RU2722671C1

RU2722671C1 - Bhk-21/susp/arriah - continuous suspension subline of newborn syrian hamster kidney cells, intended for reproduction of foot-and-mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, aujeszky's disease in producing antiviral vaccines, as well as for making diagnostic and preventive veterinary biopreparations

Info

Publication number: RU2722671C1
Application number: RU2019131190A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Анатольевич Лозовой; Марина Николаевна Гусева; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Максим Игоревич Доронин; Борис Леонидович Манин; Анжела Алексеевна Шишкова; Вячеслав Алексеевич Стариков; Максим Александрович Шевченко; Алексей Валерьевич Борисов
Priority date: 2019-10-01
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2020-06-02

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, namely to the transversal suspension subline kidney cells of the newborn Syrian hamster BHK-21/SUSP/ARPJAH. Cell line is intended for reproduction of foot-and-mouth disease virus, rabies, parainfluenza-3, Aujeszky's disease in the production of antiviral vaccines, as well as for making diagnostic and preventive veterinary biopreparations and deposited in the Specialized collection of cell cultures of the Core facilities centre "Collection of vertebrate cell cultures" of the Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences on April 23, 2019 under number RKKK(P) 797 D.

EFFECT: invention widens the range of equipment.

8 cl, 11 dwg, 6 tbl, 6 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, а именно к получению и описанию основных характеристик перевиваемой клеточной сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка (Baby Hamster Kidney, BHK-21/SUSP/ARRIAH), предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.The invention relates to the field of biotechnology and virology, in particular to the preparation and description of the main characteristics of transplantable cell subline from the kidney of a newborn Syrian hamster (Baby Hamster Kidney, BHK-21 / SUSP / ARRIAH), intended for the reproduction of foot and mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, Aujeszky’s disease in the production of antiviral vaccines, as well as for the manufacture of diagnostic and prophylactic veterinary biologics.

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13 получена в 1961 году в Англии И. Максферсоном и М. Стокером [1] и распространилась по всему миру. В последующем были получены следующие аналоги данной культуры клеток:The transplanted cell line of the kidney of the newborn Syrian hamster VNK-21 clone 13 was obtained in England in 1961 by I. Maxpherson and M. Stoker [1] and spread throughout the world. Subsequently, the following analogues of this cell culture were obtained:

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита [2];1. VNK-21/13 - subline transplantable kidney cells of a newborn Syrian hamster, obtained at the Institute of Poliomyelitis [2];

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС [3].2. VNK21 / 13 - a subline of transplantable cells of the kidney of a newborn Syrian hamster, obtained at the NIIPS [3].

3. ВНК-21/2-17b - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученный во ВНИЯИ (Всероссийский научно-исследовательский ящурный институт) [4, 5] (наиболее близкий прототип).3. VNK-21 / 2-17b - transplantable monolayer-suspension clone of kidney cells of a newborn Syrian hamster obtained at the All-Russian Scientific Research Institute of Scientific Research and Development (All-Russian Scientific Research Institute of Foot-and-Mouth Institute) [4, 5] (the closest prototype).

4. ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства, получена в ФГУП «Щелковский биокомбинат» [6];4. VNK-21 / 13-02 - transplantable monolayer-suspension subline of kidney cells of a newborn Syrian hamster, intended for the reproduction of foot and mouth disease virus and rabies virus, obtained in the FSUE "Schelkovo Biocombine" [6];

5. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства, получена в ФГУП «Щелковский биокомбинат» [7].5. VNK-21 / 13-13 - transplantable monolayer-suspension subline of kidney cells of a newborn Syrian hamster, intended for reproduction of foot and mouth disease virus types A, O, C, Asia-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 and the virus rabies strain Schelkovo-51, used for the manufacture of antiviral vaccines against foot and mouth disease and rabies, was obtained in the FSUE "Schelkovo Biocombine" [7].

Эти и другие линии клеток почки новорожденного сирийского хомячка используют для культивирования вирусов ящура и бешенства. Используемые перевиваемые клеточные линии различают по морфологии, кариологии, ростовым свойствам, особенностям культивирования, способам поддержания и чувствительности к вирусам.These and other newborn Syrian hamster kidney cell lines are used for the cultivation of foot and mouth disease viruses and rabies. Used transplantable cell lines are distinguished by morphology, karyology, growth properties, cultivation features, methods of maintenance and sensitivity to viruses.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13 [2].Characterization of the subline of transplanted kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21/13 [2].

Клеточная сублиния ВНК-21/13 адаптирована к выращиванию в пристеночных условиях. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до температуры 37°С.The cell subline VNK-21/13 is adapted for cultivation under near-wall conditions. Cells are separated from the glass using a 0.25% trypsin solution, heated to a temperature of 37 ° C.

Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 клеточный монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 суток. В культуральном флаконе объемом 1,5 м³ накапливается 40-45 млн клеток.Growth properties. When reseeding with a coefficient of 1: 2-1: 3, a cell monolayer is formed 2-3 days after explantation. Subject to correction of the pH of the medium to 7.5-7.6, the formed monolayer is stored up to 5-6 days. In a culture vial with a volume of 1.5 m ³ accumulates 40-45 million cells.

Морфология. Клетки фибробластоподобные.Morphology. Fibroblast-like cells.

Кариология. Культура клеток ВНК-21/13 резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.Karyology. The cell culture of BHK-21/13 is sharply heteroploid with variability of chromosome sets from 32 to 78. The stem line (modal class) is composed of cells with 40 chromosomes (32-34%), 4-6% of the cells in the population retain a diploid set of chromosomes.

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10% от общего объема. Восстановление после хранения в жидком азоте происходит на 85-95%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 2-3 пассажах.The freezing medium is a culture medium supplemented with dimethyl sulfoxide (DMSO) in an amount of 10% of the total volume. Recovery after storage in liquid nitrogen occurs at 85-95%. The cell line restores the original growth properties in 2-3 passages.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК21/13 [3].Characterization of the subline of transplanted kidney cells of the newborn Syrian hamster BHK 21/13 [3].

Среда культивирования. Для суспензионного выращивания клеточной линии ВНК21/13 применяют среду Игла MEM, обогащенную серином (120 мг/дм³) и L-глутамином (610 мг/дм³) с добавлением 0,25% гидролизата лактоальбумина (ГЛА) и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС). При пристеночном культивировании применяют среду Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови КРС (рН среды 7,5-7,6).The cultivation medium. For suspension growth of the BHK 21/13 cell line, the Needle MEM medium enriched in serine (120 mg / dm ³ ) and L-glutamine (610 mg / dm ³ ) with the addition of 0.25% lactoalbumin hydrolyzate (GLA) and 10% large blood serum is used cattle (cattle). In parietal cultivation, MEM Needle medium is used with 10% serum of cattle (pH 7.5-7.6).

Способ поддержания. Клеточная линия ВНК21/13 поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. При этом клетки сохраняют способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до температуры 37°С.The way to maintain. The BHK21 / 13 cell line is maintained in suspension conditions in reactors of various capacities. At the same time, cells retain the ability to grow in parietal cultures. In this case, at the next passaging, the cell layer is dispersed with a 0.25% trypsin solution, heated to a temperature of 37 ° C.

Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс.клеток/см³ обеспечивается 3-4 кратный прирост популяции на 3-4 сутки. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки и сохраняет целостность и жизнеспособность не более 3 суток.Growth properties. In suspension culture, when sowing at a concentration of 500 thousand cells / cm ³ provides 3-4 times the population growth for 3-4 days. With a reseeding coefficient of 1: 3, a monolayer is formed in the parietal cultures for 2-3 days and retains integrity and viability for no more than 3 days.

Морфология. Клетки эпителиоподобные.Morphology. The cells are epithelial.

Кариология. Популяция клеток ВНК21/13 гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).Karyology. The BHK21 / 13 cell population is heteroploid with a spread in the number of chromosomes in the cells from 20 to 78. The modal class consists of cells with a diploid set of chromosomes (16-24%).

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10% от общего объема. Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте составляет 88-96%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 1-2 пассажах.The freezing medium is a culture medium supplemented with dimethyl sulfoxide (DMSO) in an amount of 10% of the total volume. Cell viability after storage in liquid nitrogen is 88-96%. The cell line restores the original growth properties in 1-2 passages.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17b [4, 5].Characterization of the subline of transplanted kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / 2-17b [4, 5].

Данная клеточная линия является наиболее близким прототипом по отношению к заявляемому изобретению. Сублиния ВНК-21/2-17b получена во ВНИЯИ [4, 5] и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.This cell line is the closest prototype in relation to the claimed invention. The subline VNK-21 / 2-17b was obtained at the All-Russian Research Institute of Nuclear Research [4, 5] and is stored in liquid nitrogen at passage level 13.

Среда культивирования. Для культивирования данной линии клеток применяют 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), 8 витаминов группы В, 5% сыворотки крови КРС (рН среды 6,8-7,2).The cultivation medium. For the cultivation of this cell line, 0.25% muscle hydrolyzate is used in Earle's solution (for monolayer cultures) and Hanks solution for suspension cultivation with the addition of 5 amino acids (arginine, glutamine, meteonin, cystine, series), 8 B vitamins, 5% serum blood of cattle (pH 6.8-7.2).

Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают - отъемно-доливным методом, монослойную - в культуральных сосудах любой емкости. При очередном пересеве для диспергирования применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.The way to maintain. Suspension culture is grown - by the detachable-refill method, monolayer - in culture vessels of any capacity. At the next reseeding, a mixture of 0.25% trypsin and 0.02% versene solution in a ratio of 1: 1 is used for dispersion.

Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура ВНК-21/2-17b дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн клеток/см³. При монослойном выращивании с посевной концентрации 0,05-0,10 млн клеток/см³ монослой формируется на 2-3 сутки.Growth properties. After 48 hours of cultivation in suspension, the BHK-21 / 2-17b culture gives a 6-7-fold increase, reaching a final concentration of 2.3-2.8 million cells / cm ³ . When monolayer growing with a seed concentration of 0.05-0.10 million cells / cm ^{3 the} monolayer is formed on 2-3 days.

Морфология. В суспензии культура ВНК-21/2-17b представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из эпителиальных и фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.Morphology. In suspension, the BHK-21 / 2-17b culture is represented by single, shiny, rounded cells. The monolayer population consists of epithelial and fibroblast-like cells with a transparent homogeneous cytoplasm.

Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%).Karyology. The heteroploid culture. The modal class is represented by cells with 42 chromosomes, constituting 28-40% in the population).

Среда для замораживания представляет собой культуральную среду с добавлением диметилсульфоксида (DMSO) в количестве 10%) от общего объема. Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клеточная линия восстанавливает исходные ростовые свойства на 2-3 пассажах.The freezing medium is a culture medium supplemented with dimethyl sulfoxide (DMSO) in an amount of 10%) of the total volume. Cell viability after storage in liquid nitrogen is 85-90%. The cell line restores the original growth properties in 2-3 passages.

Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия-1.Susceptibility to viruses. Cell culture is sensitive to foot and mouth disease virus type A, O, C, Asia-1.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 [6].Characterization of the subline of transplanted kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / 13-02 [6].

Перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 получена на Щелковском биокомбинате и предназначена для репродукции вируса ящура, вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления вакцин против ящура и бешенства [6].The transplanted monolayer-suspension subline of kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / 13-02 was obtained at the Shchelkovo Biocombine and is intended for the reproduction of foot-and-mouth disease virus, rabies virus of the Shchelkovo-51 strain used for the manufacture of vaccines against foot and mouth disease and rabies [6].

Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, накопление которого в среднем составляет 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенных компонентов до 1,00 мкг/см³. Клетки чувствительны также к вирусу бешенства, обеспечивая репродукцию вируса со средним титром инфекционной активности 6,50 lg ЛД₅₀/см³.BHK-21 / 13-02 cells are characterized by high sensitivity to foot and mouth disease virus, the accumulation of which is on average 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ , with the content of immunogenic components up to 1.00 μg / cm ³ . Cells are also sensitive to rabies virus, providing reproduction of the virus with an average titer of infectious activity of 6.50 lg LD ₅₀ / cm ³ .

Сублиния ВНК-21/13-02 адаптирована к суспензионному способу культивирования с использованием ростовой среды на основе солевого раствора Хенкса, содержащей 5-7% сыворотки крови КРС, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина (ГЛА) с добавлением пяти аминокислот: L-аргинина 0,042 г/дм³; L-глутамина 0,584 г/дм³; L-тирозина 0,020 г/дм³; L-триптофана 0,015 г/дм³; L-цистина 0,032 г/дм³ и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034 г/дм³, пантотенат кальция (В₅) 0,0034 г/дм³, пиридоксаль-HCl 0,0034 г/дм³, тиамин (B₁) 0,0034 г/дм³, миоинозит 0,0068 г/дм³, никотинамид 0,0034 г/дм³, рибофлавин (В₂) 0,00034 г/дм³, фолиевая кислота (В₉) 0,0034 г/дм³.Subline VNK-21 / 13-02 is adapted to a suspension cultivation method using a growth medium based on Hanks saline solution containing 5-7% cattle serum, 0.125% muscle protein hydrolyzate and 0.125% lactalbumin hydrolyzate (GLA) with the addition of five amino acids: L-arginine 0.042 g / dm ³ ; L-glutamine 0.584 g / dm ³ ; L-tyrosine 0.020 g / dm ³ ; L-tryptophan 0.015 g / dm ³ ; L-cystine 0.032 g / dm ³ and seven B vitamins: choline chloride 0.0034 g / dm ³ , calcium pantothenate (B ₅ ) 0.0034 g / dm ³ , pyridoxal-HCl 0.0034 g / dm ³ , thiamine (B ₁ ) 0.0034 g / dm ³ , myoinositol 0.0068 g / dm ³ , nicotinamide 0.0034 g / dm ³ , riboflavin (B ₂ ) 0.00034 g / dm ³ , folic acid (B ₉ ) 0.0034 g / dm ³ .

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгломератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.Morphology. In suspension, the culture is represented by single rounded cells with a small number of conglomerates containing from 3 to 5 cells. In a monolayer population consists of fibroblast-like cells with a transparent homogeneous cytoplasm, sometimes a single cytoplasmic layer is formed without borders between cells with a large number of nuclei. The presence of 2-4 or more nuclear symplasts lying in isolation or in the structure of the cell layer is noted. Budding of nuclei from the total nuclear mass and the formation of micronuclei as a result of nuclear destruction are noted. Part of the cells is separated from the glass and grows in suspension.

Способы культивирования. Монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в культуральных флаконах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:9, нагретую до 37°С. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации. В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.Cultivation methods. A monolayer of BHK-21 / 13-02 cells is grown in culture bottles of any capacity. A mixture of 0.25% trypsin solution and 0.02% versene solution in a 1: 9 ratio, heated to 37 ° C, is used to disperse the cell formation during reseeding. Cells are removed by a centrifuge-free method and resuspended in a growth medium to a seed concentration. In suspension, the cell culture is grown by the weaning-refilling method for 48 hours to 10-50 consecutive passages.

Кариология. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с 44 хромосомами. Кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствует кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы.Karyology. In a monolayer culture, the number of chromosomes per cell varies from 31 to 98, cells with 44 chromosomes comprise the modal class (22%). The karyotype of VNK-21 / 13-02 cell suspension culture corresponds to the karyotype of the Syrian hamster, the range of variation in the number of chromosomes per cell is from 31 to 80, the modal class (36%) consists of cells containing 42 chromosomes.

Характеристика сублинии перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 [7].Characterization of the subline of transplanted kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / 13-13 [7].

Перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-13 предназначена для репродукции вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и вируса бешенства штамма Щелково-51, используемых для изготовления вакцин против ящура и бешенства [7].The transplantable monolayer-suspension subline of kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / 13-13 is intended for the reproduction of foot and mouth disease virus types A, O, C, Asia-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 and rabies virus of the Schelkovo- strain 51 used for the manufacture of vaccines against foot and mouth disease and rabies [7].

Клетки характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве около 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенного компонента до 1,50 мкг/см³ (в наиболее близком аналоге, с использованием культуры клеток ВНК 13/02 - до 1,00 мкг/см³). Для клеток данной сублинии характерна повышенная чувствительность к вирусу бешенства, репродукция которого позволяет достичь титров инфекционной активности 6,50-8,00 lg ЛД₅₀/см³.Cells are characterized by high sensitivity to foot and mouth disease virus, which accumulates in an amount of about 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ , when the content of the immunogenic component is up to 1.50 μg / cm ³ (in the closest analogue, using a cell culture of BHK 13/02 - up to 1.00 μg / cm ³ ). The cells of this subline are characterized by increased sensitivity to rabies virus, the reproduction of which allows to achieve titers of infectious activity of 6.50-8.00 lg LD ₅₀ / cm ³ .

Клетки сублинии ВНК-21/13-13 отличаются высоким индексом пролиферации, который при суспензионном культивировании к 48 часам составляет 6-8 при жизнеспособности клеток 95-98%. С помощью заявляемой су 6 линии получают на 50% больше конечного продукта по сравнению с аналогом (сублиния ВНК-21/13-02).Cells of the BHK-21 / 13-13 subline are characterized by a high proliferation index, which in suspension culture by 48 hours is 6-8 with a cell viability of 95-98%. Using the claimed su 6 lines get 50% more of the final product compared to the analogue (subline VNK-21 / 13-02).

Морфология. В суспензии сублиния ВНК-21/13-13 представлена одиночными фибробластоподобными клетками с прозрачной гомогенной цитоплазмой. Отмечается формирование отдельных конгломератов, состоящих из 5-10 клеток.Morphology. In the subline suspension, BHK-21 / 13-13 is represented by single fibroblast-like cells with a transparent homogeneous cytoplasm. The formation of individual conglomerates consisting of 5-10 cells is noted.

Кариология. Число диплоидных метафазных пластинок (2n=44) составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками, содержащими 30 хромосом, что составляет 43%.Karyology. The number of diploid metaphase plates (2n = 44) is 17% of the total. The spread in the number of chromosomes in culture cells ranges from 20 to 64, the modal class is represented by plates containing 30 chromosomes, which is 43%.

Способ культивирования. В суспензии культуру клеток выращивают в течение 48 часов до 50 последовательных пассажей.The method of cultivation. In suspension, a cell culture is grown for 48 hours to 50 consecutive passages.

Суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4, 40, 100, 600 и 2000 л с рабочими объемами 3, 30, 60, 450 и 1800 л, соответственно, при следующих параметрах:Suspension cultivation is carried out in reactors with a capacity of 4, 40, 100, 600 and 2000 l with working volumes of 3, 30, 60, 450 and 1800 l, respectively, with the following parameters:

- посевная концентрация - 0,4⋅10⁶-0,5⋅10⁶ клеток/см³;- inoculum concentration - 0.4⋅10 ⁶ -0.5⋅10 ⁶ cells / cm ³ ;

- скорость перемешивания - 25-40 об/мин;- mixing speed - 25-40 rpm;

- температура культивирования - 36,0-36,5°С;- cultivation temperature - 36.0-36.5 ° C;

- рН среды - 6,50-7,15;- pH of the medium is 6.50-7.15;

- аэрация путем барботирования воздухом в количестве 0,5-1,5 л воздуха/л суспензии.- aeration by sparging with air in an amount of 0.5-1.5 l of air / l of suspension.

Представленные выше сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка отличаются довольно высокими показателя интенсивности прироста и позволяют проводить репродукцию вирусов ящура и бешенства. При этом для промышленного получения культуральных вакцинных препаратов против ящура, бешенства, а также парагриппа-3 КРС и болезни Ауески требуется суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, обеспечивающая накопление вирусов с более высокими значениями титров инфекционной активности и количествами антигенных компонентов, определяющих такой важный показатель качества вакцин, как их иммуногенность. Прототипные клеточные линии почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13) позволяют получать вирус ящура с титрами инфекционной активности не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, вируса бешенства - 8,00 lg ЛД₅₀/см³. Концентрации иммуногенных компонентов в получаемых вирусных суспензиях с применением данных клеточных сублиний составляют для вируса ящура не более 1,5 мкг/см³ [7]. Сведения о результатах культивации вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в тексте патентов на сублинии клеток ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13 не обнаружены.The subcells of the kidney cells of the newborn Syrian hamster presented above have rather high growth rates and allow the reproduction of foot and mouth disease viruses and rabies. Moreover, for the industrial production of culture vaccines against foot and mouth disease, rabies, as well as parainfluenza-3 cattle and Aujeszky’s disease, suspension subline cells of the kidney of a newborn Syrian hamster are required, which ensures the accumulation of viruses with higher titers of infectious activity and quantities of antigenic components that determine such an important indicator quality of vaccines, as their immunogenicity. Prototypical cell lines of the kidney of a newborn Syrian hamster (VNK-21/13, VNK-21/13, VNK-21 / 2-17b, VNK-21 / 13-02 and VNK-21 / 13-02) allow to obtain foot-and-mouth disease virus with titers of infectious activity not more than 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ , rabies virus - 8.00 lg LD ₅₀ / cm ³ . The concentration of immunogenic components in the resulting viral suspensions using these cell sublines for the FMD virus is not more than 1.5 μg / cm ³ [7]. Information on the results of the cultivation of bovine parainfluenza-3 viruses and Aujeszky’s disease in the text of patents on the sublimation of cells BHK-21/13, BHK 21/13, BHK-21 / 2-17b, BHK-21 / 13-02 and BHK-21 / 13- 13 not detected.

