RU2761535C1 - Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time - Google Patents

Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time Download PDF

Info

Publication number
RU2761535C1
RU2761535C1 RU2020136135A RU2020136135A RU2761535C1 RU 2761535 C1 RU2761535 C1 RU 2761535C1 RU 2020136135 A RU2020136135 A RU 2020136135A RU 2020136135 A RU2020136135 A RU 2020136135A RU 2761535 C1 RU2761535 C1 RU 2761535C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
rabies virus
rabies
virus strain
infectious doses
strain
Prior art date
Application number
RU2020136135A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Максим Игоревич Доронин
Дмитрий Валерьевич Михалишин
Алексей Валерьевич Борисов
Вячеслав Алексеевич Стариков
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")
Priority to RU2020136135A priority Critical patent/RU2761535C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2761535C1 publication Critical patent/RU2761535C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. The invention is a method for indirectly determining the number of infectious doses of rabies virus strain RV-97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time using original specific oligonucleotides and the developed exponential function of the dependence of the threshold amplification cycle and the number of infectious doses of rabies virus strain RV-97. The number of infectious doses of rabies virus is determined during RT-PCR-RT by the value of the threshold amplification cycle. Based on the established value of the threshold amplification cycle (Ct), the value of the number of infectious doses of rabies virus strain RV-97 (NIDRVS RV-97) is calculated using the developed mathematical model: NIDRVS RV-97 =10^(-0,3012⋅Ct+10,2040) (R2=0.9927, E=99.99%).
EFFECT: present invention makes it possible to quickly and with a high degree of reliability determine the number of infectious doses of rabies virus strain RV-97 in raw materials for an attenuated rabies vaccine based on PCR-RT, followed by the use of the developed mathematical model.
7 cl, 2 dwg, 8 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и производству антирабических вакцин, а именно к способу опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением разработанной показательной функции зависимости величины порогового цикла амплификации комплементарной ДНК и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИДВБ РВ-97), репродуцированного в суспензионной культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH.The invention relates to the field of biotechnology and the production of rabies vaccines, namely to a method for indirectly determining the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in raw materials for an attenuated rabies vaccine by the method of reverse transcription and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR-RT) with using the developed exponential function of the dependence of the threshold cycle for the amplification of complementary DNA and the number of infectious doses of the rabies virus strain RV-97 (KID VB RV-97 ) reproduced in a suspension culture of kidney cells of a newborn Syrian hamster BNK-21 / SUSP / ARRIAH.

Бешенство (Rabies) занимает первоочередное место в ряду вирусных болезней человека и животных, является одним из высокоопасных зоонозов, вызывает поражение центральной нервной системы, энцефаломиелиты, параличи с неизбежным летальным исходом. Данное заболевание представляет собой мировую проблему, которой уделяют особое внимание международные организации (ВОЗ, МЭБ, ФАО, GARC) и ветеринарные службы многих стран мира [1].Rabies occupies the first place among viral diseases of humans and animals, is one of the highly dangerous zoonoses, causes damage to the central nervous system, encephalomyelitis, paralysis with inevitable death. This disease is a global problem, which is given special attention by international organizations (WHO, OIE, FAO, GARC) and veterinary services in many countries of the world [1].

Вирионы вируса бешенства имеют пулевидную форму длиной 100-300 нм, диаметром 45-100 нм. На наружной поверхности вирусной частицы имеются выступы в виде шипов длиной 10-12 нм, которые прикреплены к двуслойной липидной оболочке [2]. Геном вируса бешенства представлен несегментированной одноцепочечной негативной спиральной РНК длиной около 12000 н. о., который кодирует 5 основных белков: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (Р-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок). Между G- и L-цистронами располагается псевдоген (ψ-фрагмент) [2].Rabies virus virions are bullet-shaped, 100-300 nm in length and 45-100 nm in diameter. On the outer surface of the viral particle there are projections in the form of thorns 10-12 nm long, which are attached to the bilayer lipid membrane [2]. The rabies virus genome is represented by an unsegmented single-stranded negative helical RNA about 12,000 nt long. o., which encodes 5 basic proteins: nucleoprotein (N-protein), phosphoprotein (P-protein), matrix protein (M-protein), glycoprotein (G-protein), RNA-dependent RNA polymerase (L-protein). A pseudogene (ψ-fragment) is located between G- and L-cistrons [2].

Бешенство приводит к значительным экономическим потерям, которые связаны с гибелью животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак и осуществлением лабораторных исследований по постановке диагноза. Система мер для борьбы с бешенством и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1].Rabies leads to significant economic losses associated with the death of animals, the elimination of the consequences of outbreaks of the disease, the implementation of preventive and quarantine measures, the regulation of the number of wild carnivores, the capture of stray cats and dogs and the implementation of laboratory tests for diagnosis. The system of measures to combat rabies and its prevention provides for the immunization of domestic, agricultural and wild carnivores, as well as control of the level of tension of post-vaccination immunity [1].

При изготовлении аттенуированной антирабической вакцины вируссодержащую суспензию, полученную в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, исследуют на определение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 для оценки его активности в клетках. В 1,0 см3 суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК. В классическом варианте определения количества доз вируса бешенства используют монослойную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [2]. Существенными недостатками данного способа являются: 1) длительная процедура анализа (не менее 3 суток); 2) определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.In the manufacture of an attenuated rabies vaccine, the virus-containing suspension obtained in the BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell line is examined to determine the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 to assess its activity in cells. In 1.0 cm 3 of the virus suspension, the number of cell culture infectious doses causing 50% cell damage is determined, which actually reflects the concentration of total viral particles containing RNA. In the classical version of determining the number of doses of rabies virus, a monolayer cell line of the kidney of a newborn Syrian hamster BHK-21 / 2-17 is used, with the help of which the minimum dose of the virus is calculated that can cause lysis of 50% of cells (prototype) [2]. Significant disadvantages of this method are: 1) long-term analysis procedure (at least 3 days); 2) a certain degree of subjectivity in assessing research results; 3) the high cost of the cell line as a test system and the cost of maintaining it; 4) a high probability of the risk of cell culture contamination.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ.In this regard, it is advisable to search for a method for determining the number of infectious doses of rabies virus strain PB-97 in raw materials for an attenuated antirabies vaccine based on RT-PCR-RT.

Данный метод является объективным, высокочувствительным, специфичным и позволяет определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в вирусосодержащих суспензиях в течение 4 часов, не требует использования клеточных линий для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов, поскольку во время анализа пробирки закрыты, и предусматривает оценку степени чистоты выделенных элюатов РНК. Исходя из этого, целесообразно предложить новый способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.This method is objective, highly sensitive, specific and allows to determine the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in virus-containing suspensions within 4 hours, does not require the use of cell lines for analysis, does not imply contamination of the test samples, since the tubes are closed during the analysis, and provides for the assessment of the purity of the isolated RNA eluates. Based on this, it is advisable to propose a new method for the indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного способа быстрого определения количества инфекционных частиц вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ с целью устранения вышеуказанных недостатков.The objective of the present invention is to develop a highly sensitive and highly specific method for the rapid determination of the amount of infectious particles of the rabies virus strain PB-97 in raw materials for rabies vaccine by RT-PCR-RT in order to eliminate the above disadvantages.

Данная задача решена благодаря созданию нового опосредованного способа определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины при использовании метода ОТ-ПЦР-РВ. Предложенный способ позволяет:This problem was solved due to the creation of a new indirect method for determining the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine using the RT-PCR-RT method. The proposed method allows:

1) снизить время проведения анализа вирусосодержащих суспензий для определения количества инфекционных доз вируса бешенства до 4 ч;1) reduce the time of analysis of virus-containing suspensions to determine the number of infectious doses of rabies virus to 4 hours;

2) исключить вероятность контаминации; 3) повысить степень чистоты элюата РНК вируса бешенства штамма РВ-97; 4) увеличить чувствительность и специфичность анализа; 5) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИДВБ РВ-97) и пороговым циклом амплификации кДНК (Ct), представленной в виде показательной функции с основанием 10: КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040) с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9927) и эффективностью амплификации 99,99%. Предложенная модель позволяет опосредованного оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.2) eliminate the likelihood of contamination; 3) to increase the purity of the eluate of the RNA virus of the rabies virus strain PB-97; 4) increase the sensitivity and specificity of the assay; 5) to increase the reliability of the analysis by establishing the relationship between the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 (KID VB PB-97 ) and the threshold cycle of cDNA amplification (C t ), presented as an exponential function with base 10: KID VB PB-97 = 10 ^ (-0.3012⋅Ct + 10.2040 ) with a high accuracy of approximation (R 2 = 0.9927) and an amplification efficiency of 99.99%. The proposed model makes it possible to indirectly estimate the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:The essence of the invention is reflected in the graphic images:

Фиг. 1 - Спектры поглощения экстрактов РНК вируса бешенства штамма РВ-97 стандартных образцов для оценки степени их чистоты при определении количества инфекционных доз вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса бешенства зарегистрированы при длине волны 260 нм) (n=3).FIG. 1 - Absorption spectra of rabies virus RNA extracts of strain PB-97 of standard samples to assess their purity when determining the number of infectious doses of the virus in the initial suspensions (maximum optical signals for rabies virus RNA were recorded at a wavelength of 260 nm) (n = 3).

Фиг. 2 - Зависимость величины порогового цикла амплификации кДНК (Ct) и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИДВБ РВ-97) с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ (n=4, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов амплификации кДНК).FIG. 2 - Dependence of the threshold cycle for cDNA amplification (C t ) and the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 (KID VB PB-97 ) using the RT-PCR-RT method (n = 4, dots representing the average values of the threshold cycles are marked amplification of cDNA).

