образца, минимизируя при этом потерю вследствие абсорбции на шариках.
Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, относятся к осуществлению ударной обработки шариками с использованием блокирующих агентов в соответствующем количестве. Блокирующие агенты могут быть экзогенными или эндогенными по отношению к образцу. Например, моча содержит мочевину, т.е. реагент, который, как было установлено, блокирует связывание нуклеиновых кислот, присутствующих в биологическом образце, с шариками, предназначенными для ударной обработки шариками. Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы ударной обработки шариками таких образцов без добавления экзогенных блокирующих агентов, хотя также предусматривается и пополнение эндогенных блокирующих агентов экзогенными блокирующими агентами. Для биологических образцов, не содержащих или содержащих в малом количестве эндогенные блокирующие агенты, можно применять экзогенные блокирующие агенты. В настоящем изобретении предложены также системы для ударной обработки шариками, в которые вносят сухие блокирующие агенты, дающие возможность осуществлять ударную обработку шариками биологических образцов без добавления реагентов, которые приводят к разбавлению образцов.
Таким образом, в настоящем изобретении предложены системы для ударной обработки шариками, которые включают сухие блокирующие агенты. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы осуществления ударной обработки шариками для лизиса клеток, содержащихся в биологических образцах, и экстракции нуклеиновых кислот из них. Способы предусматривают осуществление ударной обработки биологических образцов в отсутствии буфера для лизиса. В способах ударной обработки можно применять предлагаемые в изобретении системы для ударной обработки шариками или стандартные системы для ударной обработки шариками. В некоторых вариантах осуществления изобретения при применении стандартных систем ударной обработки шариками в системы для ударной обработки шариками добавляют один или несколько блокирующих агентов. В других вариантах осуществления изобретения, прежде всего в тех случаях, когда биологический образец в естественных условиях содержит один или несколько блокирующих агентов, блокирующий агент не добавляют перед осуществлением ударной обработки шариками.
В настоящем описании предложены также наборы, содержащие системы ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении (или пригодные для их получения).
4.1 Система для ударной обработки шариками
В настоящем изобретении предложены системы для ударной обработки шариками, которые можно применять для лизиса клеток и экстракции дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) и рибонуклеиновых кислот (РНК) из клеток (например, микроорганизмов), содержащихся в жидком образце. Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, содержат пробирку для образца, а также шарики и сухой блокирующий агент, помещенные в пробирку для образца. Блокирующие агенты, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают мочевину, соли гуанидина, детергенты, нуклеотиды, поливинилпирролидон (ПВП) и олигонуклеотиды. Блокирующие агенты подробно описаны в разделе 4.1.2. Шарики, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают шарики, содержащие минерал и/или металл. Шарики, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, описаны в разделе 4.1.3.
4.1.1 Пробирка для образца
Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, содержат пробирку для образца, имеющую внутреннюю полость, в которую можно осуществлять доступ через отверстие и в которую можно помещать шарики, блокирующий агент и жидкий образец. Пробирка для образца может быть сделана из любого биологически инертного материала (например, из пластика или боросиликата), и предпочтительно она сделана из пластика (например, полипропилена, сополимера полипропилена или поликарбоната). В контексте настоящего описания понятие «пробирка» включает флаконы (например, стаканы для помола) и пробирки (например, конические пробирки).
Система для ударной обработки шариками может включать закрывающее устройство для закрытия отверстия и запечатывания пробирки для образца. Закрывающее устройство может быть закреплено на пробирке для образца (например, крышка, закрепленная на пробирке для образца с помощью шарнира) или ее можно снимать с пробирки для образца (т.е. удаляемая крышка). Пробирка для образца может включать резьбовую область, приспособленную для соединения с имеющей резьбу крышкой. Резьба может находиться на внутренней или внешней поверхности пробирки для образца (например, как продемонстрировано на фиг. 4-5).
Пробирки для образца, которые можно применять в системе для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении, поступают в продажу, например, снабженные завинчивающейся крышкой полипропиленовые пробирки или центрифужные пробирки. При изготовлении пробирок и систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, можно использовать стандартные размеры пробирок, например, 0,5 мл, 1,7 мл, 2 мл, 4,5 мл, 7 мл, 15 мл, 50 мл или 250 мл.
4.1.2 Блокирующий агент
Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, включают сухие блокирующие агенты. В контексте настоящего описания «сухой» или «высушенный» блокирующий агент представляет собой блокирующий агент, влажность которого составляет менее 20%. В некоторых вариантах осуществления изобретения влажность сухого блокирующего агента составляет менее 15%, менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1%.
Сухой блокирующий агент предпочтительно обладает долговременной стабильностью, т.е. систему для ударной обработки шариками можно без проблем транспортировать и хранить в течение длительного периода времени без значительного снижения блокирующего действия. Сухой блокирующий агент можно свободно помещать во внутреннюю полость элемента, представляющего собой контейнер, и/или на часть или всю внутреннюю полость элемента можно наносить слой или пленку из блокирующего агента. Блокирующий агент предпочтительно лиофилизируют. Блокирующий агент можно лиофилизировать до или после внесения шариков в пробирку.
Примеры блокирующих агентов включают один или несколько хаотропных агентов (например, мочевину, соли гуанидина), один или несколько детергентов, один или несколько нуклеотидов, поливинилпирролидон (ПВП), один или несколько олигонуклеотидов или любую их комбинацию. Более подробно такие примеры блокирующих агентов описаны ниже в разделах 4.1.2.1-4.1.2.5. Включение блокирующих агентов, которые вносят вклад в осуществление лизиса клеточной стенки микроорганизмов (например, детергента), может повышать выход нуклеиновых кислот, получаемых с использованием систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, и позволяет избегать объединения образца с раствором для лизиса перед осуществлением ударной обработки шариками. Как правило, количества блокирующих агентов, применяемые в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, меньше, чем тех, которые применяют в растворах для лизиса.
Систему для ударной обработки шариками можно получать путем лиофилизации раствора для лизиса (который называют также буфером для экстракции или буфером для лизиса) в пробирке для ударной обработки шариками. Растворы для лизиса, содержащие блокирующие агенты, известны в данной области или они поступают в продажу.
В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько детергентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов и один или несколько детергентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов и один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько детергентов и один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько детергентов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько нуклеотидов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, один или несколько детергентов, и один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, one or more детергентов, и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, один или несколько нуклеотидов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько детергентов, один или несколько нуклеотидов, и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, один или несколько детергентов, один или несколько нуклеотидов, и один или несколько олигонуклеотидов.
Блокирующий агент может содержать или дополнительно содержать этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) и/или ее натриевую соль. ЭДТК связывает кальций, магний и железо и тем самым инактивирует дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы. Эта мера препятствует также расщеплению ДНК и РНК, содержащихся в образце жидкости, обработанном с применением системы для ударной обработки шариками. Таким образом, обеспечивается более высокая чувствительность и воспроизводимость результатов измерений при исследовании ДНК и/или РНК, экстрагированной из клеток (например, микроорганизмов) с применением системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении.
Блокирующий агент можно свободно помещать во внутреннюю полость элемента, представляющего собой контейнер, например, в порошкообразной форме. Порошок можно, например, смешивать с шариками в образце или можно вносить в пробирку для образца в виде слоя, находящегося над и/или под шариками. В альтернативном или дополнительном варианте внутренняя стенка пробирки для образца может быть по меньшей мере частично покрыта слоем или пленкой из блокирующего агента. Слой или пленку можно получать путем выпаривания жидкости из водной смеси, содержащей блокирующий агент, которую добавляют в пробирку для образца. В другом варианте осуществления изобретения некоторая часть или все шарики в системе для ударной обработки шариками могут быть покрыты блокирующим агентом.
4.1.2.1 Хаотропные агенты
Хаотропные агенты нарушают структуру и вызывают денатурацию макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Хаотропные растворенные вещества снижают чистый гидрофобный эффект, обусловленный гидрофобными областями, путем нарушения порядка молекул воды, находящихся вблизи белка. Это вызывает солюбилизацию гидрофобной области в растворе, приводя тем самым к денатурации белка. Вышеуказанное воздействие непосредственно относится также к гидрофобной области в липидных бислоях; если достигается критическая концентрация хаотропного растворенного вещества (в гидрофобной области бислоя), то может нарушаться целостность мембраны и может иметь место лизис клетки.
Ниже представлены примеры хаотропных агентов, которые можно применять в качестве блокирующих агентов.
Мочевина: Когда блокирующий агент содержит мочевину (или тиомочевину; в настоящем описании, если из контекста не следует иное, понятие мочевина включает тиомочевину), количество мочевины можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать при применении системы для ударной обработки шариками, так чтобы концентрация мочевины, растворенной в образце жидкости после добавления образца жидкости, в пробирку для образца составляла от 10 до 100 г/литр, от 50 до 100 г/литр, от 20 до 50 г/л или от 25 до 35 г/л. Таким образом, согласно представленным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество мочевины, применяемой в качестве блокирующего реагента, должно составлять от 10 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 20 до 50 мг или от 25 до 35 мг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество мочевины, применяемой в качестве блокирующего реагента, должно составлять от 8 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 16 до 40 мг или от 20 до 28 мг соответственно.
Соли: Определенные соли могут обладать характеристиками, присущими хаотропным агентам. Соли могут обладать хаотропными свойствами за счет защитных зарядов и предупреждения стабилизации солевых мостиков.
Хаотропные соли включают различные соли гуанидина, лития и магния.
Соли гуанидина: Соли гуанидина, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают изоцианат гуанидина, хлорид гуанидина и их комбинации.
Соли лития: Соли лития, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают перхлорат лития, ацетат лития и их комбинации.
Соли магния: Соли магния, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают хлорид магния.
Детергенты: Определенные детергенты могут действовать в качестве хаотропных агентов, например, додецилсульфат натрия («ДСН). Применение детергентов в качестве блокирующих агентов описано в разделе 4.1.2.3.
4.1.2.2 Креатинин
Когда блокирующий агент содержит креатинин, то наличие креатинина во внутренней полости пробирки для образца может препятствовать расщеплению ДНК и/или РНК, содержащейся в образце, подвергнутом обработке с использованием системы для ударной обработки шариками. Кроме того, креатинин предупреждает неспецифическое связывание ДНК и/или РНК с шариками и/или внутренней стенкой пробирки для образца. Это обеспечивает более высокий выход при экстракции ДНК и/или РНК из клеток (например, микроорганизмов), обработанных с использованием системы, содержащей пробирку для ударной обработки шариками.
4.1.2.3 Детергенты
Детергенты, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают додецилсульфат натрия, лауроилсульфатсаркозинат натрия, полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат и их комбинации. Полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат известен также под названием полисорбат 20.
Количество детергента, применяемого в качестве блокирующего агента, можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать при применении системы для ударной обработки шариками. В определенных вариантах осуществления изобретения концентрация детергента, растворенного в образце жидкости после добавления образца жидкости, в пробирку для образца составляет от 1 до 50 мг/мл, от 1 до 25 мг/мл или от 25 до 50 мг/мл. Таким образом, согласно описанным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество детергента, применяемого в качестве блокирующего агента, должно составлять от 1 до 50 мг, от 1 до 25 мг, или от 25 до 50 мг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество детергента, применяемого в качестве блокирующего агента, должно составлять от 0,8 до 40 мг, от 0,8 до 20 мг или от 20 до 40 мг.
