KR20190112091A - 미생물로부터 데옥시리보핵산 및/또는 리보핵산을 추출하기 위한 비드 비팅 튜브 및 방법 - Google Patents

미생물로부터 데옥시리보핵산 및/또는 리보핵산을 추출하기 위한 비드 비팅 튜브 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 비드 비팅을 위한 개선된 방법 및 이에 유용한 비드 비팅 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 상기 비드 비팅 시스템을 사용하여 핵산을 함유하는 세포로부터 핵산을 추출하는 방법을 포함한다.

Description

미생물로부터 데옥시리보핵산 및/또는 리보핵산을 추출하기 위한 비드 비팅 튜브 및 방법
1. 배경
감염성 질환의 유전적 시험 및 진단은 임상 미생물학 분야에서 중요한 역할을 한다. 배양물-기반 방법론을 사용한 고유의 편향 및 한계를 극복하기 위하여, 유전 시험을 사용하여 샘플 속에 함유된 미생물을 검출하는 것이 증가하고 있다. 이러한 유전 시험을 수행할 수 있도록 하기 위해서는, 세포를 분해하여 미생물로부터 DNA 및/또는 RNA를 가능한 고 농도로 추출하도록 하는 것이 요구된다.
문헌 'Zhongtang Yu et al., 2004, "Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples," BioTechniques, Vol. 36(5):808-812'는 소화물 및 배설물 샘플로부터 DNA를 분리하는 방법을 기술하고 있다. 당해 방법에서는, 미생물, 즉 세균을 함유하는 것으로 추정되는, 소의 위장계로부터 취한 샘플 유체 0.25 g을 우선 500 mM 염화나트륨, 50 mM 트리스 하이드로클로라이드, pH 8.0, 50 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 및 4% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 1 mL의 완충액과 모두 합한다. 더욱이, 0.4 g의 멸균 지르코니아 비드(bead)를 샘플 유체 속에 도입한다. 이렇게 수득된 혼합물을 후속적으로 샘플 튜브 속에서 Mini-BeadBeater™을 사용하여 3분 동안 진동시켜 비드가 미생물의 세포벽을 파괴하도록 한다. 당해 공정에서, 세포 속에 함유된 DNA가 방출된다. 완충액은 또한 샘플 유체 속에 함유된 DNase에 의한 분해로부터 DNA를 보호하기 위해 제공된다. 비드 비팅(bead beating)을 수행한 후에, 불순물은 암모늄 아세테이트를 사용한 침전에 의해 샘플로부터 제거한다. 핵산은 이소프로판올을 사용한 침전에 의해 수득한다. 추가의 방법 단계에서 DNA를 RNase 및 Proteinase K를 사용하여 후속적으로 분해하고 컬럼을 사용하여 후속적으로 정제한다.
상기 방법은 비교적 복잡하다는 단점이 있다. 샘플 유체는 완충액을 첨가하여 희석되므로, 샘플 속의 DNA 농도는 감소한다. 따라서, 상기 방법은 제한된 검출 정확도 및 민감성 만을 허용한다.
따라서, 세포를 분해하여 샘플 유체 속에 함유된 미생물로부터 핵산을 추출하기 위한 개선된 장치 및 방법이 요구되고 있다.
2. 요약
본 개시내용은 개선된 비드 비팅 튜브 및 비드 비팅 시스템 및 방법에 관한 것이다. 용어 "비드 비팅 튜브" 및 용어 "샘플 튜브"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이론에 얽메이려는 것은 아니지만, 본 발명자들은 비드 비팅이 핵산을 용액내로 용해시킨다고 믿는다. 본 개시내용은 부분적으로, 핵산 추출 방법에서 비드 비팅의 사용이 비드 상의 흡수로 인하여 핵산 손실을 초래하며 이러한 손실은 비드 상의 결합 부위를 차단하기 위한 적절한 양의 차단제에 의해 방지될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 본 개시내용은 또한 비트 비팅에 이미 사용된 일부 분해 완충액이 차단제로서 작용하는 시약을 함유할 수 있지만, 이러한 시약은 전형적으로 사용되었던 것보다 훨씬 더 적은 양으로 사용될 수 있다는 인식을 기반으로 한다. 본원에서 사용되는 용어 "분해 완충액(lysis buffer)"는 개방 세포를 파괴하는데 사용되는 완충 용액을 지칭한다. 분해 완충액은 예를 들어 완충액 (예를 들어, Tris-HCl) 및 하나 이상의 염(예를 들어, NaCl, KCl) 및/또는 세제 (예를 들어, 소듐 도데실 설페이트)를 함유할 수 있다.
추가로, 본 개시내용은 또한 혈액과 같은 일부 생물학적 샘플이 고유하게 차단제를 함유하고 따라서 분해 완충액과 같은 첨가제의 부재하에서 비드 비팅을 겪을 수 있다는 인식을 기반으로 한다. 따라서, 예를 들어, 시판되는 혈액 수집 튜브에 수집된 후, 예컨대 비드 비팅 비드를 수집 튜브에 첨가하고 수집 튜브를 교반함으로써, 혈액을 직접 비드 비팅시킬 수 있다. 시판되는 수집 튜브의 예는 EDTA를 함유 한 라벤더-탑 튜브, 시트르산 나트륨을 함유하는 라이트 블루-탑 튜브, 칼륨 옥살레이트를 함유하는 그레이-탑 튜브 또는 헤파린을 함유하는 그린-탑 튜브를 포함한다. 대안적으로, 혈액의 일부는 비드 비팅을 위해 샘플 튜브로 옮겨질 수 있다.
특정의 국면에서, 본 개시내용은 비드에 의한 핵산 흡수의 효과적인 차단에 적절한 양 이하의 양으로 차단제(blocking agent)를 함유하거나 차단제를 고유하게(inherently) 함유하지 않는 비드 비팅 샘플의 경우에 사용하기에 적합한 비드 비팅 시스템을 제공한다. 본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 무수 차단제(dry blocking agent)를 포함한다. 놀랍게도, 액체 샘플 속에 함유된 미생물의 분해 및 미생물로부터 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA)의 추출을 위해 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 사용하는 경우, 차단제를 함유하지 않는 상응하는 비드 비팅을 사용하는 경우보다 DNA 및/또는 RNA의 보다 더 높은 추출 속도가 달성될 수 있음이 발견되었다.
본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 또한 비드 비팅 전에 샘플과 분해 용액을 합할 필요성을 피할 수 있어서, 샘플 희석의 결여로 인한 핵산의 보다 많은 양의 회수를 허용한다.
여전히 다른 국면에서, 본 개시내용은 세포를 분해하고 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 비드 비팅을 수행하기 위한 방법을 제공한다. 당해 방법은 분해 완충액의 부재하에 생물학적 샘플에서 비드 비팅을 수행함을 포함한다. 비드 비팅 방법은 본 개시내용의 비드 비팅 시스템 또는 표준 비드 비팅 시스템을 활용할 수 있다. 표준 비드 비팅 시스템을 사용하는 경우, 일부 구현예에서, 하나 이상의 차단제를 비드 비팅 시스템에 가한다. 다른 구현예에서, 생물학적 샘플이 천연적으로 하나 이상의 차단제를 포함하는 경우, 비드 비팅 전에 차단제가 첨가되지 않는다.
특정의 구현예에서, 본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 내부 강(inner cavity), 내부 강 내로 미생물을 함유하는 샘플 유체를 충전하기 위한 구멍(aperture), 및 구멍을 폐쇄하기 위한 부착된 또는 부착되지 않은 마개(closure)를 지닌 용기 부재를 포함하는 샘플 튜브로 구성되며, 여기서 다수의 거시적 입자(macroscopic particle)는 샘플 유체가 내부 강 내로 충전되고 비드 비팅 튜브가 기계적 진동에 적용되는 경우 샘플 유체 속에 함유된 미생물의 세포벽을 기계적으로 파괴하도록 조정된 내부 강 속에 정렬되어 있다. 예시적인 비드 비팅 시스템은 하기 섹션 4.1 및 하기 번호매긴 구현예 1 내지 24 및 90 내지 98에 기술되어 있다. 비드 비팅 시스템에서 사용될 수 있는 예시적인 샘플 튜브는 섹션 4.1.1에 기술되어 있고, 비드 비팅에서 사용될 수 있는 예시적인 차단제는 섹션 4.1.2에 기술되어 있으며, 비드 비팅 시스템에 사용될 수 있는 예시적인 비드는 섹션 4.1.3에 기술되어 있다.
본 개시내용은 추가로 미생물을 분해하여 미생물로부터 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA)을 추출하는 방법에 관한 것이며, 여기서 미생물을 함유하는 것으로 추정되는 샘플 유체가 제공되고, 여기서 서로에 대해 이동가능한 다수의 입자가 샘플 유체 속에 도입되며 이 속에 함유된 입자를 지닌 샘플 유체는 진동함으로써 입자가 샘플 유체 속에 함유된 미생물의 세포 벽을 기계적으로 파괴하도록 한다. 이로부터 DNA가 추출될 수 있는 예시적인 샘플은 섹션 4.2에 기술되어 있고 핵산 추출 전에 샘플을 제조하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 샘플 예비-가공 단계는 섹션 4.3에 기술되어 있다. 샘플, 예를 들어, 섹션 4.2에 기술된 샘플 또는 섹션 4.3에 기술된 바와 같이 예비-가공된 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 예시적인 방법은 하기 섹션 4.4 및 번호매긴 구현예 25 내지 81 및 99 내지 104에 기술되어 있다. 본 개시내용의 핵산 추출 방법을 수행하는데 유용한 키트(kit)는 하기 섹션 4.7 및 번호매긴 구현예 82 내지 89에 기술되어 있다.
3. 도면의 간단한 설명
도 1: 샘플 튜브(2) 및 마개 캡(6)을 포함하는 예시적인 비드 비팅 시스템(1)의 측면도.
도 2: 도 1에 나타낸 비드 비팅 시스템의 평면도.
도 3: 도 1에 나타낸 비드 비팅 시스템의 저면도.
도 4: 이를 통해 샘플 튜브의 내부 강(3)에 접근가능한 구멍(4)을 나타내는, 마개가 샘플 튜브로부터 제거될 수 있는 도 1에 나타낸 비드 비팅 시스템의 중앙 면을 통과하는 종단면도. 비드(7) 및 동결건조된 차단제(8)는 내부 강에 나타낸다.
도 5: 샘플 유체(5)로 충전된 도 1에 나타낸 비드 비팅 시스템의 중앙 면을 통과하는 종단면도.
도 6은 주형(template)으로서 비드 비팅 후 C. 알비칸스(C. 알비칸스)로부터 회수된 DNA를 사용한 PCR 증폭 생성물의 강도(intensity)를 나타낸다. Calbi144 및 Calbi54는 2개의 상이한 C. 알비칸스 표적 유전자이고 HC01-Rat87은 음성 대조군 유전자이다. 당해 연구는 우레아가 비드 비팅에서 차단 효과를 가짐으로써 PD 유체로부터 C. 알비칸스 DNA의 회수를 촉진함을 나타낸다.
도 7은 주형으로서 비드 비팅 후 C. 알비칸스로부터 회수된 DNA를 사용한 PCR 증폭 생성물의 강도를 나타낸다. Calbi144 및 Calbi54는 2개의 상이한 C. 알비칸스 표적 유전자이고 HC01-Rat87은 음성 대조군 유전자이다. 본 연구는 RNA가 비드 비팅에서 차단 효과를 가짐으로써 PD 유체로부터 C. 알비칸스 DNA의 회수를 촉진함을 나타낸다.
도 8은 주형으로서 비드 비팅 후 C. 알비칸스로부터 회수된 DNA를 사용한 PCR 증폭 생성물의 강도를 나타낸다. Calbi144 및 Calbi54는 2개의 상이한 C. 알비칸스 표적 유전자이고 HC01-Rat87은 음성 대조군이다. 추출의 최대 이론적 수율에 상응하는 C. 알비칸스 DNA의 양이 주형으로서 포함되었다. 본 연구는 C. 알비칸스 DNA가 첨가제의 부재하에서 비드 비팅 혈액에 의해 회수될 수 있음을 나타낸다.
도 9는 주형으로서 비드 비팅 후 S. 아우레우스(S. aureus)로부터 회수된 DNA를 사용한 PCR 증폭 생성물의 강도를 나타낸다. 이로부터 프로브된(probed) 유전자는 유박테리아(eubacteria)(Eub), 그람 음성 세균(Gram negative bacteria: Gng), 그람 양성 세균(Gram positive bacteria: Gpo), 스타필로코쿠스(staphylocci)(AllStaph), 엔테로박테리아카에(enterobacteriacae)(Entb), S. 아우레우스(S. aureus)(Sau), 마이코플라즈마(mycoplasma)(Myco)의 검출을 위한 것이다. N03 Rat 87은 음성 대조군이고, CC는 내부 대조군이다. 추출의 최대 이론적 수율에 상응하는 S. 아우레우스 DNA의 양이 주형으로서 포함되었다. 본 연구는 S. 아우레우스 DNA가 첨가제의 부재하에서 비드 비팅 혈액에 의해 회수될 수 있음을 나타낸다.
도 10은 주형으로서 비드 비팅 후 E.콜라이(E. coli)로부터 회수된 DNA를 사용한 PCR 증폭 생성물의 강도를 나타낸다. 이로부터 프로브된 유전자는 유박테리아(Eub), 그람 음성 세균(Gng), 그람 양성 세균(Gpo), E. 콜라이(E. coli)(Eco), 스타필로코쿠스(AHStaph), 엔테로박테리아카에(Entb)의 검출을 위한 것이다. N03 Rat 87은 음성 대조군이고, CC는 내부 대조군이다. 추출의 최대 이론적 수율에 상응하는 E. 콜라이 DNA의 양이 주형으로서 포함되었다. 본 연구는 E. 콜라이 DNA가 첨가제의 부재하에서 비드 비팅 혈액에 의해 회수될 수 있음을 나타낸다.