Сущность изобретения заключается в новом подходе по опосредованному определению титра вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ. Заявляемый способ основан на: 1) элюировании РНК вируса бешенства штамма РВ-97 с применением хаотропной смеси (3М мочевина и 3М гуанидинизотиоцианат в соотношении 1:1) и частиц цеолита (силикат алюминия) диаметром около 350 нм; 2) амплификации специфического фрагмента N-гена РНК вируса бешенства штамма РВ-97 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су5 (λmax флуоресценции=670 нм) и тушителем свечения BHQ-3 (λmax поглощения=670 нм); 3) детекции ДНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; 4) определении количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 с применением показательной функции с основанием 10, выраженной в виде уравнения: КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040) с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9927) и эффективностью амплификации 99,99%.The essence of the invention lies in a new approach for the indirect determination of the titer of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine using the RT-PCR-RT method. The inventive method is based on: 1) elution of RNA virus of rabies strain PB-97 using a chaotropic mixture (3M urea and 3M guanidine isothiocyanate in a ratio of 1: 1) and zeolite particles (aluminum silicate) with a diameter of about 350 nm; 2) amplification of a specific fragment of the N-gene RNA of the rabies virus strain PB-97 using original specific forward and reverse primers, as well as a molecular probe labeled with a Cy5 fluorescent dye (λ max of fluorescence = 670 nm) and a luminescence quencher BHQ-3 (λ max absorption = 670 nm); 3) detecting DNA amplicons using fluorescent fluorescence and displaying the accumulation of the signal in the form of a sigmoid tending to an exponential; 4) determining the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 using an exponential function with base 10, expressed as the equation: KID VB PB-97 = 10 ^ (-0.3012⋅Ct + 10.2040) with a high accuracy of approximation ( R 2 = 0.9927) and an amplification efficiency of 99.99%.

В настоящее время метод ОТ-ПЦР-РВ применяют для детекции нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе вируса бешенства. Для количественной оценки вирусной нагрузки суспензии, в частности, для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97, ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не применялся. Иными словами, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения количества инфекционных частиц вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины авторами не обнаружено.Currently, the RT-PCR-RT method is used to detect nucleic acids of various infectious agents, including the rabies virus. For the quantitative assessment of the viral load of the suspension, in particular, for the determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97, this method was not previously used with the use of the developed system of original primers and a molecular probe. In other words, the authors did not find information about analogues of the proposed method for indirectly determining the amount of infectious particles of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine.

Разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, быстротой выполнения анализа и снижением риска контаминации.The developed method for indirectly determining the number of infectious doses of rabies virus strain PB-97 in raw materials for an attenuated rabies vaccine using the RT-PCR-RT method in comparison with the prototype is characterized by higher sensitivity and specificity, faster analysis and reduced risk of contamination.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап элюирования РНК вируса бешенства штамма РВ-97 с применением хаотропной смеси (3М мочевина и 3М гуанидинизотиоцианат) и частиц цеолита диаметром 350 нм; амплификацию специфического фрагмента N-гена РНК вируса бешенства с применение специфических праймеров и молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су5 и тушителем свечения BHQ-3 (праймеры и зонд рассчитаны для консервативного участка N-гена производственного штамма РВ-97 вируса бешенства); детекцию ДНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; новый подход к методике расчета количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 с применением модели зависимости порогового цикла амплификации ДНК для кривой флуоресценции и КИД вируса бешенства штамма РВ-97 в виде показательной функции с основанием 10. Применение предложенного способа позволит снизить время проведения анализа вирусосодержащих суспензий для определения КИД вируса бешенства штамма РВ-97 до 4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чистоту элюата РНК вируса бешенства; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование; повысить достоверность проводимого анализа. Исходя их этого, актуально применять данный способ для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.Unlike the prototype, the developed method includes the stage of elution of the RNA virus of rabies strain PB-97 using a chaotropic mixture (3M urea and 3M guanidine isothiocyanate) and zeolite particles with a diameter of 350 nm; amplification of a specific fragment of the N-gene of the RNA virus of rabies with the use of specific primers and a molecular probe labeled with a fluorescent dye Cy5 and a luminescent quencher BHQ-3 (primers and a probe are designed for the conservative region of the N-gene of the industrial strain PB-97 of the rabies virus); detecting DNA amplicons using fluorescent fluorescence and displaying the accumulated signal as a sigmoid; a new approach to the method of calculating the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 using the model of the dependence of the threshold cycle of DNA amplification for the fluorescence curve and KID of the rabies virus strain PB-97 in the form of an exponential function with base 10. The use of the proposed method will reduce the time of analysis of virus-containing suspensions for determining the KID of the rabies virus strain PB-97 up to 4 hours; eliminate the likelihood of contamination; increase the purity of the rabies virus RNA eluate; increase the specificity and sensitivity of the assay; reduce the cost of research; increase the reliability of the analysis. Based on this, it is relevant to use this method to determine the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine.

Ключевым элементом заявляемого способа является детектирование пороговых циклов кривых реакции амплификации кДНК вируса бешенства штамма РВ-97 в режиме реального времени и определение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 с использованием разработанной математической модели зависимости порогового цикла амплификации кДНК-мишени и количества инфекционных доз вируса.The key element of the proposed method is the detection of threshold cycles of the amplification reaction curves of the cDNA of the rabies virus strain PB-97 in real time and the determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 using the developed mathematical model of the dependence of the threshold amplification cycle of the target cDNA and the number of infectious doses of the virus ...

Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа ОТ-ПЦР-РВ, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок N-гена вируса бешенства штамма РВ-97, и разработанной показательной функции с основанием 10 зависимости величины порогового цикла амплификации кДНК и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 для опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.Comparative analysis with prototypes allows us to conclude that the novelty and inventive level of the claimed invention lies in the use of the RT-PCR-RT method, original specific primers and a molecular probe designed for the N-gene region of the rabies virus strain PB-97, and the developed exponential function with basis 10 of the dependence of the value of the threshold cycle of amplification of cDNA and the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 for indirect determination of the amount of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины порогового цикла амплификации кДНК (Ct) и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИДВБ РВ-97) (n=4) (фиг. 2).The essence of the invention is illustrated in the graphic material - a graph of the dependence of the threshold cycle of cDNA amplification (C t ) and the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 (KID VB PB-97 ) (n = 4) (Fig. 2).

Для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливают контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве которых используют суспензии вируса бешенства указанного штамма с КИД: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ККИД50/см3 (культуральных клеточных инфекционных доз, вызывающих поражение 50% клеток, в 1,0 см3). В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма РВ-97.To determine the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97, prepare a control panel of standards for the rabies virus strain PB-97, which are used as suspensions of the rabies virus of the specified strain with KID: 10 0 , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 KKID 50 / cm 3 (cultured cellular infectious doses causing damage to 50% of cells in 1.0 cm 3 ). A suspension of kidney cells of a newborn Syrian hamster (BHK-21 / SUSP / ARRIAH) not infected with rabies virus and not infected with rabies virus strain PB-97 was used as negative controls.

На первом этапе исследования из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют РНК вируса бешенства. Для этого применяют частицы цеолита с диаметром 350 нм. Учитывая, что размер вирионов составляет 100-300 × 45-100 нм, частицы цеолита диаметром 350 нм оптимально подходят для сорбирования вирионов вируса бешенства. Для лизиса белковых клеточных структур и вирусных частиц, а также ингибирования РНКаз и ДНКаз используют хаотропную смесь, а именно 3М мочевину и 3М гуанидинизотиоцианат в соотношении 1:1. Данный комплекс денатурирует белковые молекулы и нуклеиновые кислоты. Хаотропные компоненты в растворенном состоянии увеличивают энтропию системы путем нарушения межмолекулярных взаимодействий, а именно, водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил и гидрофобных эффектов. Структура и функции макромолекул определяются влиянием данных сил, поэтому увеличение концентрации хаотропных растворенных веществ в биологической системе приводит к денатурации белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, используемые хаотропные агенты уменьшают гидрофобные взаимодействия между молекулами и, тем самым, влияют на липидный слой клеток и вириона вируса бешенства, что приводит к лизису [3, 4]. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляют 350 мкл указанной выше хаотропной смеси, перемешивают на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляют 20 мкл суспензии цеолита с диаметром частиц 350 мкл и инкубируют в процессе медленного перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Суспензию центрифугируют при 1500 об/мин, удаляют супернатант и проводят промывание частиц от ингибиторов реакции амплификации кДНК с помощью 4М раствора гуанидинизотиоцаната, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Затем смесь центрифугируют при 1500 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Проводят отмывание цеолитовых частиц с применением 80% раствора изопропанола-2 в объеме по 450 мкл. Осуществляют центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Данную процедуру повторяют. Полученный осадок частиц цеолита с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты высушивают от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляют 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3 минут для получения элюата РНК вируса бешенства штамма РВ-97. Содержимое пробирки центрифугируют при 14000 об/мин в течение 30 с и отбирают элюат РНК. Полученный экстракт РНК хранят при температуре -20±2°С или сразу используют в дальнейшей работе.At the first stage of the study, rabies virus RNA is isolated from all standard positive samples and negative controls, as well as the tested samples. For this, zeolite particles with a diameter of 350 nm are used. Considering that the size of virions is 100-300 × 45-100 nm, zeolite particles with a diameter of 350 nm are optimal for sorption of rabies virus virions. For the lysis of protein cell structures and viral particles, as well as inhibition of RNases and DNases, a chaotropic mixture is used, namely 3M urea and 3M guanidine isothiocyanate in a 1: 1 ratio. This complex denatures protein molecules and nucleic acids. Chaotropic components in a dissolved state increase the entropy of the system by disrupting intermolecular interactions, namely, hydrogen bonds, van der Waals forces, and hydrophobic effects. The structure and functions of macromolecules are determined by the influence of these forces; therefore, an increase in the concentration of chaotropic solutes in the biological system leads to denaturation of proteins and nucleic acids. In addition, the used chaotropic agents reduce hydrophobic interactions between molecules and, thereby, affect the lipid layer of cells and the virion of the rabies virus, which leads to lysis [3, 4]. To 100 μl of the suspension under study add 350 μl of the above chaotropic mixture, mix on a vortex mixer for 5 minutes. To the resulting lysate, add 20 μl of a suspension of zeolite with a particle diameter of 350 μl and incubate with slow stirring on a vortex for 5 min. The suspension is centrifuged at 1500 rpm, the supernatant is removed, and the particles are washed from the inhibitors of the cDNA amplification reaction using 4M guanidine isothiocyanate solution, adding it to the sediment in a volume of 400 μl. Then the mixture is centrifuged at 1500 rpm, the supernatant is removed. The zeolite particles are washed using an 80% solution of isopropanol-2 in a volume of 450 μl. The contents of the test tube are centrifuged under the same conditions. This procedure is repeated. The resulting precipitate of zeolite particles with adsorbed nucleic acid molecules is dried from alcohol residues using a dry solid-state thermostat at a temperature of 60 ± 2 ° C for 8-10 minutes. To the dried sediment, add 50 μl of TE buffer (10 mM tris (oxymethyl) aminomethane, 1 mM ethylenediamine tetraacetate, pH 7.3), free of RNases and Mg ions, warm the contents of the tube at 60 ± 2 ° C for 3 minutes to obtain the eluate of the RNA virus of rabies strain PB-97. The contents of the tube are centrifuged at 14000 rpm for 30 s and the RNA eluate is taken. The resulting RNA extract is stored at a temperature of -20 ± 2 ° C or immediately used in further work.