В связи с этим целесообразно получить альтернативную сублинию клеток почки новорожденного сирийского хомячка, позволяющую удовлетворить нужды производственного процесса по репродукции вируса ящура с титрами инфекционной активности выше 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и накоплением иммуногенных компонентов более 1,5 мкг/см³, вируса бешенства с титрами выше 8,00 ЛД₅₀/см³, а также вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески с титрами инфекционной активности 6,00 lg ТЦД₅₀/см³ и выше.In this regard, it is advisable to obtain an alternative subline of kidney cells of a newborn Syrian hamster, which allows satisfying the needs of the production process for the reproduction of foot and mouth disease virus with titers of infectious activity above 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ and the accumulation of immunogenic components of more than 1.5 μg / cm ³ , rabies virus with titers above 8.00 LD ₅₀ / cm ³ , as well as parainfluenza-3 cattle viruses and Aujeszky's disease with titers of infectious activity of 6.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ and above.

Задачей изобретения являлось получение новой перевиваемой суспензионной сублинии клеток, позволяющей по сравнению с прототипным вариантом значительно повысить титр инфекционной активности вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески и увеличить концентрацию их иммуногенных компонентов при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.The objective of the invention was to obtain a new transplantable suspension subline of cells, which allows, in comparison with the prototype version, to significantly increase the titer of the infectious activity of foot and mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3 cattle, Aujeszky’s disease and increase the concentration of their immunogenic components in the production of antiviral vaccines, as well as for the manufacture of diagnostic and preventive veterinary biological products.

Данная задача решена благодаря созданию перевиваемой суспензионной сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRI АН, предназначенной для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески и производства противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.This problem was solved by creating a transplantable suspension subcell of kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / SUSP / ARRI AN, intended for the reproduction of foot and mouth disease viruses, rabies, cattle influenza-3, Aujeszky's disease and the production of antiviral vaccines, as well as for the production of diagnostic and preventive veterinary biological products.

Полученная сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH характеризуется высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается за 8-15 ч в количестве до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³, при содержании иммуногенных компонентов 0,50-1,95 мкг/см³ с 1,0 млн клеток. При использовании культуры клеток ВНК-21/13-02 (аналог) титр вируса ящура составляет до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³, количество иммуногенных компонентов - до 1,00 мкг/см³ со всей популяции клеток. Применяя сублинии клеток ВНК-21/13-13 и ВНК-21/2-17b (аналоги), титр инфекционности вируса ящура достигает также 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ с концентрацией иммуногенных компонентов до 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток.The resulting subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells is characterized by high sensitivity to foot and mouth disease virus, which accumulates over 8-15 hours in an amount of up to 8.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ , when the content of immunogenic components is 0.50-1.95 μg / cm ³ with 1.0 million cells. When using a VNK-21 / 13-02 cell culture (analogue), the foot-and-mouth virus titer is up to 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ , the amount of immunogenic components is up to 1.00 μg / cm ³ from the whole cell population. Using subcells of BHK-21 / 13-13 and BHK-21 / 2-17b cells (analogues), the foot-and-mouth disease virus infectivity titer also reaches 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ with a concentration of immunogenic components up to 1.50 μg / cm ³ s entire cell population.

Сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проявляет высокую чувствительность к заражению вирусом бешенства и обеспечивает за 48 ч накопление вируса с титрами до 8,50 lg ЛД₅₀/см³. Прототипная клеточная сублиния ВНК-21/13-02 позволяет проводить репродукцию возбудителя бешенства с конечными значениями титра инфекционной активности до 6,50 lg ЛД₅₀/см³, а линии ВНК-21/13-13 и BHK-21/2-17b - до 8,00 lg ЛД₅₀/см³.The subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells is highly sensitive to rabies virus infection and provides for 48 hours of virus accumulation with titers up to 8.50 lg LD ₅₀ / cm ³ . The prototype cell subline VNK-21 / 13-02 allows the reproduction of rabies pathogen with a final value of the titer of infectious activity up to 6.50 lg LD ₅₀ / cm ³ , and the lines VNK-21 / 13-13 and BHK-21 / 2-17b - up to 8.00 lg LD ₅₀ / cm ³ .

Клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRI АН дает возможность проводить репродукцию вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески с титрами инфекционности до 6,00 и 7,80 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. В текстах патентов на прототипные клеточные сублинии из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13) информация о получении вирусов парагриппа-3 КРС и болезни Ауески не обнаружена.Cell subline VNK-21 / SUSP / ARRI AN makes it possible to reproduce parainfluenza-3 cattle viruses and Aujeszky's disease with infectivity titers of up to 6.00 and 7.80 lg TCD ₅₀ / cm ³ , respectively. In the texts of patents for prototype cell sublines from the kidney of a newborn Syrian hamster (VNK-21/13, VNK21 / 13, VNK-21 / 2-17b, VNK-21 / 13-02 and VNK-21 / 13-13) information on obtaining viruses of parainfluenza-3 cattle and Aujeszky’s disease were not detected.

С помощью заявляемой сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH для производства противоящурных вакцин и для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов возможно получать антигенный материал с титром на 1,00 lg ТЦД₅₀/см³ выше (до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³) и концентрацией иммуногенных компонентов в 2-3 раза выше (до 1,95 мкг/см³ с 1 млн кл.) по сравнению с аналогами (не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток). Предложенная сублиния позволяет проводить репродукцию вируса бешенства с титром на 0,50 lg ЛД₅₀/см³ выше (до 8,50 lg ЛД₅₀/см³) по сравнению с прототипными линиями (не более 8,00 lg ТЦД₅₀/см³), а также получать вирусы парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в количествах 6,00 и 7,80 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.Using the inventive sub-cell of BHK-21 / SUSP / ARRIAH for the production of FMD vaccines and for the manufacture of diagnostic and prophylactic veterinary biological products, it is possible to obtain antigenic material with a titer of 1.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ higher (up to 8.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ ) and the concentration of immunogenic components is 2-3 times higher (up to 1.95 μg / cm ³ from 1 million cells) compared with analogues (not more than 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ and 1.50 μg / cm ³ from the entire cell population). The proposed subline allows the reproduction of rabies virus with a titer of 0.50 lg LD ₅₀ / cm ³ higher (up to 8.50 lg LD ₅₀ / cm ³ ) compared with prototype lines (not more than 8.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ ) as well as receiving parainfluenza-3 cattle viruses and Aujeszky’s disease in amounts of 6.00 and 7.80 lg TCD ₅₀ / cm ³ , respectively.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:The invention is reflected in the graphic images:

Фиг. 1 - Экспоненциальный характер роста концентрации клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с затуханием пролиферации после 48 часов суспензионного культивирования.FIG. 1 - The exponential nature of the increase in the concentration of subline cells of BHK-21 / SUSP / ARRIAH with the attenuation of proliferation after 48 hours of suspension cultivation.

Фиг. 2 - Кариограмма популяции клеток сублинии ВНК-21/2-17b на момент патентования (1986 г.).FIG. 2 - Karyogram of the cell population of BHK-21 / 2-17b subline at the time of patenting (1986).

Фиг. 3 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/2-17b (1 пассаж).FIG. 3 - Morphology of the cells of the subline of BHK-21 / 2-17b (1 passage).

Фиг. 4 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/2-17b (2 пассаж).FIG. 4 - Morphology of the cells of the subline of BHK-21 / 2-17b (2 passage).

Фиг. 5 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора стеклянного объемом 50 дм³ (количество исследований (N)=50).FIG. 5 - Karyogram of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells. Analysis of the population from a glass cultivator with a volume of 50 dm ³ (number of studies (N) = 50).

Фиг. 6 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора металлического объемом 1000 дм³(N=50).FIG. 6 - Karyogram of subcell cells of BHK-21 / SUSP / ARRIAH. Analysis of the population from a metal cultivator with a volume of 1000 dm ³ (N = 50).

Фиг. 7 - Кариограмма клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Анализ популяции из культиватора металлического объемом 2000 дм³ (N=50).FIG. 7 - Karyogram of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells. Analysis of the population from a metal cultivator with a volume of 2000 dm ³ (N = 50).

Фиг. 8 - Морфология клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.FIG. 8 - Cell morphology of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline.

Фиг. 9 - Визуализация ядер суспензионных клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при окрашивании акридиновым оранжевым.FIG. 9 - Visualization of the nuclei of suspension cells of the subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH when stained with acridine orange.

Фиг. 10 - ДНК-гистограмма клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH (А) и ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип) (В).FIG. 10 is a DNA histogram of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells (A) and BHK-21 / 2-17b (the closest prototype) (B).

Фиг. 11 - Изменение кратности прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, рекультивированных после криоконсервирования (указаны средние значения кратности прироста, N=30, р<0,005).FIG. 11 - Change in the growth rate of cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline, reclaimed after cryopreservation (average values of the growth rate are indicated, N = 30, p <0.005).

Заявляемые преимущества изобретения обусловлены генетическими характеристиками созданной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая была получена путем перманентного культивирования в суспензии сублинии клеток ВНК-21/2-17b на протяжении 30 лет, а также подбором ростовой среды оригинального состава.The claimed advantages of the invention are due to the genetic characteristics of the created subcell of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells, which was obtained by permanent cultivation in a suspension of sub cells of BHK-21 / 2-17b cells for 30 years, as well as the selection of the growth medium of the original composition.

Перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH адаптирована к суспензионному способу выращивания с использованием ростовой среды на основе раствора Хенкса, в который добавляют 15-20 см³/дм³ 10%-ого гидролизата белков крови, 5% сыворотки крови КРС и 2-10 см³/дм³ 10%-ого перевара по Хоттингеру. Рецептура данной ростовой среды включает в себя также добавление 8 протеиногенных аминокислот: 128,3 мг/дм³ L-аргинина, 584,0 мг/дм³ L-глутамина, 7,6 мг/дм³ L-изолейцина, 26,4 мг/дм³ L-метионина, 12,6 мг/дм³ L-тирозина, 35,7 мг/дм³ L-треонина, 15,0 мг/дм³ L-триптофана, 32,0 мг/дм³ L-цистеина. В качестве моносахаров применяют глюкозу в количестве 4000 мг/дм мг/дм³. Состав ростовой среды включает в себя следующий витаминный комплекс: инозитол (6,0 мг/дм мг/дм³), никотинамид (3,0 мг/дм³), пантотенат кальция (3,0 мг/дм³), пиридоксаля гидрохлорид (3,0 мг/дм³), рибофлавин (0,3 мг/дм³), тиамин (3,0 мг/дм³), фолиевая кислота (3,0 мг/дм³), холина хлорид (3,0 мг/дм³). В качестве минеральных компонентов применяют следующие неорганические соли: калий фосфорнокислый (60,0 мг/дм³), калий хлористый (400,0 мг/дм³), кальций хлористый 6-водный (140,0 мг/дм³), магний сернокислый (200,0 мг/дм³), гидрокарбонат натрия (400,0 мг/дм³), дигидрофосфат натрия (150,0 мг/дм³), натрий хлористый (8000,0 мг/дм³) (таблица 1).The transplantable suspension subline of kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / SUSP / ARRIAH is adapted to the suspension method of growth using a growth medium based on Hanks solution to which 15-20 cm ³ / dm ^{3 of} 10% blood protein hydrolyzate is added, 5% serum of cattle and 2-10 cm ³ / dm ^{3 of a} 10% pass according to Hottinger. The formulation of this growth medium also includes the addition of 8 proteinogenic amino acids: 128.3 mg / dm ³ L-arginine, 584.0 mg / dm ³ L-glutamine, 7.6 mg / dm ³ L-isoleucine, 26.4 mg / dm ³ L-methionine, 12.6 mg / dm ³ L-tyrosine, 35.7 mg / dm ³ L-threonine, 15.0 mg / dm ³ L-tryptophan, 32.0 mg / dm ³ L-cysteine . As monosugars, glucose is used in an amount of 4000 mg / dm mg / dm ³ . The composition of the growth medium includes the following vitamin complex: inositol (6.0 mg / dm mg / dm ³ ), nicotinamide (3.0 mg / dm ³ ), calcium pantothenate (3.0 mg / dm ³ ), pyridoxal hydrochloride ( 3.0 mg / dm ³ ), riboflavin (0.3 mg / dm ³ ), thiamine (3.0 mg / dm ³ ), folic acid (3.0 mg / dm ³ ), choline chloride (3.0 mg / dm ³ ). The following inorganic salts are used as mineral components: potassium phosphate (60.0 mg / dm ³ ), potassium chloride (400.0 mg / dm ³ ), calcium chloride 6-water (140.0 mg / dm ³ ), magnesium sulfate (200.0 mg / dm ³ ), sodium bicarbonate (400.0 mg / dm ³ ), sodium dihydrogen phosphate (150.0 mg / dm ³ ), sodium chloride (8000.0 mg / dm ³ ) (table 1).

Преимуществом ростовой среды данного состава для культивирования клеток сублинии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH является использование жидкого гидролизата белков крови и перевара по Хоттингеру, которые обеспечивают богатый аминокислотный состав среды, а, следовательно, и более высокие ростовые свойства клеток. Проведен сравнительный анализ качественного и количественного аминокислотного состава используемой ростовой среды до и после добавления ГБК и перевара по Хоттингеру. Результаты исследования отражены в таблице 2, из которой следует, что готовая ростовая среда содержит больше L-аргинина на 21,62 мг/дм³, L-изолейцина на 150,00 мг/дм³, L-метионина на 28,86 мг/дм³, L-тирозина на 49,60 мг/дм³, L-треонина на 130,28 мг/дм³, L-триптофана на 38,20 мг/дм³, L-цистеина на 146,00 мг/дм³ по сравнению со средой без ГБК и перевара по Хоттингеру.The advantage of the growth medium of this composition for the cultivation of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells is the use of a liquid hydrolyzate of blood proteins and Hottinger digest, which provide a rich amino acid composition of the medium, and, therefore, higher growth properties of the cells. A comparative analysis of the qualitative and quantitative amino acid composition of the growth medium used before and after the addition of GBA and a Hottinger digest was performed. The results of the study are shown in table 2, from which it follows that the finished growth medium contains 21.62 mg / dm ³ more L-arginine, 150.00 mg / dm ³ L-isoleucine, 28.86 mg / L-methionine dm ³ , L-tyrosine at 49.60 mg / dm ³ , L-threonine at 130.28 mg / dm ³ , L-tryptophan at 38.20 mg / dm ³ , L-cysteine at 146.00 mg / dm ³ compared to a medium without GBK and a Hottinger rehearsal.

Полученная клеточная сублиния ВНК-21 /SUSP/ARRIAH депонирована 23 апреля 2019 г. в Институте цитологии РАН «Специализированная коллекция культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных»». Линии клеток присвоен номер: №РККК(П) 797 Д.The obtained cell subline VNK-21 / SUSP / ARRIAH was deposited on April 23, 2019 at the Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences "Specialized Collection of Cell Culture CCP" Collection of Vertebrate Cell Cultures "." Cell line assigned number: No. RKKK (P) 797 D.

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13 получена в 1961 году в Англии Максферсоном и Стокером. Путем селекции данной культуры клеток во ВНИЯИ (Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт) была получена клеточная сублиния ВНК-21/2-17b, из которой через 30 лет путем перманентного культивирования в суспензии получена новая сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH.The transplanted kidney cell line of the newborn Syrian hamster VNK-21 clone 13 was obtained in 1961 in England by Maxpherson and Stoker. By selection of this cell culture, the VNKI (All-Union Research Institute for Foot and Mouth Disease Institute) obtained the cell subline VNK-21 / 2-17b, from which 30 years later, by permanent cultivation in suspension, a new subline VNK-21 / SUSP / ARRIAH was obtained.

Морфологическая характеристика клеточной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.Morphological characteristics of the cell subline VNK-21 / SUSP / ARRIAH.

Клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании на субстрате не имеет постоянной формы, иными словами, ее можно охарактеризовать как «аморфная». В оптимальных условиях культивирования на клетках наблюдается большое количество высокоподвижных цитоплазматических выростов с динамикой в несколько минут; в суспензионном состоянии клетка характеризуется сферической формой с множеством микровыростов.Cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline when grown on a substrate does not have a constant shape, in other words, it can be described as “amorphous”. Under optimal cultivation conditions, a large number of highly mobile cytoplasmic outgrowths with a dynamics of several minutes are observed on the cells; in a suspension state, the cell is characterized by a spherical shape with many microgrowths.

Способы и условия культивирования клеточной сублинии BHK-21/SUSP/ARRIAH.Methods and conditions for culturing cell subline BHK-21 / SUSP / ARRIAH.

Суспензионное культивирование. Клетки су 6 линииSuspension cultivation. Su cell 6 lines

ВНК-21/SUSP/ARRIAH выращивают отъемно-доливным способом, раздельными циклами по 10-12 пассажей. При посевной концентрации 0,50-0,60 млн клеток/см через 48 часов культивирования в оптимальном режиме концентрация составляет 4,00-5,50 млн клеток/см. Иными словами, кратность прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH составляет 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%. В процессе культивирования проводится аэрация суспензии стерильным воздухом в количестве 0,5-1,7 л воздуха/л среды. Температура культивирования клеток составляет 37,0±0,5°С, Водородный показатель среды поддерживается в пределах 6,6-7,2 путем добавления 7,5%-ого раствора бикарбоната натрия. Общая тенденция суспензионного культивирования клеточной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 48 часов имеет стандартную динамику роста (экспоненциальный характер роста с затуханием пролиферации после 48 часов культивирования) (фиг. 1).VNK-21 / SUSP / ARRIAH is grown by the weaning-refilling method, in separate cycles of 10-12 passages. When the inoculum concentration of 0.50-0.60 million cells / cm after 48 hours of cultivation in the optimal mode, the concentration is 4.00-5.50 million cells / cm. In other words, the cell growth rate of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells is 6.67-11.00 with a cell viability of 96-99%. During the cultivation, the suspension is aerated with sterile air in an amount of 0.5-1.7 l of air / l of medium. The cell cultivation temperature is 37.0 ± 0.5 ° C. The pH of the medium is maintained within 6.6-7.2 by adding a 7.5% sodium bicarbonate solution. The general tendency of suspension cultivation of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell subline for 48 hours has standard growth dynamics (exponential growth with attenuation of proliferation after 48 hours of cultivation) (Fig. 1).

Следует отметить сформированную у клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH ацидофильность, толерантность к более низким значениям водородного показателя (рН<7,0) по сравнению с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b, клетки которой культивировали в среде с нейтральным и слабощелочным показателями рН.It should be noted the acidophilicity formed in the BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell line, tolerance to lower values of the hydrogen index (pH <7.0) compared with the prototype subline BHK-21 / 2-17b, the cells of which were cultured in a medium with neutral and slightly alkaline pH values.

Монослойное культивирование клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Суспензионные клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании в культуральных флаконах адгезируются в небольшом количестве на поверхности, не имеют постоянной формы и формируют цитоплазматические выросты разной длины с динамикой в несколько минут.Monolayer cell cultivation of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline. When grown in culture bottles, suspension cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline adhere to a small amount on the surface, do not have a constant shape and form cytoplasmic outgrowths of different lengths with a dynamics of several minutes.

Закономерности роста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.Patterns of cell growth of the subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH.

В начале логарифмической стадии роста активизируется синтетическая фаза (S) и уменьшается относительное количество диплоидных клеток. Пресинтетическая фаза (G1) стабилизируется и относительно уменьшается до конца культивирования. При этом увеличивается относительное количество тетраплоидных (G2) клеток и клеток, находящихся в метафазе (М).At the beginning of the logarithmic growth stage, the synthetic phase (S) is activated and the relative number of diploid cells decreases. The presynthetic phase (G1) is stabilized and relatively reduced until the end of cultivation. This increases the relative number of tetraploid (G2) cells and cells in metaphase (M).

В клеточном цикле популяции преобладает диплоидная фаза цикла (G1), на которую приходится 30 до 75% клеток в зависимости от условий культивирования. В фазе подготовки к митозу и митотического деления находится от 3,0 до 20% всей популяции. Количество крупноядерных и многоядерных клеток (>4n) увеличивается в начале и в конце стадии логарифмического роста, но количество их не превышает 2%.The diploid phase of the cycle (G1) predominates in the cell cycle of the population, accounting for 30 to 75% of the cells, depending on the cultivation conditions. In the phase of preparation for mitosis and mitotic division is from 3.0 to 20% of the entire population. The number of large and multinucleated cells (> 4n) increases at the beginning and at the end of the stage of logarithmic growth, but their number does not exceed 2%.

Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.Karyological characteristics of subline cells BHK-21 / SUSP / ARRIAH.

Сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH выделена из культуры ВНК-21/2-17b путем прохождения около 100 пассажей в суспензии в течение 30 лет, минуя монослойную стадию, вследствие чего изменилась кариологическая картина.The subnucleus of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells was isolated from the BHK-21 / 2-17b culture by passing about 100 passages in suspension for 30 years, bypassing the monolayer stage, as a result of which the karyological picture changed.