4. 상세한 설명
비드 비팅은 이들의 핵산(DNA 및 RNA)을 포함하는, 이들의 내용물을 방출하기 위해 세포를 분해하는데 사용된 균질화 공정이다. 샘플을 적절한 분쇄 비드(grinding bead)가 장착된 튜브 속에 두고 고 에너지 혼합에 적용시킨다. 이후에, 샘플을 전형적으로 원심분리하고 분해물을 비드 상부로부터 회수한다. 전형적으로, 비드 비팅에 적용되는 샘플은 분해 완충액으로 처리하여 세포로부터 DNA의 방출을 촉진시킨다.
본 개시내용은 개선된 비드 비팅 방법 및 시스템에 관한 것이다. 비드 비팅 방법은 분해 완충액의 사용없이 수행되어 세포 분해 및 핵산 추출의 공정을 단순화시키고 비드 상에서의 흡수로 인한 손실을 최소화시키면서 샘플 희석을 피할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 적절한 양의 차단제를 사용하여 비드 비팅을 수행하는 것에 관한 것이다. 차단제는 샘플에 대해 외인성 또는 내인성일 수 있다. 예를 들면, 뇨(urine)은 비드 비팅 비드에 대한 생물학적 샘플 속의 핵산의 결합을 차단하는 것으로 밝혀진 시약인, 우레아(urea)를 함유한다. 따라서, 본 개시내용은, 외인성 차단제와 내인성 차단제가 또한 고려되지만, 외인성 차단제의 첨가없이 이러한 샘플을 비드 비팅하는 방법을 제공한다. 내인성 차단제를 소량 함유하거나 함유하지 않는 생물학적 샘플의 경우, 외인성 차단제를 사용할 수 있다. 본 개시내용은 무수 차단제가 도입된 비드 비팅 시스템을 추가로 제공하며, 이는 샘플 희석을 초래하는 시약의 첨가없이 생물학적 샘플의 비드 비팅을 허용한다.
따라서, 본 개시내용은 무수 차단제를 포함하는 비드 비팅 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 또한 비드 비팅을 수행하여 생물학적 샘플 속의 세포를 분해하고, 이로부터 핵산을 추출하기 위한 방법을 제공한다. 당해 방법은 분해 완충액의 부재하에 생물학적 샘플 위에서 비드 비팅을 수행함을 포함한다. 비드 비팅 방법은 본 개시내용의 비드 비팅 시스템 또는 표준 비드 비팅 시스템을 활용할 수 있다. 표준 비드 비팅 시스템을 사용하는 경우, 일부 구현예에서, 하나 이상의 차단제가 비드 비팅 시스템에 첨가된다. 다른 구현예에서, 특히 생물학적 샘플이 하나 이상의 차단제를 천연적으로 포함하는 경우, 비드 비팅 전에 차단제가 첨가되지 않는다.
본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 함유하는(또는 수득하기에 적합한) 키트가 또한 본원에 제공된다.
4.1 비드 비팅 시스템
본 개시내용은 액체 샘플 속에 함유된 세포(예컨대, 미생물)로부터 세포 분해 및 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)의 추출에 유용한 비드 비팅 시스템을 제공한다. 본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 샘플 튜브, 및 샘플 튜브 속에 위치한 비드 및 무수 차단제를 포함한다. 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 사용될 수 있는 차단제는 우레아, 구아니딘 염(guanidine salt), 세제(detergent), 뉴클레오타이드(nucleotide), 폴립비닐피롤리돈(PVP), 및 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 포함한다. 차단제는 섹션 4.1.2.에 상세히 기술되어 있다. 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 사용될 수 있는 비드는 무기물 및/또는 금속을 포함하는 비드를 포함한다. 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에서 사용하기에 적합한 비드는 섹션 4.1.3.에 기술되어 있다.
4.1.1 샘플 튜브
본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 구멍에 의해 접근가능하고, 비드, 차단제, 및 액체 샘플을 수용할 수 있는 내부 강을 갖는 샘플 튜브를 포함한다. 샘플 튜브는 임의의 생물학적으로 불활성인 물질(예컨대, 플라스틱 또는 보로실리케이트)로도 제조될 수 있으며, 바람직하게는 플라스틱(예컨대, 폴리프로필렌, 폴리프로필렌 공중합체, 또는 폴리카보네이트)로 제조된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "튜브"는 바이알(예컨대, 분쇄 바이알) 및 튜브(예컨대, 원뿔형 튜브)를 포함한다.
비드 비팅 시스템은 구멍을 덮고 샘플 튜브를 밀봉하는 마개를 포함한다. 마개는 샘플 튜브에 고정될 수 있거나(예컨대, 경첩(hinge)에 의해 샘플 튜브에 고정된 캡(cap)) 샘플 튜브로부터 분리될 수 있다(즉, 제거가능한 캡). 샘플 튜브는 나사산이 있는(threaded) 캡이 맞물리도록 조정된 나사산이 있는 영역(threaded region)을 포함할 수 있다. 나사산(thread)은 샘플 튜브의 내부 또는 외부 표면에 존재할 수 있다(예컨대, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같음).
본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 사용될 수 있는 샘플 튜브는 상업적으로 이용가능한, 예를 들면, 스크류-캡(screw-cap) 폴리프로필렙 또는 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)이다. 예를 들면, 0.5 mL, 1.7 mL, 2 mL, 4.5 mL, 7 mL, 15 mL, 50 mL 또는 250 mL의 표준 튜브 크기를 사용하여 본 개시내용의 비드 비팅 튜브 및 시스템을 제조할 수 있다.
4.1.2 차단제
본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 무수 차단제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "무수(dry)" 또는 "건조된(dried)" 차단제는 20% 미만의 수분을 함유하는 차단제이다. 일부 구현예에서, 무수 차단제는 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 수분을 함유한다.
무수 차단제는 바람직하게는 장기간 안정한데, 즉, 비드 비팅 시스템은 차단제의 차단 효과가 상당하게 감소되지 않고도 보다 긴 기간 동안 문제없이 수송되어 저장될 수 있다. 무수 차단제는 용기 부재의 내부 강 속에 느슨하게 배열될 수 있고/있거나 샘플의 내부 강 중 일부 또는 전체는 차단제의 층 또는 필름으로 피복될 수 있다. 차단제는 바람직하게는 동결건조된다. 차단제는 비드를 튜브에 첨가하기 전 또는 후에 동결건조될 수 있다.
차단제의 예는 하나 이상의 카오트로픽제(chaotropic agent)(예컨대, 우레아, 구아니딘 염), 하나 이상의 세제, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 임의의 조합도 포함한다. 이러한 예시적인 차단제의 세부사항은 하기 섹션 4.1.2.1 내지 4.1.2.5에 설정되어 있다. 미생물 세포 벽(well)의 분해에 기여하는 차단제(예컨대, 세제)의 혼입은 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 사용하여 제조된 핵산의 수율을 증진시킬 수 있고 비드 비팅 전에 분해 용액과 샘플을 합할 필요성을 피한다. 일반적으로, 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 사용된 차단제의 양은 분해 용액 속에 사용된 것보다 더 적다.
비드 비팅 시스템은 비드 비팅 튜브 속에서 분해 용액(또한 추출 완충액 또는 분해 완충액으로 언급됨)을 동결건조시킴으로써 생산할 수 있다. 차단제를 함유하는 분해 용액은 당해 분야에 공지되어 있거나 상업적으로 구입할 수 있다.
일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제 및 하나 이상의 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제 및 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 세제 및 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 세제 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 뉴클레오타이드 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제, 하나 이상의 세제, 및 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제, 하나 이상의 세제, 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제, 하나 이상의 뉴클레오타이드 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 세제, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 차단제는 하나 이상의 카오트로픽제, 하나 이상의 세제, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
차단제는 에틸렌디아미노테트라아세트산(EDTA) 및/또는 이의 나트륨 염을 포함하거나 추가로 포함할 수 있다. EDTA는 칼슘, 마그네슘 및 철에 결합하므로 데옥시리보뉴클레아제 및 리보뉴클레아제를 불활성화시킨다. 이러한 조치는 또한 비드 비팅 시스템을 사용하여 가공된 샘플 유체 속에 함유된 DNA 및 RNA의 분해에 역으로 작용한다. 따라서, 측정 결과의 보다 높은 검출 민감성 및 재생산능이 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 사용하여 세포(예컨대, 미생물)로부터 추출된 DNA 및/또는 RNA의 실험 동안 가능해진다.
차단제는 용기 부재의 내부 강 속에, 예를 들면, 분말 형태로 느슨하게 정렬될 수 있다. 분말은 예를 들면, 샘플 속의 비드와 혼합될 수 있거나, 비드의 위 및/또는 아래에 층으로서 샘플 튜브 속에 정렬될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 샘플 튜브의 내부 벽은 차단제의 층 또는 필름으로 적어도 부분적으로 피복될 수 있다. 층 또는 필름은 샘플 튜브에 첨가된 차단제를 포함하는 수성 혼합물로부터 액체를 증발시켜 제조할 수 있다. 다른 구현예에서, 비드 비팅 시스템 속의 비드 중 일부 또는 모두는 차단제로 피복시킬 수 있다.
4.1.2.1 카오트로픽제
카오트로픽제는 단백질 및 핵산과 같은 거대 분자의 구조를 파괴하고 이러한 분자를 변성시킨다. 카오트로픽 용질은 단백질에 인접한 물 분자의 무질서화 때문에 소수성 영역의 전체 소수성 효과를 감소시킨다. 이는 용액 속의 소수성 영역을 가용화시킴으로써, 단백질을 변성시킨다. 이는 또한 지질 이중층 속의 소수성 영역에 직접 적용가능한데; 카오트로픽 용질의 임계 농도에 이르면(이중 층의 소수성 영역 속에서) 부재 통합성은 절충될 것이고 세포는 분해될 것이다.
차단제로서 사용될 수 있는 예시적인 카오트로픽제는 하기 제공된다.
우레아: 차단제가 우레아(또는 티오우레아; 본원에 사용된 바와 같음, 달리 내용에서 기술하지 않는 한, 용어 우레아는 티오우레아를 포함한다)를 포함하는 경우, 우레아의 양은 비드 비팅 시스템과 함께 사용하기 위해 의도된 샘플 유체의 양에 맞춰 조정됨으로써 샘플 유체를 샘플 튜브에 첨가한 후 샘플 유체 속에 용해된 우레아의 농도는 리터당 10 내지 100 그램, 리터당 50 내지 100 그램, 리터당 20 내지 50 그램, 또는 리터당 25 내지 35 그램의 범위이다. 따라서, 앞서의 구현예와 관련하여, 1 mL의 샘플이 첨가되어야 하는 2 mL의 튜브의 경우에, 차단 시약 속에 사용된 우레아의 양은 각각 10 내지 100 mg, 50 내지 100 mg, 20 내지 50 mg, 또는 25 내지 35 mg일 것이고, 0.8 mL의 샘플이 첨가되어야 하는 2 mL 튜브의 경우에, 차단 시약 속에 사용된 우레아의 양은 각각 8 내지 80 mg, 40 내지 80 mg, 16 내지 40 mg, 또는 20 내지 28 mg일 것이다.
염: 특정 염은 카오트로픽제로서 작용할 수 있다. 염은 전하를 차폐시키고 염 브릿지의 안정화를 방지함으로써 카오트로픽 특성을 가질 수 있다. 카오트로픽 염은 구아니딘, 리튬 및 마그네슘의 다양한 염을 포함한다.
구아니딘 염: 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에서 차단제로서 사용될 수 있는 구아니딘 염은 구아니딘 이소시아네이트, 구아니딘 클로라이드, 및 이의 조합을 포함한다.
리튬 염: 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에서 차단제로 사용될 수 있는 리튬 염은 리튬 퍼클로레이트, 아세트산리튬, 및 이의 조합을 포함한다.
마그네슘 염: 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에서 차단제로 사용될 수 있는 마그네슘 염은 염화마그네슘을 포함한다.
세제: 특정의 세제, 예를 들면, 나트륨 도데실 설페이트("SDS")는 카오트로픽제로서 작용할 수 있다. 차단제로서 세제의 용도는 섹션 4.1.2.3.에 기술되어 있다.
4.1.2.2 크레아티닌
차단제가 크레아티닌을 포함하는 경우, 샘플 튜브의 내부 강 속의 크레아티닌의 존재는 비드 비팅 시스템을 사용하여 가공된 샘플 속에 함유된 DNA 및/또는 RNA의 분해에 역작용할 수 있다. 또한, 크레아티닌은 비드 및/또는 샘플 튜브의 내부 벽에 대한 비특이적인 결합으로부터 DNA 및/또는 RNA를 방지한다. 이는 비드 비팅 튜브 시스템을 사용하여 가공된 세포(예컨대, 미생물)로부터 DNA 및/또는 RNA를 추출하는 경우 보다 큰 수율이 가능하도록 한다.
4.1.2.3 세제
본 개시내용의 비드 비팅 시스템에서 차단제로서 사용될 수 있는 세제는 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우로일설페이트 사르코시네이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, 및 이의 조합을 포함한다. 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트는 폴리소르베이트 20으로도 알려져 있다.
차단제 속에 사용된 세제의 양은 비드 비팅 시스템과 함께 사용하는 것으로 의도되는 샘플 유체의 양에 맞추어 조정될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플 튜브에 샘플 유체를 첨가한 후에 샘플 유체 속에 용해된 세제의 농도는 1 내지 50 mg/mL, 1 내지 25 mg/mL, 또는 25 내지 50 mg/mL의 범위이다. 따라서, 앞서의 구현예와 관련하여, 1 mL의 샘플이 첨가될 2 mL 튜브의 경우에, 차단제 속에 사용된 세제의 양은 각각 1 내지 50 mg, 1 내지 25 mg, 또는 25 내지 50 mg의 범위이며, 0.8 mL의 샘플이 첨가될 2 mL 튜브의 경우에, 차단제 속에 사용된 세제의 양은 0.8 내지 40 mg, 0.8 내지 20 mg, 또는 20 내지 40 mg의 범위일 것이다.