На следующем этапе осуществляют спектральный анализ элюата суммарной РНК вируса бешенства, определяя поглощение аналитом монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем тестируют в реакции амплификации. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25°С. В выделенных экстрактах оценивают содержание остатков фосфолипидов, полисахаридов и гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных взвешенных частиц, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно [5]. Элюат РНК считают свободным от примесей белка, если OD260/OD280 (коэффициент экстинкции R1) находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения R1 указывают на наличие ДНК, белковых составляющих в элюате. Более высокие значения коэффициента R1 свидетельствуют о деградации РНК и наличии свободных рибонуклеотидов. Экстракт нуклеиновой кислоты вируса бешенства штамма РВ-97 считают незагрязненным полисахаридами, если OD260/OD235 (коэффициент экстинкции R2) приближен к значению 2,000 [4]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие R2 снижается на 0,002. Значения коэффициента R2 большие 2,000 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD320 приближено к нулевому значению [5]. При несоответствии требованиям чистоты повторно проводят этап выделения РНК вируса бешенства из суспензии.At the next stage, spectral analysis of the eluate of the total RNA of the rabies virus is carried out, determining the absorption of monochromatic ultraviolet light by the analyte, which makes it possible to assess the degree of purity of the extract, which is subsequently tested in the amplification reaction. Measurements of the spectral absorption capacity of the samples are carried out at wavelengths in the range 205-325 nm and a temperature of 22-25 ° C. In the isolated extracts, the content of residues of phospholipids, polysaccharides and guanidine isothiocyanate, polypeptides and large suspended particles is assessed by determining the optical density (OD) at 205, 235, 270, 280, and 320 nm, respectively [5]. The RNA eluate is considered free of protein contaminants if the OD 260 / OD 280 (extinction coefficient R 1 ) is in the range 1.8-2.2 and is optimally about 2.0. Lower R 1 values indicate the presence of DNA, protein constituents in the eluate. Higher values of the coefficient R 1 indicate degradation of RNA and the presence of free ribonucleotides. The nucleic acid extract of the rabies virus strain PB-97 is considered uncontaminated with polysaccharides if OD 260 / OD 235 (extinction coefficient R 2 ) is close to 2,000 [4]. When replacing 1% of RNA with polysaccharide components, R 2 decreases by 0.002. R 2 values greater than 2,000 may indicate degradation of RNA molecules. The absence of a suspension of large particles in the eluate is confirmed if OD 320 is close to zero [5]. If the purity requirements are not met, the step of isolating the rabies virus RNA from the suspension is repeated.

На следующем этапе проводят ОТ-ПЦР-РВ для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей N-гена вируса бешенства производственного штамма РВ-97 и других изолятов, опубликованных в базах данных GeneBank [6] и полученных в рамках исследований в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).At the next stage, RT-PCR-RT is carried out to study control samples and test samples. To set up the reaction, a reaction mixture is prepared, the formulation of which is presented in Table 1. The design of primers and a molecular probe are shown in Table 2. The calculation of primers and a probe was carried out on the basis of the nucleotide sequences of the N-gene of the rabies virus of the industrial strain PB-97 and other isolates published in databases GeneBank data [6] and obtained as part of research at the Federal Center for Animal Health (FGBI ARRIAH).

В качестве гомологичных участку N-гена вируса бешенства штамма РВ-97 олигонуклеотидов используют Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер (5'-GGT-GAA-GCT-AGA-CTG-TGA-AGA-A-3'), Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер (5'-GCG-AAT-CTA-CTC-TGT-CGC-ATG-AA-3') и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд (5'-Cy5-CAC-CTC-CCC-TTT-AAG-TTT-GCT-TTA-TT-BHQ3-3') в концентрации 5 пМ на реакцию с внесением в реакционную смесь по 0,1 мкл. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5⋅10-2M) и диметилсульфооксид (DMSO) (1%). DMSO включают в реакционную смесь для сведения к минимуму неспецифического связывания олигонуклеотидов. В смесь также добавляют 2 мМ хлорида магния. Содержание деионизированной воды составляет 46%. В качестве катализаторов ОТ-ПЦР-РВ применяют следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.) и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (10 ед.). Элюаты суммарной РНК вируса бешенства каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer (5'-GGT-GAA-GCT-AGA-CTG-TGA-AG A-A -3 ' ), Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer (5'-GCG-AAT-CTA-CTC-TGT-CGC-ATG -AA -3 ') and 5'-NP-RV-97-quant -Cy5 / BHQ3-probe (5'-Cy5-CAC-CTC-CCC-TTT-AAG-TTT-GCT-TTA-TT-BHQ3-3 ') at a concentration of 5 pM per reaction with addition of 0.1 to the reaction mixture μl. For the formation of nucleotide chains of reaction products, deoxyribonucleoside triphosphates are used with a total concentration of 2 mM in the reaction mixture. A buffer solution (5x) is used as a base, the content of which is 20% of the total volume of the reaction mixture. The buffer solution contains potassium ions (K + ) (5⋅10 -2 M) and dimethyl sulfoxide (DMSO) (1%). DMSO is included in the reaction mixture to minimize nonspecific binding of oligonucleotides. 2 mM magnesium chloride is also added to the mixture. The deionized water content is 46%. The following enzymes are used as RT-PCR-RT catalysts: AMV reverse transcriptase (10 units) and DNA-dependent DNA polymerase (10 units). Eluates of the total RNA of the rabies virus of each sample are added to the reaction mixture in 5 μl. The total volume of the mixture for one reaction is 25 μl.

Праймеры для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [7, 8]. Длины Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Су5/BHQ3-зонда составляют 22, 23 и 26 и.о., что соответствует требованиям (20-30 н.о.) [7, 8]. Молекулярный вес олигонуклеотидов Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда равен 6873; 7024 и 7829 (без учета флуорофора и гасителя свечения), соответственно. Процентное содержание G и С в Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймере, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймере и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонде составляет 45, 48 и 42%, соответственно, что нормально (допустимо 40-60%) [7, 8, 9, 10]. На 5'-конце праймеров и зонда отмечается преобладание G и С, а на 3'-конце - А и Т. На 3'-конце олигонуклеотидных праймеров располагается полиадениловый фрагмент (poly(A)). Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор Су5 присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции BHQ3 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ОТ-ПЦР-РВ [7, 8]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран Су5 с длиной волны максимальной флуоресценцией 670 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ3 с длиной волны максимального поглощения при 672 нм и возможном диапазоне гашения 620-730 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».Primers for the cDNA template were selected in accordance with a number of general rules, which are reflected in the works of B. Deiman and R. Sooknanan [7, 8]. The lengths of the Upstream 5'-NF-RV-97-quant-primer, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer and 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe are 22, 23 and 26 a.i., which meets the requirements (20-30 n.a.) [7, 8]. The molecular weight of the oligonucleotides Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer and 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe is 6873; 7024 and 7829 (excluding fluorophore and glow suppressor), respectively. The percentage of G and C in the Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer and 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3 -probe is 45, 48 and 42%, respectively, which is normal (acceptable 40-60%) [7, 8, 9, 10]. At the 5'-end of the primers and probe, there is a predominance of G and C, and at the 3'-end - A and T. At the 3'-end of the oligonucleotide primers there is a polyadenyl fragment (poly (A)). Primers and probe were purified on polyacrylamide gel and high performance liquid chromatography, respectively. The nucleotide sequence of the probe is not complementary to the oligonucleotide primers. There are no 4 or more identical nucleotides in a row in the chain of primers and probe. The Cy5 fluorophore is attached to the 5 'end, and the fluorescence quencher BHQ3 is attached to the 3' end. These conditions correspond to the requirements for oligonucleotide primers and a molecular probe that are involved in RT-PCR-RT [7, 8]. Cy5 with a maximum fluorescence wavelength of 670 nm was chosen as a fluorescent dye. To quench the glow, a BHQ3 fluorescence quencher was used with a wavelength of maximum absorption at 672 nm and a possible quenching range of 620-730 nm. In other words, a suitable “fluorophore-quencher” pair was selected.