Кариологическое исследование сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили с применением метода Moorhead и др. [8]. После получения препарата с метафазными пластинками, производилось фотографирование 100 метафазных пластинок, далее их подсчет и составление кариограммы. По результатам исследования выяснили, что сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH образует неоднородную по кариологическим признакам популяцию клеток, в основном анеуплоидных. Модальный класс - 41 хромосома (32-40%), доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%, полиплоидов - менее 1%. Пределы изменчивости хромосом для суспензионных клеток данной сублинии составили 36-54. Представленная сублиния клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH отличается от прототипов по кариологическим показателям. Кариологическая характеристика для культуры ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип): модальное число хромосом 42 (28-40%), пределы изменчивости хромосом - 37-44. Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/13-02: модальное число хромосом 42, пределы изменчивости хромосом - 31-80 для суспензионных клеток; в монослойной культуре модальное число хромосом 44, пределы изменчивости хромосом - 31-98. Кариологическая характеристика клеток сублинии ВНК-21/13-13: число диплоидных метафазных пластинок 2n=44 составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками, содержащими 30 хромосом, что составляет 43% (таблица 3).A karyological study of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell subline was performed using the method of Moorhead et al. [8]. After receiving the drug with metaphase plates, 100 metaphase plates were photographed, then they were counted and a karyogram compiled. According to the results of the study, it was found that the subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells forms a population of cells, mainly aneuploid, that is heterogeneous in karyological characteristics. The modal class is 41 chromosomes (32-40%), the proportion of cells with the number of chromosomes 40-42 is 78-80%, polyploids - less than 1%. The limits of chromosome variation for suspension cells of this subline were 36–54. Presented subline cells VNK-21 / SUSP / ARRIAH differs from prototypes in karyological parameters. The karyological characteristic for the culture of BHK-21 / 2-17b (the closest prototype): the modal number of chromosomes is 42 (28-40%), the limits of chromosome variation are 37-44. The karyological characteristics of VLK-21 / 13-02 subline cells: modal number of chromosomes 42, limits of chromosome variability - 31-80 for suspension cells; in a monolayer culture, the modal number of chromosomes is 44, the limits of chromosome variability are 31-98. The karyological characteristic of VLK-21 / 13-13 subline cells: the number of diploid metaphase plates 2n = 44 is 17% of the total. The spread in the number of chromosomes in the cells of the culture ranges from 20 to 64, the modal class is represented by plates containing 30 chromosomes, which is 43% (table 3).

Видовая принадлежность клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Культура идентифицирована как ткань почки новорожденного сирийского хомячка, с помощью дифференциального С-окрашивания хромосом.The species affiliation of subline cells BHK-21 / SUSP / ARRIAH. The culture was identified as the kidney tissue of a newborn Syrian hamster using differential C-staining of chromosomes.

Криоконсервация и жизнеспособность клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH после криоконсервации. Для хранения суспензии клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при температуре -70°С используют пластиковые культуральные флаконы. Для длительного хранения при температуре -196°С применяют ампулы. Консервацию клеток осуществляют в криосреде (ростовая среда (состав отражен в таблице 1) с добавлением 7-10% этиленгликоля и 20% фетальной сыворотки КРС) в ампулах объемом 80 см³ с концентрацией клеток 20,0-30,0 млн/см³. До температуры -70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры -150°С - 10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (-196°С). Размораживание производят в температурном диапазоне 39-42°С в течение 2 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования на первом пассаже составляет 85-90%, затем увеличивается до 96-99%. После реконсервации клеток и выращивания непосредственно в суспензии (в ферментере) в течение первого пассажа происходит задержка пролиферации на сутки.Cryopreservation and viability of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells after cryopreservation. To store the cell suspension of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells at a temperature of -70 ° C, plastic culture bottles are used. For long-term storage at -196 ° C, ampoules are used. Cell preservation is carried out in a cryomedium (growth medium (the composition is shown in table 1) with the addition of 7-10% ethylene glycol and 20% fetal bovine serum) in ampoules of 80 cm ³ volume with a cell concentration of 20.0-30.0 million / cm ³ . To a temperature of -70 ° C, the cell suspension is cooled at a rate of 2 ° C / min, to a temperature of -150 ° C - 10 ° C / min, then the ampoules are placed in liquid nitrogen (-196 ° C). Defrosting is carried out in the temperature range of 39-42 ° C for 2 minutes. Cell viability after cryopreservation in the first passage is 85-90%, then increases to 96-99%. After cell preservation and growth directly in suspension (in the fermenter) during the first passage, there is a delay in proliferation for a day.

Описание способа получения сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве исходного материала использовали перевиваемую монослойно-суспензионный линию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 2-17b, полученную во ВНИЯИ в 1986 г. [4, 5]. Данная клеточная сублиния применялась в качестве производственной в течение 10-12 пассажей для получения суспензий с концентрациями клеток 3,5-4,0 млн клеток/см³. Для культивирования данных клеток была разработана ростовая среда оригинального состава (таблицы 1 и 2), содержащая 5% сыворотки крови КРС, 15-20 см³/дм³ гидролизата белков крови, 2-10 см³/дм³ перевара по Хоттингеру, 8 протеиногенных аминокислот (L-аргинин, L-глутамин, L-изолейцин, L-метионин, L-тирозин, L-треонин, L-триптофан, L-цистеин), глюкозу, комплекс витаминов и минеральных солей.Description of the method for producing subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells. A transplantable monolayer-suspension cell line of the kidney of the newborn Syrian hamster VNK-21 clone 2-17b, obtained at the All-Russian Scientific Research Institute in 1986, was used as the starting material [4, 5]. This cell subline was used as production for 10-12 passages to obtain suspensions with cell concentrations of 3.5-4.0 million cells / cm ³ . For the cultivation of these cells, a growth medium of the original composition was developed (Tables 1 and 2), containing 5% serum of cattle, 15-20 cm ³ / dm ^{3 of} hydrolyzed blood proteins, 2-10 cm ³ / dm ^{3 of} Hotter's digest, 8 proteinogenic amino acids (L-arginine, L-glutamine, L-isoleucine, L-methionine, L-tyrosine, L-threonine, L-tryptophan, L-cysteine), glucose, a complex of vitamins and mineral salts.

Клетки многократно подвергали криоконсервации с последующим размораживанием и выращиванием в данной ростовой среде до 13 пассажа. Для криоконсервирования применяли криосреду, представляющую собой ростовую среду (таблица 1) с добавлением 7-10% этиленгликоля и 20% фетальной сыворотки КРС.Cells were subjected to cryopreservation many times, followed by thawing and growing in this growth medium until passage 13. For cryopreservation, a cryomedium was used, which was a growth medium (table 1) with the addition of 7-10% ethylene glycol and 20% fetal cattle.

В течение 30 лет клеточная сублиния ВНК-21/2-17b прошла около 100 пассажей и преобразовалась в новую сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH, клетки которой отличаются однообразием морфологии и размера с высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 6,67-11,00) и количеством жизнеспособных клеток 96-99%.Over the course of 30 years, the BHK-21 / 2-17b cell subline went through about 100 passages and was transformed into the new BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline, the cells of which are characterized by uniform morphology and size with high proliferative activity (proliferation index was 6.67-11 , 00) and the number of viable cells 96-99%.

Клеточная сублиния прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности».Cell subline passed sterility control according to GOST 28085-89 “Biological preparations. The method of bacteriological control of sterility. "

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.

Пример 1. Морфологические исследования клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b.Example 1. Morphological studies of subline cells of BHK-21 / SUSP / ARRIAH in comparison with the prototype subline of BHK-21 / 2-17b.

Перевиваемая клеточная сублиния ВНК-21/2-17b более 30 лет культивировалась в суспензионных условиях без монослойной стадии. Перемежающиеся заморозки в больших ампулах объемом 100 см3 позволяли поддерживать популяции клеток в активном состоянии, без снижения пролиферативной активности (кратность прироста не менее 4-6) благодаря использованию ростовой среды модифицированного состава (таблицы 1, 2).The transplanted cell subline VNK-21 / 2-17b was cultured for more than 30 years under suspension conditions without a monolayer stage. Intermittent freezing in large ampoules with a volume of 100 cm3 made it possible to maintain cell populations in an active state without reducing proliferative activity (growth rate of at least 4-6) due to the use of a growth medium of modified composition (tables 1, 2).

На фиг. 3 показано морфологическое состояние клеток сублинии ВНК-21/2-17b на момент патентования (1986 г.). Морфология клеток была определена как аморфная, иными словами, при посеве на субстрат в первом пассаже клетки не имели постоянной формы, активно перемещались и только во время деления приобретали сферическую форму. На втором пассаже клетки данной сублинии полноценно адгезировались и принимали эпителиоподобную форму. После полного покрытия субстрата часть клеток переходила в суспензионное состояние (фиг. 4) и характеризовалась высокими показателями пролиферативной активности (кратность прироста составляла не менее 4-6).In FIG. Figure 3 shows the morphological state of the BHK-21 / 2-17b subline cells at the time of patenting (1986). The morphology of the cells was defined as amorphous, in other words, when plated on the substrate in the first passage, the cells did not have a constant shape, actively moved and only acquired a spherical shape during division. At the second passage, the cells of this subline fully adhered and assumed an epithelial-like form. After complete coverage of the substrate, part of the cells turned into a suspension state (Fig. 4) and was characterized by high proliferative activity (growth rate was at least 4-6).

В результате суспензионного культивирования в производстве клетки перевиваемой сублинии ВНК-21/2-17b были подвержены около 100 последовательным пассажам в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2). При этом монослойная стадия наработки данной культуры клеток не применялась. В результате была получена новая суспензионная клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH.As a result of suspension cultivation in the production of transplantable subline cells, BHK-21 / 2-17b were exposed to about 100 consecutive passages in a growth medium of a modified composition (tables 1, 2). At the same time, a monolayer stage of the production of this cell culture was not used. The result was a new suspension cell subline BHK-21 / SUSP / ARRIAH.

Морфология суспензионных клеток выведенной сублинии представлена на фиг. 8. По итогам морфологического анализа видно, что внешне клетки практически не меняются по сравнению с сублинией ВНК-21/2-17b. В популяции преобладает доля мелких клеток размером 8-10 мкм (до 90%). При этом в процессе пассирования на горизонтальной поверхности клетки слабо адгезируются (исключение составляют полиплоиды) и интенсивно перемещаются. В результате многократных митотических делений наблюдается значительное увеличение концентрации клеток в культуральном флаконе в суспензионном состоянии. Иными словами, созданная клеточная линия ВНК-21/SUSP/ARRIAH представляет собой исключительно суспензионную клеточную сублинию.The morphology of the suspension cells of the excreted subline is shown in FIG. 8. According to the results of morphological analysis, it can be seen that outwardly the cells practically do not change in comparison with the subnational VNK-21 / 2-17b. The proportion of small cells with a size of 8-10 microns (up to 90%) predominates in the population. Moreover, in the process of passage on the horizontal surface, the cells weakly adhere (the exception is polyploids) and intensively move. As a result of repeated mitotic divisions, a significant increase in the concentration of cells in the culture bottle in suspension is observed. In other words, the created BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell line is an exclusively suspension cell subline.