4.1.2.4 뉴클레오타이드
본 개시내용의 비드 비팅 시스템에서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및 이의 조합을 포함한다.
뉴클레오타이드는 천연적으로 존재할 수 있다. 천연적으로 존재하는 리보뉴클레오타이드는 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 사이토신 모노포스페이트, 및 티민 모노포스페이트이다. 사용될 수 있는 천연적으로 존재하는 데옥시리보뉴클레오타이드는 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시사이토신 모노포스페이트, 및 데옥시티미딘 모노포스페이트이다.
뉴클레오타이드는 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드의 천연적으로 존재하는 유사체일 수 있다. 비-천연적으로 존재하는 유사체의 예는 펩타이드 뉴클레오타이드, 록킹된 핵산(locked nucleic acid)("LNA") 뉴클레오타이드(이는 데옥시리보스 또는 리보스 당 대신에 비사이클릭 당 모이어티(moiety)를 함유한다), 하전되지 않은 연결을 지닌 것들(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 지닌 것들(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 및 펜던트 모이어티를 함유하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 유사체(analog)는 4-아세틸사이토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐사이토신, 슈도이소사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닐, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 및 2,6-디아미노푸린, 또는 7-데아자구아노신이다.
일부 구현예에서, 차단제는 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개의 천연적으로 존재하는 리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 차단제는 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 4개의 천연적으로 존재하는 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 차단제는 적어도 2개, 적어도 3개, 4개 또는 심지어 4개 이상의 뉴클레오타이드 유사체의 혼합물을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 차단제는 (a) 천연적으로 존재하는 리보뉴클레오타이드 및 천연적으로 존재하는 데옥시리보뉴클레오타이드, (b) 천연적으로 존재하는 리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, (c) 천연적으로 존재하는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체; 또는 (d) 천연적으로 존재하는 리보뉴클레오타이드, 천연적으로 존재하는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체의 혼합물을 포함한다.
차단제에 사용된 리보뉴클레오타이드의 양은 비드 비팅 시스템과 함께 사용하도록 의도되는 샘플 유체의 양에 맞춰 조정될 수 있다. 특정의 구현예에서, 샘플 튜브에 샘플 용액을 첨가한 후에 샘플 유체에 용해된 리보뉴클레오타이드의 농도는 200 pg/ml 내지 20 μg mL, 1 ng/ml 내지 15 μg ml, 또는 1 μg ml 내지 10 μg ml의 범위이다. 따라서, 앞서의 구현예와 관련하여, 1 mL의 샘플이 첨가될 2 mL 튜브의 경우에, 차단제에 사용된 리보뉴클레오타이드의 양은 각각 200 pg 내지 20 μg, 1 ng 내지 15 μg, 또는 1 μg 내지 10 μg의 범위일 것이고 0.8 mL의 샘플이 첨가될 2 mL 튜브의 경우에, 차단제에 사용된 리보뉴클레오타이드의 양은 160 pg 내지 16 μg, 0.8 ng 내지 12 μg, 또는 0.8 μg 내지 8 μg의 범위일 것이다.
4.1.2.5 올리고뉴클레오타이드
차단제로서 유용한 올리고뉴클레오타이드는 천연적으로 존재하는 공급원으로부터 합성되거나 생성될 수 있다.
본원에 언급된 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"는 분자의 크기를 함축하지 않으며 어떠한 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 의미한다. 그러나, 전형적으로 올리고머는 2,000개 이하의 뉴클레오타이드, 1,000개의 뉴클레오타이드이고, 보다 전형적으로 500개 이하의 뉴클레오타이드, 및 심지어 보다 전형적으로 250개 이하의 뉴클레오타이드이다. 용어 올리고뉴클레오타이드는 이중- 및 단일- 가닥 DNA 및 RNA(그러나 바람직하게는 적어도 부분적으로 단일-가닥)를 포함한다. 이는 또한 공지된 유형의 변형, 예를 들면, 당해 분야에 공지된 표지, 메틸화, "캡", 및 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 예를 들면, 유사체(섹션 4.1.2.4에 기술된 것과 같은 것)의 치환을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드는 상이한 크기의 혼합물일 수 있고/있거나 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 또는 2개 이상의 앞서의 것의 조합(예컨대, 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물, 리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체의 혼합물, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체의 혼합물, 또는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체의 혼합물)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차단제는 RNA를 포함한다.
본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 사용될 수 있는 합성 올리고뉴클레오타이드는 길이가 전형적으로 2 내지 120개 뉴클레오타이드이다. 다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 2, 5, 8, 10, 15, 18, 25, 40, 50, 80, 100 또는 120개 뉴클레오타이드이거나, 길이가 앞서의 값의 어떠한 쌍 사이의 범위, 예컨대, 길이가 2 내지 100개 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 50개 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 25개 뉴클레오타이드, 길이가 5 내지 40개 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 15개 뉴클레오타이드, 길이가 8 내지 120개 뉴클레오타이드, 길이가 8 내지 80개 뉴클레오타이드, 길이가 10 내지 100개 뉴클레오타이드, 길이가 15 내지 50개 뉴클레오타이드, 길이가 50 내지 100개 뉴클레오타이드, 길이가 100 내지 120개 뉴클레오타이드 등인 올리고뉴클레오타이드이다.
천연적으로 존재하는 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 천연적으로 존재하는 공급원, 예컨대, 연어 정자 DNA, 소 흉선 DNA, 청어 정자 DNA, 또는 이의 조합을 전단(shearing)하여 제조할 수 있다.
차단제에 사용된 올리고뉴클레오타이드의 양은 비드 비팅 시스템과 함께 사용하도록 의도되는 샘플 유체의 양에 맞추어 조정될 수 있다. 특정의 구현예에서, 샘플 튜브에 샘플 유체를 첨가한 후 샘플 유체 속에 용해된 올리고뉴클레오타이드의 농도는 200 pg/ml 내지 20 μg/ml, 1 ng/ml 내지 15 μg/ml, 또는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 범위이다. 따라서, 앞서의 구현예와 관련하여, 1 mL의 샘플이 첨가될 2 mL 튜브의 경우에, 차단제에 사용된 올리고뉴클레오타이드의 양은 각각 200 pg 내지 20 μg, 1 ng 내지 15 μg, 또는 1 μg to 10 μg의 범위일 것이고, 0.8 mL의 샘플이 첨가될 2 mL 튜브의 경우에, 차단제에 사용된 리보뉴클레오타이드의 양은 160 pg 내지 16 μg, 0.8 ng 내지 12 μg, 또는 0.8 μg 내지 8 Mg의 범위일 것이다.
4.1.3 비드
본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 이들이 샘플 유체 속에 배열된 경우 서로에 대해 이동가능한 비드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "비드"는 구형 및 비-구형 입자 둘 다를 포함한다. 비드는 무기물 비드, 예를 들면 결정성 입자(예컨대, 지르코늄, 지르콘(지르코늄 실리케이트) 및 지르코니아(지르코늄 디옥사이드), 석영, 산화알루미늄, 탄화규소(또한 카르보룬둠으로 알려짐), 가닛(garnet), 세라믹 입자, 유리(예컨대, 이산화규소 유리 또는 실리카), 또는 하나 이상의 앞서의 것들(예컨대, 지르코니아/실리카 비드 또는 지르코니아/이트륨 비드)를 포함하는 조합으로 제조된 것들일 수 있다. 비드는 또한 금속 비드, 예를 들면, 스테인레스 강 비드 또는 크롬-강 비드일 수 있다.
세균 DNA의 회수를 위해, 비드는 바람직하게는 석영 입자 및/또는 지르코늄 입자를 포함한다. 이러한 비드는 대량으로 상업적으로 이용가능하며 DNA 및 RNA와 관련하여 화학적으로 불활성이다. 석영 및/또는 지르코늄 입자는 비교적 높은 비중량(specific weight)을 가지며, 딱딱하고 날카로운 가장자리를 가질 수 있다. 따라서, 이들은 기계적 진동에 노출되는 경우 세포막을 개방시키는데 매우 적합하다.
제공된 비드 비팅 시스템을 위한 비드의 물질 및 크기는 가공될 유체 샘플 속에서 세포 유형의 확인을 기반으로 당해 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 비드는 직경이 50 μm 내지 3 mm이다. 세균 세포로부터 핵산을 추출하기 위해서, 전형적으로 유리 또는 지르코늄으로 제조되고 직경이 50 μm 내지 0.5 mm 범위인, 작은 크기 내지 중간 크기의 비드를 사용할 수 있다. 효모와 같은 보다 큰 미생물 세포로부터 핵산을 추출하기 위해서는, 중간 크기 또는 큰 비드(예컨대, 전형적으로 유리 또는 지르코늄으로 제조된, 직경이 0.5 mm, 1 mm 또는 1.5 mm인 비드)를 사용할 수 있다. 상이한 세포 유형을 가공하기 위한 상이한 크기 및 조성의 비드는 상업적으로 이용가능하다(참고: 예컨대, Benchmark Scientific, Product Note: Benchmark Bead Beating Guide, www.denvillescientific.com/sites/default/files/Bead_Blasting_Notes.pdf로부터 이용가능).
본 개시내용의 비드 비팅 시스템은 특히 다수의 공급원으로부터 핵산의 회수가 요구되는 경우(예컨대, 세균 및 진균 DNA), 다수 유형의 비드 및/또는 다수 크기의 동일한 유형의 비드를 포함할 수 있다. 다수 유형의 비드를 사용한 비드 비팅 시스템은 산화알루미늄 비드 및 탄화규소 비드의 조합, 세라믹 비드와 실리카 비드의 조합, 유리 비드와 산화지르코늄 비드의 조합, 지르코니아 비드와 산화알루미늄 비드의 조합, 또는 탄화규소와 유리 비드의 조합을 포함한다. 상이한 유형의 비드는 크기가 동일하거나 상이할 수 있다.
4.2 샘플
이로부터 핵산이 본 개시내용의 비드 비팅 방법을 사용하여 추출될 수 있는 샘플의 예는 다양한 유체 샘플을 포함한다. 일부 예에서, 샘플은 대상체로부터의 체액 샘플일 수 있다. 샘플은 대상체로부터 수집한 조직을 포함할 수 있다. 샘플은 대상체의 체액, 분비물, 및/또는 조직을 포함할 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액, 분비물, 및/또는 조직 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 예는 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 위 및 소화액, 눈물, 대변, 정액, 질액, 종양 조직으로부터 기원한 간질액, 눈 액, 땀, 점액, 귀지, 오일, 선 분비물, 입김, 척추액, 모발, 손톱, 피부 세포, 혈장, 비강 채취물 또는 비인두 세척액, 척추액, 뇌척추액, 조직, 인후 채취물, 상처 채취물, 생검(biopsy), 태반액, 양수, 제대혈, 림프액(emphatic fluid), 공동 유체(cavity fluid), 가래, 고름 또는 다른 상처 삼출물, 상처 창상절개 또는 절개에 의해 샘플링된 감염 조직, 뇌척수액, 세척액, 백혈구조혈 채취물, 복강 투석액, 우유 및/또는 다른 배출물을, 식물 및 이의 일부를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
샘플은 대상체로부터 신선한 비드 비팅 튜브내에 위치시킬 수 있거나 비드 비팅 튜브에 위치시키기 전에 예비-가공(예를 들면, 하기 섹션 4.3.에 기술된 바와 같음), 저장, 또는 수송의 일부 형태를 겪을 수 있다. 샘플은 개입 또는 많은 시간할애를 겪지않고 비드 비팅 시스템에 첨가될 수 있다.
대상체는 샘플을 제공하고/하거나, 샘플은 대상체로부터 수집될 수 있다(예를 들어, 혈액 샘플은 EDTA와 같은 항응고제를 함유하는 혈액 수집 튜브에 수집될 수 있다). 대상체는 사람 또는 비-사람 동물일 수 있다. 샘플은 살아있거나 죽은 대상체로부터 수집될 수 있다. 동물은 포유동물, 예를 들면, 농장 동물(예컨대, 소, 돼지, 양), 스포츠 동물(예컨대, 말) 또는 애완동물(예컨대, 개 또는 고양이)일 수 있다. 대상체는 환자, 임상 대상체, 또는 전-임상 대상체일 수 있다. 대상체는 진단, 치료, 및/또는 질환 관리 또는 생활방식 또는 예방적 치유를 겪을 수 있다. 대상체는 건강 보호 전문가의 보호하에 있거나 있지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 환경 샘플일 수 있다. 환경 샘플의 예는 공기 샘플, 물 샘플(예컨대, 지하수, 지표수, 또는 폐수), 토양 샘플, 또는 식물 샘플일 수 있다.
추가의 샘플은 식품 제품, 음료, 제조 물질, 직물, 화학물질, 치료요법, 또는 어떠한 다른 샘플도 포함할 수 있다.
4.3 샘플 예비-가공
일부 예에서, 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 가공하기 전에 샘플을 예비-가공하는 것이 유리할 수 있다. 비드 비팅 튜브 속에 샘플을 두기 전에 사용될 수 있는 예비-가공 단계의 예는 본원에 논의되거나 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은, 여과, 증류, 추출, 농축, 원심분리, 방해하는 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함한다.
본 개시내용의 비드 비팅 튜브내로의 이들의 배치 전에 생물학적 샘플로부터 원치않는 세포 유형 및 미립자 물질(particulate matter)을 제거하여 목적한 세포 유형으로부터 DNA의 회수를 최대화하는 것이 특히 유리할 수 있다.
