RU2756557C1 - Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology - Google Patents

Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology Download PDF

Info

Publication number
RU2756557C1
RU2756557C1 RU2020136076A RU2020136076A RU2756557C1 RU 2756557 C1 RU2756557 C1 RU 2756557C1 RU 2020136076 A RU2020136076 A RU 2020136076A RU 2020136076 A RU2020136076 A RU 2020136076A RU 2756557 C1 RU2756557 C1 RU 2756557C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
rna
fmd virus
titer
fmd
virus
Prior art date
Application number
RU2020136076A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Максим Игоревич Доронин
Дмитрий Валерьевич Михалишин
Вячеслав Алексеевич Стариков
Алексей Валерьевич Борисов
Марина Николаевна Гусева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")
Priority to RU2020136076A priority Critical patent/RU2756557C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2756557C1 publication Critical patent/RU2756557C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology and production of vaccines against FMD. Described is a method for indirect identification of the FMD virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons applying the molecular beacon technology and the developed exponential function with a base of 10 of the dependence of the threshold RNA amplification cycle and the FMD virus titer. The value of the FMD virus titer is determined while conducting the viral RNA amplification reaction using a fluorescently labeled molecular RNA beacon by the value of the threshold RNA amplification cycle. Based on the determined value of the threshold RNA amplification cycle (Ct RNA), the value of the FMD virus titer (TFMDV) of different types is calculated using the developed mathematical model:
Figure 00000024
EFFECT: proposed invention provides a possibility to quickly and with a high degree of accuracy determine the value of the FMD virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine based on the RNA amplification reaction, followed by applying the developed mathematical model.
6 cl, 4 dwg, 6 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов и разработанной показательной функции с основанием 10 зависимости величины порогового цикла амплификации РНК и титра вируса ящура.The invention relates to the field of biotechnology and the production of FMD vaccines, namely to a method for the indirect determination of the titer of the FMD virus in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology and a developed exponential function with a base 10 of the dependence of the threshold cycle value RNA amplification and FMD virus titer.

Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое относится к категории трансграничных инфекций [1]. Возбудитель принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [2]. Характерной особенностью вируса ящура является наличие 7 типов: А, О, С, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. В пределах каждого типа существует множество генетических вариантов вируса [3].Foot and mouth disease is a highly contagious viral disease of cloven-hoofed animals, which belongs to the category of transboundary infections [1]. The causative agent belongs to the order Picornavirales, family Picornaviridae, genus Aphthovirus [2]. A characteristic feature of the foot and mouth disease virus is the presence of 7 types: A, O, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. Within each type, there are many genetic variants of the virus [3].

Вирион вируса ящура имеет диаметр около 23-25 нм, геном представлен одноцепочечной позитивной РНК, состоящей приблизительно из 8500 н.о. с одной большой открытой рамкой считывания длиной около 7000 и.о., которая состоит из 1А-, 1 В-, 1С-, 1D-, 2А-, 2 В-, 2С-, 3А-, 3 В-, 3С-, 3D-генов. Весь геном возбудителя ящура характеризуется высокой степенью вариабельности нуклеотидов, за исключением генов, кодирующих неструктурные белки и 5'-нетранслируемой области (5'-NTR), которые стабильны для всех вакцинных штаммов вируса ящура. Обнаружение генов, кодирующих неструктурные белки или 5'-NTR позволяет детектировать вирус в исследуемом материале [1].The FMD virus virion has a diameter of about 23-25 nm, the genome is represented by a single-stranded positive RNA, consisting of approximately 8500 nt. with one large open reading frame with a length of about 7000 i.o., which consists of 1A-, 1B-, 1C-, 1D-, 2A-, 2B-, 2C-, 3A-, 3B-, 3C-, 3D genes. The entire genome of the causative agent of foot and mouth disease is characterized by a high degree of variability of nucleotides, with the exception of genes encoding non-structural proteins and the 5'-untranslated region (5'-NTR), which are stable for all vaccine strains of foot and mouth disease. Detection of genes encoding non-structural proteins or 5'-NTR allows the detection of the virus in the test material [1].

Данное заболевание причиняет серьезный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства. Система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает массовую иммунизацию восприимчивых животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1, 4].This disease causes serious economic damage due to the cost of eradicating the disease and the imposition of strict restrictions on domestic and international trade in livestock products. The system of measures to combat foot and mouth disease and its prevention provides for mass immunization of susceptible animals, as well as control of the level of tension of post-vaccination immunity [1, 4].

При изготовлении противоящурных вакцин перед заражением чувствительной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) не инактивированную вируссодержащую суспензию исследуют на определение титра вируса ящура для оценки его активности в клетках с развитием цитопатического действия (ЦПД). В 1,0 см3 не инактивированной суспензии вируса определяют количество инфекционных доз, вызывающих 50%-ное ЦПД, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК в активном состоянии. В классическом варианте определения титра вируса ящура используют монослойную клеточную линию почки свиньи IB-RS-2, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [2, 5]. Существенными недостатками данного способа являются: 1) длительная процедура титрования, связанная с развитием цитопатического действия (не менее 3 суток); 2) определенная степень субъективности при оценке результатов анализа; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.In the manufacture of FMD vaccines, before infection of the sensitive cell line of the kidney of a newborn Syrian hamster (BHK-21), the non-inactivated virus-containing suspension is examined to determine the titer of the FMD virus to assess its activity in cells with the development of cytopathic action (CPA). In 1.0 cm 3 of a non-inactivated virus suspension, the number of infectious doses causing 50% CPP is determined, which actually reflects the concentration of total viral particles containing RNA in an active state. In the classical version of determining the titer of the FMD virus, a monolayer cell line of pig kidney IB-RS-2 is used, which is used to calculate the minimum dose of the virus capable of causing lysis of 50% of cells (prototype) [2, 5]. Significant disadvantages of this method are: 1) a long titration procedure associated with the development of cytopathic action (at least 3 days); 2) a certain degree of subjectivity in assessing the results of the analysis; 3) the high cost of the cell line as a test system and the cost of maintaining it; 4) a high probability of the risk of cell culture contamination.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе реакции амплификации вирусной нуклеиновой кислоты.In this regard, it is advisable to search for a method for determining the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine based on the amplification reaction of the viral nucleic acid.