4.1.2.4 Нуклеотиды
Нуклеотиды, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды и их комбинации.
Нуклеотиды могут представлять собой встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды. Встречающиеся в естественных условиях рибонуклеотиды представляют собой аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат и тимидинмонофосфат. Встречающиеся в естественных условиях дезоксирибонуклеотиды, которые можно применять в качестве блокирующих агентов, представляют собой дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат и дезокситимидинмонофосфат.
Нуклеотиды могут представлять собой не встречающиеся в естественных условиях аналоги встречающихся в естественных условиях нуклеотидов. Примеры не встречающиеся в естественных условиях аналогов включают (но, не ограничиваясь только ими) пептидные нуклеотиды, нуклеотиды замкнутой нуклеиновой кислоты («LNA») (которые содержат бициклические сахарные фрагменты вместо сахаров дезоксирибозы или рибозы), нуклеотиды с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфороамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), и нуклеотиды, содержащие «качающиеся» основания. В конкретных вариантах осуществления изобретения аналог представляет собой 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту и 2,6-диаминопурин или 7-деазагуанозин.
В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит смесь по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или четырех встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов. В других вариантах осуществления изобретения блокирующий агент блокирующий агент содержит смесь по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или четырех встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов. В следующих вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит смесь по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, четырех или даже более четырех нуклеотидных аналогов. В следующих вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит смесь (а) встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов и встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов, (б) встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов, (в) встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов или (г) встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов, встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов.
Количество рибонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать в системе для ударной обработки шариками. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация рибонуклеотидов, растворенных в образце жидкости, после добавления образца жидкости в пробирку для образца составляет от 200 пг/мл до 20 мкг/мл, от 1 нг/мл до 15 мкг/мл или от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. Таким образом, согласно указанным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество рибонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 200 пг до 20 мкг, от 1 нг до 15 мкг или от 1 мкг до 10 мкг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество рибонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 160 пг до 16 мкг, от 0,8 нг до 12 мкг или от 0,8 мкг до 8 мкг.
4.1.2.5 Олигонуклеотиды
Олигонуклеотиды, применяемые в качестве блокирующих агентов можно синтезировать или получать из встречающихся в естественных условиях источников.
В контексте настоящего описания понятие «олигонуклеотид» не связано с размером молекулы и относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины. Однако, как правило, олигомеры состоят не более чем из 2000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, более типично не более чем из 500 нуклеотидов и еще более типично не более чем из 250 нуклеотидов. Понятие «олигонуклеотид» включает двух- и одноцепочечные (но предпочтительно по меньшей мере частично одноцепочечные) ДНК и РНК. Оно включает также наличие известных типов модификаций, например, меток, известных в данной области, метилирования, «кэпов» и замены одного или нескольких встречающихся в естественных условиях нуклеотидов на аналоги (такие, как аналоги, описанные в разделе 4.1.2.4).
Олигонуклеотиды могут представлять собой смесь олигонуклеотидов различных размеров и/или могут содержать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, нуклеотидные аналоги или комбинацию двух или большего количества указанных выше элементов (например, смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, смесь рибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов, смесь дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов или смесь рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов). В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит РНК.
Синтетические олигонуклеотиды, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, как правило, имеют длину от 2 до 120 нуклеотидов. В различных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотиды имеют длину, равную 2, 5, 8, 10, 15, 18, 25, 40, 50, 80, 100 или 120 нуклеотидам, или олигонуклеотиды имеют длину, находящуюся между любыми двумя из указанных выше величин, например, длину от 2 до 100 нуклеотидов, длину от 2 до 50 нуклеотидов, длину от 2 до 25 нуклеотидов, длину от 5 до 40 нуклеотидов, от 2 до 15 нуклеотидов, от 8 до 120 нуклеотидов, от 8 до 80 нуклеотидов, от 10 до 100 нуклеотидов, от 15 до 50 нуклеотидов, от 50 до 100 нуклеотидов, от 100 до 120 нуклеотидов и т.д. и т.п.
Встречающиеся в естественных условиях олигонуклеотиды могут быть получены путем выделения ДНК из одного или нескольких встречающихся в естественных условиях источников, например, из ДНК спермы лосося, ДНК тимуса теленка, ДНК спермы сельди или их комбинаций.
Количество олигонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать в системе для ударной обработки шариками. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация олигонуклеотидов, растворенных в образце жидкости, после добавления образца жидкости в пробирку для образца составляет от 200 пг/мл до 20 мкг/мл, от 1 нг/мл до 15 мкг/мл или от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. Таким образом, согласно указанным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество олигонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 200 пг до 20 мкг, от 1 нг до 15 мкг или от 1 мкг до 10 мкг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество олигонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 160 пг до 16 мкг, от 0,8 нг до 12 мкг или от 0,8 мкг до 8 мкг.
4.1.3 Шарики
Система для ударной обработки шариками, предлагаемая в изобретении, содержит шарики, которые могут перемещаться друг относительно друга, когда их помещают в образец жидкости. В контексте настоящего описания понятие «шарик» включает как сферические, так и несферические частицы. Шарики могут представлять собой минеральные шарики, например, сделанные из кристаллических частиц (например, циркония, циркона (силиката циркония) и двуокиси циркония (диоксида циркония), кварца, оксида алюминия, карбида кремния (который называют также карборундом), гранат, керамических частиц, стекол различных типов (например, стекла из двуокиси кремния или диоксида кремния) или комбинаций, включающих один или несколько из вышеуказанных материалов (например, шарики из диоксида циркония/диоксида кремния или шарики из диоксида циркония/иттрия). Шарики могут представлять собой также металлические шарики, например, шарики из нержавеющей стали или шарики из хромистой стали.
Для выделения бактериальной ДНК шарики предпочтительно включают кварцевые частицы и/или циркониевые частицы. Такие шарики поступают в продажу в больших количествах, и они являются химически инертными по отношению к ДНК и РНК. Кварцевые и/или циркониевые частицы имеют относительно высокий удельный вес, они являются твердыми и могут иметь острые грани. Поэтому они хорошо подходят для открытия клеточных мембран, когда их подвергают механическим вибрациям.
Специалисты в данной области могут выбирать материал и размер шариков для конкретной системы для ударной обработки шариками на основе идентификации типов клеток в образце жидкости, предназначенном для обработки. Как правило, шарики должны иметь диаметр от 50 пм до 3 мм. Для экстракции нуклеиновых кислот из бактериальных клеток можно применять шарики размером от малого до среднего, как правило, сделанные из стекла или циркония, которые имеют диаметр от 50 мкм до 0,5 мм. Для экстракции нуклеиновых кислот из более крупных клеток микробов, таких как дрожжевые клетки, можно применять шарики размером от среднего до большого (например, шарики диаметром 0,5, 1 или 1,5 мм, как правило, сделанные из стекла или циркония). Шарики различных размеров и составов поступают в продажу (см., например, документ фирмы Benchmark Scientific, Product Note: Benchmark Bead Beating Guide, доступный на сайте www.denvillescientific.com/sites/default/files/Bead_Blasting_Notes.pdf).
Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, могут включать шарики нескольких типов и/или шарики нескольких размеров одного типа, в частности в тех случаях, когда требуется осуществлять выделение нуклеиновой кислоты из нескольких источников (например, бактериальная и грибная ДНК). Примеры систем для ударной обработки шариками с шариками нескольких типов включают системы с комбинацией шариков из оксида алюминия и шариков из карбида кремния, комбинацией керамических шариков и шариков из диоксида кремния, комбинацией стеклянных шариков и шариков из оксида циркония, комбинацией циркониевых шариков и шариков из оксида алюминия или комбинацией шариков из карбида кремния и стеклянных шариков. Шарики различных типов могут иметь одинаковые или различные размеры.
4.2 Образцы
Примеры образцов, из которых можно экстрагировать нуклеиновые кислоты с использованием способов ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают различные образцы жидкости. В некоторых случаях образец может представлять собой образец общей воды организма индивидуума. Образец может включать ткань, взятую из организма индивидуума. Образец может включать общую воду организма, выделения (секрет) и/или ткань индивидуума. Образец может представлять собой биологический образец. Биологический образец может представлять собой образец общей воды организма, секрета и/или ткани. Примеры биологических образцов могут включать (но, не ограничиваясь только ими) кровь, сыворотку, слюну, мочу, желудочный и пищеварительный сок, слезы, испражнения, сперму, вагинальную жидкость, интерстициальные жидкости, выделенные из опухолевой ткани жидкости, глазные жидкости, пот, слизь, ушную серу, жир, железистые секреты, выдыхаемый продукт, спинальную жидкость, волосы, ногти, клетки кожи, плазму, мазок из носа или носоглоточный смыв, спинальную жидкость, спинномозговую жидкость, ткань, мазок из глотки, мазок из раны, биопсию, плацентарную жидкость, амниотическую жидкость, кровь из пуповины, эмфатические жидкости, внутриполостные жидкости, мокроту, гной или другие экссудаты из раны, образцы инфицированной ткани, полученные при хирургической обработке или иссечении, спинномозговую жидкость, лаваж, продукты лейкопоэза, жидкость, полученную при перитонеальном диализе, молоко и/или другие выделения, а также растения и их части.
Образец можно помещать в пробирку для ударной обработки шариками сразу после его взятия из организма индивидуума или его можно подвергать определенной форме предварительной обработки (например, с использованием процедур, описанных ниже в разделе 4.3), хранить или транспортировать перед помещением в пробирку для ударной обработки шариками. Образец можно добавлять в систему для ударной обработки шариками без обработки или осуществлять ее несколько раз.
Индивидуум может предоставлять образец сам и/или образец может быть взят из организма индивидуума (например, образец крови можно собирать в пробирку для сбора крови, содержащую антикоагулянт, такой как ЭДТК). Индивидуум может представлять собой человека или животное кроме человека. Образец может быть взят из организма живого или мертвого индивидуума. Животное может представлять собой млекопитающее, такое как сельскохозяйственное животное (например, корову, свинью, овцу), спортивное животное (например, лошадь) или домашнее животное (например, собаку или кошку). Индивидуум может представлять собой пациента, индивидуума на клинической или доклинической стадии. Индивидуум может находиться на стадии установления диагноза, лечения и/или контроля заболевания, или подвергаться коррекции образа жизни или профилактическим мерам. За индивидуумом может осуществлять уход профессиональный медицинский работник или такой уход может не осуществляться.
В некоторых вариантах осуществления изобретения образец может представлять собой образец, взятый из окружающей среды. Примеры образцов, взятых из окружающей среды, включают образцы воздуха, образцы воды (например, грунтовой воды, поверхностной воды или сточной воды), образцы почвы или растительные образцы.
Дополнительными примерами образцов могут служить пищевые продукты, напитки, производственные материалы, текстильные изделия, химикаты, терапевтические средства или любые другие образцы.