생물학적 샘플 속에서 세균을 검출하는 것을 의도하는 경우, 이후에 생물학적 샘플을 여과기를 통해 예비-가공하여 미립자 및 비-세균 세포를 여과기 위에 보유시키면서 세균 세포(경우에 따라, 이들의 포자를 포함함)를 통과시키는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같은 "여과기"는 크기를 기반으로 입자 및 분자의 차등적인 통과를 허용하는 막 또는 장치이다. 전형적으로, 이는 특수한 공칭 크기(nominal size)의 여과기 속에 공극을 가짐으로써 달성된다. 예를 들면, 세균 검출 적용을 위한 특수 목적의 여과기는 세균의 통과는 허용하기에 충분히 크지만 목적한 샘플 속에 존재하는 진핵 세포의 통과는 방지하기에 충분히 작은 공극을 갖는다. 일반적으로, 세균 세포는 직경이 0.2 내지 2 μm(마이크로미터 또는 마이크론)이며, 대부분의 진균 세포는 직경이 1 내지 10 μm의 범위이고, 혈소판은 직경이 대략 3 μm이며 대부분의 핵처리된 포유동물 세포는 전형적으로 직경이 10 내지 200 μm이다. 따라서, 2 μm 미만 또는 1 μm 미만의 여과기 공극 크기가 세균의 검출이 의도된 경우 생물학적 샘플로부터 비-세균 세포를 제거하기에 특히 적합하다.
여과 단계 외에 또는 대신에, 생물학적 샘플을 원심분리에 적용시켜 비드 비팅 전에 샘플로부터 세포 및 부스러기를 제거할 수 있다. 진핵 세포를 침전시키지만 세균 세포는 침전시키지 않는 원심분리 매개변수는 당해 분야에 알려져 있다. 상층액은 이후에 경우에 따라 여과할 수 있다.
여과 단계에 의해 생성된 여액(filtrate)은 "샘플"일 수 있으며 본 개시내용에 따라 비드 비팅 튜브 속에 두거나, 추가의 예비-가공 단계(예컨대, 농축 또는 희석)에 적용시킨다.
4.4 비드 비팅
핵산 제조의 초기 단계로서, 샘플을 비드 비팅용 비드 비팅 튜브 속에 둔다. 비드 비팅 단계는 본 개시내용의 비드 비팅 시스템 또는 표준 비드 비팅 시스템을 이용할 수 있다. 일부 예에서, 표준 비드 비팅 시스템을 사용하는 경우, 하나 이상의 외인성 차단제가 첨가될 수 있으나, 내인성 차단제를 함유하는 생물학저 샘플의 경우에. 외인성 차단제의 첨가는 필수적이지 않다. 하나 이상의 차단제를 첨가하는 경우, 이들은 샘플의 첨가 전에, 샘플의 첨가 후에 비드 비팅 튜브에 첨가될 수 있거나, 샘플 및 차단제(들) 둘 다가 동시에 첨가될 수 있다(예를 들면, 샘플 및 차단제(들)를 혼합한 후 비드 비팅 튜브)로 이전할 수 있다.
샘플을 비드 비팅 튜브 속에 둔 후, 튜브를 교반에 적용시켜 세포를 기계적으로 분해한다. 분해는 일반적인 실험실 와동기 또는 균질화기에 의해 달성될 수 있다. 와동기에서의 가공 시간은 특수한 균질화기에서 보다 3 내지 10배 더 길지만, 와동은 용이하게 파괴된 세포를 위해 작동하며 저렴하다.
비드 비팅에 적합한 많은 균질화기는 시판되고 있으며 본 개시내용의 비트 비팅 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 균질화기는 BeadBug 및 BeadBlaster 24 (Benchmark Scientific), PowerLyzer 24 (MO Bio Laboratories Inc.), FastPrep-24, FastPrep-24 5G 및 SuperFastPrep-1(MP Biomedicals), 및 Mini-Beadbeater-16 (BioSpec Products)이다.
균질화 매개변수는 제조업자의 추천에 따라 선택할 수 있다. 일반적으로, 기계적 파괴 기간(예컨대, 비드 비팅)은 1초 미만, 1 내지 5초, 5 내지 10초, 10 내지 25초, 25 내지 60초, 1분 내지 2분, 2분 내지 5분, 5분 이상일 수 있다. 기계적 파괴의 반복 수(예컨대, 비드 비팅 기간의 수)는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 7 내지 10회, 10회 이상 반복일 수 있다. 파괴 속도(예컨대, 비드 비팅의 속도 또는 셋팅)은 분당 50회 미만, 50 내지 100회, 100 내지 250회, 250 내지 500회, 500 내지 750회, 750 내지 1000회, 1000 내지 1500회, 1500 내지 2000회, 2000회 이상의 회전(진동)일 수 있다.
4.5 핵산 정제
세포 분해 후, 유체 샘플은 예를 들면 유체 샘플을 피펫 등의 수단에 의해 샘플 튜브로부터 제거하여, 비드만을 남김으로써, 비드로부터 분리하며, 비드는 샘플 튜브의 바닥 위에 침착된다.
추출된 DNA의 분석을 방해할 수 있는 불순물은 예를 들면, 암모늄 아세테이트와 같은 공지된 방법에 의한 불순물의 침전에 의해 또는 시판 키트를 사용하여 제거할 수 있다.
핵산은 회수하여 세척하고 임의로 추가로 정제할 수 있다. 핵산의 회수 및/또는 정제는 이소프로판올을 사용한 침전에 의해서와 같은 통상의 방법을 사용하거나 시판 키트 또는 자동화된 장치를 사용하여 수행할 수 있다.
4.6 핵산 분석
목적한 핵산(예를 들면, 세균 또는 진균 DNA)의 존재에 대한 샘플의 분석은 증폭 기술, 폴리머라제 쇄 반응(PCR), 등온 증폭, 역 전사 폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR), 정량적 실시간 폴리머라제 쇄 반응(Q-PCR), 디지탈 PCR, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 질량 분광법, 형광성 검출, 자외선 분광법, 하이브리드화 검정, DNA 또는 RNA 서열분석, 제한 분석, 역 전사, NASBA, 대립형질 특이적인 폴리머라제 쇄 반응, 폴리머라제 사이클링 조립(PCA), 비대칭적 폴리머라제 쇄 반응, 대수적 폴리머라제 쇄 반응 후 선형화(linear after the exponential polymerase chain reaction: LATE-PCR), 헬리카제-의존성 증폭(HDA), 핫-스타트 폴리머라제 쇄 반응(hot-start polymerase chain reaction), 서열간-특이적인 폴리머라제 쇄 반응(intersequence-specific polymerase chain reaction: ISSR), 역 폴리머라제 쇄 반응, 연결 매개된 폴리머라제 쇄 반응, 메틸화 특이적인 폴리머라제 쇄 반응(MSP), 다중 폴리머라제 쇄 반응, 네스티드 폴리머라제 쇄 반응(nested polymerase chain reaction), 고체 상 폴리머라제 쇄 반응, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 핵산 분석 방법도 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 표적 핵산의 서열을 아는 것은 과학자가 표적의 증폭 및/또는 검출을 허용하는 프라이머 및/또는 프로브를 작제할 수 있도록 한다. PCR 앰플리콘(amplicon)을 또한 서열분석하여 이들의 동일성을 확인할 수 있다.
본 개시내용에 따른 비드 비팅 시스템을 사용하여, 샘플 유체 속에 함유된 미생물로부터 DNA 및/또는 RNA를 그 자체로 공지된 방법을 사용하여 미생물학적으로 DNA 및/또는 RNA를 직접 실험하기에 충분한 농도로 추출하는 것이 가능하다. 이는 특히 샘플 유체를 DNA 및/또는 RNA 및/또는 이 속에 함유된 DNA 및/또는 RNA 성분에 특이적으로 결합하는, 표면에 고정된 수용체와 접촉시켜 발생시킬 수 있다. 수용체에 대한 DNA 및/또는 RNA 및/또는 DNA 및/또는 RNA 성분의 결합은 마커, 특히 형광성 염료와 같은 광학 마커에 의해 그 자체로 공지된 방법으로 검출하고, 필요한 경우 정량화할 수 있다. 대안적으로, 샘플 유체 속에 함유된 미생물로부터의 DNA 및/또는 RNA는 예를 들면, PCR에 의해 실험 전에 증폭시킬 수 있다.
4.7 키트
본 개시내용은 추가로 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 함유하는(또는 수득하기에 적합한) 키트를 제공한다. 당해 키트는 섹션 4.1.1에 기술된 샘플 튜브와 같은 샘플 튜브, 섹션 4.1.2에 기술된 것들과 같은 하나 이상의 차단제, 및/또는 섹션 4.1.3에 기술된 것들과 같은, 하나 이상의 유형의 비드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 차단제 각각은 동결건조시킬 수 있으며 튜브 내에 또는 튜브로부터 별도로 포함될 수 있다. 유사하게, 비드가 튜브 내에 또는 튜브로부터 별도로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 샘플 튜브 및 하나 이상의 차단제를 포함한다. 추가의 구현예에서, 키트는 하나 이상의 유형의 비드를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 키트는 샘플 가공을 위한 하나 이상의 성분, 예컨대, 염수, 하나 이상의 완충액 용액, 섹션 4.3 등에 기술된 바와 같은 여과제(filter)를 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의 목적한 병원체(예컨대, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium avium subsp paratuberculosis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(methicillin resistant Staphylococcus aureus: MRSA), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 해모필루스 파라인플루에자에(Haemophilus parainfuluezae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 악시네토박터 종(Acinetobacter sp.), 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis), 노카르디아 종(Nocardia sp.), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia), 레지오넬라 종(Legionella species), 뉴모시스티스 지로벡시(Pneumocystis jiroveci), A형 인플루엔자 바이러스(influenza A virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 엔테로코쿠스 파에키움(Enterococcus faecium), 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 코리네박테리움 아미콜라툼(Corynebacterium amycolatum), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) CI 4413, 세라티아 마르케스켄스(Serratia marcescens), 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)) 중 하나 이상의 병원체로부터의 DNA 및/또는 RNA를 증폭시키기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의 목적한 병원체(예컨대, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 스트렙토코쿠스 파이오게네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 해모필루스 인플루엔자에, 해모필루스 파라인플루에자에, 모락셀라 카타르할리스, 클렙시엘라 뉴모니아에, 에스케리키아 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사, 악시네토박터 종, 보르데텔라 페르투씨스, 나이세리아 메닝기티디스, 바실러스 안트라키스, 노카르디아 종, 악티노마이세스 종, 마이코플라스마 뉴모니아에, 클라미디아 뉴모니아, 레지오넬라 종, 뉴모시스티스 지로벡시, A형 인플루엔자 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 리노바이러스, 엔테로코쿠스 파에키움, 악시네토박터 바우만니이, 코리네박테리움 아미콜라툼, 엔테로박터 아에로게네스, 엔테로코쿠스 파에칼리스 CI 4413, 세라티아 마르케스켄스, 스트렙토코쿠스 에퀴, 및 칸디다 알비칸스 중 하나 이상)로부터의 DNA 및/또는 RNA를 검출하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다. 상이한 프로브를 상이한 염료로 표지하여 다수의 목적한 병원체를 동시 검출할 수 있다.
5. 예시적인 비드 비팅 시스템
예시적인 비드 비팅 시스템이 도에 나타나 있다. 도 1 내지 도 3에서 참고 문자(1)로 지정된 비드 비팅 시스템은 내부 강(3) 및 폐쇄가능한 구멍(4)을 갖는 샘플 튜브(2)를 포함한다. 샘플 튜브는 바람직하게는 플라스틱으로 제조되지만, 또한 다른 생물학적으로 불활성인 물질로 제조될 수 있다.
미생물을 함유하는 것으로 추정되는 샘플 유체(5)는 샘플 튜브(2)의 내부 강(3)내로 충전할 수 있으며 구멍(4)을 통해 이로부터 제거할 수 있다. 구멍(4)을 폐쇄하기 위하여, 샘플 튜브는 개방 및 폐쇄된 위치로 수송되도록 조정된 마개(6)를 가지며 구멍(4)을 결합하는 샘플 튜브(2)의 외부 벽의 가장자리 영역 위에 제공된 외부 나사산으로 고정되도록 조정되는 내부 나사산을 포함하는 마개 캡으로 설계된다.
내부 강(3)에서, 비드(7)(예컨대, 2 그램의 이산화규소 및/또는 지르코늄 비드)는 추가로 정렬되며, 이의 가장 큰 직경은 평균적으로 대략 100 μm이다. 비드(7)는 느슨한 규모의 형태로 이용가능하며, 여기서 이들은 서로에 대해 이동가능하다. 동결건조된 차단제(8)는 또한 내부 강(3) 내에서 정렬된다.
비드(7)는 샘플 유체(5)가 내부 강(3)내로 충전되고 비드 비팅 튜브가 기계적 진동, 예를 들면, 초음파성 진동에 적용되는 경우 샘플 유체(5) 속에 함유된 미생물의 세포 벽을 기계적으로 파괴하기 위해 제공된다. 이들은 도면에 상세히 나열되어 있지 않고 비드 비팅 시스템(1)으로 이전될 수 있는 진동 생성기로 생성될 수 있다. 이러한 진동 생성기는 MP Biomedicals로부터의 지정 MPBio 비드 비터(bead beater) 하에서 상업적으로 이용가능하다. 세포 벽의 파괴로 인하여 미생물 속에 함유된 핵산(예컨대, DNA)가 방출되어 샘플 유체(5) 속에 용해된다.