Данный метод является объективным, высокочувствительным, специфичным и позволяет определять титр вируса ящура в неинактивированных вирусосодержащих суспензиях в течение 3-4 часов, не предполагает контаминации исследуемых образцов, поскольку во время анализа пробирки закрыты, не требует применения клеточных культур для анализа и затрат на их поддержание. Исходя из этого, целесообразно предложить новый способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.This method is objective, highly sensitive, specific and allows to determine the titer of the FMD virus in non-inactivated virus-containing suspensions within 3-4 hours, does not imply contamination of the test samples, since the tubes are closed during the analysis, does not require the use of cell cultures for analysis and the cost of maintaining them ... Based on this, it is advisable to propose a new method for indirect determination of the FMD virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного способа быстрого определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов с целью устранения вышеуказанных недостатков.The objective of the present invention is to develop a highly sensitive and highly specific method for the rapid determination of the titer of foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology in order to eliminate the aforementioned disadvantages.

Данная задача решена благодаря созданию нового способа оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов. Предложенный способ позволяет: 1) снизить время проведения анализа вирусосодержащих суспензий для определения титра вируса ящура до 3-4 ч; 2) исключить вероятность контаминации; 3) увеличить специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и РНК-бикона; 4) увеличить чувствительность анализа; 5) удешевить способ анализа за счет использования реактивов только для получения РНК-ампликонов; 6) применение фермента Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы позволяет повторно использовать кДНК, что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее, чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; 7) применять технологию молекулярных биконов, меченых флуорофором малеимид Cyanine5 и неизлучающим тушителем свечения BHQ3 (Black Hole Quencher-3) и очищенных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; 8) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра вируса ящура (ТВЯ) и пороговыми циклами амплификации РНК (Ct РНК) представленной в виде показательной функции с основанием 10:This problem was solved due to the creation of a new method for assessing the titer of the foot-and-mouth disease virus in non-inactivated vaccine raw materials during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology. The proposed method allows: 1) to reduce the time of analysis of virus-containing suspensions to determine the titer of the FMD virus to 3-4 hours; 2) eliminate the likelihood of contamination; 3) to increase the specificity of the assay through the use of highly specific original primers and RNA beacon; 4) increase the sensitivity of the analysis; 5) reduce the cost of the analysis method by using reagents only for the production of RNA amplicons; 6) the use of the T7 enzyme of DNA-dependent RNA polymerase allows you to reuse cDNA, which leads to an increase in the concentration of RNA amplicons by at least 1 order of magnitude compared to the concentration of RNA primers; 7) apply the technology of molecular beacons labeled with maleimide fluorophore Cyanine5 and non-emitting luminescence quencher BHQ3 (Black Hole Quencher-3) and purified using high performance liquid chromatography; 8) increase the reliability of the analysis due to the establishment of the relationship between the values of the FMD virus titer (T VV ) and the threshold RNA amplification cycles (C t RNA ) presented as an exponential function with a base 10:

Figure 00000001
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9966) и эффективностью амплификации 98,89%. Предложенная модель позволяет количественно оценивать титр вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины.
Figure 00000001
with high accuracy of approximation (R 2 = 0.9966) and amplification efficiency of 98.89%. The proposed model makes it possible to quantify the titer of the FMD virus in non-inactivated raw materials for the FMD vaccine.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Сущность реакции амплификации РНК.The essence of the invention is reflected in the graphical representations: FIG. 1 - The essence of the RNA amplification reaction.

Фиг. 2 - Спектры поглощения экстрактов суммарной РНК вируса ящура стандартных образцов для оценки степени их чистоты при определении концентрации титра вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса ящура зарегистрированы при длине волны 262 нм) (n=3).FIG. 2 - Absorption spectra of total FMD virus RNA extracts of standard samples to assess their purity when determining the concentration of the virus titer in the initial suspensions (the maximum optical signals for FMD virus RNA were recorded at a wavelength of 262 nm) (n = 3).

Фиг. 3 - Зависимость порогового цикла амплификации вирусной РНК и титра вируса ящура при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов амплификации РНК).FIG. 3 - Dependence of the threshold cycle of viral RNA amplification and the titer of the FMD virus during the amplification of viral nucleic acid and the detection of RNA amplicons using the molecular beacon technology (n = 3, points are marked, which represent the average values of the threshold cycles of RNA amplification).

Фиг. 4 - Спектры поглощения экстрактов суммарной РНК вируса ящура исследуемых проб для оценки степени их чистоты при определении концентрации титра вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса ящура зарегистрированы при длине волны 262 нм) (n=3).FIG. 4 - Absorption spectra of the total FMD virus RNA extracts of the studied samples to assess their purity when determining the concentration of the virus titer in the initial suspensions (the maximum optical signals for the FMD virus RNA were recorded at a wavelength of 262 nm) (n = 3).