Для оценки размера ядра относительно цитоплазмы проводили обработку суспензионных клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH акридиновым оранжевым. Для анализа проводили отбор 50 образцов клеточных суспензий новой сублинии после выращивания клеток в стеклянных и металлических реакторах. В результате экспозиции с акридиновым оранжевым ядра приобретали яркое зеленовато-желтое окрашивание и были визуализированы на оранжевом фоне цитоплазмы (фиг. 9). По итогам измерений диаметров ядер и клеток пришли к выводу о том, что для новой сублинии отмечается увеличение размера ядра относительно цитоплазмы и размера клетки. В некоторых случаях размер ядра составлял 60-80% от объема клетки.To assess the size of the nucleus relative to the cytoplasm, the cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline suspension cells were treated with acridine orange. For analysis, 50 samples of cell suspensions of the new subline were sampled after cell growth in glass and metal reactors. As a result of exposure with acridine orange, the nuclei acquired a bright greenish-yellow stain and were visualized on an orange cytoplasm background (Fig. 9). According to the results of measurements of the diameters of nuclei and cells, they came to the conclusion that for a new subline, an increase in the size of the nucleus relative to the cytoplasm and cell size is noted. In some cases, the size of the nucleus was 60-80% of the cell volume.

Пример 2. Кариологическое исследование клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной линией ВНК-21/2-17b.Example 2. Karyological study of subline cells BHK-21 / SUSP / ARRIAH in comparison with the prototype line BHK-21 / 2-17b.

Кариологическое исследование сублинии клетокKaryological study of subline cells

ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b проводили с применением метода Moorhead и др. [8]. После получения препарата с метафазными пластинками, производили фотографирование 100 метафазных пластинок, их подсчет и составление кариограммы.VNK-21 / SUSP / ARRIAH in comparison with the prototype subline VNK-21 / 2-17b was performed using the method of Moorhead et al. [8]. After receiving the drug with metaphase plates, we took photographs of 100 metaphase plates, their calculation and compilation of the karyogram.

На фиг. 2 показан популяционный состав культуры клеток ВНК-21/2-17b на момент патентования в 1986 г. Многократные опыты указывали на стабильное преобладание популяций с 42 хромосомами (28-40% от всей популяции).In FIG. Figure 2 shows the population composition of the cell culture of BHK-21 / 2-17b at the time of patenting in 1986. Multiple experiments indicated a stable predominance of populations with 42 chromosomes (28-40% of the entire population).

В течение трех десятилетий в производстве монослойная стадия наработки данной культуры клеток не применялась. В результате суспензионного культивирования в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2) в течение около 100 последовательных пассажей клетки ВНК-21/2-17b трансформировались в новую клеточную сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Популяции клеток данной линии, выращенных в стеклянных и металлических культиваторах объемом 50, 1000 и 2000 дм соответственно, подвергали кариологическому анализу. Для исследования использовали по 50 образцов клеточных суспензий, полученных через 48 ч после посева. По итогам анализа выяснили, что в однородных условиях культивирования в клетках произошли некоторые кариологические изменения. Модальный класс новой сублинии стал равен 41 хромосоме и соответствует 32-40% популяции. Доля клеток с количеством хромосом 40-42 составляет 78-80%), полиплоидов - в среднем около 1%. Пределы изменчивости хромосомного набора для клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH соответствуют диапазону от 36 до 54 хромосом. Наличие 36 хромосом отмечают у 0-1% популяций, 37 хромосом - у 0-4%, 38 хромосом - у 2-9%, 39 хромосом - у 3-11%, 40 хромосом - у 8-24%, 42 хромосомы - у 15-27%, 43 хромосомы - у 6-12%, 44 хромосомы - у 2-3%, 46 хромосом - у 0-2% и 52-54 хромосом - у 0-2% (фиг. 5-7).For three decades in production, a monolayer stage of the production of this cell culture has not been used. As a result of suspension cultivation in a growth medium of a modified composition (Tables 1, 2) for about 100 consecutive passages, BHK-21 / 2-17b cells were transformed into a new BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell subline. Populations of cells of this line grown in glass and metal cultivators with a volume of 50, 1000 and 2000 dm, respectively, were subjected to karyological analysis. For the study, 50 samples of cell suspensions obtained 48 h after sowing were used. According to the results of the analysis, it was found that under uniform cultivation conditions, some karyological changes occurred in the cells. The modal class of the new subline has become equal to 41 chromosomes and corresponds to 32-40% of the population. The proportion of cells with the number of chromosomes 40-42 is 78-80%), polyploids - on average about 1%. The limits of variation of the chromosome set for BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells correspond to the range from 36 to 54 chromosomes. The presence of 36 chromosomes is noted in 0-1% of populations, 37 chromosomes in 0-4%, 38 chromosomes in 2-9%, 39 chromosomes in 3-11%, 40 chromosomes in 8-24%, 42 chromosomes 15-27%, 43 chromosomes - 6-12%, 44 chromosomes - 2-3%, 46 chromosomes - 0-2% and 52-54 chromosomes - 0-2% (Fig. 5-7) .

Сравнивая все кариограммы можно сделать вывод, что при суспензионном культивировании в указанных выше условиях происходит селекция полученной клеточной сублинии в направлении гипоплоидии, при этом модальный класс не опускается ниже 41 хромосомы.Comparing all karyograms, we can conclude that during suspension cultivation under the above conditions, the resulting cell subline is selected in the direction of hypoploidy, while the modal class does not drop below 41 chromosomes.

Пример 3. Цитометрические исследования клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH для анализа клеточного цикла в сравнении с прототипной сублинией ВНК-21/2-17b.Example 3. Cytometric studies of subline cells of BHK-21 / SUSP / ARRIAH for cell cycle analysis in comparison with the prototype subline of BHK-21 / 2-17b.

Для сравнительного анализа фаз жизненного цикла клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH и ВНК-21/2-17b (наиболее близкий прототип) провели цитометрические исследования на проточном цитометре «Accuri С6» с помощью набора для определения ДНК клеток «С6 Flow Cytometer Fluid Kit» (N=22). ДНК-гистограммы для клеток сублиний ВНК-21/SUSP/ARRIAH и ВНК-21/2-17b через 48 ч после пересева клеточной суспензии представлены на фиг. 10 и в таблице 4.For a comparative analysis of the life cycle phases of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH and BHK-21 / 2-17b subline cells (the closest prototype), cytometric studies were performed on an Accuri C6 flow cytometer using a C6 Flow Cytometer Fluid cell DNA detection kit Kit ”(N = 22). DNA histograms for BHK-21 / SUSP / ARRIAH and BHK-21 / 2-17b subline cells 48 hours after subculture of the cell suspension are shown in FIG. 10 and in table 4.

Из сведений, отраженных на фиг. 10, и средних значений таблицы 4 видно, что у прототипной линии ВНК-21/2-17b клеток в состоянии апоптоза и дебриса было 51,0-60,0%, что на 31,0-5,0%) больше, чем у клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH (20,0-55,0%). В G1-фазе (пресинтетический период) находилось 30,0-75,0% клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH и 28,0-70,3% клеток сублинии ВНК-21/2-17b. Во время данной фазы клетки указанных линий подготавливаются к удвоению хромосом, отмечается интенсивный полипептидов, увеличивается количество митохондрий и рибосом. В данной стадии клетки новой сублинии находятся на 2,0-4,7%) в большем количестве по сравнению с прототипным вариантом.From the information reflected in FIG. 10, and the average values of table 4 shows that the prototype line of BHK-21 / 2-17b cells in the state of apoptosis and debris had 51.0-60.0%, which is 31.0-5.0%) more than in BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells (20.0-55.0%). In the G1 phase (presynthetic period) there were 30.0-75.0% of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells and 28.0-70.3% of BHK-21 / 2-17b subline cells. During this phase, the cells of these lines are prepared for doubling of chromosomes, intense polypeptides are noted, the number of mitochondria and ribosomes increases. At this stage, the cells of the new subline are 2.0-4.7%) in larger numbers compared to the prototype version.

Следует отметить, что, вероятно, у сублинии ВНК-21/2-17b часть клеток между митотической фазой М и началом S-фазы переходит в стадию апоптоза, что, соответственно, в дальнейшем сказывается на кратности прироста всей клеточной популяции.It should be noted that, probably, in the BHK-21 / 2-17b subline, some of the cells between the mitotic phase M and the beginning of the S-phase go into the apoptosis stage, which, accordingly, subsequently affects the growth rate of the entire cell population.

В стадии S-фазы (синтетический период), когда наблюдается репликация клеточной ДНК во многих репликонах, и начинается удвоение центриолей в клеточном центре, у сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH находится 2,0-33,0% клеток, а у прототипной линии - 1,5-30,0%», что на 0,5-3,0% выше по сравнению с клетками новой сублинии.In the S-phase stage (synthetic period), when cell DNA replication is observed in many replicons, and centrioles are doubling in the cell center, 2.0-33.0% of the cells are located in the subnational BHK-21 / SUSP / ARRIAH, and in the prototype lines - 1.5-30.0% ”, which is 0.5-3.0% higher compared to cells of the new subline.

В 02-фазе (постсинтетический период), во время которой накапливаются энергия, белки для митотического деления клетки и достигается тетраплоидный набор ДНК, а также в М-фазе (митоз) через 48 ч у сублинии ВНК-21/2-17b находится 2,6-18%) клеток, а у ВНК-21/SUSP/ARRIAH - 3,0-20% клеток, что на 0,4-2,0% выше и свидетельствует о большем потенциале клеток новой сублинии для продолжения деления.In the 02-phase (postsynthetic period), during which energy is accumulated, proteins for mitotic cell division and tetraploid DNA collection are achieved, as well as in the M-phase (mitosis) after 48 h, the subnation VNK-21 / 2-17b is 2, 6-18%) of the cells, and in BHK-21 / SUSP / ARRIAH - 3.0-20% of the cells, which is 0.4-2.0% higher and indicates a greater potential of the new subline cells to continue division.

Таким образом, в результате суспензионного культивирования в ростовой среде модифицированного состава в течение 100 последовательных пассажей клетки перевиваемой линии ВНК-21/2-17b трансформировались в новую сублинию ВНК-21/SUSP/ARRIAH, для которой, вероятно, произошла селекция основной популяции, что проявилось в снижении количества клеток, находящихся в стадии апоптоза и дебриса на 31,0-5,0%, и в увеличении числа клеток, участвующих в G1-, S- и G2+М-фазах на 2,0-4,7, 0,5-3,0, 0,4-2,0%), соответственно, обеспечивающих клеточный рост.Thus, as a result of suspension cultivation in a growth medium of a modified composition for 100 consecutive passages, cells of the BHK-21 / 2-17b transplanted line were transformed into the new BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline, for which selection of the main population probably occurred, which manifested itself in a decrease in the number of cells in the stage of apoptosis and debris by 31.0-5.0%, and in an increase in the number of cells involved in the G1, S and G2 + M phases by 2.0-4.7, 0.5-3.0, 0.4-2.0%), respectively, providing cell growth.