6. 사례 연구
6.1 가래로부터 병원체 DNA를 회수하기 위한 비드-비팅의 사용
마이코박테리움 투베르쿨로시스("MTB")는 마이코박테리아세아에 계열에서 절대적인 병원성 세균이며 결핵의 대부분의 사례의 유발제이다. 주로 포유동물 호흡계의 병원체인 이것은 폐를 감염시킨다. 증거는 마이코박테리아(mycobacteria)가 영양 결핍 또는 저산소증과 같은 스트레스 동안에 비-복제 또는 휴면(포자 형성) 상태로 도입할 수 있음을 시사하고 있다. 포자의 형성은 이것이 세균 세포를 분해하여 세균 DNA를 추출하는 것을 도전하도록 한다.
마이코박테리아 DNA의 추가의 복잡한 회수는 미생물 균주가 전형적으로 감염된 환자의 가래로부터 분리된다는 것이다. 가래는 농도가 진하고, 점성이어서 가공하기 어렵다. 분석을 위한 대부분의 가래 채취물은 다양한 양의 유기 부스러기 및 다양한 오염물, 정상, 또는 일시적인 세균 세균총을 함유한다. 화학적 오염/공정을 전형적으로 사용하여 마이코박테리아의 회수를 허용하면서, 점도를 감소시키고 오염원을 사멸시킨다.
MTB를 함유하는 것으로 추정된 샘플은 사용자에게 잠재적인 위험을 나타낸다. 따라서, 가래 샘플은 가열 및/또는 샘플 속에 존재하는 미생물을 불활성화시키기에 적합한 시약을 포함시켜 예비-처리함으로써, 이러한 위험을 완화시킬 수 있다. MTB와 같은 미생물의 불활성화는 활성 단백질을 변성시키기 위한 가열(예컨대, 90℃, 5 분), 세포 벽 구조의 효소적 분해, 세포를 물리적으로 파괴하거나 불활성화시키기 위한 기계적 파괴, 화학적 처리 또는 이의 조합으로 수행될 수 있다.
가래 샘플(전형적으로 1 내지 10 mL, 5 내지 10 mL 또는 그 이상으로 수집됨)은 초기에 액화시켜 지속적인 샘플 가공을 위해 이의 점도 및 불균질성을 감소시킬 수 있다. 가래 샘플은 특수한 도전을 나타낸다. 가래 속의 MTB는 세침흡인검사법(acid fast bacilli)의 지질이 풍부한 소수성 세포 벽 및 가래의 점성의, 불균질한 특성으로 인하여 가공하기 위한 가장 도전받는 세포 및 샘플 유형들 중 하나이다. 가래에 대한 표준 추출 방법은 전형적으로 침강 공정으로 시작하며, 이는 흔히 N-아세틸-L-시스테인(NALC), 제피란-인산삼나트륨(Z-TSP), 또는 벤즈알코늄과 같은 점액용해제를 사용한 처리에 이은 원심분리, 경사분리(decanting), 및 재-현탁을 포함한다.
따라서, 가래와 같은 고 점성의 샘플을 가공하는 경우, 샘플은 점도를 감소시키기 위하여 화학적 처리에 적용되므로 후속적인 공정 단계가 지연되지 않는다. 일 구현예에서, 점액용해제를 사용한 화학적 처리에 의한 가래 샘플의 액화는 60℃에서 20분 동안 수행된다. 가래는 점도 범위가 약 100 내지 6,000 cP (mPas)이고 90 s-1에서의 전단 속도를 갖는다. mPas로 측정된 점도는 전단 속도로 나눈 전단 강도로 측정된다. 바람직하게는, 샘플을 액화시켜 가래의 점도를 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소시킨다.
재현탁에 이어, 샘플을 섹션 4.4에 기술한 바와 같이) 세포 분해를 위해 본 개시내용의 비드 비팅 시스템(섹션 4.1에 기술된 바와 같음)에 첨가한다. 분해 및 핵산 추출(섹션 4.5 참고)에 이어서, MTB DNA를 MTB 서열의 PCR 증폭으로 분석할 수 있고 MTB 약물 내성을 약물 내성 유전자의 증폭으로 분석할 수 있다. 가래 샘플은 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 스타필로코쿠스 파이오게네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 해모필루스 인플루엔자에, 해모필루스 파라인플루에자에, 모락셀라 카타르할리스, 클렙시엘라 뉴모니아에, 에스케리키아 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사, 악시네토박터 종, 보르데텔라 페르투씨스, 나이세리아 메닝기티디스, 바실러스 안트라키스, 노카르디아 종, 악티노마이세스 종, 마이코플라스마 뉴모니아에, 클라미디아 뉴모니아, 레지오넬라 종, 뉴모시스티스 지로벡시, A형 인플루엔자 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 리노바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 세균 및 바이러스 병원체에 대해 분석될 수 있다.
6.2 가축 병원체로부터 DNA를 회수하기 위한 비드 - 비팅의 사용
마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium avium subsp paratuberculosis: MAP)는 가정 및 야생 반추동물에서 부결핵증 또는 존슨 질환(Johne's disease: JD), 만성 육아종성 위장염에 관여하는 가축 병원체이다. MAP는 정액, 우유, 초유 및 자궁내를 통해 직접적으로 및 오염된 사료, 여물, 목초, 물 등을 통한 경구 경로(태아 경구 경로)에 의해 간접적으로 둘 다 짐승 무리에서 전염된다. JD는 가축 생산성(조기 폐기 및 감소된 우유 생산)에 있어서 대단히 파괴적인 효과를 가지며 축산업은 거대한 경제적 손실을 초래한다. JD 방제 효과는 토양 및 물 속에서 MAP의 지속성에 의해서 방해받아 왔으며 또한 준임상 및 임상의 소에 의해 떨어지고 있다.
앞서의 섹션에서 언급한 바와 같이, 포자의 형성은 마이코박테리아 세포를 분해하여 세균성 DNA를 추출하기 위해 도전하도록 한다. 따라서, 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 사용하여 MAP 회복을 증진시킬 수 있다. 예를 들면, 비드 비팅 시스템을 사용하여 우유, 토양, 배설물, 정액 등 속에 존재하는 MAP로부터 DNA를 회수할 수 있다.
우유 샘플은 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 사용하여 직접 가공할 수 있거나 예비-가공하여, 예컨대, 샘플 속에 존재하는 경우, MAP의 농도를 증가시킬 수 있다. 예시적인 예비-처리 방법은 우유의 샘플을 원심분리하여 크림 분획, 유장 분획, 및 펠렛(pellet)을 제공함을 포함한다. 크림 분획 및 펠렛은 세포 분해를 위해 혼주시켜 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 첨가할 수 있다.
배설물 샘플은 예를 들면, 이후에 세포 분해를 위해 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 첨가될 수 있는 배설물 현탁액을 제조함으로써 예비-가공할 수 있다. 예시적인 배설물 현탁액은 배설물 샘플을 물, 염수 또는 완충액(예컨대, 인산나트륨, 인산염 완충된 염수, 트리스 등)과 혼합하고, 혼합물을 침전시키고, 분리한 후 상층액을 원심분리하고, 최종적으로 펠렛을 물, 염수, 또는 완충액과 같은 적합한 액체 속에 재현탁시킴으로써 제조할 수 있다.
토양 샘플은 액체(예컨대, 물, 염수, 또는 완충액) 속에 현탁시킨 후 분해를 위해 본 개시내용의 비드 비팅 시스템에 가할 수 있다. 정액 샘플은 정액 샘플을 비드 비팅 전에 물, 염수, 또는 완충액의 소정의 양과 합함으로써 유사하게 예비-가공할 수 있다.
6.3 상처로부터 병원체 DNA를 회수하기 위한 비드-비팅의 용도
상처 감염의 검출을 위해, 상처 채취물(wound swab)을 염수, 세포 배양 배지의 용액, 또는 시판되는 키트로부터의 샘플 제조 용액 속에서 항온처리할 수 있다. 채취물은 전형적으로 대략 5분 내지 1시간의 기간 동안 및 보다 바람직하게는 0.25 내지 1 시간(예컨대, 0.25 시간, 0.5 시간 또는 0.75 시간) 동안 항온처리한다. 적합한 용적의 용액은 200 μL 내지 10 mL이고 특수한 구현예는 500 μL, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 8 mL이거나 앞서의 구현예들 중 어느 2개를 결합한 범위로부터 선택된다(예컨대, 1 mL 내지 5 mL, 500 μL 내지 10 mL, 200 μL 내지 8 mL 등). 용액은 주기적으로 진탕하거나 교반하여 채취물로부터 병원체 세포를 방출시킬 수 있다. 항온처리 기간 말기에 채취물을 짜서 버릴 수 있다.
이후에, 용액을 본 개시내용의 비드 비팅 시스템 속에 둘 수 있다. 임의로, 이를 비드 비팅 전에 여과하고/하거나 농축시킨다.
상처를 일반적으로 감염시키는 병원체는 E. 콜라이(E. coli), P. 아에루기노사(P. aeruginosa), E. 파에키움(E. faecium), S. 아우레우스(S. aureus)(MRSA 포함), K. 뉴모니아에(K. pneumoniae), A. 바우만니이(A. baumannii), C. 아미콜라툼(C. amycolatum), E. 아에로게네스(E. aerogenes), E. 파에칼리스(E. faecalis) CI 4413, S. 마르케센스(S. marcescens), S. 에퀴(S. equi) 및 C. 알비칸스(C. albicans)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 상처 채취물 샘플은 앞서의 유기체 중 어느 것에 대해 단독으로 또는 함께 분석할 수 있다.
6.4 복강 투석액으로부터 병원체 DNA를 회수하기 위한 비드-비팅의 용도
복강 투석은 심각한 만성 신장 질환을 지닌 환자에 대한 치료이다. 이러한 유형의 투석은 이를 가로질러 유체 및 용해된 물질이 혈액으로부터 교환되는 막으로서 복부 속의 환자의 복막을 사용한다. 유체는 복부 속의 영구적인 튜브를 통해 도입된 후 과도한 염, 뇨산 및 다른 폐기 물질을 정화시키기 위하여 씻어낸다. 복강 막을 가로지르는 삼투압에 의해, 용질이 혈액과 투석액 사이에서 교환된다. 적합한 시간 후, 투석액이 복강으로부터 제거되어 폐기된다. 이러한 방식으로, 혈액은 평형화되며 뇨산과 같은 말기 대사 산물이 혈액 속에 무기한 축적되는 것을 방지한다.
복강 투석의 주요 합병증은 복부 속의 영구적인 튜브의 존재로 인한 감염이다. 적어도 하나의 감염 부위가 복강 공간 속에 존재하여, 복부 통증, 혼탁한 투석 삼출액 및 그람 균주에 있어서 또는 카테터(catheter) 내로부터의 배양물 속에서 병원체의 발견을 야기한다. 추가로, 조직 터널 또는 카테터의 외부 표면은 접촉 오염으로부터의 일반적인 감염 지점이다. 조직 터널에서 감염은 피부 부위로부터의 이주로 인하여 가장 일반적이다. 감염은 복막염 및 일부 경우에 사망을 야기할 수 있다.
복강 감염은 복막 투석을 하는 개인으로부터 제거된 복강 투석액 속에서 검출될 수 있다. S. 아우레우스 및 P. 아에루기노사가 대부분의 감염에 관여하지만, 다른 세균(디프테리아모양의, 혐기성 유기체, 비발효 세균, 스트렙토코쿠스, 비결핵성 마이코박테리아, 레지오넬라(Legionella), 효모, 및 진균)이 또한 포함될 수 있다. 따라서, 복강 투석액 샘플을 앞서의 유기체 중 어느 것에 대해 단독으로 또는 함께 분석할 수 있다.
복강 투석액은 섹션 4.3에 기술된 바와 같이 여과 및 임의로 농축시켜 예비-가공할 수 있다.
6.5 폐수 오염물로부터 DNA를 회수하기 위한 비드-비팅의 용도
생물학적 페수 처리 공정에서 문제가 있는 발포성 및 대량의 세균 종의 검출에 관한 미국 특허 제9,290,796호의 실시예는 비드 비팅 프로토콜을 사용하여 폐수 처리 플랜트로부터 회수된 DNA 폐수를 추출하는 것을 기술하고 있다. 비드-비팅 프로토콜은 본 개시내용의 비드-비팅 시스템을 혼입시키기 위해 조정할 수 있다.
6.6 식품 병원체로부터 DNA를 회수하기 위한 비드-비팅의 용도
액체 식품 샘플을 비드-비팅 전에 섹션 4.3에 상술한 바와 같이 여과 및/또는 원심분리에 의해 예비-가공할 수 있다. 예를 들면, 음료수를 바람직하게는 여과에 의해 예비-가공하여 존재할 수 있는 미생물을 수집할 수 있다. 여과에 의해 수집된 미생물은 비드-비팅 전에 임의로 세척하고 원심분리에 적용시킬 수 있다. 육류 또는 어류와 같은, 고형 식품으로부터 병원체를 검출하기 위해, 식품의 샘플을 면봉으로 닦아서 식품 표면으로부터 미생물을 수집할 수 있다. 미생물을 이후에 채취물로부터 세척한 후 비드-비팅에 적용할 수 있다.
일부 경우에, 비드-비팅 전에 샘플 위에 또는 샘플 속에 존재할 수 있는 병원체(예컨대, 살모넬라)의 성장을 촉진시키기 위하여 일정 기간 동안 식품 샘플을 예비-배양하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 고형 식품 샘플을 실험실 배합기(예컨대, Stomacher® 서큘레이터(circulator), Seward Limited, 영국 소재)를 사용하여 분쇄한 후 배양하여 미생물 성장을 촉진시킬 수 있다(예컨대, 8 내지 12 시간 동안). 이후에, 배양물의 샘플을 비드-비팅에 적용할 수 있다.