Сущность изобретения заключается в новом подходе по определению титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов. Заявляемый способ основан на: 1) проведении выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-HCl и латексных частиц белого цвета диаметром 300 нм; 2) амплификации специфического фрагмента в 5'-NTR гена РНК вируса ящура с применение специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; 3) детекции РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде графика, стремящегося к экспоненте; 4) определении титра вируса ящура с применением показательной функции с основанием 10, выраженной в виде уравнения:

Figure 00000002
при R2=0,9966 и эффективности амплификации (Е)=98,89%.The essence of the invention lies in a new approach for determining the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology. The inventive method is based on: 1) carrying out the isolation of the FMD virus RNA using 3M guanidine-HCl and white latex particles with a diameter of 300 nm; 2) amplification of a specific fragment in the 5'-NTR of the FMD virus RNA gene using specific forward and reverse primers, as well as a molecular beacon labeled with the maleimide Cyanine 5 fluorophore and a luminescence quencher BHQ3; 3) detecting RNA amplicons using fluorescent fluorescence and displaying the accumulation of the signal in the form of a graph tending to an exponential; 4) determination of the titer of the FMD virus using an exponential function with base 10, expressed as an equation:
Figure 00000002
when R 2 = 0.9966 and amplification efficiency (E) = 98.89%.

В настоящее время метод амплификации РНК применяют для детекции различных инфекционных агентов, в частности, возбудителя аспергиллеза, кандидоза, хламидиоза, гриппа птиц А, энтеровирусной инфекции, цитомегаловирусной инфекции, микобактериоза КРС, парагриппа-1, 2, 3, 4, сальмонеллеза животных и др. патогенов [6-13]. Однако ранее указанный метод применялся только для выявления возбудителя заболевания. Для количественной оценки вирусной нагрузки суспензии, в частности, для определения титра вируса ящура ранее данный метод не применялся. Иными словами, сведений об аналогах предлагаемого способа определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины авторами не обнаружено.Currently, the RNA amplification method is used to detect various infectious agents, in particular, the causative agent of aspergillosis, candidiasis, chlamydia, avian influenza A, enterovirus infection, cytomegalovirus infection, mycobacteriosis of cattle, parainfluenza-1, 2, 3, 4, salmonellosis of animals, etc. pathogens [6-13]. However, the previously indicated method was used only to identify the causative agent of the disease. For the quantitative assessment of the viral load of the suspension, in particular, for the determination of the titer of the FMD virus, this method has not previously been used. In other words, the authors did not find information about analogues of the proposed method for determining the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine.

Разработанный способ опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, быстротой выполнения анализа и экономичностью в расходовании реагентов.The developed method for indirect estimation of the FMD virus titer in non-inactivated vaccine raw materials during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology, compared to the prototype, is characterized by higher sensitivity and specificity, faster analysis and economy in reagent consumption.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-HCl и латексных частиц белого цвета диаметром 300 нм; амплификацию специфического фрагмента в 5'-NTR РНК вируса ящура с применением специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; детекцию РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде графика, стремящегося к экспоненте; новый подход к методике расчета титра вируса ящура с применением модели зависимости порогового цикла амплификации РНК для кривой флуоресценции и титра вируса ящура в виде показательной функции с основанием 10. Применение предложенного способа позволит снизить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра вируса ящура до 3-4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чистоту РНК вируса ящура; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование; позволяет повторно использовать кДНК, что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; применять технологию молекулярных биконов, меченых флуорофором малеимидом Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; повысить достоверность проводимого анализа. Исходя их этого, актуально применять данный способ для определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.Unlike the prototype, the developed method includes the step of isolating the FMD virus RNA using 3M guanidine-HCl and white latex particles with a diameter of 300 nm; amplification of a specific fragment in the 5'-NTR RNA of the FMD virus using specific forward and reverse primers, as well as a molecular beacon labeled with the maleimide fluorophore Cyanine 5 and a luminescence quencher BHQ3; detecting RNA amplicons using fluorescence and displaying the accumulation of the signal in the form of a graph tending to an exponential; a new approach to the methodology for calculating the titer of the foot and mouth disease virus using the model of the dependence of the threshold cycle of RNA amplification for the fluorescence curve and the titer of foot and mouth disease virus in the form of an exponential function with base 10. The application of the proposed method will reduce the time of analysis of vaccinated suspensions for determining the titer of foot and mouth disease virus to 3-4 h; eliminate the likelihood of contamination; increase the purity of the FMD virus RNA; increase the specificity and sensitivity of the assay; reduce the cost of research; allows you to reuse cDNA, which leads to an increase in the concentration of RNA amplicons by at least 1 order of magnitude compared to the concentration of RNA primers; apply the technology of molecular beacons labeled with the Cyanine 5 maleimide fluorophore and the BHQ3 luminescent quencher; increase the reliability of the analysis. Based on this, it is relevant to use this method to determine the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine.

Ключевым элементом заявляемого способа является детектирование пороговых циклов кривых реакции амплификации вирусной РНК в режиме реального времени для исследуемых проб и определение титра вируса ящура с использованием разработанной математической модели зависимости точки порогового цикла амплификации РНК-мишени для кривой накопления флуоресценции и титра вируса ящура.The key element of the proposed method is the detection of threshold cycles of the viral RNA amplification reaction curves in real time for the samples under study and the determination of the FMD virus titer using the developed mathematical model of the dependence of the point of the target RNA amplification threshold cycle for the fluorescence accumulation curve and the FMD virus titer.

Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов и разработанной показательной функции с основанием 10 зависимости величины порогового цикла амплификации РНК и титра вируса ящура для опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.Comparative analysis with prototypes allows us to conclude that the novelty and inventive level of the claimed invention lies in the application of a method for amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology and a developed exponential function with base 10 of the dependence of the threshold RNA amplification cycle and FMD virus titer for the indirect determination of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины порогового цикла амплификации РНК (Ct РНК) и титра вируса ящура (ТВЯ) (Фиг. 3).The essence of the invention is illustrated on the graphical material - a graph of the dependence of the value of the threshold cycle of amplification of RNA (C t RNA ) and the titer of the FMD virus (T VV ) (Fig. 3).