4.3 Предварительная обработка образца
В некоторых случаях может оказаться предпочтительным подвергать образец предварительной обработке перед осуществлением обработки в системе для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении. Примеры стадий предварительной обработки, которые можно применять перед внесением образца в пробирку для ударной обработки шариками, включают фильтрацию, дистилляцию, экстракцию, концентрирование, центрифугирование, инактивацию вредных компонентов, добавление реагентов и т.п., как представлено в настоящем описании, или, в ином случае, согласно процедурам, известным в данной области.
Может оказаться особенно предпочтительным удалять нежелательные типы клеток и состоящий из частиц продукт из биологических образцов перед их внесением в пробирку для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для достижения максимального выхода ДНК из представляющего интерес типа клеток.
Если предполагается обнаруживать бактерии в биологическом образце, то желательно биологический образец подвергать предварительной обработке, пропуская через фильтр так, чтобы состоящий из частиц продукт и небактериальные клетки удерживались на фильтре, в то время как бактериальные клетки (включая их споры, если это требуется) проходили через него. В контексте настоящего описания «фильтр» представляет собой мембрану или устройство, который/которое обеспечивает дифференциальное прохождение частиц и молекул в зависимости от размера. Как правило, это осуществляют с использованием фильтра, имеющего поры конкретного номинального размера. Например, фильтры, представляющие особый интерес для применения с целью обнаружения бактерий, имеют поры, достаточно большие для обеспечения прохождения бактерий, но достаточно малые для того, чтобы предупреждать прохождение эукариотических клеток, которые присутствуют в представляющем интерес образце. Как правило, диаметр бактериальных клеток составляет от 0,2 до 2 мкм (микрометров или микронов), диаметр большинства грибных клеток составляет от 1 до 10 мкм, тромбоциты имеют диаметр примерно 3 мкм, а большинство имеющих ядра клеток млекопитающих, как правило, имеют диаметр от 10 до 200 мкм. Таким образом, для удаления небактериальных клеток из биологического образца, если предполагается осуществлять обнаружение бактерий, наиболее пригодны фильтры с размерами пор менее 2 мкм или менее 1 мкм.
Дополнительно или вместо стадии фильтрации биологический образец можно подвергать центрифугированию для удаления клеток и дебриса из образца перед осуществлением ударной обработки шариками. Параметры центрифугирования, позволяющие осаждать эукариотические, но не бактериальные клетки, известны в данной области. После этого супернатант можно подвергать фильтрации, если это требуется.
Фильтрат, полученный на стадии фильтрации, может представлять собой «образец» и его помещают в пробирку для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, или подвергают дальнейшим стадиям предварительной обработки (например, концентрированию или разведению).
4.4 Ударная обработка шариками
В качестве начальной стадии при получении нуклеиновой кислоты образец помещают в пробирку для ударной обработки шариками для осуществления ударной обработки шариками. На стадии ударной обработки шариками можно применять систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, или стандартную систему для ударной обработки шариками. В некоторых случаях при использовании стандартной системы для ударной обработки шариками можно добавлять один или несколько экзогенных блокирующих агентов, но в случае биологических образцов, содержащих эндогенные блокирующие агенты, добавление экзогенных блокирующих агентов не является обязательным. Когда добавляют один или несколько блокирующих агентов, то их можно добавлять в пробирку для ударной обработки шариками перед добавлением образца, после добавления образца или образец и блокирующий(е) агент(ы) можно добавлять одновременно (например, образец и блокирующий(е) агент(ы) можно смешивать и затем переносить в пробирку для ударной обработки шариками).
После помещения образца в пробирку для ударной обработки шариками пробирку подвергают встряхиванию для осуществления механического лизиса клеток. Лизис можно обеспечивать с использованием обычного лабораторного вихревого смесителя или гомогенизатора. Хотя время обработки в вихревом смесителе в 3-10 раз больше, чем в специальном гомогенизаторе, интенсивное перемешивание «работает» в случае легко разрушаемых клеток и является экономичным.
Для ударной обработки шариками пригодны многие поступающие в продажу гомогенизаторы, и их можно применять с системами для ударной обработки шариками, предлагаемыми в изобретении. Примерами гомогенизаторов являются BeadBug и BeadBlaster 24 (фирма Benchmark Scientific), PowerLyzer 24 (фирма МО Bio Laboratories Inc.), FastPrep-24, FastPrep-24 5G и SuperFastPrep-1 (фирма MP Biomedicals) и Mini-Beadbeater-16 (фирма BioSpec Products).
Параметры гомогенизации можно выбирать согласно рекомендациям производителя. Как правило, продолжительность механического разрушения (например, ударной обработки шариками) может составлять менее 1 с, 1-5 с, 5-10 с, 10-25 с, 25-60 с, 1-2 мин, 2-5 мин, 5 мин или более. Число повторений механического разрушения (например, число циклов ударной обработки шариками) может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7-10, 10 или более. Скорость разрушения (например, скорость или установочное значение для ударной обработки шариками) может составлять менее 50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000 или более оборотов (колебаний) в минуту.
4.5 Очистка нуклеиновой кислоты
После осуществления лизиса клеток образец жидкости отделяют от шариков, например, путем удаления образца жидкости из пробирки для образца с помощью пипетки или т.п., оставляя в ней шарики, которые сохраняются на дне пробирки для образца.
Примеси, которые могут мешать анализу экстрагированной ДНК, можно удалять, например, путем осаждения примесей с помощью известных методов, например, с помощью ацетата аммония или с использованием поступающего в продажу набора.
Нуклеиновую кислоту можно выделять и промывать и необязательно подвергать дальнейшей очистке. Выделение и/или очистку нуклеиновой кислоты можно осуществлять с помощью стандартных методов, таких как осаждение изопропанолом, или с использованием поступающего в продажу набора или автоматизированного устройства.
4.6 Анализ нуклеиновой кислоты
Анализ образца на присутствие представляющих интерес нуклеиновых кислот (таких как бактериальная или грибная ДНК) можно осуществлять с помощью любого метода анализа нуклеиновых кислот, включая (но, не ограничиваясь только ими) технологии амплификации, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), изотермическую амплификацию, полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (Q-ПЦР), цифровую ПЦР, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию, флуоресцентное обнаружение, ультрафиолетовую спектрометрию, гибридизационные анализы, секвенирование ДНК или РНК, рестрикционный анализ, обратную транскрипцию, NASBA (амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот), аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию, полимеразную циклическую сборку (РСА), асимметричную полимеразную цепную реакцию, линейную после экспоненциальной полимеразную цепную реакцию (LATE-ПЦР), геликазо-зависимую амплификацию (HDA), полимеразную цепную реакцию с горячим стартом, специфическую в отношении микросателлитных последовательностей полимеразную цепную реакцию (ISSR), инвертированную полимеразную цепную реакцию, опосредованную лигированием полимеразную цепную реакцию, специфичную к метилированию полимеразную цепную реакцию (MSP), мультиплексную полимеразную цепную реакцию, гнездовую полимеразную цепную реакцию, твердофазную полимеразную цепную реакцию или любую их комбинацию. Указанные технологии хорошо известны специалистам в данной области. Информация о последовательности нуклеиновой кислоты-мишени дает возможность ученому конструировать праймеры и/или зонды, которые позволяют осуществлять амплификацию и/или обнаружение мишени. Можно также осуществлять секвенирование ПЦР-ампликонов для подтверждения их идентичности.
С помощью системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении, можно экстрагировать ДНК и/или РНК из содержащихся в жидком образце микроорганизмов в концентрации, достаточной для прямого микробиологического исследования ДНК и/или РНК с помощью хорошо известных методов. Это можно осуществлять, в частности, путем приведения в контакт образца жидкости с иммобилизованными на поверхности рецепторами, которые специфически связываются с содержащейся в нем ДНК и/или РНК и/или компонентами ДНК и/или РНК. Связывание ДНК и/или РНК и/или компонентов ДНК и/или РНК с рецепторами можно обнаруживать хорошо известным образом с использованием маркеров, в частности, оптических маркеров, таких как флуоресцентные красители, и при необходимости осуществлять их количественную оценку. Альтернативно этому ДНК и/или РНК из микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости, можно амплифицировать перед осуществлением исследования, например, с помощью ПЦР.
4.7 Наборы
В настоящем изобретении предложены также наборы, содержащие (или пригодные для получения) системы для ударной обработки шариками, предлагаемые изобретении. Наборы могут содержать пробирку для образца, такую как пробирка для образца, описанная в разделе 4.1.1, один или несколько блокирующих агентов, таких как агенты, описанные в разделе 4.1.2, и/или один или несколько типов шариков, таких как шарики, описанные в разделе 4.1.3. Каждый из одного или нескольких блокирующих агентов может быть предварительно лиофилизирован и может быть помещен внутрь пробирки или находиться вне пробирки. Аналогично этому шарики могут быть помещены внутрь пробирки или находиться вне пробирки.
В некоторых вариантах осуществления изобретения набор содержит пробирку для образца и один или несколько блокирующих агентов. В другом варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит один или несколько типов шариков.
Наборы, предлагаемые в изобретении, могут включать один или несколько компонентов для предварительной обработки образца, например, соляной раствор, один или несколько буферных растворов, фильтр, описанный в разделе 4.3, и т.д.
Наборы могут включать один или несколько олигонуклеотидов для амплификации ДНК и/или РНК из одного или нескольких представляющих интерес патогенов (например, одного или нескольких видов Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вируса гриппа А, цитомегаловируса, риновируса, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans).
Наборы могут включать один или несколько зондов для обнаружения ДНК и/или РНК из одного или нескольких представляющих интерес патогенов (например, одного или нескольких видов Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вируса гриппа А, цитомегаловируса, риновируса, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans). В одном из вариантов осуществления изобретения один или несколько зондов содержит(ат) олигонуклеотиды, меченные флуоресцентным красителем. Различные зонды могут быть мечены различными красителями для того, чтобы можно было осуществлять одновременно обнаружение нескольких представляющих интерес патогенов.
5. Пример системы для ударной обработки шариками
Пример системы для ударной обработки шариками представлен на чертежах. Система для ударной обработки шариками, обозначенная номером позиции (1) на фиг. 1-3, содержит пробирку (2) для образца, имеющую внутреннюю полость (3) и закрываемое отверстие (4). Пробирка для образца предпочтительно изготовлена из пластика, но она может быть изготовлена также из другого биологически инертного материала.
Образец жидкости (5), который предположительно содержит микроорганизмы, можно вносить во внутреннюю полость (3) пробирки (2) для образца и удалять из нее через отверстие (4). Для закрывания отверстия (4) пробирка для образца имеет крышку (6), которая приспособлена для перевода в открытое и закрытое положения и которая сконструирована в виде запорного колпачка, имеющего внутреннюю резьбу, приспособленную для завинчивания на внешнюю резьбу, которой снабжена краевая область внешней стенки пробирки (2) для образца, ограничивающая отверстие (4).
Кроме того, во внутренней полости (3), размещают 2 г шариков (7) (например, шариков из диоксида кремния и/или циркония), наибольший размер которых составляет в среднем примерно 100 мкм. Шарики (7) находятся в форме свободно насыпанного продукта и при этом могут перемещаться друг относительно друга. Лиофилизированный блокирующий агент (8) также размещают во внутренней полости (3).