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя.When analyzing the nucleotide sequences of the oligonucleotides, it was found that the formation of “hairpins” is not typical for the primers and the probe, and also no 3'-complementarity and sites annealing towards themselves were revealed.

Проведено определение температур плавления (Tm) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет очень важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ОТ-ПЦР-РВ вируса бешенства штамма РВ-97. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли несколько методов. Один из них -метод, учитывающий концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO) с применением формулы [9, 11]:Melting temperatures (T m ) were determined for oligonucleotide primers and probe. Accurate determination of the melting point plays a very important role in molecular biological research, including the selection of DNA primers and a probe for RT-PCR-RT of the rabies virus strain PB-97. Several methods have been used to estimate the melting temperature of oligonucleotides. One of them is a method that takes into account the concentration of K + ions and dimethyl sulfoxide (DMSO) using the formula [9, 11]:

Figure 00000001
Figure 00000001

где: [К+] - концентрация ионов калия (М),where: [K + ] - concentration of potassium ions (M),

[% DMSO] - количество диметилсульфооксида (%),[% DMSO] - amount of dimethyl sulfoxide (%),

G - количество остатков гуанозинтрифосфата,G - the amount of guanosine triphosphate residues,

С - количество остатков цитидинтрифосфата.C is the amount of cytidine triphosphate residues.

Данный метод не является высокоточным, но он позволяет приблизительно оценить температуру плавления олигонуклеотидов.This method is not highly accurate, but it allows an approximate estimate of the melting temperature of oligonucleotides.

Другой метод, который применяли в работе, высокоточный и основан на модели ближайших соседей (nearest neighbour) с применением расчетной формулы [12, 13]:Another method used in this work is highly accurate and based on the nearest neighbor model using the calculation formula [12, 13]:

Figure 00000002
Figure 00000002

где: dH - дифференциал энтропии (ккал/моль),where: dH - entropy differential (kcal / mol),

dG - дифференциал энергии Гиббса (ккал/моль),dG - Gibbs energy differential (kcal / mol),

dS - дифференциал энтальпии (кал/°К⋅моль),dS - enthalpy differential (cal / ° K⋅mol),

С - концентрация олигонуклеотида (М),C is the concentration of the oligonucleotide (M),

L - длина олигонуклеотида,L is the length of the oligonucleotide,

[К+] -концентрация ионов калия (М),[K + ] -concentration of potassium ions (M),

ln - натуральный логарифм.ln is the natural logarithm.

В данной формуле учитывается длина олигонуклеотида (L), концентрация ионов калия ([К+]=5⋅10-2M), газовая постоянная (R=1,987 кал/К⋅моль), концентрация олигонуклеотида в (с=2⋅10-7M), значения энтропии (dH) (в ккал/моль) и энтальпии (dS) (в кал/°К⋅моль). Значения dH и dS вычисляли в соответствии с общеизвестными формулами и термодинамическими параметрами для ближайших соседей (NN) пар нуклеотидов при концентрации NaCl 1М [12, 13]. Расчеты термодинамических параметров проводили при условии, что концентрация NaCl 1 M, температура 25°С и значение водородного показателя рН 7,0.This formula takes into account the length of the oligonucleotide (L), the concentration of potassium ions ([K + ] = 5⋅10 -2 M), the gas constant (R = 1.987 cal / K⋅mol), the concentration of the oligonucleotide in (c = 2⋅10 - 7 M), values of entropy (dH) (in kcal / mol) and enthalpy (dS) (in cal / ° K⋅mol). The dH and dS values were calculated in accordance with well-known formulas and thermodynamic parameters for the nearest neighbors (NN) nucleotide pairs at a NaCl concentration of 1M [12, 13]. Calculations of thermodynamic parameters were carried out under the condition that the NaCl concentration is 1 M, the temperature is 25 ° C and the pH value is 7.0.

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления [11] разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и зонда представлены в таблице 3. Из данных таблицы 3 видно, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера составили 173,0 ккал/моль, 27 ккал/моль, 454,4 кал/(°К⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера составили 185,6 ккал/моль, 30,4 ккал/моль, 484,4 кал/(°К⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда составили 212,0 ккал/моль, 33,8 ккал/моль, 558,2 кал/(°К⋅моль), соответственно. Данные значения были необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда составили 53, 58 и 58°С, соответственно. Исходя из полученных данных температура отжига (Та) примерно на 1-5°С ниже Tm.Physical, thermodynamic constants and calculation of melting temperatures [11] of the developed oligonucleotide DNA primers and probe are presented in Table 3. From the data in Table 3 it can be seen that the entropy, Gibbs energy and enthalpy for Upstream-5'-NF-RV-97-quant- primer were 173.0 kcal / mol, 27 kcal / mol, 454.4 cal / (° K⋅mol), respectively. The entropy, Gibbs energy and enthalpy for the Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer were 185.6 kcal / mol, 30.4 kcal / mol, 484.4 cal / (° K⋅mol), respectively. Entropy, Gibbs energy and enthalpy for the 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe were 212.0 kcal / mol, 33.8 kcal / mol, 558.2 cal / (° K⋅mol), respectively. These values were required to calculate the melting temperatures of the presented oligonucleotides. T m using the Nearest Neighbor Algorithm for Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer and 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe were 53, 58 and 58 ° C, respectively. Based on the data obtained, the annealing temperature (T a ) is approximately 1-5 ° C below T m .

При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO) Tm для Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда составили 60, 63 и 65°С. Иными словами, температура отжига праймеров и зонда должна быть ниже полученных значений на 1-5°С.When using a simpler method that takes into account the concentration of K + ions and dimethyl sulfoxide (DMSO) T m for Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer and 5 '-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe were 60, 63 and 65 ° C. In other words, the annealing temperature of the primers and the probe should be 1-5 ° C lower than the obtained values.

Экспериментально было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 52, 57, 57°С. Для проведения ОТ-ПЦР-РВ было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком N-гена вируса бешенства штамма РВ-97 при температуре 55°С.It was experimentally revealed that the annealing temperature of the considered oligonucleotides is 52, 57, 57 ° C. To carry out RT-PCR-RT, it was decided to hybridize the primers and the probe with the N-gene region of the rabies virus strain PB-97 at a temperature of 55 ° C.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса бешенства [6]. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [10]. Было выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.The sequences of the developed primers and the molecular probe were checked for unwanted coincidences with other nucleic acid sequences using the Rabies Virus Nucleic Acid Sequence Databank [6]. The primer and probe sequences were also analyzed for the presence of internal secondary structures using the nucleic acid folding program using the Mfold program [10]. It was found that for the developed oligonucleotides, no unwanted coincidences with other nucleic acid sequences, as well as the presence of internal secondary structures, were found.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем амплификаторе любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.The reaction was carried out in a detecting amplifier of any brand at temperature and time parameters, information about which is presented in Table 4.

Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 15 мин. Перед проведением ПЦР-РВ осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 5 мин. для активации фермента Taq-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы. ПЦР-РВ включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг праймеров и зонда, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 55°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 68°С в течение 30 с. Reverse transcription is carried out at 42 ° C for 15 minutes. Before carrying out RT-PCR, the mixture is preheated at a temperature of 95 ° C for 5 minutes. to activate the enzyme Taq-DNA polymerase and inactivate AMV-revertase. RT-PCR includes 3 substages: denaturation, annealing of primers and probe, elongation. Denaturation is carried out at a temperature of 95 ° C for 10 s, annealing of oligonucleotides - at a temperature of 55 ° C for 30 s, elongation - at a temperature of 68 ° C for 30 s.

Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации Ct, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f(Ct). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации кДНК. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде сигмоиды). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспонециальная кривая.The results of the RNA amplification reaction in real time are analyzed by evaluating and comparing the graphs of the fluorescent signal accumulation according to the values of the threshold amplification cycles C t , determined by crossing the threshold line and the logarithmic display of the function F1 = f (C t ). The results are taken into account in the reaction at each cycle. The device determines the level of fluorescence and builds a kinetic curve in the coordinates: fluorescence level - cDNA amplification cycle. If a specific cDNA template is present in the test sample, the kinetic curve has an exponential relationship (the graph is presented as a sigmoid). Samples that correspond to the sigmoids obtained in the analysis of the fluorescence of the dye included in the molecular probe are considered positive. Samples are considered negative if there is no exponential curve in their analysis.

Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10-1,/k-1), где k -угловой коэффициент в зависимости Ct=10^(-k⋅КИДвб рв-97+b), а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной модели рассчитывают значение КИД вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.The relationship between the threshold amplification cycle and the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine is established in the process of constructing an exponential function with base 10. The magnitude of the amplification reaction efficiency (E) is estimated by the formula: E = (10 -1, / k -1), where k is the angle coefficient depending on C t = 10 ^ (-k⋅KIDvb pv-97 + b) , as well as the accuracy of the approximation (R 2 ). On the basis of the developed model, the KID value of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine is calculated.

Пример 1. Выражение функции зависимости количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины и порогового цикла реакции амплификации в виде показательного уравнения с основанием 10.Example 1. Expression of the function of the dependence of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine and the threshold cycle of the amplification reaction in the form of an exponential equation with base 10.