Для определения титра вируса ящура подготавливают калибровочную панель стандартов вируса ящура, в качестве которых используют неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ТЦД50/см3 (тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение 50% клеток, в 1,0 см3). В данном анализе взят широкий диапазон возможных значений титра вируса ящура, применяемого при исследовании. В качестве отрицательного контроля применяют суспензию клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), не зараженную вирусом ящура.To determine the titer of the FMD virus, prepare a calibration panel of standards of the FMD virus, which are used as non-inactivated suspensions of the FMD virus with titers: 10 0 , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 TCD 50 / cm 3 (tissue cytopathic doses causing damage to 50% of cells in 1.0 cm 3 ). This assay covers a wide range of possible FMD virus titers used in the study. As a negative control, a suspension of kidney cells of a newborn Syrian hamster (BHK-21), not infected with the FMD virus, is used.

На первом этапе исследования из всех стандартных образцов и контроля выделяют РНК вируса ящура. Для этого взамен частиц кремнезема [14] применяют латексные частицы белого цвета с диаметром 300 нм. Для лизиса клеточных структур и вирусных частиц, а также ингибирования РНКаз и ДНКаз используют хаотропный агент гуанидин-HCl, но не 4 М [14], а 3 М раствор. Этого оказалось достаточно для выделения РНК и количественного определения титра вируса ящура при амплификации РНК-мишени. Тем самым достигалась экономия в расходовании данного реактива. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляют 400 мкл 3М гуанидин-HCl, перемешивают на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляют 25 мкл латексной суспензии белого цвета с диаметром частиц 300 мкл и инкубируют в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Далее суспензию центрифугируют при 2000 об/мин, удаляют супернатант и проводят промывание латексных частиц от ингибиторов реакции амплификации РНК с помощью 2М раствора перхлората лития, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Затем смесь центрифугируют при 2000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Проводят отмывание латексных частиц с применением 70% раствора этилового спирта в объеме по 500 мкл. Осуществляют центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию с этиловым спиртом повторяют. Полученный осадок латексных частиц с адсорбированными молекулами вирусной РНК высушивают от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляют 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионовAt the first stage of the study, FMD virus RNA is isolated from all standard samples and control. For this, instead of silica particles [14], white latex particles with a diameter of 300 nm are used. For the lysis of cellular structures and viral particles, as well as for the inhibition of RNases and DNases, the chaotropic agent guanidine HCl is used, but not 4 M [14], but a 3 M solution. This was sufficient for the isolation of RNA and the quantitative determination of the titer of the FMD virus during amplification of the target RNA. Thus, savings were achieved in the consumption of this reagent. To 100 μl of the suspension under study, 400 μl of 3M guanidine-HCl is added, and the mixture is vortexed for 5 min. To the resulting lysate, add 25 μl of a white latex suspension with a particle diameter of 300 μl and incubate with stirring on a vortex for 5 min. Next, the suspension is centrifuged at 2000 rpm, the supernatant is removed, and the latex particles are washed from the inhibitors of the RNA amplification reaction using 2M lithium perchlorate solution, adding it to the sediment in a volume of 400 μl. Then the mixture is centrifuged at 2000 rpm, the supernatant is removed. Latex particles are washed using 70% ethanol solution in a volume of 500 μl. The contents of the test tube are centrifuged under the same conditions. The operation with ethyl alcohol is repeated. The resulting sediment of latex particles with adsorbed viral RNA molecules is dried from alcohol residues using a dry solid-state thermostat at a temperature of 60 ± 2 ° C for 8-10 minutes. To the dried precipitate, add 50 μl of TE buffer (10 mM tris (oxymethyl) aminomethane, 1 mM ethylenediamine tetraacetate, pH 7.0-7.3), free of RNases and ions

Mg2+, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут для получения элюата РНК вируса ящура. Содержимое пробирки центрифугируют при 14000 об/мин в течение 1 мин и отбирают элюат РНК. Полученный экстракт РНК хранят при температуре -20±2°С или сразу используют в дальнейшей работе.Mg 2+ , heat the contents of the tube at a temperature of 60 ± 2 ° C for 3-5 minutes to obtain the eluate of the FMD virus RNA. The contents of the tube are centrifuged at 14000 rpm for 1 min and the RNA eluate is taken. The resulting RNA extract is stored at a temperature of -20 ± 2 ° C or immediately used in further work.

На следующем этапе осуществляют спектральное исследование элюата РНК, определяя поглощение аналитом монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем тестируют в реакции амплификации. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25°С. В выделенных экстрактах оценивают содержание остатков фосфолипидов, полисахаридов и гуанидин-HCl, полипептидов и крупных взвешенных частиц, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно [15]. Элюат РНК считают свободным от примесей белка, если OD262/OD280 (коэффициент экстинкции R1) находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения R1 указывают на наличие ДНК, белковых составляющих в элюате. Более высокие значения коэффициента R1 свидетельствуют о деградации РНК и наличии свободных рибонуклеотидов. Экстракт нуклеиновой кислоты вируса ящура считают незагрязненным полисахаридами, если OD262/OD235 (коэффициент экстинкции R2) приближен к значению 2,000 [16]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие R2 снижается на 0,002. Значения коэффициента R2