6.7 혈액으로부터 병원체 DNA를 회수하기 위한 비드-비팅의 용도
사람 감염에 대한 신속한 분자적 진단 시험의 개발은 세계 인구의 건강 증진을 위한 세계 보건 기구(World Health Organization)(Daar et al., 2002, Nat. Genet. 32:229-232)의 대부분 높은 등급의 우선권이다. 심각한 혈액 감염은 전세계적인 입원 환자에서 질병률 및 사망의 중요한 원인이고 중환자 치료에 있어서 가장 중요한 도전 중 하나이다. 예를 들면, 패혈증 발생의 최근 추산은 미국에서 100,000명당 240건이다. 패혈증의 사람 및 경제적 부담감은 상당할 수 있다(Grossi et al., 2006, Surg. Infect. (Larchmt) 7:S87-S91). 감염성 질환 및 중환자 치료 관리 및 새로운 치료를 개발하기 위한 다수의 시도에 있어서의 진전에도 불구하고, 패혈증 사망율은 20% 내지 50%의 범위로, 허용할 수 없게 높다. 심각한 혈액 감염 및/또는 심각한 패혈증의 증상의 인식 및 조기 및 정확한 진단을 하는 것은 치유를 증진시키고 생존률을 증가시키는 열쇠이다. 실제로, 신속한 진단은 혈액 샘플채취와 항미생물 치료요법 적용 사이의 시간 간격을 감소시킴으로써 환자 생존률을 증가시킬 수 있다.
병원체를 검출하기 위한 분자 기술(예컨대, PCR 및 DNA 서열 분석)을 위해, 병원체 DNA의 적절한 분리가 성공적인 검출을 보증하기 위해 중요하다. 다양한 방법이 때때로 비드-비팅과 같은 물리적 파괴 방법을 동반한, 분해 완충액을 사용함으로써, 혈액으로부터 병원체 DNA의 회수를 증진시킨다.
본 개시내용은 혈액 속에서 천연적으로 존재하는 차단제의 존재의 장점을 취하며 혈액으로부터 병원체 DNA를 분리하기 위한 단순화된 방법을 제공한다. 혈액은 예를 들어 시판되는 혈액 수집 튜브(예 : BD Vacutainer® 혈액 수집 튜브)를 사용하여 대상체로부터 수집될 수 있다. 항응고제를 함유하는 다수의 표준 혈액 수집 튜브는 시판되고 식별이 용이하도록 색채 코딩된, 예컨대 EDTA를 함유한 라벤더-탑 튜브, 시트르산 나트륨을 함유한 라이트 블루-탑 튜브, 옥살산 칼륨 및 플루오르화 나트륨을 함유 한 그레이-탑 튜브, 및 헤파린을 함유 한 그린-탑 튜브가 이용 가능하다. 혈액, 예를 들어 EDTA를 함유 한 혈액 수집 튜브에서 수집 된 혈액은 어떠한 완충액 또는 다른 첨가제로 희석하지 않고, 본 개시내용의 비드 비팅 시스템(차단제 함유) 또는 전통적인 비드 비팅 시스템(차단제 결여)을 사용하여 비드 비팅에 적용할 수 있다. 비드 비팅 후, 표준 방법을 사용하여 섹션 4.5에 기술된 것과 같이 병원체 DNA를 회수할 수 있다. 임의로, 회수된 병원체 DNA를 이후에 예를 들면, 섹션 4.6에 기술된 방법에 의해 분석한다.
패혈증 유발 병원체는 전형적으로 세균 또는 진균이다. 패혈증의 일반적인 세균 원인은 그람-음성 세균(예를 들면, E. 콜라이, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), E. 코로덴스(E. corrodens), 및 H. 인플루엔자에(H. influenzae))이다. 패혈증을 또한 유발하는 다른 세균은 S. 아우레우스, 스트렙토코쿠스 종, 엔테로코쿠스 종 및 네이쎄리아(Neisseria)이다. 칸디다(Candida) 종은 패혈증을 유발하는 가장 흔한 진균중 일부이다. 따라서, 혈액 샘플을 앞서의 유기체 중 어느 것에 대해 단독으로 또는 함께 분석할 수 있다.
7. 실시예
7.1 실시예 1: DNA 손실에 있어서 비드 비팅 시스템 결과
7.1.1 물질
본 연구에 사용된 물질은 다음과 같다:
비드 비팅 튜브 : 부품 번호 : ARY0007 OPS Diagnostics, 2.0 gm의 100 μm SiO2 비드가 들어있는 4.5 mL 저온유리병(cryovial).
PD 유체; 글루코즈를 함유하고 Na+, Ca2+, Mg2+가 균형을 이룬 복강 투석액.
BE 완충액: Taigen Bioscience. 1 μg의 RNA/μl 함유.
우레아: ACS 등급
7.1.2 방법
EDTA로 10 mM의 수준에서 및 C. 알비칸스로 5000 CFU/mL에서 스파이킹한(spiked) 2 mL의 PD 유체는 표준 매트릭스였다. 우레아 및 BE 완충액의 12개의 상이한 조합을 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 샘플에 가하였다:
Figure pct00001
모든 샘플을 45초 동안 비드 비팅하였다. 비드 비팅에 이어서, DNA를 LabTurbo® 48 핵산 추출 시스템(Taigen Bioscience Corporation, 대만 타이페이 소재)을 사용하여 제조업자의 시약 및 프로토콜을 사용하여 샘플로부터 분리하였다. 2.0 ml의 각각의 비드-비팅 샘플로부터 분리된 DNA를 100 μl의 TE(트리스 EDTA) 완충액 속에서 용출시켰다. 분리된 DNA를 실시간 PCR 증폭 및 정량화에 적용시켜 각각의 샘플 속에서 표적 DNA의 양을 측정하였다.
7.1.3 결과
각각의 샘플에 대한 광학 밀도 비(이는 분리된 DNA의 순도의 지표이다) 및 상응하는 DNA 농도를 하기 표 2에 나타낸다:
Figure pct00002
PCR 증폭 및 하이브리드화후 배열(array)로부터의 시그날의 영상화로부터 수득된 시그날의 강도에 의해 반영된 DNA의 수율은 도 6 및 도 7에 그래프적으로 나타낸다.
7.1.4 결론
차단제를 함유하는 샘플 1에서, C. 알비칸스 DNA의 회수는 단지 5.5 ng/mL이었다. 차단제로서 우레아의 혼입은 회수를 3 내지 4배 증가시켰고, 차단제로서 RNA의 혼입은 회수를 대략 10 내지 20배 증가시켰으며, 수율은 이론적 최대치에 이르렀다. 이러한 증가된 회수는 C. 알비칸스 PCR 유전자 증폭에 있어서의 개선을 초래한다.
7.2 실시예 2: 본 개시내용의 비드 비팅 시스템을 사용한 DNA의 추출
7.2.1 본 개시내용의 비드 비팅 시스템의 제조
250 mg/mL의 우레아, 25 mg/mL의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 사나트륨 염, 125 mg/mL의 아데노신 모노포스페이트, 125 mg/mL의 구아노신 모노포스페이트, 125 mg/mL의 사이토신 모노포스페이트, 125 mg/mL의 티미딘 모노포스페이트 및 75 mg/mL의 나트륨 라우릴 사르코시네이트를 포함하는 스톡(stock) 차단제 용액을 TE(트리스/EDTA) 완충액 속에서 제조하였다.
200 마이크로리터의 스톡 용액을 4.5- 내지 5-mL들이 샘플 튜브에 가하고 진공 건조시켜, 샘플 튜브의 내부 벽의 아래 영역에 침착되는 건조된 차단제를 생성하였다. 건조된 차단제는 적어도 1년 동안 안정한 것으로 예측된다.
2.0 그램의 100 마이크로리터의 이산화규소 비드를 이후에 샘플 튜브에 가하였다.
7.2.2 본 개시내용의 비드 비팅 시스템의 용도
6 mL의 뇨 및 6 mL의 복강 투석액을 0.4 마이크로미터 멸균 여과기를 통해 여과한 후 배양물 속에서 성장시킨 스타필로코쿠스 아우레우스 밀리리터당 10,000개의 콜로니-형성 단위(colony-forming unit)를 뇨 및 복강 투석액 여액에 가하였다.
2.9 mL의 스파이크된 뇨 및 2.9 mL의 스파이크된 복강 투석액을 섹션 7.2.1에 기술된 바와 같이 제조된 샘플 튜브 또는 2.0 그램의 100 마이크로미터 이산화규소를 함유하지만 차단제는 결여한 샘플 튜브로 이전시켰다.
튜브를 뚜껑을 덮고 MPBio 비드 비터 속에서 클램핑하고 최대 전력으로 30초 동안 가동시켰다. 뚜껑을 제거하고 시판되는 DNA 분리 장치의 샘플 랙(sample rack)에 위치시켰다. 2 mL의 각각의 샘플을 각각의 튜브로부터 꺼낸 다음 DNA 추출제를 가하였다(LabTurbo®). 이후에, DNA 추출을 수행하였다. 100 마이크로리터의 DNA 추출물을 각각의 샘플에 대해 수득하였다.
각각의 샘플 속에서 추출된 스타필로코쿠스. 아우레우스 DNA의 양을 문헌 'Gillespie, et al., 2005, "Simultaneous Detection of Mastitis Pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uteris, and Streptococcus agalactiae by Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction," J. Dairy Sci. 88:3510-3518'에 따라 실시간 폴리머라제 쇄 반응으로 측정하였다. 1 마이크로리터의 각각의 DNA 추출물을 20 마이크로리터 반응물 속에서 증폭시켰다.
차단제가 결여된 샘플 튜브를 사용하여 가공한 샘플은 뇨에 대해 32 및 복강 투석액에 대해 38의 주기 역치 값(cycle threshold value)을 가졌으며, 낮은 DNA 회수를 나타내었다.
차단제가 들어있는 샘플 튜브를 사용하여 가공된 샘플은 뇨에 대해 31 및 복강 투석액에 대해 32의 주기 역치 값을 가졌으며, 이들 조건 하에서 복강 투석액에 대해 개선된 회수를 나타낸다.
7.3 실시예 3: 차단제로서의 혈액
7.3.1 개관
본 연구를 수행하여 혈액 샘플에 대한 최적의 비드 비팅 조건을 확인하였다. 배양물-음성 혈액 샘플을 병원체 S. 아우레우스, E. 콜라이 및 C. 알비칸스로 스파이킹하였다. 양성 PCR 대조군을 가동시켰다. 당해 대조군의 농도(게놈 카피)를 도입된 병원체의 이론적인 100% 회수율로서 설정하였다. 본 연구는 이러한 완충제, 세제 등과 같은 첨가제의 부재하에서 비드 비팅을 사용한 혈액 병원체로부터 DNA를 추출하는 것이 가능함을 입증하였다.
7.3.2 물질
본 연구에 구체적으로 사용된 물질은 다음과 같다:
비드 비팅 튜브: 부품 번호: ARY0007 OPS Diagnostics, 2.0 gm의 100 μm Si02 비드가 들어있는 4.5 mL 저온유리병.
혈액: 건강한 공여체로부터의 음성인 배양물
S. 아우레우스, E. 콜라이 및 C. 알비칸스 배양물: 모두 ATCC에서 공급됨
7.3.3 방법
3.0 mL의 혈액 및 배양된 병원체를 함유하는 15 μL의 염수 배양물로 이루어진 일련의 38개의 스파이크된 혈액 샘플을 제조하였다. 배양된 병원체를 함유하는 염수 배양물 외에는 다른 각각의 혈액 샘플에 아무 것도 첨가하지 않았다. 비팅 튜브를 FastPrep®-24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 6.5 m/s의 속도에서 가공하였다. 이후에, DNA를 LabTurbo® 48 핵산 추출 시스템(Taigen Bioscience Corporation)을 사용하여 제조업자의 시약 및 프로토콜을 사용하여 샘플로부터 분리하였다. DNA를 55회 주기의 PCR로 증폭시키고 배열에 하이브리드화한 후 이를 세척하고 영상화하였다. 병원체의 양 및 비드 비팅 시간을 하기 표 3에 나타낸다:
샘플
샘플 번호 샘플 비드/튜브 시간
1 혈액/스파이크 없음 OPS/OPS
 45
2
3 혈액 + 5000 CFU/mL C. 알비칸스 OPS/OPS
 45
4
5 혈액 + 5000 CFU/mL C. 알비칸스 OPS/OPS 50
6
7 혈액 + 5000 CFU/mL C. 알비칸스
OPS/OPS 55
8
9 혈액 + 5000 CFU/mL C. 알비칸스
OPS/OPS 60
10
11 혈액 + 5000 CFU/mL C. 알비칸스
 OPS/OPS 65
12
13 혈액 + 5000 CFU/mL S. 아우레우스
 OPS/OPS 45
14
15 혈액 + 5000 CFU/mL S. 아우레우스 OPS/OPS
 50
16
17 혈액 + 5000 CFU/mL S. 아우레우스
 OPS/OPS 55
18
19 혈액 + 5000 CFU/mL S. 아우레우스
 OPS/OPS 60
20
21 혈액 + 5000 CFU/mL S. 아우레우스
 OPS/OPS 65
22
23 혈액 + 100000 CFU/mL E. 콜라이 OPS/OPS 45
24
25 혈액 + 100000 CFU/mL E. 콜라이 OPS/OPS
 50
26
27 혈액 + 100000 CFU/mL E. 콜라이 OPS/OPS
 55
28
29 혈액 + 100000 CFU/mL E. 콜라이
 OPS/OPS
 60
30
31 혈액 + 100000 CFU/mL E. 콜라이
 OPS/OPS
 65
32
33 혈액 + 5000 CFU/mL C. 알비칸스
 MPBio/MPBio
 60
34
35 혈액 + 5000 CFU/mL S. 아우레우스
 MPBio/MPBio
 60
36
37 혈액 + 100000 CFU/mL E. 콜라이
 MPBio/MPBio
 60
38
제공된 스파이크 수준에서 3개의 상이한 병원체에 대해, DNA 분리로부터 μl당 게놈 생산량이 계산되었다. 이러한 게놈 카피 값을 100% 효능 표적으로서 사용하였다.