Для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливали контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве которых использовали суспензии вируса бешенства указанного штамма с КИД: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ККИД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма РВ-97.To determine the number of infectious doses of the rabies virus of the PB-97 strain, a control panel of the standards of the rabies virus of the PB-97 strain was prepared, which were used as suspensions of the rabies virus of the indicated strain with KID: 10 0 , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 KKID 50 / cm 3 . A suspension of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells not infected with rabies virus and not infected with rabies virus strain PB-97 was used as negative controls.

На первом этапе исследования из всех контролей выделяли РНК вируса бешенства. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляли 350 мкл хаотропной смеси (3М мочевина и 3М гуанидинизотиоцианата в соотношении 1:1), перемешивали на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляли 20 мкл суспензии цеолита с диаметром частиц 350 мкл и инкубировали в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Суспензию центрифугировали при 1500 об/мин, удаляли супернатант и проводили промывание частиц от ингибиторов реакции амплификации кДНК с помощью 4М раствора гуанидинизотиоцаната, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Смесь центрифугировали при 1500 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Проводили отмывание цеолитовых частиц с применением 80% раствора изопропанола-2 в объеме по 450 мкл. Осуществляли центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию проводили дважды. Полученный осадок частиц цеолита с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты высушивали от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg2+, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3 минут для получения элюата РНК вируса бешенства штамма РВ-97. Содержимое пробирки центрифугировали при 14000 об/мин в течение 30 с и отбирали элюат РНК.At the first stage of the study, rabies virus RNA was isolated from all controls. To 100 μL of the suspension under study, 350 μL of a chaotropic mixture (3M urea and 3M guanidine isothiocyanate in a 1: 1 ratio) was added, and the mixture was vortexed for 5 min. To the resulting lysate, 20 μl of a zeolite suspension with a particle diameter of 350 μl was added and incubated with stirring on a vortex for 5 min. The suspension was centrifuged at 1500 rpm, the supernatant was removed, and the particles were washed from the inhibitors of the cDNA amplification reaction using 4M guanidine isothiocyanate solution, adding it to the sediment in a volume of 400 μL. The mixture was centrifuged at 1500 rpm, the supernatant was removed. The zeolite particles were washed using an 80% solution of isopropanol-2 in a volume of 450 μl. The contents of the tube were centrifuged under the same conditions. The operation was performed twice. The resulting precipitate of zeolite particles with adsorbed nucleic acid molecules was dried from alcohol residues using a dry solid-state thermostat at a temperature of 60 ± 2 ° C for 8-10 min. To the dried sediment, 50 μL of TE buffer (10 mM tris (oxymethyl) aminomethane, 1 mM ethylenediamine tetraacetate, pH 7.3) free of RNases and Mg 2+ ions was added, the contents of the tube were heated at a temperature of 60 ± 2 ° C for 3 minutes to obtain the eluate of the RNA virus of the rabies virus strain PB-97. The contents of the tube were centrifuged at 14000 rpm for 30 s, and the RNA eluate was collected.

На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов РНК вируса бешенства штамма РВ-97 из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (l=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (фиг. 1, таблица 5).At the next stage of the study, using spectral analysis in the radiation of ultraviolet light, the degree of purity of the obtained eluates of the RNA virus of the rabies virus strain PB-97 from the dilutions of the standard was assessed. RNA samples were scanned in quartz cuvettes (l = 10 mm) at a temperature of 23-25 ° C and extinction values were recorded in the range from 205 to 325 nm every 2 nm, recording the RNA absorption spectrum using the Specrtrum v. 5.0 (Fig. 1, table 5).

По результатам анализа стандартов выявили, что значения OD205-259 и OD261-325 не превышали OD260, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (фиг. 1) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициентов экстинкции (R1) для стандартов приближены к норме 2,000 (R1=1,994-2,000), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не наблюдалось, так как R1 не превышал 2,000. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и гуанидинизотиоцианатом, поскольку значения коэффициента экстинкции (R2) приближены к норме 2,000 и соответствовали 1,998-2,000. Учитывая, что при замещении 1% РНК на углеводы значение R2 уменьшается на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисахаридных примесей составило не более 1%, что допустимо. Разрушения РНК в экстрактах данным методом не обнаружено. Таким образом, экстракты РНК вируса бешенства, выделенные из стандартов, характеризовались высокой степенью чистоты [5].According to the results of the analysis of the standards, it was revealed that the values of OD 205-259 and OD 261-325 did not exceed OD 260 , which is a sign of a high degree of purity of the obtained RNA eluates (n = 3). From the data of the spectral study of the standards, the absence of pronounced peaks on the graphs (Fig. 1) at wavelengths 205, 235, 270, 280 and 320 nm was noted, which indicated the almost complete absence of contamination of RNA extracts with impurities of phospholipids, polysaccharides and residues of guanidine isothiocyanate, polypeptides and large conglomerates, respectively. The values of the extinction coefficients (R 1 ) for the standards are close to the norm of 2,000 (R 1 = 1.994-2,000), which confirms the absence of DNA and the presence of only trace amounts of protein impurities. Nucleic acid degradation and the presence of free nucleotides in the eluates were not observed, since R 1 did not exceed 2,000. Viral RNA extracts are not contaminated with polysaccharides and guanidine isothiocyanate, since the values of the extinction coefficient (R 2 ) are close to the norm of 2.000 and corresponded to 1.998-2.000. Considering that when 1% of RNA is replaced by carbohydrates, the value of R 2 decreases by 0.002, the presence of polysaccharide impurities in the obtained extracts was no more than 1%, which is permissible. The destruction of RNA in the extracts was not detected by this method. Thus, the rabies virus RNA extracts isolated from the standards were characterized by a high degree of purity [5].

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса бешенства штамма РВ-97 проводили ОТ-ПЦР-РВ для исследования стандартов. Для постановки реакции готовили реакционную смесь в соответствии с данными таблицы 1. Постановку реакции осуществляли при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.After evaluating the degree of purity of the obtained RNA extract of the rabies virus strain PB-97, RT-PCR-RT was carried out to study the standards. To set up the reaction, a reaction mixture was prepared in accordance with the data in Table 1. The reaction was set up at temperature and time parameters, information about which is presented in Table 4.

Результаты ОТ-ПЦР-РВ анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации Ct, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f(Ct). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Полученные данные отражены на фиг.2 и выражены в виде показательной функции с основанием 10: КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040). Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10-1/k-1) (k брали из функции Ct=10^(-k⋅КИДвб рв-97+b)), а также достоверность аппроксимации (R2). Эффективность реакции амплификации составила 99,99%, достоверность аппроксимации - 0,9927, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [2].The results of RT-PCR-RT were analyzed by evaluating and comparing the graphs of the accumulation of the fluorescent signal according to the values of the threshold amplification cycles C t , determined by crossing the threshold line and the logarithmic display of the function F1 = f (C t ). A relationship was established between the threshold amplification cycle and the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine in the process of constructing an exponential function with base 10. The data obtained are shown in Fig. 2 and expressed as an exponential function with base 10: KID WB PB-97 = 10 ^ (-0.3012⋅Ct + 10.2040) . The magnitude of the efficiency of the amplification reaction (E) was estimated by the formula: E = (10 -1 / k -1) (k was taken from the function C t = 10 ^ (-k⋅KIDvb pv-97 + b )), as well as the accuracy of the approximation ( R 2 ). The efficiency of the amplification reaction was 99.99%, the accuracy of the approximation was 0.9927, which corresponded to the generally accepted requirements for molecular biological test systems [2].

Пример 2. Тестирование способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ.Example 2. Testing of the method for indirect determination of the amount of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine using the RT-PCR-RT method.

Для анализа использовали 6 суспензий культурального вируса бешенства производственного штамма РВ-97 с количеством инфекционных доз вируса 106,50, 106,75, 107,00, 107,25, 107,50, 107,75 ККИД50/см3, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма РВ-97 с титром вируса 107,00 ККИД50/см3. Отрицательными контролями служили суспензии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, не зараженные вирусом бешенства, и не зараженные вирусом бешенства штамма РВ-97. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 1.For the analysis, 6 suspensions of the cultural rabies virus of the industrial strain PB-97 were used with the number of infectious doses of the virus 10 6.50 , 10 6.75 , 10 7.00 , 10 7.25 , 10 7.50 , 10 7.75 KKID 50 / cm 3 , respectively (samples No. 1-6). A suspension of the cultured rabies virus strain PB-97 with a virus titer of 10 7.00 KKID 50 / cm 3 was used as a positive control. Suspensions of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells not infected with rabies virus and not infected with rabies virus strain PB-97 served as negative controls. Test samples and control samples were examined in triplicate. The stages of RNA isolation, assessment of their purity and RT-PCR-RT were performed as described in example 1.