Figure 00000003
2,000 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD320 приближено к нулевому значению [16].At the next stage, a spectral study of the RNA eluate is carried out, determining the absorption of monochromatic ultraviolet light by the analyte, which makes it possible to assess the degree of purity of the extract, which is subsequently tested in the amplification reaction. Measurements of the spectral absorption capacity of the samples are carried out at wavelengths in the range 205-325 nm and a temperature of 22-25 ° C. In the isolated extracts, the content of phospholipid residues, polysaccharides and guanidine HCl, polypeptides and large suspended particles is assessed by determining the optical density (OD) values at 205, 235, 270, 280, and 320 nm, respectively [15]. The RNA eluate is considered free of protein impurities if OD262/ OD280 (extinction coefficient R1) is in the range of 1.8-2.2 and is optimally about 2.0. Lower R values1indicate the presence of DNA, protein components in the eluate. Higher values of the coefficient R1 indicate degradation of RNA and the presence of free ribonucleotides. The FMDV nucleic acid extract is considered uncontaminated with polysaccharides if OD262/ OD235(extinction coefficient R2) is close to the value 2,000 [16]. When replacing 1% of RNA with polysaccharide components R2 decreases by 0.002. R factor values2
Figure 00000003
2,000 may indicate degradation of RNA molecules. The absence of a suspension of large particles in the eluate is confirmed if OD320 close to zero [16].

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура проводят реакцию амплификации РНК для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 1.After evaluating the purity of the obtained FMD virus RNA extract, an RNA amplification reaction is carried out to study control samples and test samples. To set up the reaction, a reaction mixture is prepared, the recipe for which is presented in Table 1.

В качестве гомологичных 5'-NTR вируса ящура олигонуклеотидов используют Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-, Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймеры и 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3-6HKOH в концентрации 15 пМ на реакцию с внесением в реакционную смесь по 0,1 мкл. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и рибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (10х), содержание которого составляет 10% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5⋅10-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1%). DMSO включают в реакционную смесь, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание праймеров. В смесь добавляют 12 мМ хлорида магния. В качестве катализаторов реакции амплификации РНК применяют следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.), РНКаза Н Е. coli (10 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (10 ед.). Данные ферменты добавляют в реакционную смесь после прогревания до 65°С и приведения температуры к 41°С, поскольку эти компоненты реакции не термостабильны.Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-, Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-primers and 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5 / BHQ3-6HKOH are used as oligonucleotides homologous to 5'-NTR of the FMD virus at a concentration of 15 pM per reaction with the addition of 0.1 μl to the reaction mixture. For the formation of nucleotide chains of reaction products, deoxyribonucleoside triphosphates and ribonucleoside triphosphates with a total concentration of 2 mM in the reaction mixture are used. As a basis, a buffer solution (10x) is used, the content of which is 10% of the total volume of the reaction mixture. The buffer solution contains potassium ions (K + ) (5⋅10 -2 M) and dimethyl sulfoxide (DMSO) (1%). DMSO is included in the reaction mixture to minimize nonspecific primer binding. 12 mM magnesium chloride is added to the mixture. The following enzymes are used as catalysts for the RNA amplification reaction: AMV reverse transcriptase (10 units), E. coli RNase H (10 units), and T7 DNA-dependent RNA polymerase (10 units). These enzymes are added to the reaction mixture after heating to 65 ° C and bringing the temperature to 41 ° C, since these components of the reaction are not thermostable.

Элюаты суммарной РНК вируса ящура каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.The eluates of the total FMD virus RNA of each sample are added to the reaction mixture in 5 μl. The total volume of the mixture for one reaction is 25 μl.

Праймеры для РНК-матрицы взяты в соответствии с рядом правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [17, 18]. Флуорофор Cyanine5 присоединен к 5'-концу, содержащему С, а гаситель флуоресценции BHQ3 - к 3'-концу, содержащему G. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному бикону, которые участвуют в реакции амплификации РНК [17, 19, 20]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран Cyanine5 с длиной волны максимальной абсорбции 650 нм и длиной волны с максимальной флуоресценцией 670 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ3 с длиной волны максимального поглощения при 672 нм и возможном диапазоне гашения 620-730 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».Primers for the RNA template were taken in accordance with a number of rules, which are reflected in the works of B. Deiman and R. Sooknanan [17, 18]. The Cyanine5 fluorophore is attached to the 5'-end containing C, and the fluorescence quencher BHQ3 - to the 3'-end containing G. These conditions correspond to the requirements for oligonucleotide primers and molecular beacon, which are involved in the RNA amplification reaction [17, 19, twenty]. Cyanine5 with a maximum absorption wavelength of 650 nm and a maximum fluorescence wavelength of 670 nm was chosen as a fluorescent dye. To quench the glow, a BHQ3 fluorescence quencher was used with a wavelength of maximum absorption at 672 nm and a possible quenching range of 620-730 nm. In other words, a suitable “fluorophore-quencher” pair was selected.

При анализе нуклеотидных последовательностей гибридизационной части установили, что для олигонуклеотидных праймеров и бикона не характерно образование «шпилек» (за исключением «стеблевой» части бикона), а также не выявлено З'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя.When analyzing the nucleotide sequences of the hybridization part, it was found that the formation of “hairpins” (except for the “stem” part of the beacon) is not typical for oligonucleotide primers and beacon, and also no 3'-complementarity and sites annealing to themselves were revealed.

Последовательности праймеров и молекулярного бикона проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности РНК [21]. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [22]. Было выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.The primer and molecular beacon sequences were checked for unwanted coincidences with other nucleic acid sequences using the RNA Sequence Databank [21]. The primer sequences were also analyzed for the presence of internal secondary structures using the nucleic acid folding program using the Mfold program [22]. It was found that for the developed oligonucleotides, no unwanted coincidences with other nucleic acid sequences, as well as the presence of internal secondary structures, were found.