Пример 4. Оценка ростовых свойств клеток су 6 линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипными сублиниями.Example 4. Evaluation of the growth properties of su 6 cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH line in comparison with prototype sublines.

Клетки су 6 линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, полученные в результате длительного суспензионного культивирования (около 100 пассажей) в ростовой среде модифицированного состава (таблицы 1, 2) исследовали на оценку ростовых свойств в сравнении с клетками прототипных сублиний ВНК-21/13, ВНК21/13, ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13. Результаты анализа представлены в таблице 5 и на фиг. 1.Su 6 cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH line obtained as a result of long-term suspension cultivation (about 100 passages) in a growth medium with a modified composition (Tables 1, 2) were examined to assess the growth properties in comparison with the cells of the prototype subline of BHK-21/13 , BHK 21/13, BHK-21 / 2-17b, BHK-21 / 13-02 and BHK-21 / 13-13. The results of the analysis are presented in table 5 and in FIG. 1.

Из данных таблицы 5 видно, что при суспензионном культивировании клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH отъемно-доливным способом, раздельными циклами по 10-12 пассажей, при посевной концентрации 0,5-0,6 млн клеток/см через 48 часов культивирования в оптимальном режиме концентрация составляет 4,0-5,5 млн клеток/см³. Таким образом, кратность прироста равна 6,67-11,00 при жизнеспособности клеток 96-99%. Отмечается экспоненциальный характер роста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензионном состоянии с затуханием пролиферации после 48 часов культивирования (фиг. 1).From the data of table 5 it can be seen that during suspension cultivation of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells by the detachable-refill method, in separate cycles of 10-12 passages, at a seed concentration of 0.5-0.6 million cells / cm after 48 hours of cultivation in optimal mode, the concentration is 4.0-5.5 million cells / cm ³ . Thus, the growth rate is 6.67-11.00 with a cell viability of 96-99%. The exponential nature of the growth of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells in suspension with proliferation attenuation after 48 hours of cultivation is noted (Fig. 1).

Суспензионные клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при выращивании в культуральных флаконах в статичных условиях характеризуются низкими показателями адгезии, имеют аморфную форму с множеством цитоплазматических выростов, динамика которых составляет несколько минут.Suspension cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline when grown in culture bottles under static conditions are characterized by low adhesion rates, have an amorphous shape with many cytoplasmic outgrowths, the dynamics of which is several minutes.

Таким образом, в сравнении с прототипами клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при суспензионном выращивании имеют большую кратность прироста на 0,67-3,00 с сохранением жизнеспособности клеток на 96-99%.Thus, in comparison with the prototypes, the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells during suspension growth have a large growth rate of 0.67-3.00 with preservation of cell viability by 96-99%.

Пример 5. Репродукция вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в сравнении с прототипными сублиниями.Example 5. Reproduction of FMD viruses, rabies, parainfluenza-3 cattle and Aujeszky’s disease in the cells of the subgroup VNK-21 / SUSP / ARRIAH in comparison with the prototype subline.

В клетках перевиваемой суспензионной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH провели репродукцию вируса ящура штаммов А/Турция/2006 (N=100), O/PanAsia-2 (N=100), Азия-1/Таджикистан/2011 (N=80), вируса бешенства штаммов ВНИИЗЖ (N=40) и РВ-97 (N=40), вируса болезни Ауески штаммов ВК (N=40) и К (N=40), вируса парагриппа-3 КРС штамма ВГНКИ-4 (N=50) с целью получения вируссодержащего сырья для изготовления противовирусных вакцин.In cells of the transplantable suspension subline VNK-21 / SUSP / ARRIAH, foot and mouth disease virus strains A / Turkey / 2006 (N = 100), O / PanAsia-2 (N = 100), Asia-1 / Tajikistan / 2011 (N = 80 ), rabies virus of strains ARRIAH (N = 40) and PB-97 (N = 40), Aujeszky's disease virus of strains VK (N = 40) and K (N = 40), parainfluenza virus-3 of cattle VGNKI-4 strain (N = 50) in order to obtain virus-containing raw materials for the manufacture of antiviral vaccines.

Результаты культивирования указанных вирусов представлены в таблице 6 и проведен сравнительный анализ с данными для прототипных клеточных сублиний ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13. Из таблицы 6 следует, что вирус ящура в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 95-99% с титрами инфекционной активности 7,30±0,13 - 8,00±0,21 lg ТЦД₅₀/см³ (N=280) (в аналогах, с использованием культур клеток ВНК-21/2-17b, ВНК-21/13-02 и ВНК-21/13-13, - до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³).The results of the cultivation of these viruses are presented in table 6 and a comparative analysis with the data for the prototype cell subline VNK-21 / 2-17b, VNK-21 / 13-02 and VNK-21 / 13-13. From table 6 it follows that the foot-and-mouth disease virus in the cells of the subgroup of BHK-21 / SUSP / ARRIAH causes a cytopathic effect (CPP) of 95-99% with titers of infectious activity of 7.30 ± 0.13 - 8.00 ± 0.21 lg ₅₀ / cm ³ (N = 280) (in analogs, using VNK-21 / 2-17b, VNK-21 / 13-02 and VNK-21 / 13-13 cell cultures, up to 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ ).

С помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции [9] определяли концентрацию иммуногенного 146S компонента вируса ящура после репродукции в полученной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая в среднем составила 1,95±0,32 мкг/см³ с 1,00 млн клеток. При использовании культуры клеток ВНК-21/13-02 (аналог) количество иммуногенных компонентов составляло до 1,00 мкг/см³, а клеток сублиний ВНК-21/13-13и ВНК-21/2-17b (аналоги) до 1,50 мкг/см³ с общей популяции клеток.Using the method of reverse transcription and polymerase chain reaction [9], the concentration of the immunogenic 146S component of foot-and-mouth disease virus was determined after reproduction in the resulting subline of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells, which averaged 1.95 ± 0.32 μg / cm ³ s 1 , 00 million cells. When using a cell culture of BHK-21 / 13-02 (analogue), the number of immunogenic components was up to 1.00 μg / cm ³ , and subline cells BHK-21 / 13-13 and BHK-21 / 2-17b (analogues) to 1, 50 μg / cm ³ with a total population of cells.

При репродукции вируса бешенства в полученной сублинии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH - ЦПД составило 95-99% с титрами инфекционности - 8,25±0,20 - 8,50±0,13 ЛД₅₀/см³ (N=100), а в аналогах, с использованием культуры клеток ВНК-21/13-02 - 6,50 ЛД₅₀/см³, с ВНК-21/2-17b и ВНК-21/13-13 - до 8,00 ЛД₅₀/см³. Вирус болезни Ауески при культивировании в клетках сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH вызывал ЦПД у 95-97% клеток с накоплением 7,50±0,19 - 7,80±0,15 lg ТЦД₅₀/см³ (N=80), а вирус парагриппа-3 КРС обеспечивал ЦПД клеток на 95-98%) с титром инфекционной активности до 6,00±0,15 lg ТЦД₅₀/см³ (N=50).When rabies virus was reproduced in the obtained subcell of BHK-21 / SUSP / ARRIAH cells, the CPD was 95-99% with the infectivity titers of 8.25 ± 0.20 - 8.50 ± 0.13 LD ₅₀ / cm ³ (N = 100 ), and in analogues, using a cell culture of BHK-21 / 13-02 - 6.50 LD ₅₀ / cm ³ , with BHK-21 / 2-17b and BHK-21 / 13-13 - up to 8.00 LD ₅₀ / cm ³ . Aujeszky’s disease virus, when cultured in BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells, caused CPD in 95-97% of cells with an accumulation of 7.50 ± 0.19 - 7.80 ± 0.15 lg TCD ₅₀ / cm ³ (N = 80 ), and the parainfluenza-3 virus of cattle provided a cell CPR of 95-98%) with an infectious activity titer of up to 6.00 ± 0.15 lg TCD ₅₀ / cm ³ (N = 50).

Таким образом, клетки сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, полученной для производства противоящурных вакцин а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов, позволяют проводить репродукцию вируса ящура с титром на 1,00 lg ТЦД₅₀/см³ выше (до 8,00±0,21 lg ТЦД₅₀/см³) и концентрацией иммуногенных компонентов в 2-3 раза выше (до 1,95 мкг/см³ с 1 млн клеток) по сравнению с аналогами (не более 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ и 1,50 мкг/см³ со всей популяции клеток). Предложенная сублиния обеспечивает накопление вируса бешенства с титром на 0,50 lg ЛД₅₀/см³ (до 8,50±0,13 lg ЛД₅₀/см³) выше по сравнению с прототипными линиями (не более 8,00 lg ЛД₅₀/см³), а также получать вирусы парагриппа-3 КРС и болезни Ауески в количествах 6,00±0,15 и до 7,80±0,15 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно.Thus, cells of the BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline obtained for the production of FMD vaccines as well as for the manufacture of diagnostic and prophylactic veterinary biologics allow the reproduction of foot and mouth disease virus with a titer of 1.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ higher (up to 8, 00 ± 0.21 lg TCD ₅₀ / cm ³ ) and the concentration of immunogenic components is 2-3 times higher (up to 1.95 μg / cm ³ from 1 million cells) compared with analogues (not more than 7.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ and 1.50 μg / cm ³ from the entire cell population). The proposed subline provides the accumulation of rabies virus with a titer of 0.50 lg LD ₅₀ / cm ³ (up to 8.50 ± 0.13 lg LD ₅₀ / cm ³ ) higher compared with prototype lines (not more than 8.00 lg LD ₅₀ / cm ³ ), as well as receiving parainfluenza-3 cattle viruses and Aujeszky’s disease in amounts of 6.00 ± 0.15 and up to 7.80 ± 0.15 lg TCD ₅₀ / cm ³ , respectively.

Пример 6. Оценка жизнеспособности клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, рекультивированных после криоконсервирования.Example 6. Evaluation of the viability of the subline cells of BHK-21 / SUSP / ARRIAH, reclaimed after cryopreservation.