Из данных спектрального анализа (таблица 6) шести элюатов РНК проб вируса бешенства штамма РВ-97 следует, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 261-325 нм не превышали OD260, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах отсутствовали выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициенты экстинкции (R1) для проб вируса бешенства штамма РВ-97 составляли 1,996-2,000, что приближено к значению нормы 2,000 и означало высокую степень чистоты элюатов вирусной РНК, практически полное отсутствие белка. Коэффициенты экстинкции (R2) для проб вируса соответствовали значениям 1,996-2,000, что близко к норме 2,000 и обуславливало высокую чистоту элюатов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [5], и их можно использовать для дальнейших исследований.From the spectral analysis data (table 6) of six RNA eluates of rabies virus strain PB-97 it follows that the average extinction values at wavelengths 205-259 and 261-325 nm did not exceed OD 260 , in other words, the RNA eluates were characterized by a high degree of purity. The extracts were not contaminated with impurities of phospholipids, polysaccharides and guanidine isothiocyanate residues, polypeptides and large conglomerates, since there were no pronounced peaks in the spectrograms at λ 205, 235, 270, 280 and 320 nm, respectively. The extinction coefficients (R 1 ) for rabies virus samples of strain PB-97 were 1.996-2.000, which is close to the normal value of 2.000 and meant a high degree of purity of viral RNA eluates, almost complete absence of protein. The extinction coefficients (R 2 ) for the virus samples corresponded to the values of 1.996-2.000, which is close to the norm of 2.000 and determined the high purity of the eluates. Thus, the obtained preparations met the purity requirements [5], and they can be used for further research.

С полученными экстрактами РНК вируса бешенства штамма РВ-97 проводили ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ получали данные, которые отражены в таблице 6. Из данных таблицы 6 следует, что средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 12,30±0,01, 11,40±0,03, 10,57±0,03, 9,87±0,01, 8,94±0,01, 8,15±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной показательной функцией КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040) (R2=0,9927, E=99,99%), рассчитали средние значения КИД вируса бешенства для проб №1-6, которые составили 106,50, 106,77, 107,02, 107,23, 107,51, 107,75 ККИД50/см3, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 10,64±0,01, что соответствовало КИД вируса бешенства штамма РВ-97, равному 107,00 ККИД50/см3. Для отрицательных контролей сигмоиды не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.RT-PCR-RT was carried out with the obtained RNA extracts of the rabies virus strain PB-97. Using the developed method for the indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method, the data shown in Table 6 were obtained. From the data in Table 6, it follows that the average values of the threshold amplification cycles for the samples No. 1-6 were 12.30 ± 0.01, 11.40 ± 0.03, 10.57 ± 0.03, 9.87 ± 0.01, 8.94 ± 0.01, 8.15 ± 0 , 01, respectively. Using the developed exponential function KID VB PB-97 = 10 ^ (-0.3012⋅Ct + 10.2040) (R 2 = 0.9927, E = 99.99%), we calculated the average KID of the rabies virus for samples No. 1 -6, which amounted to 10 6.50 , 10 6.77 , 10 7.02 , 10 7.23 , 10 7.51 , 10 7.75 KKID 50 / cm 3 , respectively. For the positive control, the value of the threshold amplification cycle was 10.64 ± 0.01, which corresponded to the KID of the rabies virus strain PB-97, equal to 10 7.00 KKID 50 / cm 3 . For negative controls, sigmoids were not formed, which meant that there was no rabies virus in these samples.

Исследуемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии ВНК-21/2-17 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеинизотиоцианатом и в ОТ-ПЦР-РВ. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток и ОТ-ПЦР-РВ на 99-100%) (n=8). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.The studied samples and controls were also tested by the classical method of titration in the monolayer cell line BHK-21 / 2-17 using specific immunoglobulin G labeled with fluorescein isothiocyanate and in RT-PCR-RT. It was found that the data obtained using the developed method correlated with the titration method in cell culture and RT-PCR-RT by 99-100%) (n = 8). The results obtained indicated a high degree of accuracy of the developed method for indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method.

Таким образом, разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 позволяет оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.Thus, the developed method for the indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 makes it possible to estimate the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method.

Пример 3. Определение степени достоверности оценки количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ.Example 3. Determination of the degree of reliability of the assessment of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine using the RT-PCR-RT method.

Для анализа использовали 320 суспензий культурального вируса бешенства производственного штамма РВ-97 с количеством инфекционных доз вируса от 101,00 до 108,00 ККИД50/см3. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма РВ-97 с титром вируса 107,00 ККИД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма РВ-97. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 7.For the analysis, 320 suspensions of the cultural rabies virus of the industrial strain PB-97 with the number of infectious doses of the virus from 10 1.00 to 10 8.00 KKID 50 / cm 3 were used . A suspension of the cultured rabies virus strain PB-97 with a virus titer of 10 7.00 KKID 50 / cm 3 was used as a positive control. A suspension of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells not infected with rabies virus and not infected with rabies virus strain PB-97 was used as negative controls. Test samples and control samples were examined in triplicate. The stages of RNA isolation, assessment of their purity and RT-PCR-RT were performed as described in example 1. The results of the study are presented in table 7.

Из данных спектрального анализа 320 элюатов РНК проб вируса бешенства штамма РВ-97 следует, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 261-325 нм не превышали OD260, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах отсутствовали выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициенты экстинкции (R1) для проб вируса бешенства штамма РВ-97 составляли 1,990-2,001, что приближено к значению нормы 2,000 и означало высокую степень чистоты элюатов вирусной РНК, практически полное отсутствие белка. Коэффициенты экстинкции (R2) для проб вируса бешенства штамма РВ-97 соответствовали значениям 1,998-2,002, что близко к норме 2,000 и обуславливало высокую чистоту элюатов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [5], и их можно использовать для дальнейших исследований.From the data of spectral analysis of 320 RNA eluates of rabies virus strain PB-97, it follows that the average extinction values at wavelengths 205-259 and 261-325 nm did not exceed OD 260 , in other words, the RNA eluates were characterized by a high degree of purity. The extracts were not contaminated with impurities of phospholipids, polysaccharides and guanidine isothiocyanate residues, polypeptides and large conglomerates, since there were no pronounced peaks in the spectrograms at λ 205, 235, 270, 280 and 320 nm, respectively. The extinction coefficients (R 1 ) for rabies virus samples of strain PB-97 were 1.990-2.001, which is close to the normal value of 2.000 and meant a high degree of purity of viral RNA eluates, almost complete absence of protein. Extinction coefficients (R 2 ) for rabies virus samples of strain PB-97 corresponded to the values of 1.998-2.002, which is close to the norm of 2.000 and determined the high purity of the eluates. Thus, the obtained preparations met the purity requirements [5], and they can be used for further research.

С полученными экстрактами РНК вируса бешенства штамма РВ-97 проводили ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ получили данные, результат обработки которых отражен в таблице 7. Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной показательной функциейRT-PCR-RT was carried out with the obtained RNA extracts of the rabies virus strain PB-97. Using the developed method for the indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method, the data were obtained, the processing result of which is reflected in Table 7. The interpretation of the results was carried out using the developed exponential function

КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040) (R2=0,9927, E=99,99%) с получением значений КИДВБ РВ-97 для каждой из 320 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 10,64±0,01, что соответствовало КИД вируса бешенства штамма РВ-97, равному 107,00 ККИД50/см3. Для отрицательных контролей сигмоиды не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.KID VB RV-97 = 10 ^ (-0.3012⋅Ct + 10.2040) (R 2 = 0.9927, E = 99.99%) with obtaining the values of KID VB RV-97 for each of 320 samples. For the positive control, the value of the threshold amplification cycle was 10.64 ± 0.01, which corresponded to the KID of the rabies virus strain PB-97, equal to 10 7.00 KKID 50 / cm 3 . For negative controls, sigmoids were not formed, which meant that there was no rabies virus in these samples.

Исследуемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии ВНК-21/2-17 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеинизотиоцианатом и в ОТ-ПЦР-РВ. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99,5-100% для 108,0-7,0 ККИД50/см3 (n=64), на 98-99,5% для 107,0-4,0 ККИД50/см3 (n=64), на 97-98,5% для 104,0-3,0 ККИД50/см3 (n=64), на 94-98% для 103,0-2,0 ККИД50/см3 (n=64), на 93-98% для 102,0-1,0 ККИД50/см3 (n=64). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.The studied samples and controls were also tested by the classical method of titration in the monolayer cell line BHK-21 / 2-17 using specific immunoglobulin G labeled with fluorescein isothiocyanate and in RT-PCR-RT. It was found that the data obtained using the developed method correlated with the titration method in cell culture by 99.5-100% for 10 8.0-7.0 CCID 50 / cm 3 (n = 64), at 98-99, 5% for 10 7.0-4.0 KKID 50 / cm 3 (n = 64), by 97-98.5% for 10 4.0-3.0 KKID 50 / cm 3 (n = 64), by 94-98% for 10 3.0-2.0 KKID 50 / cm 3 (n = 64), by 93-98% for 10 2.0-1.0 KKID 50 / cm 3 (n = 64). The results obtained indicated a high degree of accuracy of the developed method for indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method.

Таким образом, разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 позволяет с высокой степенью достоверности оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.Thus, the developed method for the indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 makes it possible to estimate with a high degree of reliability the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 позволяет с высокой степенью достоверности оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.Example 4. Determination of the analytical sensitivity of the test system developed for the method of indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 allows to estimate with a high degree of reliability the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR method. RV.