Постановку реакции осуществляют в термоциклере с наличием флуориметра любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2. Стадию плавления проводят при температуре 65°С в течение 5 мин за 1 цикл. Реакцию амплификации РНК в режиме реального времени осуществляют в течение 35 циклов при температуре 41°С в течение 105 минут. Каждый условный цикл длится 3 минуты и складывается из 6 подэтапов: отжиг прямого праймера на вирусной РНК, элонгация комплементарной ДНК (кДНК), разрушение гибрида РНК/кДНК, отжиг обратного праймера, элонгация второй цепи кДНК, активация промотора Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы и синтез вирусной РНК. Принципиальная схема процесса отражена на фиг. 1.The reaction is carried out in a thermal cycler with a fluorometer of any brand at temperature and time parameters, information about which is presented in Table 2. The melting stage is carried out at a temperature of 65 ° C for 5 minutes per cycle. The RNA amplification reaction in real time is carried out for 35 cycles at a temperature of 41 ° C for 105 minutes. Each conditioned cycle lasts 3 minutes and consists of 6 substages: annealing of the forward primer on viral RNA, elongation of complementary DNA (cDNA), destruction of the RNA / cDNA hybrid, annealing of the reverse primer, elongation of the second strand of cDNA, activation of the T7 promoter of DNA-dependent RNA polymerase and viral RNA synthesis. A schematic diagram of the process is shown in FIG. 1.

Принцип применяемого метода основан на проведении реакции амплификации РНК при фиксированной температуре 41°С с участием трех ферментов: AMV-ревертазы (ревертаза вируса миелобластоза птиц), РНКазы Н Е. coli и Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, полученной рекомбинантным способом из бактериофага Т7, специфических прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров и молекулярного бикона для экспонециальной амплификации РНК. В результате этого процесса в ходе реакции происходит накопление миллиардов специфических фрагментов вирусной РНК-мишени. После инкубации РНК вируса ящура при 65°С в течение 5 мин, при котором осуществляется денатурация нуклеиновой кислоты, начинается линейная стадия реакции амплификации, когда специфический прямой праймер (Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-npaftMep) гибридизируется с участком вирусной РНК. Данный олигонуклеотидный праймер включает в свой состав специфическую гибридизационную часть, а также промоторную последовательность Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы. При температуре 41°С AMV-ревертаза проводит элонгацию, создавая ДНК-копию с вирусной РНК-мишени. В результате формируется гибрид типа РНК/кДНК. Для РНКазы Н E.coli данный гибрид является субстратом. Фермент гидролизует РНК, оставляя одноцепочечную кДНК. С данной нитью кДНК гибридизуется обратный праймер (Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймер). AMV-ревертаза вновь удлиняет к ДНК до 5'-конца с образованием двуцепочечной кДНК, что приводит промотор Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы в функциональное состояние. Фермент Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза воспринимает двуцепочечную кДНК с функциональным промотором в качестве субстрата. Подготовленный молекулярный бикон, комплементарный определенному участку РНК-мишени, гибридизутся с РНК. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель флуоресценции в составе молекулярного бикона сближены. Благодаря механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии свечение подавлено. После линейной стадии реакция амплификации РНК вступает в циклический процесс.Обратный праймер гибридизуется с вновь синтезированной молекулой РНК вируса ящура. Фермент AMV-ревертаза проводит элонгацию кДНК. В результате образуется гибрид РНК/кДНК. За счет активности РНКазы Н Е. coli после отжига бикона происходит гидролиз РНК, наблюдается пространственное разделение флуорофора и гасителя свечения, что приводит к росту детектируемого сигнала при длине волны 670 нм. Затем прямой праймер гибридизируется с кДНК, а AMV-ревертаза удлиняет его с образованием двуцепочечной кДНК. Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК вируса ящура. После этого запускается следующий цикл амплификации РНК [17, 23, 24].The principle of the applied method is based on carrying out the RNA amplification reaction at a fixed temperature of 41 ° C with the participation of three enzymes: AMV-revertase (revertase of avian myeloblastosis virus), E. coli RNase H and T7 DNA-dependent RNA polymerase, recombinantly obtained from bacteriophage T7 , specific forward and reverse oligonucleotide primers and molecular beacon for exponential RNA amplification. As a result of this process, in the course of the reaction, there is an accumulation of billions of specific fragments of the viral target RNA. After incubation of the FMD virus RNA at 65 ° C for 5 min, during which denaturation of the nucleic acid occurs, the linear stage of the amplification reaction begins, when a specific forward primer (Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-npaftMep) hybridizes with a region of viral RNA ... This oligonucleotide primer includes a specific hybridization part, as well as the promoter sequence of T7 DNA-dependent RNA polymerase. At a temperature of 41 ° C, AMV-revertase elongates, creating a DNA copy from the viral RNA target. As a result, a hybrid of the RNA / cDNA type is formed. For E. coli RNase H, this hybrid is a substrate. The enzyme hydrolyzes RNA, leaving a single-stranded cDNA. A reverse primer (Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV primer) hybridizes to this cDNA strand. AMV revertase again extends to DNA to the 5'-end to form double-stranded cDNA, which brings the T7 promoter of DNA-dependent RNA polymerase into a functional state. The T7 enzyme DNA-dependent RNA polymerase accepts double-stranded cDNA with a functional promoter as a substrate. The prepared molecular beacon, complementary to a specific region of the target RNA, hybridizes with the RNA. In the absence of a target, the fluorophore and the fluorescence quencher in the molecular beacon are close together. Due to the mechanism of fluorescence resonance energy transfer, the luminescence is suppressed. After the linear stage, the RNA amplification reaction enters into a cyclic process. The reverse primer hybridizes with the newly synthesized FMD virus RNA molecule. The enzyme AMV-revertase carries out cDNA elongation. The result is an RNA / cDNA hybrid. Due to the activity of E. coli RNase H, after annealing of the beacon, hydrolysis of RNA occurs, spatial separation of the fluorophore and the luminescent quencher is observed, which leads to an increase in the detected signal at a wavelength of 670 nm. The forward primer then hybridizes to the cDNA, and AMV revertase extends it to form a double-stranded cDNA. T7 DNA-dependent RNA polymerase synthesizes FMD virus RNA. After this, the next cycle of RNA amplification starts [17, 23, 24].

Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации Ct рнк, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции

Figure 00000004
Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации РНК. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической РНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют экспонециальные кривые, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного бикона. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспонециальная кривая.The results of the RNA amplification reaction in real time are analyzed by evaluating and comparing the graphs of the fluorescent signal accumulation by the values of the threshold amplification cycles C t rnc, determined by crossing the threshold line and logarithmic display of the function
Figure 00000004
The results are taken into account in the reaction at each cycle. The device determines the level of fluorescence and builds a kinetic curve in the coordinates: the level of fluorescence - the cycle of RNA amplification. If a specific RNA template is present in the test sample, the kinetic curve has an exponential relationship. Samples are considered positive if they correspond to the exponential curves obtained in the analysis of the fluorescence of the dye that is part of the molecular beacon. Samples are considered negative if there is no exponential curve in their analysis.

Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации РНК и титром вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:

Figure 00000005
где k - угловой коэффициент в зависимости
Figure 00000006
а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.The relationship between the threshold cycle of RNA amplification and the titer of the FMD virus in non-inactivated raw materials for the vaccine is established in the process of constructing an exponential function with base 10. The magnitude of the amplification reaction efficiency (E) is estimated by the formula:
Figure 00000005
where k is the slope depending
Figure 00000006
as well as the reliability of the approximation (R 2 ). Based on the developed model, the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw material for the vaccine is calculated.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.

Пример 1. Выражение функции зависимости титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины и порогового цикла реакции амплификации вирусной РНК в виде показательного уравнения с основанием 10.Example 1. Expression of the function of dependence of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine and the threshold cycle of the amplification reaction of viral RNA in the form of an exponential equation with base 10.

Для определения титра вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 подготавливали калибровочную панель стандартов вируса ящура, в качестве которых использовали неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ТЦД50/см. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом ящура.To determine the titer of the FMD virus strain Asia-1 / Tajikistan / 2011, a calibration panel of FMD virus standards was prepared, which were used as non-inactivated suspensions of the FMD virus with titers: 10 0 , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 TCD 50 / cm. As a negative control, a BHK-21 cell suspension not infected with FMD virus was used.

Из всех контролей выделяли РНК вируса ящура штамма Азия-1 /Таджикистан/2011. К 100 мкл исследуемых суспензий добавляли по 400 мкл 3М гуанидин-HCl, перемешивали на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляли 25 мкл латексной суспензии белого цвета с диаметром частиц 300 мкл и инкубировали в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Далее суспензию центрифугировали при 2000 об/мин, удаляли супернатант и проводили промывание латексных частиц от ингибиторов реакции амплификации РНК с помощью 2М раствора перхлората лития, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Затем смесь центрифугировали при 2000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Далее проводили отмывание латексных частиц с применением 70% раствора этилового спирта в объеме по 500 мкл. Осуществляли центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию с этиловым спиртом проводили дважды. Полученный осадок латексных частиц с адсорбированными молекулами вирусной РНК высушивали от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg2+, прогревали содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут для получения элюата РНК вируса ящура. Содержимое пробирки центрифугировали при 14000 об/мин в течение 1 мин и отбирали элюат РНК. Полученный экстракт РНК использовали в дальнейшей работе без замораживания.FMD virus RNA strain Asia-1 / Tajikistan / 2011 was isolated from all controls. To 100 μL of the suspensions under study, 400 μL of 3M guanidine-HCl was added, and the mixture was vortexed for 5 min. To the resulting lysate, 25 μL of a white latex suspension with a particle diameter of 300 μL was added and incubated with vortexing for 5 min. Then the suspension was centrifuged at 2000 rpm, the supernatant was removed, and the latex particles were washed from the inhibitors of the RNA amplification reaction using 2M lithium perchlorate solution, adding it to the sediment in a volume of 400 μL. Then the mixture was centrifuged at 2000 rpm, the supernatant was removed. Next, the latex particles were washed using a 70% ethanol solution in a volume of 500 μl. The contents of the tube were centrifuged under the same conditions. The operation with ethyl alcohol was performed twice. The resulting sediment of latex particles with adsorbed viral RNA molecules was dried from alcohol residues using a dry solid-state thermostat at a temperature of 60 ± 2 ° C for 8-10 min. To the dried sediment, 50 μL of TE buffer (10 mM tris (oxymethyl) aminomethane, 1 mM ethylenediamine tetraacetate, pH 7.0-7.3) free of RNases and Mg 2+ ions was added, the contents of the tube were heated at a temperature of 60 ± 2 ° C for 3-5 minutes to obtain the FMD virus RNA eluate. The contents of the tube were centrifuged at 14000 rpm for 1 min, and the RNA eluate was collected. The resulting RNA extract was used in further work without freezing.

На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов РНК вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (1=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (Фиг. 2, таблица 3).At the next stage of the study, using spectral analysis in ultraviolet light, the purity of the obtained FMD virus RNA eluates of the Asia-1 / Tajikistan / 2011 strain from the dilutions of the standard was assessed. RNA samples were scanned in quartz cuvettes (1 = 10 mm) at a temperature of 23-25 ° C and extinction values were recorded in the range from 205 to 325 nm every 2 nm, recording the RNA absorption spectrum using the Specrtrum v. 5.0 (Fig. 2, table 3).