Шарики (7) служат для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости (5), когда образец жидкости (5) вносят во внутреннюю полость (3) и пробирку для ударной обработки шариками подвергают механическим колебаниям, например, ультразвуковым колебаниям. Их можно создавать с помощью генератора колебаний, который не проиллюстрирован подробно на чертеже, и может быть подведен к системе (1) для ударной обработки шариками. Такой генератор колебаний поступает в продажу под названием MPBio Bead Beater от фирмы MP Biomedicals. В результате разрушения клеточных стенок нуклеиновые кислоты (например, ДНК), содержащиеся в микроорганизмах, высвобождаются и растворяются в образце жидкости (5).
6. Конкретные исследования
6.1 Применение ударной обработки шариками для выделения патогенной ДНК из мокроты
Mycobacterium tuberculosis («MTB») представляет собой облигатный патогенный вид бактерий семейства Mycobacteriaceae и является возбудителем туберкулеза в большинстве случаев. Являясь патогеном для респираторной системы млекопитающих, она прежде всего, инфицирует легкие. Доказано, что микобактерии способны переходить в состояние, в котором отсутствует репликация, или «спящее» состояние (образование спор) в условиях стресса, вызванного дефицитом питательных веществ или гипоксией. Образование спор делает затруднительным осуществление лизиса бактериальных клеток с целью экстракции бактериальной ДНК.
Другая сложность при осуществлении выделения микобактериальной ДНК заключается в том, что штаммы микобактерий, как правило, выделяют из мокроты инфицированных пациентов. Мокрота является густой, вязкой и трудно поддается обработке. Большинство образцов мокроты, предназначенных для анализа, содержат различные количества органических остатков и различной загрязняющей нормальной или транзиторной бактериальной флоры. Химическую очистку/обработку, как правило, применяют для снижения вязкости и уничтожения источников загрязнения, обеспечивая тем самым возможность осуществлять выделение микобактерий.
Образцы, в которых предполагается присутствие MTB, несут потенциальный риск для работающего с ними персонала. Поэтому для снижения указанного риска образец мокроты следует подвергать предварительной обработке путем нагревания и/или включения реагентов, пригодных для инактивации микроорганизмов, присутствующих в образце. Инактивацию микроорганизмов, таких как MTB, можно осуществлять путем нагревания (например, 90°С, 5 мин) с целью денатурации активных белков, ферментативного расщепления структур клеточной стенки, механического разрушения с целью физического разрушения или инактивации клеток, химической обработки или комбинации указанных процедур.
Образец мокроты (как правило, собранный в объеме, составляющем 1-10 мл, 5-10 мл или более) сначала можно разжижать для снижения его вязкости и гетерогенности до уровней, пригодных для обработки образца. Работа с образцами мокроты сопряжена с определенными проблемами. МТВ в мокроте является одним из представляющих наибольшую трудность типов клеток и образцов для обработки вследствие богатой липидами гидрофобной клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий и вязкой гетерогенной природы мокроты. Стандартные методы экстракции при работе с мокротой, как правило, начинаются с процесса осаждения, в котором часто применяют обработку муколитическим агентом, таким как N-ацетил-L-цистеин (NALC), зефиран-тринатрийфосфат (Z-TSP) или бензалконий, после чего осуществляют центрифугирование, декантацию и ресуспендирование.
Таким образом, при обработке обладающих высокой вязкостью образцов, таких как мокрота, образец можно подвергать химической обработке для снижения вязкости так, чтобы не затруднять последующие стадии обработки. В одном из вариантов осуществления изобретения разжижение образцов мокроты путем химической обработки муколитическими агентами осуществляют в течение 20 мин при 60°С. Мокрота имеет вязкость, составляющую примерно 100-6000 кПа (мПа⋅с) при скорости сдвига 90 с-1. Вязкость, измеренную в мПа⋅с, определяют путем деления сопротивления сдвигу на скорость сдвига. Предпочтительно образец разжижают для снижения вязкости мокроты по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%.
После ресуспендирования образец добавляют в систему для ударной обработки шариками (описанную в разделе 4.1), предлагаемую в изобретении, для лизиса клеток как описано в разделе 4.4. После лизиса и экстракции нуклеиновой кислоты (см. раздел 4.5), можно анализировать ДНК МТВ с помощью ПЦР-амплификации последовательностей МТВ и можно анализировать устойчивость МТВ к лекарственным средствам с помощью амплификации генов, обусловливающих устойчивость к лекарственным средствам. Образцы мокроты можно анализировать в отношении других бактериальных и вирусных патогенов, включая (но, не ограничиваясь только ими) Staphylococcus aureus, устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус и риновирус.
6.2 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК из важных для ветеринарии патогенов
Mycobacterium avium, подвид paratuberculosis (MAP), представляет собой важный для ветеринарии патоген, вызывающий паратуберкулез или болезнь Йоне (JD), хронический грануломатозный гастроэнтерит у домашних и диких жвачных животных. MAP передается в стадах как непосредственно через сперму, молоко, молозиво и внутриутробно, так и опосредованно оральным путем через зараженный корм, фураж, подножный корм (на пастбище), воду и т.д. (фекально-оральный путь). JD оказывает истощающее действие на продуктивность крупного рогатого скота (ранняя выбраковка и сниженное производство молока), в результате чего животноводство несет огромные экономические потери. Усилия по контролю JD сдерживаются из-за персистентности MAP в почве и воде, а также их из-за выделения находящимся на доклинической и клинической стадии крупным рогатым скотом.
Как указано в предыдущем разделе, образование спор затрудняет осуществление лизиса микобактериальных клеток для экстракции бактериальной ДНК. Поэтому системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, можно применять для увеличения выхода MAP. Например, системы для ударной обработки шариками можно применять для выделения ДНК из MAP, присутствующих в молоке, почве, фекалиях, сперме и т.д.
Образцы молока можно обрабатывать непосредственно с помощью систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, или их можно подвергать предварительной обработке, например, для увеличения концентрации MAP, если они присутствуют, в образце. Пример метода предварительной обработки включает центрифугирование образца молока с получением фракции крема, фракции сыворотки и дебриса. Фракцию сливок и дебрис можно объединять и добавлять в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для лизиса клеток.
Образцы фекалий можно подвергать предварительной обработке, например, путем приготовления содержащих фекалии суспензий, которые затем можно добавлять в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для лизиса клеток. Например, содержащую фекалии суспензию можно приготавливать путем смешения образца фекалий с водой, соляным раствором или буфером (например, фосфатом натрия, забуференным фосфатом соляным раствором, Трис и т.д.), давая возможность осадиться смеси, путем разделения и последующего центрифугирования супернатанта и, наконец, ресуспендирования дебриса в пригодной жидкости, такой как вода, соляной раствор или буфер.
Образцы почвы можно суспендировать в жидкости (например, воде, соляном растворе или буфере) и затем добавлять в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для лизиса. Образцы спермы можно аналогичным образом подвергать предварительной обработке путем объединения образца спермы с определенным количеством воды, соляного раствора или буфера перед осуществлением ударной обработки шариками.
6.3 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК патогена из ран
Для обнаружения инфекций в ране мазок из раны можно инкубировать в соляном растворе, среде для клеточных культур или препаративном растворе для образца из поступающего в продажу набора. Мазок, как правило, инкубируют в течение периода времени примерно от 5 мин до 1 ч и более предпочтительно 0,25-1 ч (например, 0,25 ч, 0,5 ч или 0,75 ч). Пригодный объем раствора составляет от 200 мкл до 10 мл, и в конкретных вариантах осуществления изобретения он составляет 500 мкл, 1 мл, 2 мл, 5 мл, 8 мл или его выбирают из диапазона, ограниченного любыми двумя значениями, представленными в указанных выше вариантах (например, от 1 до 5 мл, от 500 мкл до 10 мл, от 200 мкл до 8 мл и т.д. и т.п. Раствор можно периодически встряхивать или перемешивать для стимулирования высвобождения патогенных клеток из мазка. После окончания периода инкубации мазок можно отжимать и выбрасывать.
После этого раствор можно помещать в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении.
Перед осуществлением ударной обработки шариками его необязательно можно фильтровать и/или концентрировать.
Патогены, которые обычно инфицируют раны, включают (но не ограничиваясь только ими) Е. coli, P. aeruginosa, Е. faecium, S. aureus (включая MRSA), K. pneumoniae, A. baumannii, С. amycolatum, Е. aerogenes, Е. faecalis CI 4413, S. marcescens, S. equi и С. albicans. Таким образом, образцы мазков из раны можно анализировать в отношении любого из указанных выше организмов индивидуально или в комбинации.
6.4 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК патогена из жидкости, полученной при осуществлении перитонеального диализа
Перитонеальный диализ представляет собой лечение пациентов с серьезным хроническим заболеванием почек. При осуществлении этого типа диализа брюшину в брюшной полости пациента используют в качестве мембраны, через которую обменивают жидкости и растворенные вещества из крови. Жидкость вводят через постоянную трубку в брюшную полость и затем выводят для очистки от избытка солей, мочевой кислоты и других отработанных субстанций. В результате осмоса через перитонеальную мембрану происходит обмен растворенными веществами между кровью и используемой для диализа жидкостью. По истечении соответствующего времени жидкость для диализа удаляют из брюшины и утилизируют. В результате этого состав крови становится сбалансированным и предупреждается бесконечное накопление в крови конечных метаболических продуктов, таких как мочевая кислота.
Основные осложнения при осуществлении перитонеального диализа связаны с инфекцией, обусловленной присутствием постоянной трубки в брюшной полости. По меньшей мере одной областью инфекции является перитонеальное пространство, она приводит к боли в брюшной полости, мутному вытекающему продукту диализа и обнаружению патогенов на окрашенных по Граму мазках или в культурах, взятых из внутренней полости катетера. Кроме того, туннель в ткани или внешние поверхности катетера являются типичными областями инфекции, обусловленной контактным загрязнением. Инфекция в области туннеля в ткани наиболее часто обусловлена переносом с участков кожи. Инфекции могут приводить к перитониту и в некоторых случаях к смерти.
Перитонеальные инфекции можно обнаруживать в жидкости, используемой для перитонеального диализа, взятой после осуществления перитонеального диализа у индивидуумов. Хотя за большинство инфекций ответственны S. aureus и P. aeruginosa, в них могут участвовать и другие бактерии (дифтероиды, анаэробные организмы, неферментирующие бактерии, стрептококки, нетуберкулезные микобактерии, Legionella, дрожжи и грибы). Таким образом, можно анализировать образцы жидкости, полученной при перитонеальном диализе, в отношении любого из указанных выше организмов индивидуально или в комбинации.
Жидкость, полученную при перитонеальном диализе, можно подвергать предварительной обработке путем фильтрации и необязательно концентрирования, как это описано в разделе 4.3.
6.5 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК из загрязняющих продуктов сточных вод
В примере 1 патента U.S. 9290796, посвященного обнаружению видов бактерий, создающих проблемы, связанные с пенообразованием и скоплением, при осуществлении процессов биологической обработки сточных вод, описана экстракция ДНК из сточных вод, собранных на предприятиях по очистке сточных вод, с использованием протокола ударной обработки шариками. Протокол ударной обработки шариками можно адаптировать для включения системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении.