7.3.4 결과
결과를 도 8 내지 10에 그래프적으로 나열하였으며, 이는 PCR 증폭 및 하이브리드화 이후 배열로부터 시그날의 영상화로부터 수득된 시그날의 강도에 의해 반영된 DNA의 수율을 나타낸다. 도 8은 100% 표적과 함께 C. 알비칸스 시간 시리즈를 나타낸다. 도 10은 100% 표적과 함께 E. 콜라이 시간 시리즈를 나타낸다.
7.3.5 결론
3개의 상이한 병원체에 대하여, 비드에 대한 병원체 DNA 결합으로 인한 시그날 손실의 증거는 없었다. 모든 경우에서 이론치의 적어도 100%가 입증되었다. 2개의 경우에 100% 이상이 회수되었으며, 이는 스파이크내 죽은 세균으로부터의 DNA의 존재에 기인하는 듯 하다.
8. 특이적인 구현예
본 개시내용은 하기 특이적인 구현예에 의해 예시된다.
1. (i) 구멍에 의해 접근가능한 내부 강을 갖는 샘플 튜브, (ii) 비드, 및 (iii) 무수 차단제를 포함하는 비드 비팅 시스템으로서, 여기서 상기 비드 및 무수 차단제는 상기 샘플 튜브의 내부 강 내에 위치하는, 비드 비팅 시스템.
2. 구현예 1에서, 상기 차단제가 하나 이상의 카오트로픽제, 크레아티닌, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 조합을 포함하는 비드 비팅 시스템.
3. 구현예 2에 있어서, 상기 차단제가 우레아, 하나 이상의 구아니딘 염, 하나 이상의 리튬 염, 하나 이상의 마그네슘 염, 하나 이상의 세제, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 카오트로픽제를 포함하는 비드 비팅 시스템.
4. 구현예 3에 있어서, 상기 차단제가 구아니딘 이소시아네이트, 구아니딘 클로라이드, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 구아니딘 염을 포함하는 비드 비팅 시스템.
5. 구현예 3 또는 구현예 4에 있어서, 상기 차단제가 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 리튬 염을 포함하는 비드 비팅 시스템.
6. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 차단제가 염화마그네슘을 포함하는 비드 비팅 시스템.
7. 구현예 3 내지 구현예 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 차단제가 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우로일설페이트 사르코시네이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 세제를 포함하는 비팅 시스템.
8. 구현예 2 내지 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 차단제가 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드, 비-천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 비드 비팅 시스템.
9. 구현예 8에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드가 하나 이상의 천연적으로 존재하는 데옥시리보뉴클레오타이드, 하나 이상의 천연적으로 존재하는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 조합을 포함하는 비드 비팅 시스템.
10. 구현예 9에 있어서, 상기 차단제가 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시사이토신 모노포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 비드 비팅 시스템.
11. 구현예 9 또는 구현예 10에 있어서, 상기 차단제가 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 사이토신 모노포스페이트, 티미딘 모노포스페이트, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하는 비드 비팅 시스템.
12. 구현예 2 내지 구현예 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 차단제가 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이의 조합을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 비드 비팅 시스템.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 차단제가 이들 각각이 독립적으로 길이가 2 내지 120개인 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 100개인 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 50개인 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 25개인 뉴클레오타이드, 길이가 5 내지 40개인 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 15개인 뉴클레오타이드, 길이가 8 내지 120개인 뉴클레오타이드, 길이가 8 내지 80개인 뉴클레오타이드, 길이가 10 내지 100개인 뉴클레오타이드, 길이가 15 내지 50개인 뉴클레오타이드, 길이가 50 내지 100개인 뉴클레오타이드, 또는 길이가 100 내지 120개인 뉴클레오타이드인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 비드 비팅 시스템.
14. 구현예 12 또는 구현예 13에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 비드 비팅 시스템.
15. 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플 튜브의 내부 강이 차단제의 층 또는 필름으로 적어도 부분적으로 피복된 비드 비팅 시스템.
16. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드 중 일부 또는 모두가 차단제의 층 또는 필름으로 부분적으로 또는 완전히 피복된 비드 비팅 시스템.
17. 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 하나에 있어서, 차단제를 함유하는 분말을 포함하는 비드 비팅 시스템.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 분말이 차단제를 함유하는 동결건조된 분말인 비드 비팅 시스템.
19. 구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드가 세균, 효모, 섬사상 진균(filamentous fungi), 포자, 식물 세포, 또는 동물세포를 분해하도록 조정된 비드 비팅 시스템.
20. 구현예 1 내지 구현예 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드가 무기물 비드, 세라믹 비드, 유리 비드, 금속 비드, 또는 이의 조합을 포함하는 비드 비팅 시스템.
21. 구현예 20에 있어서, 상기 비드가 지르코늄 비드, 지르콘 비드, 지르코니아 비드, 석영 비드, 산화알루미늄 비드, 탄화규소 비드, 세라믹 비드, 이산화규소 유리 비드, 스테인레스 강 비드, 크롬 강 비드, 또는 이의 조합을 포함하는 비드 비팅 시스템.
22. 구현예 1 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드가 직경이 50 μm 내지 3 mm의 범위인 비드 비팅 시스템.
23. 구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, 샘플 튜브의 내부 강 내에 위치한 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 이의 나트륨 염을 추가로 포함하는 비드 비팅 시스템.
24. 구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, 샘플 튜브의 내부 강 내에 위치한 크레아티닌을 추가로 포함하는 비드 비팅 시스템.
25. 세포를 분해하기에 충분한 조건 하에서 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 하나에 따른 비드 비팅 시스템의 샘플 튜브내에서 액체 샘플을 교반시킴을 포함하는, 액체 샘플 속에 함유된 세포를 분해하기 위한(예컨대, 세포로부터 핵산을 추출하기 위한) 방법.
26. 액체 샘플을 분해 완충액 및/또는 첨가제의 부재하에 비드 비팅 튜브 및 비드를 포함하는 비드 비팅 시스템 내에서 교반시킴을 포함하는, 외인성 차단제를 함유하는 액체 속에 함유된 세포를 분해하기 위한(예컨대, 세포로부터 핵산을 추출하기 위한) 방법.
27. 액체 샘플 및 하나 이상의 차단제를 샘플 튜브 및 비드를 포함하는 비드 비팅 시스템 내에서 교반시킴을 포함하고, 임의로 여기서 하나 이상의 차단제는 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 하나에 따른 샘플 튜브 속에 존재하는 차단제인, 분해 완충액과 함께 항온처리되지 않은 액체 샘플 속에 함유된 세포를 (예컨대, 세포로부터 핵산을 추출하기 위하여) 분해하기 위한 방법.
28. 구현예 27에 있어서, 상기 액체 샘플이 내인성 차단제(endogeneous blocking agent)를 함유하는, 방법.
29. 구현예 26 내지 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드가 세균, 효모, 섬사상 진균, 포자, 식물 세포, 또는 동물 세포를 분해하도록 조정된 방법.
30. 구현예 26 내지 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드가 무기물 비드, 세라믹 비드, 유리 비드, 금속 비드, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 비드가 지르코늄 비드, 지르콘 비드, 지르코니아 비드, 석영 비드, 산화알루미늄 비드, 탄화규소 비드, 세라믹 비드, 이산화규소 유리 비드, 스테인레스 강 비드, 크롬 강 비드, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
32. 구현예 26 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드가 직경이 50μm 내지 3mm의 범위인 방법.
33. 구현예 25 내지 구현예 32 중 어느 하나에 있어서, 액체 샘플을 교반하기 전에 상기 액체 샘플을 샘플 튜브 내에 위치시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
34. 구현예 25 내지 구현예 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 교반이 상기 비드 비팅 시스템을 진동 운동에 적용시킴을 포함하는 방법.
35. 구현예 25 내지 구현예 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 샘플, 환경 샘플, 또는 식품 생성물인 방법.
36. 구현예 35에 있어서, 상기 샘플이, 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 위액, 소화액, 눈물, 대변, 정액, 질액, 간질액, 종양 조직으로부터 기원한 유체, 눈 액, 땀, 점액, 귀지, 오일, 선 분비물, 입김, 척추액, 모발, 손톱, 피부 세포, 혈장, 비강 채취물로부터 수득된 유체, 비인두 세척액으로부터 수득된 유체, 뇌척추액, 조직 샘플, 인후 채취물로부터 수득된 유체 또는 조직, 상처 채취물로부터 수득된 유체 또는 조직, 생검 조직, 태반액, 양수, 복강 투석액, 제대혈, 림프액(lymphatic fluid), 공동 유체(cavity fluid), 가래, 고름, 미생물군, 태변, 유방 젖, 또는 앞서의 어느 것으로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플로부터 선택된 생물학적 샘플인 방법.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 뇨, 가래 또는 뇨로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플인 방법.
38. 구현예 36에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 가래 또는 가래로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플인 방법.
39. 구현예 36에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 상처 채취물 또는 상처 채취물로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플인 방법.
40. 구현예 36에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 또는 혈액으로부터 가공되거나 추출되거나 분획화된 샘플인 방법.
41. 구현예 40에 있어서, 상기 혈액이 항응고제를 포함하는 방법.
42. 구현예 41에 있어서, 상기 항응고제가 EDTA인 방법.
43. 구현예 41에 있어서, 상기 항응고제가 시트레이트(예를 들어, 시트르산 나트륨)인 방법.
44. 구현예 41 에있어서, 항응고제가 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산 칼륨) 인 방법.
45. 구현예 41 에있어서, 항응고제가 헤파린(예를 들어, 헤파린 나트륨) 인 방법.
46. 구현예 41에있어서, 교반 전에 혈액을 혈액 수집 튜브로부터 샘플 튜브로 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 혈액 수집 튜브 내의 혈액의 전부가 또는 일부만이 샘플 튜브로 전달되는 방법.
47. 구현예 46에 있어서, 혈액 수집 튜브가 항응고제를 함유하는 것인 방법.
48. 구현예 47에있어서, 상기 항응고제가 EDTA 인 방법.
49. 구현예 47에있어서, 상기 항응고제가 시트 레이트(예를 들어, 시트르산 나트륨)인 방법.
50. 구현예 47에있어서, 상기 항응고제가 옥살레이트 (예를 들어, 칼륨 옥살레이트) 인 방법.
51. 구현예 47에 있어서, 상기 항응고제가 헤파린 (예를 들어, 헤파린 나트륨) 인 방법.
52. 구현예 46 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 혈액을 샘플 튜브로 옮기기 전에 혈액 수집 튜브 내로 혈액을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
53. 구현예 52에 있어서, 혈액 수집 튜브가 상기 수집 전에 항응고제를 함유하는 방법.
54. 구현예 52 또는 구현예 53에 있어서, 혈액을 샘플 튜브로 옮기기 전에 혈액을 혈액 수집 튜브에 수송 및/또는 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
55. (a) 혈액을 함유하는 혈액 수집 튜브에서 비드와 혈액을 조합하는 단계 및 (b) 비드의 존재하에 혈액을 교반함으로써 혈액 샘플에 함유된 세포를 분해시키는 단계를 포함하는, 분해 완충액과 함께 배양되지 않은 혈액 샘플에 함유된 세포를 분해하는 방법(예를 들어, 세포로부터 핵산을 추출하는 방법).
56. 구현예 55에 있어서, 상기 비드가 혈액을 함유하는 혈액 수집 튜브에 첨가되는 방법.
57. 구현예 55에 있어서, 상기 혈액이 비드를 함유하는 혈액 수집 튜브 내로 수집되는 방법.
58. 구현예 55 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 혈액 수집 튜브가 항응고제를 함유하는 방법.
59. 구현예 58에 있어서, 항응고제가 EDTA인 방법.
60. 구현예 58에 있어서, 항응고제가 시트레이트 (예를 들어, 시트르산 나트륨)인 방법.
61. 구현예 58에 있어서, 항응고제가 옥살레이트 (예를 들어, 옥살산 칼륨) 인 방법.
62. 구현예 58에 있어서, 항응고제가 헤파린 (예를 들어, 헤파린 나트륨)인 방법.
63. 구현예 36에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 복강 투석액 또는 복강 투석액으로부터 가공되거나 추출되거나 분획화된 샘플인 방법.
64. 구현예 35에 있어서, 상기 샘플이 토양, 지하수, 지표수, 폐수, 또는 이들 중 어느 것으로부터 가공되거나 추출되거나 분획화된 샘플인 방법.
65. 구현예 25 내지 구현예 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 병원체를 포함하는 방법.
66. 구현예 65에 있어서, 상기 하나 이상의 병원체가 하나 이상의 세균 병원체, 바이러스 병원체, 진균 병원체, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
67. 구현에 65 또는 구현예 66에 있어서, 상기 하나 이상의 병원체가 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 아비움 아종 파라투베르쿨로시스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 스트렙토코쿠스 파이오게네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 해모필루스 인플루엔자에, 해모필루스 파라인플루엔자에, 모락셀라 카타르할리스, 클렙시엘라 뉴모니아에, 에스케리키아 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사, 악시네토박터 종, 보르데텔라 페르투씨스, 나이세리아 메닝기티디스, 바실러스 안트라키스, 노카르디아 종, 악티노마이세스 종, 마이코플라스마 뉴모니아에, 클라미디아 뉴모니아, 레지오넬라 종, 뉴모시스티스 지로벡시, A형 인플루엔자 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 리노바이러스, 엔테로코쿠스 파에키움, 악시네토박터 바우만니이, 코리네박테리움 아미콜라툼, 엔테로박터 아에로게네스, 엔테로코쿠스 파에칼리스 CI 4413, 세라티아 마르케스켄스, 스트렙토코쿠스 에퀴, 및 칸디다 알비칸스 중 하나 이상을 포함하는 방법.