Для определения аналитической чувствительности разработанной тест-системы для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливали калибровочную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97 с КИД: 100, 100,5, 101,0, 101,5, 102,0, 102,5, 103,0, 104,0, 105,0, 106,0, 107,0, 108,0 ККИД50/см3. Испытуемые контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 7, в которой отражен сравнительный анализ определения КИД вируса бешенства штамма РВ-97 разработанным способом в сравнении с данными прототипного метода. Выявлено, что с достоверностью ≥98,5% разработанным способом определены КИД вируса бешенства штамма РВ-97 со значениями от 103,0 до 108,0 ККИД50/см3, с достоверностью 93-98% - с КИД от 101,0 до 103,0 ККИД50/см3. Наиболее часто для производства аттенуированных антирабических вакцин применяют суспензии вируса бешенства штамма РВ-97 с КИД более 106,50 ККИД50/см3, следовательно, для данных образцов достоверность определения количества инфекционных доз вируса составляла 99,5-100%.To determine the analytical sensitivity of the developed test system for the method for indirectly determining the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97, a calibration panel of the standards of the rabies virus strain PB-97 was prepared with KID: 10 0 , 10 0.5 , 10 1.0 , 10 1, 5 , 10 2.0 , 10 2.5 , 10 3.0 , 10 4.0 , 10 5.0 , 10 6.0 , 10 7.0 , 10 8.0 KKID 50 / cm 3 . Test control samples were tested in five replicates. Stages of RNA isolation, assessment of their purity and RT-PCR-RT, as described in example 1. The results of the study are presented in table 7, which reflects a comparative analysis of the determination of the KID of the rabies virus strain PB-97 by the developed method in comparison with the data of the prototype method ... It was revealed that with a reliability of ≥98.5%, the developed method determined the KID of the rabies virus strain PB-97 with values from 10 3.0 to 10 8.0 KKID 50 / cm 3 , with a reliability of 93-98% - with a KID of 10 1 , 0 to 10 3.0 KKID 50 / cm 3 . Most often, for the production of attenuated rabies vaccines, suspensions of the rabies virus strain PB-97 with a KID of more than 10 6.50 KKID 50 / cm 3 are used , therefore, for these samples, the reliability of determining the number of infectious doses of the virus was 99.5-100%.

Таким образом, аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ составляет не менее 101,00 ККИД50/см3 с достоверностью результатов исследования 93-100%.Thus, the analytical sensitivity of the test system developed for the method of indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method is at least 10 1.00 KKID 50 / cm 3 with the reliability of the results research 93-100%.

Пример 5. Оценка специфичности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.Example 5. Evaluation of the specificity of the test system developed for the method of indirect determination of the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method.

Для оценки специфичности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ, исследовали суспензии вируса бешенства штаммов РВ-97, ВНИИЗЖ, CVS-11, вируса ящура штамма А/Забайкальский/13, инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, весенней виремии карповых, инфекционного некроза поджелудочной железы. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял 106,0 ККИД50/см3. Исследования проводили в трех повторностях.To assess the specificity of the test system developed for the method for indirectly determining the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine by the RT-PCR-RT method, suspensions of the rabies virus strains PB-97, ARRIAH, CVS-11, virus foot and mouth disease strain A / Zabaikalsky / 13, infectious necrosis of hematopoietic tissue of salmonids, spring viremia of cyprinids, infectious necrosis of the pancreas. The number of infectious doses of viruses in suspensions was 10 6.0 KKID 50 / cm 3 . The studies were carried out in triplicate.

Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 1. Выделенные экстракты РНК характеризовались высокими показателями степени чистоты, поскольку коэффициенты экстинкции R1 и R2 находились в диапазоне 1,996-2,000, что соответствовало требованиям [5].The stages of RNA isolation, assessment of their purity and RT-PCR-RT were performed as described in example 1. The isolated RNA extracts were characterized by high levels of purity, since the extinction coefficients R 1 and R 2 were in the range of 1.996-2.000, which corresponded to the requirements [5].

В ходе ОТ-ПЦР-РВ с тест-системой, специфичной только для участка N-гена гена вируса бешенства штамма РВ-97, наблюдали построение сигмоид накопления флуоресцентного сигнала только для штамма вируса бешенства штамма РВ-97. Для проб, содержащих другие штаммы вируса бешенства и другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,0125 у.е.) (таблица 8). Иными словами, разработанная тест-система и предложенный способ являются специфичными по отношению к вирусу бешенства штамма РВ-97.In the course of RT-PCR-RT with a test system specific only for the N-gene region of the rabies virus gene of strain PB-97, the construction of a sigmoid accumulation of a fluorescent signal was observed only for the strain of the rabies virus strain PB-97. For samples containing other strains of the rabies virus and other viruses, the formation of exponential curves was not observed, and they did not go beyond the threshold level of the fluorescent signal (0.0125 cu) (Table 8). In other words, the developed test system and the proposed method are specific for the rabies virus strain PB-97.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность снизить время проведения анализа сырья аттенуированной антирабической вакцины для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 до 4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чистоту РНК вируса бешенства штамма РВ-97; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование. В предлагаемом изобретении между количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 и пороговым циклом амплификации установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации (R=0,9927) и эффективностью амплификации 99,99%. Разработанная математическая модель КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040) дает возможность оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для производства аттенуированной антирабической вакцины.The main advantages of the proposed invention is the ability to reduce the time of analysis of the raw material of the attenuated rabies vaccine to determine the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 to 4 hours; eliminate the likelihood of contamination; to increase the purity of the RNA of the rabies virus strain PB-97; increase the specificity and sensitivity of the assay; reduce the cost of research. In the proposed invention between the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 and the threshold amplification cycle, a relationship is established, reflected in the form of an exponential function with a base 10 with a high accuracy of approximation (R = 0.9927) and an amplification efficiency of 99.99%. The developed mathematical model KID VB PB-97 = 10 ^ (-0.3012⋅Ct + 10.2040) makes it possible to estimate the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in raw materials for the production of an attenuated rabies vaccine.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с применением оригинальных специфических олигонуклеотидов и с последующим применением разработанной математической модели.The proposed invention makes it possible to quickly and with a high degree of reliability determine the number of infectious doses of rabies virus strain PB-97 in raw materials for an attenuated antirabies vaccine based on RT-PCR-RT using original specific oligonucleotides and with subsequent application of the developed mathematical model.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»:Sources of information taken into account in the preparation of the description of the invention to the application for the grant of a patent of the Russian Federation for the invention "Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain PB-97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by the method of reverse transcription and polymerase chain reaction in real time":

1. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 3.1.17.-P. 578-612.1. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 3.1.17.-P. 578-612.

2. Груздев K.H., Метлин A.E. Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019.-394 с.2. Gruzdev K.H., Metlin A.E. Animal rabies. - Vladimir: FGBI "ARRIAH", 2019.-394 p.

3. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.3. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.

4. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Hansen C.L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.4. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Hansen C. L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.

5. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 02.11.2019).5. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Electronic resource] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Date of treatment 11/02/2019).

6. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 15.12.2019).6. GenBank. [Electronic resource] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Date of access: 15.12.2019).

7. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.7. Deiman B., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.

8. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.8. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.

9. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.9. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.

10. The RNA Institute college of arts and scienceuniversity at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/forml.cgi (Дата обращения: 11.01.2020).10. The RNA Institute college of arts and scienceuniversity at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Electronic resource] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/forml.cgi (Date of access: 01/11/2020).

11. Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Дата обращения: 19.12.2019).11. Molecular oligocalculator. [Electronic resource] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Date of access: 19.12.2019).

12. Nicolas von Ahsen, Carl Т. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.12. Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg 2+ , deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.

13. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4.-P. 1460-1465.13. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (eng.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4.-P. 1460-1465.

Figure 00000003
Figure 00000003

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Figure 00000006
Figure 00000006

Figure 00000007
Figure 00000007

Figure 00000008
Figure 00000008

Figure 00000009
Figure 00000009

Figure 00000010
Figure 00000010

Claims (18)

1. Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что в качестве гомологичных N-гену вируса бешенства штамма РВ-97 оригинальных олигонуклеотидов используют Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер с нуклеотидной последовательностью GGT-GAA-GCT-AGA-CTG-TGA-AGA-A, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер с нуклеотидной последовательностью GCG-AAT-CTA-CTC-TGT-CGC-ATG-AA и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд с нуклеотидной последовательностью Cy5-CGC-CNC-CCC-TTT-AAG-TTT-GCT-TTA-TT-BHQ3, и включающий следующие стадии:1. A method for indirectly determining the number of infectious doses of rabies virus strain PB-97 in raw materials for an attenuated rabies vaccine by the method of reverse transcription and polymerase chain reaction in real time, characterized in that the original oligonucleotides are homologous to the N gene of the rabies virus strain PB-97 use Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer with nucleotide sequence GGT-GAA-GCT-AGA-CTG-TGA-AGA-A, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-primer with nucleotide sequence sequence GCG-AAT-CTA-CTC-TGT-CGC-ATG-AA and 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe with nucleotide sequence Cy5-CGC-CNC-CCC-TTT-AAG-TTT- GCT-TTA-TT-BHQ3, and includes the following stages: - подготавливают калибровочную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве положительного контроля используют суспензии с количеством инфекционных доз: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ККИД50/см3, а в качестве отрицательного контроля используют суспензии клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, не зараженные вирусом бешенства любого штамма и вирусом бешенства штамма РВ-97;- prepare a calibration panel of standards of the rabies virus strain PB-97, as a positive control using suspensions with the number of infectious doses: 10 0 , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 KCID 50 / cm 3 , and as a negative control, cell suspensions from the kidney of a newborn Syrian hamster BHK-21 / SUSP / ARRIAH, not infected with the rabies virus of any strain and the rabies virus of the PB-97 strain, are used; - выделяют РНК вируса бешенства штамма РВ-97 из сырья для аттенуированной антирабической вакцины, образцов отрицательных и положительных контролей;- RNA of the rabies virus strain PB-97 is isolated from raw materials for the attenuated rabies vaccine, samples of negative and positive controls; - элюаты РНК добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:5;- RNA eluates are added to the mixture of components for RT-PCR-RT in a ratio of 1: 5; - проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией ДНК-ампликонов с помощью флуоресцентного детектора, анализируют полученные данные;- carry out RT-PCR-RT followed by detection of DNA amplicons using a fluorescent detector, analyze the data obtained; - определяют величину порогового цикла амплификации;- determine the value of the threshold amplification cycle; - устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины в виде показательной функции с основанием 10;- establish the relationship between the threshold amplification cycle and the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 in the raw material for the attenuated rabies vaccine in the form of an exponential function with base 10; - оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) и достоверность аппроксимации (R2);- evaluate the magnitude of the effectiveness of the amplification reaction (E) and the accuracy of the approximation (R 2 ); - рассчитывают значение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИДВБ РВ-97) в образцах сырья для аттенуированной антирабической вакцины на основе разработанной математической модели: КИДВБ РВ-97=10^(-0,3012⋅Ct+10,2040), (R2=0,9927, E=99,99%), где R2 обозначает достоверность аппроксимации, а Е обозначает эффективность амплификации.- calculate the value of the number of infectious doses of the rabies virus strain RV-97 (KID VB RV-97 ) in samples of raw materials for attenuated anti-rabies vaccine based on the developed mathematical model: KID VB RV-97 = 10 ^ (- 0.3012⋅Ct + 10, 2040) , (R 2 = 0.9927, E = 99.99%), where R 2 denotes the accuracy of the approximation, and E denotes the amplification efficiency. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие компоненты: Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд, каждый - по 5 пМ, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) - по 0,20 мМ, MgCl2 - 2 мМ, Taq-буферный раствор Colorless Flexi (× 5) - 20% от объема реакционной смеси, AMV-ревертаза - 10 ед., Taq-ДНК-зависимая ДНК-полимераза - 10 ед.2. The method according to claim 1, characterized in that the mixture of components for RT-PCR-RT includes the following components: Upstream-5'-NF-RV-97-quant-primer, Downstream-5'-NR- RV-97-quant-primer and 5'-NP-RV-97-quant-Cy5 / BHQ3-probe, each - 5 pM, a mixture of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) - 0.20 mM each, MgCl 2 - 2 mM, Taq - buffer solution Colorless Flexi (× 5) - 20% of the volume of the reaction mixture, AMV-revertase - 10 units, Taq-DNA-dependent DNA polymerase - 10 units. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОТ-ПЦР-РВ проводят с соблюдением следующих режимов:3. The method according to claim 1, characterized in that RT-PCR-RT is carried out in compliance with the following regimes: - обратная транскрипция: температура 42°С в течение 15 мин;- reverse transcription: temperature 42 ° С for 15 min; - предварительная денатурация: температура 95°С в течение 5 мин;- preliminary denaturation: temperature 95 ° С for 5 minutes; - ПЦР-РВ: денатурация - температура 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - температура 55°С в течение 30 с, элонгация - температура 68°С в течение 30 с.- RT-PCR: denaturation - temperature 95 ° С for 10 s, annealing of oligonucleotides - temperature 55 ° С for 30 s, elongation - temperature 68 ° С for 30 s. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 снижается до 4 ч.4. The method according to claim. 1, characterized in that the time for the analysis of vaccinated suspensions to determine the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 is reduced to 4 hours. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличивается степень чистоты РНК вируса бешенства штамма РВ-97 за счет применения частиц цеолита диаметром 350 нм в присутствии хаотропной смеси, содержащей 3М мочевины и 3М гуанидинизотиоцианат, в соотношении 1:1.5. The method according to claim 1, characterized in that the degree of purity of the RNA virus of rabies strain PB-97 is increased by using zeolite particles with a diameter of 350 nm in the presence of a chaotropic mixture containing 3M urea and 3M guanidine isothiocyanate in a 1: 1 ratio. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличивается специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда.6. The method according to claim 1, characterized in that the specificity of the assay is increased due to the use of highly specific original primers and a molecular probe. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ по определению количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 имеет аналитическую чувствительность не менее 10 ККИД50/см3.7. The method according to claim 1, characterized in that the analysis for determining the number of infectious doses of the rabies virus strain PB-97 has an analytical sensitivity of at least 10 KKID 50 / cm 3 .
RU2020136135A 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time RU2761535C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020136135A RU2761535C1 (en) 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020136135A RU2761535C1 (en) 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2761535C1 true RU2761535C1 (en) 2021-12-09

Family

ID=79174335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020136135A RU2761535C1 (en) 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2761535C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2812859C1 (en) * 2023-08-14 2024-02-05 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Method of differentiating arriah-g333 genome of genetically modified strain from pb-97 vaccine strain of rabies virus using real-time polymerase chain reaction with high-resolution peak analysis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2511440C2 (en) * 2012-09-17 2014-04-10 Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Method of quantitative determination of fixed rabies virus "moskva 3253"
RU2575088C1 (en) * 2014-10-02 2016-02-10 Федеральное бюджетное государственное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") Set of synthetic oligonucleotide primers for identification of rna of rabies virus and method of identification of rna of rabies virus by means of synthetic oligonucleotide primers in polymerase chain reaction with reverse transcription (rt-pcr)
RU2722671C1 (en) * 2019-10-01 2020-06-02 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Bhk-21/susp/arriah - continuous suspension subline of newborn syrian hamster kidney cells, intended for reproduction of foot-and-mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, aujeszky's disease in producing antiviral vaccines, as well as for making diagnostic and preventive veterinary biopreparations

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2511440C2 (en) * 2012-09-17 2014-04-10 Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Method of quantitative determination of fixed rabies virus "moskva 3253"
RU2575088C1 (en) * 2014-10-02 2016-02-10 Федеральное бюджетное государственное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") Set of synthetic oligonucleotide primers for identification of rna of rabies virus and method of identification of rna of rabies virus by means of synthetic oligonucleotide primers in polymerase chain reaction with reverse transcription (rt-pcr)
RU2722671C1 (en) * 2019-10-01 2020-06-02 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Bhk-21/susp/arriah - continuous suspension subline of newborn syrian hamster kidney cells, intended for reproduction of foot-and-mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, aujeszky's disease in producing antiviral vaccines, as well as for making diagnostic and preventive veterinary biopreparations

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEIMAN В., et al., Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification, Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179. *
ГРУЗДЕВ K. H. и др., Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ "ВНИИЗЖ", 2019. - 394 с. *
ГУЛЮКИН А. М., Бешенство. Современная система анализа и контроля эпизоотического процесса на территории Российской Федерации, авто диссертации, Москва 2018, с.12-14. *
ГУЛЮКИН А. М., Бешенство. Современная система анализа и контроля эпизоотического процесса на территории Российской Федерации, автореферат диссертации, Москва 2018, с.12-14. DEIMAN В., et al., Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification, Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2812859C1 (en) * 2023-08-14 2024-02-05 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Method of differentiating arriah-g333 genome of genetically modified strain from pb-97 vaccine strain of rabies virus using real-time polymerase chain reaction with high-resolution peak analysis

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2439951T3 (en) Multiplex detection and quantification of internally controlled microbial nucleic acids
KR102018201B1 (en) Method and kit for detecting batcoronavirus using real-time PCR
JP2018046818A (en) Methods for determining amount of nucleic acid of interest in unprocessed sample
CN110872637A (en) Reagent for identifying African swine fever gene deletion vaccine, detection method and application
JP6962927B2 (en) Compositions and methods for detecting Zika virus
Katsarou et al. Viral detection: past, present, and future
Viedma et al. Optimization of qRT-PCR assay for zika virus detection in human serum and urine
Broeders et al. A new multiplex RT-qPCR method for the simultaneous detection and discrimination of Zika and chikungunya viruses
La Fauce et al. TaqMan real-time PCR for detection of hepatopancreatic parvovirus from Australia
RU2761535C1 (en) Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time
RU2756557C1 (en) Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology
JP2016019495A (en) Nucleic acid amplification technique
RU2755925C1 (en) Method for mediated determination of the titer of infectious activity of the rabies virus of the arriah strain in raw materials for an inactivated rabies vaccine by means of pcr in real time
CN111254217A (en) Method for detecting norovirus
RU2756472C1 (en) Method for mediated determination of the infectious titer of the rabies virus in non-inactivated raw materials for rabies vaccines in transcriptional amplification and detection of reaction products using the beacon technology
RU2760436C1 (en) Method for the indirect determination of the concentration of the immunogenic rnp complex of rabies virus in raw materials for rabies vaccines by amplification and hybridization-fluorescent detection of dna amplicons
RU2809221C1 (en) Method for indirect determining of the titer of infectious activity of feline calicivirus in raw materials for vaccine using real-time pcr
RU2815533C1 (en) Method of indirect determining of titre of infectious activity of causative agent of canine distemper in raw materials for vaccines using method of reverse transcription and amplification reaction in real time
RU2812858C1 (en) Method of indirect determination of titer of infectious activity of canine mastadenovirus in raw materials for vaccines using real-time pcr
CN109983138A (en) For detecting the composition and method of BK virus
RU2700479C1 (en) Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products
RU2821895C1 (en) Method for indirect determination of concentration of ribonucleoprotein of industrial strain "rich" of coronavirus infection agent in raw material for cultural vaccines according to quantitative assessment cycle for amplicons of target region of m-gene of coronavirus
RU2808641C1 (en) Method of indirect determination of titer of infectious activity of causative agent of infectious feline rhinotracheitis fhv in non-inactivated raw materials for vaccines using polymerase chain reaction and quantitative hybridization-fluorescence detection in real time
KR102040303B1 (en) A primer and a probe for detecting biological agents, a kit comprising the same, and a detection method using the same
RU2809224C1 (en) Method of indirect determining of titer of infectious activity of canine alpha-coronavirus production strain named rich in raw materials for vaccine using real-time rt-pcr