6.6 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК из пищевых патогенов
Образцы жидкой пищи можно подвергать предварительной обработке путем фильтрации и/или центрифугирования как это описано выше в разделе 4.3, перед осуществлением ударной обработки шариками. Например, напитки предпочтительно можно предварительно обрабатывать путем фильтрации для сбора микроорганизмов, которые могут в них присутствовать. Микроорганизмы, собранные путем фильтрации, необязательно можно промывать и подвергать центрифугированию перед осуществлением ударной обработки шариками. Для обнаружения патогенов в твердых пищевых продуктах, таких как мясо или рыба, можно брать мазок с пищевого продукта для сбора микроорганизмов с поверхности пищевого продукта. Затем микроорганизмы можно смывать с мазка и подвергать ударной обработке шариками.
В некоторых случаях может оказаться предпочтительным осуществлять предварительное культивирование образца пищи в течение определенного периода времени для усиления роста патогенов (например, Salmonella), которые могут присутствовать на или в образце, перед осуществлением ударной обработки шариками. Например, образец твердой пищи можно измельчать с помощью лабораторного блендера (например, измельчителя-гомогенизатора Stomacher®, фирма Seward Limited, Великобритания) и затем культивировать для усиления роста микроорганизма (например, в течение 8-12 ч). Затем образец культуры можно подвергать ударной обработке шариками.
6.7 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК патогенов из крови
Всемирная Организация Здравоохранения рассматривает разработку быстрых тестов молекулярной диагностики для человеческих инфекций в качестве наиболее приоритетной задачи в области совершенствования здравоохранения во всем мире (Daar и др., Nat. Genet. 32, 2002, сс. 229-232). Серьезные инфекции крови являются важной причиной заболеваемости и смерти среди госпитализированных пациентов во всем мире и одной из наиболее важных проблем для интенсивной терапии. Например, согласно современным оценкам в Соединенных Штатах встречаемость сепсиса составляет 240 случаев на 100000. Значительным является социальное и экономическое бремя, обусловленное сепсисом (Grossi и др., Surg. Infect. (Larchmt) 7, 2006, сс. 87-91). Несмотря на прогресс в борьбе с инфекционными заболеваниями и совершенствование интенсивной терапии, и многочисленные попытки разработать новые подходы к лечению, коэффициент смертности от сепсиса остается на неприемлемо высоком уровне, составляющем от 20 до 50%. Распознавание признаков серьезных инфекций в крови и/или серьезного сепсиса и установление раннего и точного диагноза имеют решающее значение для улучшения ухода и повышения коэффициента выживаемости. Фактически, быстрая диагностика может повышать выживаемость пациента за счет уменьшения интервала времени между взятием образца крови и применением противомикробной терапии.
В случае методов обнаружения патогенов на молекулярном уровне (например, ПЦР и анализа последовательности ДНК) адекватное выделение ДНК патогена имеет решающее значение для гарантии успешного обнаружения. В различных методах для улучшения выделения ДНК патогена из крови применяют буферы для лизиса, иногда в сочетании с методами физического разрушения, такими как ударная обработка шариками.
В настоящем изобретении используются преимущества, обусловленные присутствием встречающихся в естественных условиях блокирующих агентов в крови, и предложены упрощенные способы выделения ДНК патогена из крови. Кровь можно собирать из организма индивидуума, например, с использованием поступающей в продажу пробирки для сбора крови (например, пробирки для сбора крови BD Vacutainer®). В продажу поступает целый ряд стандартных пробирок для сбора крови, некоторые из которых содержат антикоагулянты и снабжены цветовой маркировкой для облегчения идентификации, например, можно применять пробирки с сиреневой крышкой, содержащие ЭДТК, пробирки со светло-синей (голубой) крышкой, содержащие цитрат натрия, пробирки с серой крышкой, содержащие оксалат калия, или пробирки с зеленой крышкой, содержащие гепарин. Кровь, например, которая была собрана в пробирку для сбора крови, содержащую ЭДТК, можно подвергать ударной обработке шариками, не разбавляя ее какими-либо буферами или другими добавками, с использованием предлагаемой в изобретении системы для ударной обработки шариками (содержащей блокирующие агенты) или традиционной системы для ударной обработки шариками (не содержащей блокирующие агенты). После осуществления ударной обработки шариками можно применять стандартные методы для выделения ДНК патогена, такие как методы, описанные в разделе 4.5. Затем необязательно анализируют выделенную ДНК патогена, например, с помощью методов, описанных в разделе 4.6.
Вызывающие сепсис патогены, как правило, представляют собой бактерии или грибы. Обычными бактериальными возбудителями сепсиса являются грамотрицательные бациллы (например, Е. coli, P. aeruginosa, Е. corrodens и Н. influenzae). Другими бактериями, также вызывающими сепсис, являются S. aureus, Streptococcus spp., Enterococcus spp. и Neisseria. К наиболее часто встречающимся грибам, которые вызывают сепсис, относятся Candida spp. Следовательно, образцы крови можно анализировать в отношении любых указанных выше организмов индивидуально или в комбинации.
7. Примеры
7.1 Пример 1: Системы для ударной обработки шариками приводят к занижению (определяемого) количества ДНК
7.1.1 Материалы
В данном исследовании использовали следующие материалы:
Пробирка для ударной обработки шариками: каталожный номер: ARY0007 OPS Diagnostics, криопробирка вместимостью 4,5 мл, содержащая 2,0 г шариков из Si02 размером 100 мкм.
ПД-жидкость: Жидкость, полученная при перитонеальном диализе, содержащая глюкозу и в необходимой для баланса концентрации Na+, Са2+, Mg2+.
Буфер BE: фирма Taigen Bioscience. Содержит 1 мкг РНК/мкл.
Мочевина: степень чистоты, соответствующая стандарту ACS (Американское химическое общество).
7.1.2 Методы
В качестве стандартного матрикса использовали два (2) мл ПД-жидкости, в которую впрыскивали ЭДТК до концентрации 10 мМ и С. albicans в количестве 5000 КОЕ/мл. К образцу добавляли в двенадцати (12) различных концентрациях мочевину и буфер BE, как проиллюстрировано ниже в таблице 1:
Все образцы подвергали ударной обработке шариками в течение 45 с. После осуществления ударной обработки шариками ДНК выделяли из образцов с помощью системы для экстракции нуклеиновой кислоты LabTurbo® 48 (фирма Taigen Bioscience Corporation, Тайбэй, Тайвань) с использованием реагентов и протокола производителя. ДНК, выделенную из 2,0 мл каждого образца, подвергнутого ударной обработке шариками, элюировали в 100 мкл буфера ТЕ (Трис-ЭДТК). Выделенную ДНК подвергали амплификации с помощью ПЦР в реальном времени и количественно оценивали для определения количества целевой ДНК в каждом образце.
Результаты
Отношение оптических плотностей (которое является показателем чистоты выделенной ДНК) и соответствующая концентрация ДНК для каждого образца представлены ниже в таблице 2:
Выход ДНК, о котором свидетельствует интенсивность сигнала, полученного в результате визуализации сигнала от массива после ПЦР-амплификации и гибридизации, представлен на графиках на фиг. 6 и фиг. 7.
7.1.4 Выводы
В образце 1, не содержащем блокирующий агент, выход ДНК С. albicans составлял лишь 5,5 нг/мл. Включение мочевины в качестве блокирующего агента повышало выход в 3-4 раза, а включение РНК в качестве блокирующего агента повышало выход примерно в 10-20 раз, и выход приближался к максимальному теоретическому выходу. Этот повышенный выход приводил к улучшению ПЦР-амплификации гена С. albicans
7.2 Пример 2: Экстракция ДНК с использованием системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении
7.2.1 Получение системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении
Приготавливали маточный раствор блокирующего агента, содержащий 250 мг/мл мочевины, 25 мг/мл тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), 125 мг/мл аденозинамонофосфата, 125 мг/мл гуанозинмонофосфата, 125 мг/мл цитозинмонофосфата, 125 мг/мл тимидинмонофосфата и 75 мг/мл лауроилсаркозината натрия в буфере ТЕ (Трис/ЭДТК).
200 мкл маточного раствора добавляли в пробирку для образца вместимостью от 4,5 до 5 мл и сушили досуха в вакууме, в результате чего высушенный блокирующий агент откладывался на внутренней стенке в нижней области пробирки для образца. Ожидается, что высушенный блокирующий агент должен сохранять стабильность по меньшей мере в течение одного года.
Затем в пробирку для образца добавляли 2,0 г шариков из диоксида кремния размером 100 мкм.
7.2.2 Применение системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении
6 мл мочевины и 6 мл жидкости для перитонеального диализа, фильтровали через стерильный фильтр с размером пор 0,4 мкм и затем к фильтратам мочевины и жидкости для перитонеального диализа, добавляли выращенную в культуре в лабораторных условиях Staphylococcus aureus, в количестве 10000 колониеобразующих единиц/мл.
2,9 мл зараженной мочевины и 2,9 мл зараженной жидкости для перитонеального диализа переносили в пробирки для образцов, подготовленные согласно процедуре, описанной в разделе 7.2.1, или в пробирки для образцов, содержащие 2,0 г шариков из диоксида кремния размером 100 мкм, но без блокирующего агента.
Пробирки закрывали крышками и зажимали в устройство для ударной обработки шариками фирмы MPBio и осуществляли обработку в течение 30 с при полной мощности. Крышки удаляли и пробирку помещали на штатив для образцов поступающего в продажу устройства для выделения ДНК. Из каждой пробирки извлекали по 2 мл каждого образца и затем добавляли агенты для экстракции ДНК (LabTurbo®). После этого осуществляли экстракцию ДНК. Для каждого образца получали по 100 мкл экстракта ДНК.
Количество экстрагированной ДНК Staphylococcus aureus в каждом образце определяли с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени согласно методу, описанному у Gillespie и др., «Simultaneous Detection of Mastitis Pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uteris, and Streptococcus agalactiae by Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction», J. Dairy Sci. 88, 2005, cc. 3510-3518. 1 мкл каждого экстракта ДНК амплифицировали в реакционном объеме 20 мкл.
Образцы, обработанные с использованием пробирок для образцов без блокирующего агента, характеризовались величиной порогового цикла, равной 32 в случае мочевины и 38 в случае жидкости для перитонеального диализа, что свидетельствовало о низком выходе ДНК.
Образцы, обработанные с использованием пробирок для образцов с блокирующим агентом, характеризовались величиной порогового цикла, равной 31 в случае мочевины и 32 в случае жидкости для перитонеального диализа, что свидетельствовало об увеличенном выходе в случае жидкости для перитонеального диализа в указанных условиях.
7.3 Пример 3: Кровь в качестве блокирующего агента
7.3.1 Введение
Данное исследование проводили для идентификации оптимальных условий осуществления ударной обработки шариками образцов крови. Не содержащие культуры патогенов образцы крови заражали патогенами S. aureus, E. coli и С .albicans. Осуществляли ПЦР для положительного контроля. Концентрация (количество геномных копий) в этом контроле соответствовала теоретическому 100%-му выходу интродуцированного патогена. Результаты этого исследования продемонстрировали, что можно экстрагировать ДНК из присутствующих в крови патогенов с помощью ударной обработки шариками при отсутствии добавок, таких как буферы, детергенты и т.д.