68. 구현에 65에 있어서, 상기 샘플이 가래 또는 가래로부터 가공되거나, 추출되거나, 분획화된 샘플이고 상기 하나 이상의 병원체가 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 스트렙토코쿠스 파이오게네스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 해모필루스 인플루엔자에, 해모필루스 파라인플루에자에, 모락셀라 카타르할리스, 클렙시엘라 뉴모니아에, 에스케리키아 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사, 악시네토박터 종, 보르데텔라 페르투씨스, 나이세리아 메닝기티디스, 바실러스 안트라키스, 노카르디아 종, 악티노마이세스 종, 마이코플라스마 뉴모니아에, 클라미디아 뉴모니아, 레지오넬라 종, 뉴모시스티스 지로벡시, A형 인플루엔자 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 리노바이러스 중 하나 이상을 포함하는 방법.
69. 구현예 68에 있어서, 상기 하나 이상의 병원체가 마이코박테리움 튜베르쿨로시스를 포함하는 방법.
70. 구현예 65에 있어서, 상기 샘플이 우유 또는 정액, 또는 우유, 토양, 대변, 또는 정액으로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플이고, 상기 하나 이상의 병원체가 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜베르쿨로시스를 포함하는 방법.
71. 구현예 65에 있어서, 상기 샘플이 상처 채취물 또는 상처 채취물로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플이고 상기 하나 이상의 병원체가 E. 콜라이, P. 아에루기노사, E. 파에키움, S. 아우레우스, K. 뉴모니아에, A. 바우만니이, C. 아미콜라툼, E. 아에로게네스, E. 파에칼리스 CI 4413, S. 마르케센스, S. 에퀴 및 C. 알비칸스 중 하나 이상을 포함하는 방법.
72. 구현예 65에 있어서, 상기 샘플이 복강 투석액 또는 복강 투석액으로부터 가공되거나, 추출되거나 분획화된 샘플이고 상기 하나 이상의 병원체가 S. 아우레우스 및/또는 P. 아에루기노사를 포함하는 방법.
73. 구현예 25 내지 구현예 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 액체 샘플이 다수 종으로부터의 세포를 포함하는 방법.
74. 구현예 25 내지 구현예 73 중 어느 하나에 있어서, 세포 분해 후 샘플 튜브로부터 상기 액체 샘플을 회수함을 추가로 포함하는 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 회수된 액체 샘플로부터 핵산을 정제함을 추가로 포함하는 방법.
76. 구현예 25 내지 구현예 75 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 핵산을 분석함을 추가로 포함하는 방법.
77. 구현예 76에 있어서, 상기 분석이 미세배열을 사용하거나 하나 이상의 핵산을 서열분석함으로써 수행되는 방법.
78. 구현에 76 또는 구현예 77에 있어서, 표적 서열이 분석을 수행하기 전에 증폭되는 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 표적이 PCR에 의해 증폭되는 방법.
80. 구현예 25 내지 구현예 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 DNA를 포함하는 방법.
81. 구현예 25 내지 구현예 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 RNA를 포함하는 방법.
82. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나의 비드 비팅 시스템 및 임의로: (i) 액체 샘플을 제조하기 위한 하나 이상의 성분, (ii) 하나 이상의 핵산을 증폭하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, (iii) 하나 이상의 핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 프로브, 또는 (iv) (i) 또는 (iii)의 임의의 조합을 포함하는, 액체 샘플 속에 포함된 세포를 분해하기 위한(예컨대, 세포로부터 핵산을 추출하기 위한) 키트.
83. 구현예 82에 있어서, 액체 샘플을 제조하기 위한 하나 이상의 성분을 포함하고, 여기서 상기 액체 샘플을 제조하기 위한 하나 이상의 성분이 물, 염수, 완충액, 여과제, 또는 이의 조합을 포함하는 키트.
84. 구현예 82 또는 구현예 83에 있어서, 하나 이상의 핵산을 증폭시키기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
85. 구현예 82 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함하는 키트.
86. 샘플 튜브, 비드, 및 무수 차단제를 포함하는, 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 하나에 따른 비드 비팅 시스템을 수득하기 위한 키트.
87. 구현예 86에 있어서, 상기 비드 및/또는 무수 차단제가 상기 샘플 튜브와 독립적으로 키트 속에 포함된 키트.
88. 구현예 86에 있어서, 상기 비드 및/또는 무수 차단제가 상기 샘플 튜브 내의 키트 속에 포함된 키트.
89. 구현예 86 내지 구현예 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드 비팅 시스템을 사용하여 핵산 추출하기 위한 세포를 함유하는 샘플을 제조하기 위한 하나 이상이 성분, 하나 이상의 핵산을 증폭시키기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 하나 이상의 핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 프로브, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 키트.
90. 내부 강(3), 내부 강(3) 내로 미생물을 잠재적으로 함유하는 샘플 유체(5)를 충전하기 위한 구멍(4), 및 구멍(4)을 폐쇄하기 위한 마개(6)를 지닌 용기 부재(2)를 포함하는 샘플 튜브를 포함하는 비드 비팅 시스템(1)으로서, 여기서 다수의 거시적인(macroscopic), 무기물 입자(7)가, 상기 샘플 유체(5)가 내부 강(3) 내로 충전되고 상기 비드 비팅 시스템(1)이 기계적 진동에 적용되는 경우, 샘플 유체(5) 속에 함유된 미생물의 세포 벽을 기계적으로 파괴하도록 조정된 내부 강(3)내에 정렬되고, 우레아 및/또는 적어도 하나의 구아니딘 염 및/또는 적어도 하나의 세제를 포함하는 차단제(8)가 상기 샘플 튜브의 내부 강(3)에서 건조된 형태로 정렬됨을 특징으로 하는 비트 비팅 시스템(1).
91. 구현예 90에 있어서, 상기 차단제(8)가 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시사이토신 모노포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 또는 이들 모노포스페이트들 중 적어도 2개의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
92. 구현예 90 또는 구현예 91에 있어서, 상기 차단제(8)가 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 사이토신 모노포스페이트, 티미딘 모노포스페이트, 또는 이들 모노포스페이트들 중 적어도 2개의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
93. 구현예 90 내지 구현예 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 차단제(8) 속에 함유된 적어도 하나의 모노포스페이트가 적어도 2 및 최대 120개의 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
94. 구현예 90 내지 구현예 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 세제가 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우로일설페이트 사르코시네이트 및/또는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트를 포함함을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
95. 구현예 90 내지 구현예 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 건조된 차단제가 용기 부재(2)의 내부 강(3)내에, 바람직하게는 분말 형태로 느슨하게 정렬됨을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
96. 구현예 90 내지 구현예 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 용기 부재(2)의 내부 벽이 상기 차단제의 층 또는 필름으로 적어도 부분적으로 피복됨을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
97. 구현예 90 내지 구현예 96 중 어느 하나에 있어서, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 이의 나트륨염이 상기 샘플 튜브의 내부 강(3) 속에 정렬됨을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
98. 구현예 90 내지 구현예 97 중 어느 하나에 있어서, 크레아티닌이 상기 샘플 튜브의 내부 강(3) 속에 정렬됨을 특징으로 하는 비드 비팅 시스템(1).
99. 미생물로부터 데옥시리보핵산 및/또는 리보핵산을 추출하기 위한 구현예 90 내지 구현예 98 중 어느 하나에 따른 비드 비팅 시스템 (1)의 용도.
100. 미생물을 함유하는 것으로 추정되는 샘플 유체(5)가 제공되고, 여기서 서로에 대해 이동가능한 다수의 무기물 입자(7)가 상기 샘플 유체(5) 속에 도입되며 상기 샘플 유체(5)와 이 속에 함유된 입자(7)가 진동함으로써, 상기 입자(7)가 상기 샘플 유체(5) 속에 함유된 미생물의 세포 벽을 기계적으로 파괴할 수 있으며, 우레아 및/또는 적어도 하나의 구아니딘 염 및/또는 적어도 하나의 세제를 포함하는 상기 차단제(8)가 상기 입자(7)가 진동되기 전 및/또는 진동되는 동안에 상기 샘플 유체(5) 속으로 도입됨을 특징으로 하는, 미생물로부터 데옥시리보핵산 및/또는 리보핵산을 추출하기 위한 방법.
101. 구현에 100에 있어서, 상기 우레아의 양이 샘플 유체(5)의 양에 맞춰 조정됨으로써 상기 샘플 유체(5) 속에 용해된 유레아의 농도가 리터당 10 내지 100 그램, 특히 리터당 20 내지 50 그램, 및 바람직하게는 리터당 25 내지 35 그램의 범위임을 특징으로 하는 방법.
102. 구현예 100 또는 구현예 101에 있어서, 상기 입자(7)가 진동되기 전 및/또는 진동되는 동안에, 다음의 모노포스페이트 중 적어도 하나가 상기 샘플 유체(5) 속에 도입됨을 특징으로 하는 방법: 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시사이티딘 모노포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트.
103. 구현예 100 내지 구현예 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자(7)가 진동되기 전 및/또는 진동되는 동안에, 다음의 모노포스페이트들 중 적어도 하나가 상기 샘플 유체(5) 속에 도입됨을 특징으로 하는 방법: 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 사이티딘 모노포스페이트, 티미딘 모노포스페이트.
104. 구현예 100 내지 구현예 103 중 어느 하나에 있어서, 크레아티닌 및/또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 이의 나트륨 염이 상기 입자(7)가 진동되기 전 및/또는 진동되는 동안에 상기 샘플 유체(5) 속에 도입됨을 특징으로 하는 방법.
9. 참고문헌의 인용
본 출원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허원 및 다른 문서는 각각의 개개 공보, 특허, 특허원 또는 다른 문서가 모든 목적을 위해 참고로 포함되는 것으로 개별적으로 기술되는 바와 동일한 정도로서 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 본원에 포함된 참고문헌 중 하나 이상의 교시내용과 본 개시내용 사이에 불일치가 있는 경우, 본 명세서의 교시내용이 의도된다.

Claims (33)

  1. 분해 완충액의 부재 하에서 (i) 샘플 튜브 또는 혈액 수집 튜브 및 (ii) 비드를 포함하는 비드 비팅 시스템 내에서 혈액 또는 혈액으로부터 가공, 추출 또는 분획화된 샘플을 교반하는 단계를 포함하는, 혈액에 함유된 세포를 용해시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 비드가 세균(bacteria), 효모(yeast), 섬사상 진균(filamentous fungi), 포자(spore), 식물 세포(plant cell), 또는 동물 세포(animal cell)를 분해하도록 조정되는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 비드가 무기물 비드(mineral bead), 세라믹 비드(ceramic bead), 유리 비드(glass bead), 금속 비드(metal bead), 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 비드가 지르코늄 비드, 지르콘 비드, 지르코니아 비드, 석영 비드, 산화알루미늄 비드, 탄화규소 비드, 세라믹 비드, 이산화규소 유리 비드, 스테인레스 강 비드, 크롬 강 비드, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나에 있어서,
    상기 비드의 직경이 50 μm 내지 3 mm의 범위인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나에 있어서,
    혈액을 혈액 수집 튜브 내로 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나에 있어서,
    상기 혈액 또는 혈액으로부터 가공, 추출 또는 분획화된 샘플을 교반시키기 전에 샘플 튜브 내에 위치시키는 단계를 포함하는 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 교반시키는 단계는 상기 비드 비팅 시스템을 진동 동작(oscillating motion)에 적용시킴을 포함하는 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액이 항응고제를 포함하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 항응고제가 EDTA 인 방법.
  11. 청구항 9 에 있어서,
    상기 항응고제가 시트레이트 (예를 들어, 시트르산 나트륨)인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서,
    상기 항응고제가 옥살레이트 (예를 들어, 칼륨 옥살레이트)인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서,
    상기 항응고제가 헤파린인 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액이 교반되는 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액으로부터 가공, 추출 또는 분획화된 샘플이 교반되는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비드 비팅 시스템이 샘플 튜브 및 비드를 포함하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비드 비팅 시스템이 혈액 수집 튜브 및 비드를 포함하는 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포가 하나 이상의 병원체(pathogen)를 포함하는 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액이 다수의 종으로부터의 세포를 포함하는 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 분해 후 샘플 튜브로부터 상기 분해물을 회수함을 추가로 포함하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    분해물로부터 핵산을 정제함을 추가로 포함하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    핵산을 분석함을 추가로 포함하고, 임의로:
    a) 상기 분석이 미세배열(microarray)을 사용하거나 하나 이상의 핵산을 서열분석(sequencing)함으로써 수행되며;
    b) 표적 서열이 분석을 수행하기 전에, 임의로 PCR에 의해, 증폭되는, 방법.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서,
    상기 핵산이 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 방법.
  24. 혈액 수집 튜브 및 비드 비딩에 적합한 비드를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 세포를 용해시키기 위한 키트.
  25. 청구항 24에 있어서,
    혈액 수집 튜브가 항응고제를 포함하는 키트.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 항응고제가 EDTA인 키트.
  27. 청구항 25에 있어서,
    상기 항응고제가 시트레이트인 키트.
  28. 청구항 25에 있어서,
    상기 항응고제가 옥살레이트인 키트.
  29. 청구항 25에 있어서,
    상기 항응고제가 헤파린인 키트.
  30. 청구항 24 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 비드는 혈액 수집 튜브와 별도로 포장되는 키트.
  31. 청구항 30의 키트에서 혈액을 비드 및 혈액 수집 튜브와 조합하는 단계 및 혈액에 함유된 세포가 분해(lysed)될 때까지 튜브를 교반하는(agitating) 단계를 포함하는, 혈액에 함유된 세포를 분해시키는 방법.
  32. 청구항 24 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 혈액 수집 튜브에 포장되는 키트.
  33. 청구항 32의 키트에서 혈액을 비드 및 혈액 수집 튜브와 조합하는 단계, 및 혈액에 함유된 세포가 분해될 때까지 튜브를 교반하는 단계를 포함하는, 혈액에 함유된 세포를 분해시키는 방법.
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