Криоконсервирование суспензии клеток полученной сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в производственных условиях проводят в ампулах объемом 100 см³ в криосреде (ростовая среда (таблица 1) с добавлением 7-10%) этиленгликоля и 20%>фетальной сыворотки КРС). До температуры -70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры -150°С - 10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (-196°С), предварительно подержав над парами азота. Размораживание клеточной суспензии осуществляют при температуре 39-42°С в течение 2 мин. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования на первом пассаже составляет 85-90%, со второго пассажа увеличивается до 96-99%. После реконсервации клеток и выращивания непосредственно в суспензии (в ферментере) в течение первого пассажа происходит задержка пролиферации на сутки. На фиг. 11 показана кратность прироста клеток сублинии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 12 последовательных пассажей после криоконсервации. Данное исследование проводили в 30 повторностях. Интенсивность пролиферации на первом-третьем пассажах после криоконсервирования варьировала от 3,36±0,21 до 5,88±0,15 (р<0,005). Начиная с четвертого пассажа значения кратности прироста составляли от 6,85±0,18 до 10,95±0,31 (р<0,005).Cryopreservation of a cell suspension of the obtained BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline under industrial conditions is carried out in ampoules of 100 cm ³ volume in a cryomedium (growth medium (table 1) with the addition of 7-10%) ethylene glycol and 20%> fetal bovine serum). To a temperature of -70 ° C, the cell suspension is cooled at a rate of 2 ° C / min, to a temperature of -150 ° C - 10 ° C / min, then the ampoules are placed in liquid nitrogen (-196 ° C), after holding it over nitrogen vapor. Thawing the cell suspension is carried out at a temperature of 39-42 ° C for 2 minutes Cell viability after cryopreservation in the first passage is 85-90%, from the second passage it increases to 96-99%. After cell preservation and growth directly in suspension (in the fermenter) during the first passage, there is a delay in proliferation for a day. In FIG. 11 shows the cell growth rate of BHK-21 / SUSP / ARRIAH subline cells during 12 consecutive passages after cryopreservation. This study was performed in 30 replicates. The proliferation rate in the first or third passages after cryopreservation ranged from 3.36 ± 0.21 to 5.88 ± 0.15 (p <0.005). Starting from the fourth passage, the values of the growth rate ranged from 6.85 ± 0.18 to 10.95 ± 0.31 (p <0.005).

Таким образом, клеточная сублиния ВНК-21/SUSP/ARRIAH быстро рекультивируется после криоконсервирования и отличается высокими пролиферативными показателями (до 10,95±0,31) с жизнеспособностью клеток 95-99%о.Thus, the BHK-21 / SUSP / ARRIAH cell subline quickly reclamates after cryopreservation and is characterized by high proliferative indices (up to 10.95 ± 0.31) with cell viability of 95-99% o.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является новая перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая предназначена для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3 КРС, болезни Ауески с большим накоплением антигена для производства противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.The main advantage of the invention is a new transplantable suspension subline of kidney cells of the newborn Syrian hamster VNK-21 / SUSP / ARRIAH, which is intended for the reproduction of foot-and-mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3 cattle, Aujeszky's disease with a large accumulation of antigen for the production of antiviral vaccines, as well as manufacturing diagnostic and preventive veterinary biological products.

Предлагаемое изобретение отличается высокими показателями пролиферативной активности клеток полученной сублинии, существенными изменениями кариологических показателей и селекцией в направлении гипоплоидии с 41 хромосомой в модальном классе. В предлагаемом изобретении отмечается снижение количества клеток, находящихся в стадии апоптоза, на 31,0-5,0% и увеличение доли клеток, участвующих в обеспечивающих клеточный рост G1-, S- и G2+М-фазах, на 2,0-4,7, 0,5-3,0, 0,4-2,0%, соответственно.The present invention is characterized by high proliferative activity of the cells obtained subline, significant changes in karyological parameters and selection in the direction of hypoploidy with 41 chromosomes in the modal class. In the present invention, there is a decrease in the number of cells undergoing apoptosis by 31.0-5.0% and an increase in the proportion of cells involved in cell growth providing G1, S and G2 + M phases by 2.0-4 , 7, 0.5-3.0, 0.4-2.0%, respectively.

Предлагаемое изобретение отличается высокой кратностью прироста клеток 6,67-11,00 с сохранением жизнеспособности клеток на 96-99%, начиная со второго пассажа рекультивации после криоконсервирования.The present invention is characterized by a high multiplicity of cell growth of 6.67-11.00 while maintaining cell viability by 96-99%, starting from the second passage of reclamation after cryopreservation.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «ВНК-21/SUSP/ARRIAH - перевиваемая суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вирусов ящура, бешенства, парагриппа-3, болезни Ауески при производстве противовирусных вакцин, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.»:Sources of information taken into account when drawing up the description of the invention to the application for the grant of a patent of the Russian Federation for the invention of "VNK-21 / SUSP / ARRIAH - transplantable suspension subline of kidney cells of a newborn Syrian hamster, designed for the reproduction of foot and mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, Aujeszky’s disease in the manufacture of antiviral vaccines, as well as for the manufacture of diagnostic and prophylactic veterinary biological products. ”:

1. Stoker М., Macpherson I.A. Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its derivaties // Nature. - 1964. - V. 203. - P. 1355-1357.1. Stoker M., Macpherson I.A. Syrian hamster fibroblast cell line BHK-21 and its derivaties // Nature. - 1964. - V. 203. - P. 1355-1357.

2. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 60.2. Yurkov S.G., Zuev V.V. The catalog of the collection of cell cultures VNIIVViM - Pokrov. - 2000 .-- S. 60.

3. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 61.3. Yurkov S.G., Zuev V.V. The catalog of the collection of cell cultures VNIIVViM - Pokrov. - 2000 .-- S. 61.

4. Сокова В.В., Алеева Л.А., Бондаренко А.Ф., Худяков Г.А, 1988. Авторское свидетельство СССР №240289, 1986.4. Sokova V.V., Aleeva L.A., Bondarenko A.F., Khudyakov G.A., 1988. USSR author's certificate No. 240289, 1986.

5. Юрков С.Г., Зуев В.В. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ - Покров. - 2000. - С. 62.5. Yurkov S.G., Zuev V.V. Catalog of the collection of cell cultures VNIIVViM - Pokrov. - 2000 .-- S. 62.

6. Патент РФ №2614074, 22.03.2017. ВНК-21/13-02-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства // Патент России №заявки 2005116301/2017.03.22. Бюл. №9 / Елисеев А.К., Мельник Н.А., Зенов Н.И. [и др.].6. RF patent No. 2614074, 03/22/2017. VNK-21 / 13-02-translucent monolayer-suspension subline of kidney cells of a newborn Syrian hamster, intended for the reproduction of foot and mouth disease virus and rabies virus // Russian Patent Application No. 2005116301 / 2017.03.22. Bull. No. 9 / Eliseev A.K., Melnik N.A., Zenov N.I. [and etc.].

7. Патент РФ №2553552, 01.08.2014. ВНК-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства // Патент России №заявки 2014131866/10/2014.08.01. МПК C12N / Елисеев А.К., Зенов Н.И., Красуткин С.Н. [и др.].7. RF patent No. 2553552, 01/01/2014. VNK-21 / 13-13-transposable monolayer-suspension subline of kidney cells of a newborn Syrian hamster, intended for reproduction of foot-and-mouth disease virus and rabies virus // Russian Patent Application No. 2014131866/10 / 2014.08.01. IPC C12N / Eliseev A.K., Zenov N.I., Krasutkin S.N. [and etc.].

8. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral Blood / P.S. Moorhead, P.C. Nowell, W.J Mellman et al. // Exper. Cell. Res. - 1960. - V. 20. - P. 613-616.8. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral Blood / P.S. Moorhead, P.C. Nowell, W.J. Mellman et al. // Exper. Cell. Res. - 1960. - V. 20. - P. 613-616.

9. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].9. RF patent No. 2619878/13, 05/18/2017. A method for determining the concentration of the 1468 component of foot-and-mouth disease virus in a virus-containing raw material for a vaccine using the real-time reverse transcription-polymerase chain reaction method // Russian Patent No. 2016140460/15. 2017. Bull. No. 14 / Lozova D.A., Mikhalishin D.V., Doronin M.I. [and etc.].

Claims

1. BHK-21 / SUSP / ARRIAH - transplantable suspension subline of the cells of the kidney of a newborn Syrian hamster, intended for the reproduction of foot and mouth disease viruses, rabies, parainfluenza-3, Aujeszky’s disease in the manufacture of antiviral vaccines, as well as for the manufacture of diagnostic and preventive veterinary biologics that was deposited in the Specialized Collection of Cell Culture CKP “Collection of Vertebrate Cell Cultures” of the Institute of Cytology RAS 04/04/2019 under the number RKKK (P) 797 D.

2. The subline of cells according to claim 1, characterized in that it was obtained from the BHK-21 / 2-17b cell line by permanent suspension cultivation for 100 passages, bypassing the monolayer stage, in a growth medium of the original composition containing 5% cattle serum, 15-20 cm ³ / dm ^{3 of a} 10% hydrolyzate of blood proteins, 2-10 cm ³ / dm ^{3 of a} 10th Hottinger test, 8 proteinogenic amino acids (L-arginine, L-glutamine, L-isoleucine, L-methionine , L-tyrosine, L-threonine, L-tryptophan, L-cysteine), glucose, a complex of vitamins and mineral salts.

3. The subline of cells according to claim 1, characterized in that during suspension cultivation, selection takes place in the direction of hypoploidy:

- the modal class corresponds to 41 chromosomes (32-40% of cells);

- the proportion of cells with the number of chromosomes 40-42 is 78-80%;

- the proportion of polyploids - an average of about 1%;

- the limits of variability of the chromosome set correspond to the range from 36 to 54 chromosomes.

4. The subline of cells according to claim 1, characterized in that during suspension cultivation by the detachable-refilling method with separate cycles of 10-12 passages, the exponential nature of cell growth with attenuation of proliferation after 48 hours, with a growth rate of 6.67-11, 00 with a cell viability of 96-99%.

5. The subline of cells according to claim 1, characterized in that when grown under static conditions, the suspension cells exhibit low adhesive properties, have an amorphous shape with many cytoplasmic microgrowths and accumulate in the suspension in the culture medium in the course of mitotic division (in suspension).

6. The subline of cells according to claim 1, characterized in that the G1 phase predominates in the cell cycle of the population after 48 hours, accounting for 30.0-75.0% of the cells. In the phases of preparation for mitosis and mitotic division (G2 + M phases), from 3.0 to 20.0% of the entire population is located. The number of large and multinucleated cells (> 4n) at the beginning and at the end of the stage of logarithmic growth increases to 2%.

7. The subline of cells according to claim 1, characterized in that the cells quickly recover after cryopreservation with a viability of 95-99%, with a growth rate of 3.36-5.88 in 1-3 passages and 6.85-10.95 with 4 12 passages each.

8. The subline of cells according to claim 1, characterized in that it allows the reproduction of the following viruses:

- foot and mouth disease virus with titers of 7.30-8.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ and the number of immunogenic components 0.50-1.95 μg / cm ³ with 1.00 million cells;

- rabies virus with titers of 8.25-8.50 lg LD ₅₀ / cm ³ ;

- virus parainfluenza-3 cattle with a titer of 6.00 lg TCD ₅₀ / cm ³ ;

- Aujeszky's disease virus with titers of 7.50-7.80 lg TCD ₅₀ / cm ³ .