7.3.2 Материалы
В исследовании использовали следующие конкретные материалы:
Пробирка для ударной обработки шариками: каталожный номер: ARY0007 OPS Diagnostics, криопробирка вместимостью 4,5 мл, содержащая 2,0 г шариков из Si02 размером 100 мкм.
Кровь: не содержащая культуры патогенов, взятая из организма здоровых доноров.
Культуры S. aureus, Е. coli и С. albicans: все получены из АТСС.
7.3.3 Методы
Приготавливали серии по тридцать восемь (38) зараженных образцов крови, состоящие из 3,0 мл крови и 15 мкл соляного раствора, содержащего выращенные в культуре патогены. К каждому образцу крови не добавляли ничего за исключением соляного раствора, содержащего выращенные в культуре патогены. Пробирки для ударной обработки обрабатывали с использованием гомогенизатора FastPrep®-24 (фирма MP Biomedicals) при скорости 6,5 м/с. Затем из образцов выделяли ДНК с помощью системы для экстракции нуклеиновых кислот LabTurbo® 48 (фирма Taigen Bioscience Corporation) с использованием реагентов и протокола производителя. ДНК амплифицировали, осуществляя 55 циклов ПЦР и гибридизовали с массивом, который затем промывали и визуализировали. Количества патогенов и периоды времени ударной обработки шариками представлены ниже в таблице 3:
Для трех различных патогенов при данном уровне заражения рассчитывали геномный выход на 1 мкл на основе выделенной ДНК. Это количество геномных копий использовали в качестве целевой 100%-ной эффективности.
7.3.4 Результаты
Результаты графически проиллюстрированы на фиг. 8-10, на которых представлен выход, о котором свидетельствует интенсивность сигнала, полученного в результате визуализации сигнала от массива после ПЦР-амплификации и гибридизации. На фиг. 8 представлены данные для серии периодов времени обработки С. albicans, а также для целевой 100%-ной эффективности. На фиг. 9 представлены данные для серии периодов времени обработки S. aureus, а также для целевой 100%-ной эффективности. На фиг. 10 представлены данные для серии периодов времени обработки Е. coli, а также для целевой 100%-ной эффективности.
7.3.5 Выводы
Для трех различных патогенов не было выявлено потери сигнала, обусловленной связыванием ДНК патогена с шариками. Во всех случаях был продемонстрирован выход, составляющий по меньшей мере 100% от теоретического. В двух случаях выход составлял более 100%, что возможно было обусловлено присутствием ДНК из погибших бактерий в материале, использованном для заражения.
8. Конкретные варианты осуществления изобретения
Примеры конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения представлены ниже.
1. Система для ударной обработки шариками, содержащая (I) пробирку для образца, имеющую внутреннюю полость, в которую можно осуществлять доступ через отверстие, (II) шарики и (III) сухой блокирующий агент, где шарики и сухой блокирующий находятся во внутренней полости пробирки для образца.
2. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 1, в которой блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, креатинин, один или несколько нуклеотидов, один или несколько олигонуклеотидов или их комбинацию.
3. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 2, в которой блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, включающих мочевину, одну или несколько солей гуанидина, одну или несколько солей лития, одну или несколько солей магния, один или несколько детергентов или их комбинацию.
4. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 3, в которой блокирующий агент содержит одну или несколько солей гуанидина, включая изоцианат гуанидина, хлорид гуанидина или их комбинацию.
5. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 3 или варианту осуществления изобретения 4, в которой блокирующий агент содержит одну или несколько солей лития, включая перхлорат лития, ацетат лития или их комбинацию.
6. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 3-5, в которой блокирующий агент содержит хлорид магния.
7. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 3-6, в которой блокирующий агент содержит один или несколько детергентов, включая додецилсульфат натрия, лауроилсульфатсаркозинат натрия, полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат или их комбинацию.
8. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 2-7, в которой блокирующий агент содержит один или несколько нуклеотидов, включая встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды, не встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды или их комбинацию.
9. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 8, в которой один или несколько нуклеотидов включают один или несколько встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов, один или несколько встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов или их комбинацию.
10. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 9, в которой блокирующий агент содержит один или несколько дезоксирибонуклеотидов, включая дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат и дезокситимидинмонофосфат или их комбинацию.
11. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 9 или варианту осуществления изобретения 10, в которой блокирующий агент содержит один или несколько рибонуклеотидов, включая аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат и тимидинмонофосфат или их комбинацию.
12. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 2-11, в которой блокирующий агент содержит один или несколько олигонуклеотидов, включая рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, нуклеотидные аналоги или их комбинацию.
13. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 12, в которой блокирующий агент содержит один или несколько олигонуклеотидов, каждый из которых независимо имеет длину от 2 до 120 нуклеотидов, от 2 до 100 нуклеотидов, от 2 до 50 нуклеотидов, от 2 до 25 нуклеотидов, от 5 до 40 нуклеотидов, от 2 до 15 нуклеотидов, от 8 до 120 нуклеотидов, от 8 до 80 нуклеотидов, от 10 до 100 нуклеотидов, от 15 до 50 нуклеотидов, от 50 до 100 нуклеотидов или от 100 до 120 нуклеотидов.
14. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 12 или варианту осуществления изобретения 13, в которой олигонуклеотиды содержат ДНК и/или РНК.
15. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-14, в которой внутренняя полость пробирки для образца по меньшей мере частично покрыта слоем или пленкой из блокирующего агента.
16. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-15, в которой некоторые или все шарики частично или полностью покрыты слоем или пленкой из блокирующего агента.
17. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-16, которая содержит порошок, содержащий блокирующий агент.
18. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 17, в которой порошок представляет собой лиофилизированный порошок, содержащий блокирующий агент.
19. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-18, в которой шарики приспособлены для осуществления лизиса бактерий, дрожжей, нитчатых грибов, спор, клеток растений или клеток животных.
20. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-19, в которой шарики включают минеральные шарики, керамические шарики, стеклянные шарики, металлические шарики или их комбинацию.
21. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 20, в которой шарики включают шарики из циркония, шарики из силиката циркония, шарики из диоксида циркония, шарики из кварца, шарики из оксида алюминия, шарики из карбида кремния, керамические шарики, стеклянные шарики из диоксида кремния, шарики из нержавеющей стали, шарики из хромистой стали или их комбинацию.
22. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-21, в которой шарики имеют диаметр в пределах от 50 мкм до 3 мм.
23. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-22, которая дополнительно содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) и/или ее натриевую соль, находящуюся во внутренней полости пробирки для образца.
24. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-22, которая дополнительно содержит креатинин, находящийся во внутренней полости пробирки для образца.
25. Способ лизиса клеток (например, для экстрагирования нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в жидком образце, включающий встряхивание жидкого образца в пробирке для образца, входящей в систему для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24, в условиях, обеспечивающих лизис клеток.
26. Способ лизиса клеток (например, для экстрагирования нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в жидком образце, который содержит экзогенный блокирующий агент, включающий встряхивание жидкого образца в системе для ударной обработки шариками, которая содержит пробирку для образца и шарики, в отсутствии буфера для лизиса и/или добавок.
27. Способ лизиса клеток (например, для экстрагирования нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в жидком образце, который не инкубировали с буфером для лизиса, включающий встряхивание жидкого образца и одного или нескольких блокирующих агентов в системе для ударной обработки шариками, которая содержит пробирку для образца шариками и шарики, где необязательно один или несколько блокирующих агентов представляют собой блокирующий агент, присутствующий в пробирке для образца по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24.
28. Способ по варианту осуществления изобретения 0, в котором жидкий образец содержит эндогенный блокирующий агент.
29. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 26-28, в котором шарики приспособлены для лизиса бактерий, дрожжей, нитчатых грибов, спор, клеток растений или клеток животных.
30. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 26-29, в котором шарики включают минеральные шарики, керамические шарики, стеклянные шарики, металлические шарики или их комбинацию.
31. Способ по варианту осуществления изобретения 30, в котором включают шарики из циркония, шарики из силиката циркония, шарики из диоксида циркония, шарики из кварца, шарики из оксида алюминия, шарики из карбида кремния, керамические шарики, стеклянные шарики из диоксида кремния, шарики из нержавеющей стали, шарики из хромистой стали или их комбинацию.
32. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 26-31, в котором шарики имеют диаметр в пределах от 50 мкм до 3 мм.
33. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-32, дополнительно включающий стадию, на которой помещают жидкий образец в пробирку для образца перед осуществлением встряхивания жидкого образца.
34. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-34, в котором встряхивание включает приведение системы для ударной обработки шариками в колебательное движение.
35. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-34, в котором образец представляет собой биологический образец, образец, взятый из окружающей среды, или пищевой продукт.
36. Способ по варианту осуществления изобретения 35, в котором образец представляет собой биологический образец, выбранный из крови, сыворотки, слюны, мочи, желудочного сока, пищеварительного сока, слез, испражнений, спермы, вагинальной жидкости, интерстициальной жидкости, выделенной из опухолевой ткани жидкости, глазной жидкости, пота, слизи, ушной серы, жира, железистых секретов, выдыхаемого продукта, спинальной жидкости, волос, ногтей, клеток кожи, плазмы, жидкости, полученной из мазка из носа, жидкости, полученной из носоглоточного смыва, цереброспинальной жидкости, образца ткани, жидкости или ткани, полученной из мазка, взятого из глотки, жидкости или ткани, полученной из мазка, взятого из раны, ткани, полученной путем биопсии, плацентарной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, полученной при перитонеальном диализе, крови из пуповины, лимфатических жидкостей, внутриполостных жидкостей, мокроты, гноя, микрофлоры, мекония, грудного молока или образца, полученного путем обработки, экстракции или фракционирования любого из указанных выше образцов.
37. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой мочу, мокроту или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования мочи.
38. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой мокроту или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования мокроты.
39. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой мазок из раны или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования мазка из раны.
40. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой кровь или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования крови.
41. Способ по варианту осуществления изобретения 40, в котором кровь содержит антикоагулянт.
42. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТК.
43. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат (например, цитрат натрия).
44. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат (например, оксалат калия).
45. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин (например, гепарин натрия).
46. Способ по варианту осуществления изобретения 41, дополнительно включающий перенос крови из пробирки для сбора крови в пробирку для образца перед осуществлением встряхивания, при этом в пробирку для образца необязательно переносят всю или только часть крови, находящейся в пробирке для сбора крови.
47. Способ по варианту осуществления изобретения 46, в котором пробирка для сбора крови содержит антикоагулянт.
48. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТК.
49. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат (например, цитрат натрия).
50. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат (например, оксалат калия).
51. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин (например, гепарин натрия).
52. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 46-51, дополнительно включающий осуществление сбора крови в пробирку для сбора крови перед переносом крови в пробирку для образца.
53. Способ по варианту осуществления изобретения 52, в котором пробирка для сбора крови содержит антикоагулянт перед осуществлением указанного сбора.
54. Способ по варианту осуществления изобретения 52 или варианту осуществления изобретения 53, дополнительно включающий перенос и/или хранение крови в пробирке для сбора крови перед переносом крови в пробирку для образца.
55. Способ лизиса клеток (например, для экстракции нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в образце крови, который не инкубировали с буфером для лизиса, включающий (а) объединение шариков и крови в пробирке для сбора крови, содержащей кровь, и (б) встряхивание крови в присутствии шариков, в результате чего происходит лизис клеток, содержащихся в образце крови.
56. Способ по варианту осуществления изобретения 55, в котором шарики добавляют в пробирку для сбора крови, содержащую кровь.
57. Способ по варианту осуществления изобретения 55, в котором кровь собирают в пробирку для сбора крови, содержащую шарики.
58. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 55-57, в котором пробирка для сбора крови содержит антикоагулянт.
59. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТК.
60. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат (например, цитрат натрия).
61. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат (например, оксалат калия).
62. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин (например, гепарин натрия).
63. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой жидкость, полученную при перитонеальном диализе, или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования жидкости, полученной при перитонеальном диализе.
64. Способ по варианту осуществления изобретения 35, в котором образец представляет собой образец, взятый из окружающей среды, который выбран из образца почвы, грунтовой воды, поверхностной воды, сточной воды или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования любого из указанных выше образцов.
65. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-64, в котором клетки содержат один или несколько патогенов.
66. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором один или несколько патогенов включают один или несколько бактериальных патогенов, вирусных патогенов, грибных патогенов или их комбинацию.
67. Способ по варианту осуществления изобретения 65 или варианту осуществления изобретения 66, в котором один или несколько патогенов включают один или несколько из следующих патогенов: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивую к метициллину бактерию Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус, риновирус, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans.
68. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой мокроту или образец, полученный из мокроты путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают один или несколько из следующих патогенов: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивую к метициллину бактерию Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус и риновирус.
69. Способ по варианту осуществления изобретения 68, в котором один или несколько патогенов включают Mycobacterium tuberculosis.
70. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой молоко или сперму, или образец, полученный из молока, почвы, фекалий или спермы путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.
71. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой мазок из раны или образец, полученный из мазка из раны путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают один или несколько из следующих патогенов: Е. coli, Р. aeruginosa, Е. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, С. amycolatum, Е. aerogenes, Е. faecalis CI 4413, S. marcescens, S. equi и С. albicans.
72. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой жидкость, полученную при перитонеальном диализе, или образец, который получен из жидкости, полученной при перитонеальном диализе путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают S. aureus и/или P. aeruginosa.
73. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-72, в котором жидкий образец содержит клетки из различных видов.
74. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-73, дополнительно включающий извлечение жидкого образца из пробирки для образца после лизиса клеток.
75. Способ по варианту осуществления изобретения 74, дополнительно включающий очистку нуклеиновых кислот из извлеченного жидкого образца.
76. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-75, дополнительно включающий осуществление анализа одной или нескольких нуклеиновых кислот.
77. Способ по варианту осуществления изобретения 76, в котором анализ осуществляют с использованием микромассива или путем секвенирования одной или нескольких нуклеиновых кислот.
78. Способ по варианту осуществления изобретения 76 или варианту осуществления изобретения 77, в котором последовательность-мишень амплифицируют перед осуществлением анализа.
79. Способ по варианту осуществления изобретения 78, в котором последовательность-мишень амплифицируют с помощью ПЦР.
80. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-79, в котором нуклеиновые кислоты содержат ДНК.
81. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-80, в котором нуклеиновые кислоты содержат РНК.
82. Набор для лизиса клеток (например, для экстракции нуклеиновых кислот из клеток), которые содержатся в жидком образце, содержащий систему для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24 и необязательно: (I) один или несколько компонентов для приготовления жидкого образца, (II) один или несколько олигонуклеотидов для амплификации одной или нескольких нуклеиновых кислот, (III) один или несколько зондов для обнаружения одной или нескольких нуклеиновых кислот или (IV) любую комбинацию компонентов, указанных в подпунктах (I)-(II).
83. Набор по варианту осуществления изобретения 82, который содержит один или несколько компонентов для получения жидкого образца и в котором один или несколько компонентов для получения жидкого образца включают воду, соляной раствор, буфер, фильтр или их комбинацию.
84. Набор по варианту осуществления изобретения 82 или варианту осуществления изобретения 83, который содержит один или несколько олигонуклеотидов для амплификации одной или нескольких нуклеиновых кислот.
85. Набор по одному из вариантов осуществления изобретения 82-84, который содержит один или несколько зондов для обнаружения одной или нескольких нуклеиновых кислот.
86. Набор для получения системы для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24, содержащий пробирку для образца, шарики и сухой блокирующий реагент.
87. Набор по варианту осуществления изобретения 86, в котором шарики и/или сухой блокирующий реагент включены в набор отдельно от пробирки для образца.
88. Набор по варианту осуществления изобретения 86, в котором шарики и/или сухой блокирующий реагент включены в набор в пробирке для образца.
89. Набор по одному из вариантов осуществления изобретения 86-88, дополнительно содержащий один или несколько компонентов для получения содержащего клетки образца для экстракции нуклеиновой кислоты с помощью системы для ударной обработки шариками, один или несколько олигонуклеотидов для амплификации одной или нескольких нуклеиновых кислот, один или несколько зондов для обнаружения одной или нескольких нуклеиновых кислот или их комбинацию.
90. Система (1) для ударной обработки шариками, включающая пробирку для образца, которая содержит элемент, представляющий собой контейнер (2), с внутренней полостью (3), отверстие (4) для внесения образца жидкости (5), который может содержать микроорганизмы, во внутреннюю полость (3), и крышку (6) для закрытия отверстия (4), где во внутренней полости (3) размещено множество макроскопических минеральных частиц (7), которые приспособлены для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости (5), когда образец жидкости (5) вносят во внутреннюю полость (3) и систему (1) для ударной обработки шариками подвергают механическим колебаниям, отличающаяся тем, что во внутренней полости (3) пробирки для образца располагается находящийся в высушенной форме блокирующий агент (8), содержащий мочевину и/или по меньшей мере одну соль гуанидина, и/или по меньшей мере один детергент.
91. Система (1) для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 67, отличающаяся тем, что блокирующий агент (8) содержит дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат или смесь по меньшей мере двух указанных монофосфатов.
92. Система (1) для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 90 или 91, отличающаяся тем, что блокирующий агент (8) содержит аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат, тимидинмонофосфат или смесь по меньшей мере двух указанных монофосфатов.
93. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-92, отличающаяся тем, что по меньшей мере один монофосфат, содержащийся в блокирующем агенте (8), представляет собой олигонуклеотид, состоящий как минимум из 2 и как максимум из 120 нуклеотидов.
94. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-93, отличающаяся тем, что по меньшей мере один детергент содержит додецилсульфат натрия, лауроилсульфатсаркозинат натрия и/или полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат.
95. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-94, отличающаяся тем, что высушенный блокирующий агент, предпочтительно находящийся в порошкообразной форме, свободно расположен во внутренней полости (3) представляющего собой контейнер элемента (2).
96. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-95, отличающаяся тем, что внутренняя стенка представляющего собой контейнер элемента (2) по меньшей мере частично покрыта слоем или пленкой блокирующего агента.
97. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-96, отличающаяся тем, что во внутреннюю полость (3) пробирки для образца помещена этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК) и/или ее натриевая соль.
98. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-97, отличающаяся тем, что во внутреннюю полость (3) пробирки для образца помещен креатинин.
99. Применение системы (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-98 для экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов.
100. Способ экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов, в котором получают образец жидкости (5), предположительно содержащий микроорганизмы, в котором вносят в образец жидкости (5) множество минеральных частиц (7), которые могут перемещаться относительно друг друга, и образец жидкости (5) с содержащимися в нем частицами (7) подвергают колебаниям таким образом, чтобы частицы (7) могли механически разрушать клеточные стенки микроорганизмов, содержащихся в жидком образце (5),
отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в образец жидкости (5) вносят блокирующий агент (8), содержащий мочевину и/или по меньшей мере одну соль гуанидина, и/или по меньшей мере один детергент.
101. Способ по варианту осуществления изобретения 100, отличающийся тем, что количество мочевины приводят в соответствие с количеством образца жидкости (5) таким образом, чтобы концентрация мочевины, растворенной в образце жидкости (5), составляла от 10 до 100 г/л, в частности, от 20 до 50 г/л и предпочтительно от 25 до 35 г/л.
102. Способ по варианту осуществления изобретения 100 или 101, отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в жидкий образец (5) вносят один или несколько из следующих монофосфатов: дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат.
103. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 100-102, отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в образец жидкости (5) вносят один или несколько из следующих монофосфатов: аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат, тимидинмонофосфат.
104. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 100-103, отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в образец жидкости (5) вносят креатинин и/или этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) и/или ее натриевую соль.
9. Цитирование ссылок
Все публикации, патенты, заявки на патент и другие документы, процитированные в настоящей заявке, полностью включены в нее в качестве ссылки для всех целей в той степени, как если бы было индивидуально указано, что каждая/каждый индивидуальная/индивидуальный публикация, патент, заявка на патент или другой документ включена/включен в качестве ссылки для всех целей. В случае несоответствия между доктриной одной или нескольких ссылок и настоящего описания следует руководствоваться доктриной настоящей заявки.
Claims (39)
1. Способ лизиса клеток, которые содержатся в крови, содержащей антикоагулянт, включающий встряхивание крови в условиях, эффективных для лизиса грибкового патогена, в системе для ударной обработки шариками, которая включает (I) пробирку для образца или пробирку для сбора крови и (II) шарики, в отсутствие буфера для лизиса и в отсутствие какой-либо добавки.
2. Способ по п. 1, в котором шарики приспособлены для лизиса дрожжей или нитчатых грибов.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором шарики включают минеральные шарики, керамические шарики, стеклянные шарики, металлические шарики или их комбинацию.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором шарики включают шарики из циркония, шарики из силиката циркония, шарики из диоксида циркония, шарики из кварца, шарики из оксида алюминия, шарики из карбида кремния, керамические шарики, стеклянные шарики из диоксида кремния, шарики из нержавеющей стали, шарики из хромистой стали или их комбинацию.
5. Способ по одному из пп. 1-4, в котором шарики имеют диаметр в пределах от 50 мкм до 3 мм.
6. Способ по одному из пп. 1-5, дополнительно включающий стадию, на которой собирают кровь в пробирку для сбора крови.
7. Способ по одному из пп. 1-6, который включает внесение крови в пробирку для образца перед осуществлением встряхивания.
8. Способ по одному из пп.1-7, где грибковый патоген представляет собой Candida albicans.
9. Способ по одному из пп.1-8, в котором условия также являются достаточными для лизиса бактериальных патогенов.
10. Способ по п.9, в котором бактериальные патогены включают Staphylococcus aureus и Escherichia coli.
11. Способ по одному из пп. 1-10, в котором встряхивание включает приведение системы для ударной обработки шариками в колебательное движение.
12. Способ по п.11, в котором встряхивание включает в себя воздействие на систему для ударной обработки шариками 2000 или более колебаний в минуту.
13. Способ по одному из пп.1-12, в котором встряхивание осуществляют с помощью шейкера или гомогенизатора.
14. Способ по п.13, в котором встряхивание осуществляют с помощью гомогенизатора.
15. Способ по п.14, в котором встряхивание проводят в течение 25-60 секунд.
16. Способ по п. 14, в котором встряхивание осуществляют в течение 1-2 минут.
17. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТА.
18. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат.
19. Способ по п. 18, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат натрия.
20. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат.
21. Способ по п. 20, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат калия.
22. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин.
23. Способ по одному из пп. 1-22, в котором система для ударной обработки шариками включает пробирку для образца и шарики.
24. Способ по одному из пп. 1-22, в котором система для ударной обработки шариками включает пробирку для сбора крови и шарики.
25. Способ по одному из пп. 1-24, в котором клетки содержат один или несколько патогенов.
26. Способ по п.25, где клетки содержат один или несколько бактериальных патогенов, вирусных патогенов, грибковых патогенов или их комбинацию.
27. Способ по п. 26, где клетки содержат один или несколько грибковых патогенов.
28. Способ по п.27, где один или несколько грибковых патогенов включают Candida albicans.
29. Способ по одному из пп. 26-28, где клетки содержат один или несколько бактериальных патогенов.
30. Способ по п.29, где клетки содержат Staphylococcus aureus.
31. Способ по п.29, где клетки содержат Escherichia coli.
32. Способ по одному из пп. 1-31, в котором кровь содержит клетки из нескольких видов.
33. Способ по одному из пп. 1-32, дополнительно включающий извлечение лизата из пробирки для образца после лизиса клеток.
34. Способ по п. 33, дополнительно включающий очистку одной или более нуклеиновых кислот из лизата.
35. Способ по п. 34, дополнительно включающий проведение анализа одной или более нуклеиновых кислот, в котором необязательно:
(а) анализ осуществляют с использованием микромассива или путем
секвенирования одной или нескольких нуклеиновых кислот;
(б) перед осуществлением анализа амплифицируют последовательность - мишень, необязательно с помощью ПЦР.
36. Способ по п. 34 или 35, в котором одна или более нуклеиновых кислот включают ДНК и/или РНК.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17051902 | 2017-01-30 | ||
EP2017051902 | 2017-01-30 | ||
US201762538073P | 2017-07-28 | 2017-07-28 | |
US62538073 | 2017-07-28 | ||
PCT/EP2018/052173 WO2018138363A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-01-29 | Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019126453A RU2019126453A (ru) | 2021-03-01 |
RU2019126453A3 RU2019126453A3 (ru) | 2021-03-05 |
RU2762314C2 true RU2762314C2 (ru) | 2021-12-17 |
Family
ID=61132427
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019126453A RU2762314C2 (ru) | 2017-01-30 | 2018-01-29 | Пробирка для ударной обработки шариками и способ экстракции дезорибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11667884B2 (ru) |
EP (1) | EP3573756A1 (ru) |
KR (2) | KR20230030024A (ru) |
AU (2) | AU2018211530B2 (ru) |
CA (1) | CA3052096A1 (ru) |
IL (1) | IL268324A (ru) |
MX (1) | MX2019008941A (ru) |
PH (1) | PH12019501694A1 (ru) |
RU (1) | RU2762314C2 (ru) |
SG (2) | SG10201913371SA (ru) |
WO (1) | WO2018138363A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201905052B (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10036054B2 (en) | 2016-01-30 | 2018-07-31 | Safeguard Biosystems Holdings Ltd. | Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms |
US11856945B2 (en) * | 2017-04-21 | 2024-01-02 | Washington University | Methods and systems for preparing and preserving a biological sample |
JP7274164B2 (ja) * | 2018-10-30 | 2023-05-16 | 学校法人常翔学園 | ストレプトコッカス ミュータンスの検出方法 |
WO2023130075A2 (en) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | Empyrean Neuroscience, Inc. | Genetically modified organisms for producing psychotropic alkaloids |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010065420A2 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Integrated Nano-Technologies, Inc. | Universal biological sample processing |
WO2013091102A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Enrichment & isolation of microbial cells & microbial nucleic acids from a biological sample |
WO2013096799A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
RU2013148806A (ru) * | 2011-04-01 | 2015-05-10 | Оккам Байолэбс, Инк. | Способы и наборы для обнаружения бесклеточных специфических для патогенов нуклеиновых кислот |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69528256T2 (de) | 1994-04-14 | 2003-07-31 | Rockefeller University New Yor | Vorrichtung zur isolierung von zellularinhaltsstoffen |
JP4665124B2 (ja) | 2004-01-28 | 2011-04-06 | 株式会社東京大学Tlo | 環境サンプルからのdnaの回収方法 |
EP1574583A1 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-14 | Roche Diagnostics GmbH | Methods for isolation of bacteria from biological samples |
US20060281103A1 (en) | 2005-04-19 | 2006-12-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Increased sensitivity of nucleic acid-based detection of organisms by fractionation of target genomes |
JP2008154521A (ja) | 2006-12-25 | 2008-07-10 | Kurita Water Ind Ltd | 塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法、及び該方法に用いられる塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キット |
JP4522434B2 (ja) * | 2007-05-31 | 2010-08-11 | キヤノン株式会社 | 血液採取用容器 |
DE102007041864B4 (de) | 2007-09-04 | 2012-05-03 | Sirs-Lab Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen |
EP2210936A1 (en) | 2009-01-27 | 2010-07-28 | Curetis AG | Processing and analysis of viscous liquid biological samples |
CN102686306B (zh) * | 2009-09-21 | 2015-11-25 | 阿科尼生物系统公司 | 磁力裂解方法和装置 |
US10041061B2 (en) | 2010-09-29 | 2018-08-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Fungal nucleic acid extraction |
US8563298B2 (en) * | 2010-10-22 | 2013-10-22 | T2 Biosystems, Inc. | NMR systems and methods for the rapid detection of analytes |
BR122020001802B1 (pt) | 2010-10-22 | 2021-05-18 | T2 Biosystems, Inc | métodos para detectar a presença de um patógeno em uma amostra de sangue total e para detectar um analito em uma amostra |
US10767214B2 (en) | 2010-10-28 | 2020-09-08 | Clinical Genomics Pty Ltd | Method of microvesicle enrichment |
US9290796B1 (en) | 2011-04-22 | 2016-03-22 | The Regents Of The University Of California | Detection of foaming and bulking bacteria in wastewater |
US20150031038A1 (en) | 2011-09-06 | 2015-01-29 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample preparation methods |
CA2868805C (en) | 2012-03-28 | 2018-09-04 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for the collection and isolation of nucleic acids from biological specimens |
WO2014049022A1 (en) | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
EP3017042A4 (en) | 2013-07-02 | 2017-02-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for the purification of targeted nucleic acids from background nucleic acids |
EP3199629A1 (en) | 2016-01-30 | 2017-08-02 | Safeguard Biosystems Holdings Ltd. | Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms |
US10036054B2 (en) | 2016-01-30 | 2018-07-31 | Safeguard Biosystems Holdings Ltd. | Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms |
-
2018
- 2018-01-29 EP EP18702474.0A patent/EP3573756A1/en active Pending
- 2018-01-29 RU RU2019126453A patent/RU2762314C2/ru active
- 2018-01-29 SG SG10201913371SA patent/SG10201913371SA/en unknown
- 2018-01-29 WO PCT/EP2018/052173 patent/WO2018138363A1/en unknown
- 2018-01-29 MX MX2019008941A patent/MX2019008941A/es unknown
- 2018-01-29 SG SG11201906950PA patent/SG11201906950PA/en unknown
- 2018-01-29 CA CA3052096A patent/CA3052096A1/en active Pending
- 2018-01-29 US US16/487,769 patent/US11667884B2/en active Active
- 2018-01-29 AU AU2018211530A patent/AU2018211530B2/en active Active
- 2018-01-29 KR KR1020237005737A patent/KR20230030024A/ko active IP Right Grant
- 2018-01-29 KR KR1020197025357A patent/KR102502654B1/ko active IP Right Grant
-
2019
- 2019-07-23 PH PH12019501694A patent/PH12019501694A1/en unknown
- 2019-07-29 IL IL268324A patent/IL268324A/en unknown
- 2019-07-31 ZA ZA2019/05052A patent/ZA201905052B/en unknown
-
2022
- 2022-12-13 AU AU2022287572A patent/AU2022287572A1/en active Pending
-
2023
- 2023-04-21 US US18/305,068 patent/US20230383242A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010065420A2 (en) * | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Integrated Nano-Technologies, Inc. | Universal biological sample processing |
RU2013148806A (ru) * | 2011-04-01 | 2015-05-10 | Оккам Байолэбс, Инк. | Способы и наборы для обнаружения бесклеточных специфических для патогенов нуклеиновых кислот |
WO2013091102A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Enrichment & isolation of microbial cells & microbial nucleic acids from a biological sample |
WO2013096799A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ESHOO M.W. et al. "Direct molecular detection and genotyping of Borrelia burgdorferi from whole blood of patients with early lime disease".//PLOS ONE, 2012, vol.7, N.5, e36825. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20190112091A (ko) | 2019-10-02 |
PH12019501694A1 (en) | 2020-06-15 |
KR20230030024A (ko) | 2023-03-03 |
AU2018211530A1 (en) | 2019-08-22 |
AU2022287572A1 (en) | 2023-02-02 |
SG11201906950PA (en) | 2019-08-27 |
AU2018211530B2 (en) | 2022-09-15 |
IL268324A (en) | 2019-09-26 |
EP3573756A1 (en) | 2019-12-04 |
RU2019126453A3 (ru) | 2021-03-05 |
KR102502654B1 (ko) | 2023-02-23 |
ZA201905052B (en) | 2020-05-27 |
CA3052096A1 (en) | 2018-08-02 |
MX2019008941A (es) | 2019-09-11 |
US11667884B2 (en) | 2023-06-06 |
US20230383242A1 (en) | 2023-11-30 |
RU2019126453A (ru) | 2021-03-01 |
WO2018138363A1 (en) | 2018-08-02 |
SG10201913371SA (en) | 2020-03-30 |
US20210284951A1 (en) | 2021-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11952614B2 (en) | Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms | |
JP7488246B2 (ja) | ビーズ破砕用チューブならびに微生物からデオキシリボ核酸および/またはリボ核酸を抽出する方法 | |
US20230383242A1 (en) | Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms | |
US11702647B2 (en) | Method for pretreatment of microbial cells | |
EP2547767A2 (en) | Use of achromopeptidase for lysis at room temperature | |
EP3408388B1 (en) | Method for producing a lysate from cells contained in a liquid sample | |
EP3971290A1 (en) | Method for producing a lysate from cells contained in a liquid sample | |
JP7216652B2 (ja) | ビーズ破砕用チューブ並びに微生物からデオキシリボ核酸及び/又はリボ核酸を抽出する方法 | |
TWI838658B (zh) | 用於從微生物中萃取去氧核糖核酸及/或核糖核酸的珠粒撞擊管及方法 | |
CN116724122A (zh) | 用于浓缩和鉴定血液中微生物的系统、方法和设备 | |
WO2020218553A1 (ja) | デジタル微生物叢解析 | |
Venkatesha et al. | Rapid diagnosis of leptospirosis using PCR and DNA hybridization techniques | |
CN112805388A (zh) | 微生物的检测方法 |