По результатам анализа стандартов выявили, что значения OD205-259 и OD263-325 не превышают OD260-262, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (Фиг. 2, таблица 3) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидин-HCl, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициента экстинкции R1 для стандартов приближены к норме 2,000 (R1=1,998-2,000), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не наблюдалось, так как R1 не превышал 2,000. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и гуанидин-HCl, поскольку значения коэффициента экстинкции R2 приближены к норме 2,000 и соответствовали 1,992-2,000. Учитывая, что при замещении 1% РНК на углеводы значение R2 уменьшается на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисахаридных примесей составило не более 4%, что допустимо. Разрушения РНК в экстрактах не обнаружено данным методом. Таким образом, экстракты РНК вируса ящура, выделенные из стандартов, характеризуются высокой степенью чистоты [15, 16] и могут быть использованы для дальнейшего исследования.According to the results of the analysis of the standards, it was revealed that the values of OD205-259 and OD 263-325 do not exceed OD 260-262 , which is a sign of a high degree of purity of the obtained RNA eluates (n = 3). From the data of the spectral study of the standards, the absence of pronounced peaks in the graphs (Fig. 2, table 3) at wavelengths 205, 235, 270, 280 and 320 nm was noted, which indicated the almost complete absence of contamination of RNA extracts with impurities of phospholipids, polysaccharides and guanidine residues. HCl, polypeptides and large conglomerates, respectively. The values of the extinction coefficient R 1 for the standards are close to the norm of 2.000 (R 1 = 1.998-2.000), which confirms the absence of DNA and the presence of only trace amounts of protein impurities. Nucleic acid degradation and the presence of free nucleotides in the eluates were not observed, since R 1 did not exceed 2,000. Viral RNA extracts are not contaminated with polysaccharides and guanidine-HCl, since the values of the extinction coefficient R 2 are close to the norm of 2,000 and correspond to 1,992-2,000. Considering that when 1% of RNA is replaced by carbohydrates, the value of R 2 decreases by 0.002, the presence of polysaccharide impurities in the obtained extracts was no more than 4%, which is permissible. RNA destruction in the extracts was not detected by this method. Thus, the FMD virus RNA extracts isolated from the standards are characterized by a high degree of purity [15, 16] and can be used for further research.

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура проводили реакцию амплификации РНК для исследования стандартов. Для постановки реакции готовили реакционную смесь в соответствии с данными таблицы 1. В качестве катализаторов реакции применяли следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.), РНКаза Н Е. coli (10 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (10 ед.). Их добавляли в реакционную смесь после прогревания до 65°С и приведения температуры к 41°С. Элюаты суммарной РНК вируса ящура каждого образца добавляли к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составил 25 мкл.After evaluating the purity of the obtained FMD virus RNA extract, an RNA amplification reaction was carried out to study the standards. To set up the reaction, a reaction mixture was prepared in accordance with the data in Table 1. The following enzymes were used as reaction catalysts: AMV reverse transcriptase (10 units), E. coli RNase H (10 units) and T7 DNA-dependent RNA polymerase ( 10 units). They were added to the reaction mixture after heating to 65 ° C and bringing the temperature to 41 ° C. The eluates of the total RNA of the FMD virus of each sample were added to the reaction mixture in 5 μl. The total volume of the mixture for one reaction was 25 μL.

Постановку реакции осуществляли при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2.The reaction was carried out at temperature and time parameters, information about which is presented in Table 2.

Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации РНК Ct рнк, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (Ct РНК). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации РНК и титром вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Полученные данные отражены на фиг. 3 и выражены в виде показательной функции с основанием 10:

Figure 00000007
Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:
Figure 00000008
(k из функции
Figure 00000009
а также достоверность аппроксимации (R). Эффективность реакции амплификации РНК составила 98,89%, достоверность аппроксимации -0,9966, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [24].The results of the RNA amplification reaction in real time were analyzed by evaluating and comparing the graphs of the fluorescent signal accumulation according to the values of the threshold cycles of RNA amplification C t rnc , determined by crossing the threshold line and logarithmic display of the function Fl = f (C t RNA ). The relationship between the threshold RNA amplification cycle and the FMD virus titer in non-inactivated vaccine raw materials was established in the process of constructing an exponential function with base 10. The data obtained are shown in FIG. 3 and expressed as an exponential function with base 10:
Figure 00000007
The value of the efficiency of the amplification reaction (E) was estimated by the formula:
Figure 00000008
(k from function
Figure 00000009
as well as the reliability of the approximation (R). The efficiency of the RNA amplification reaction was 98.89%, the accuracy of the approximation was -0.9966, which corresponded to the generally accepted requirements for molecular biological test systems [24].

Пример 2. Опосредованное определение титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.Example 2. Indirect determination of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology.

Для анализа использовали неинактивированные суспензии культурального вируса ящура штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, CAT-1/Ахал кал акский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65 с титрами вируса 106,75, 107,00, 108,25, 106,75, 107,25, 107,00 ТЦД50/см3, соответственно. В качестве положительного контроля применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 с титром вируса 107,00 ТЦД50/см3. Отрицательным контролем служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 4 и на фиг. 4.For the analysis, we used non-inactivated suspensions of the cultured FMD virus strains A / Zabaikalsky / 2013, O / Saudi Arabia / 2008, Asia-1 / Tajikistan / 2011, CAT-1 / Akhal Kalaksky / 62, CAT-2 / Saudi Arabia / 2000, CAT -3 / Bechuanaland / 65 with virus titers 10 6.75 , 10 7.00 , 10 8.25 , 10 6.75 , 10 7.25 , 10 7.00 TCD 50 / cm 3 , respectively. As a positive control, a non-inactivated suspension of the cultured FMD virus strain A / Zabaikalsky / 2013 with a virus titer of 10 7.00 TCD 50 / cm 3 was used . A suspension of BHK-21 cells with a concentration of 2.50-3.00 million cells / cm3, not infected with the FMD virus, served as a negative control. The test samples and control samples were examined in triplicate. The stages of RNA isolation, assessment of their purity and the setting of the viral RNA amplification reaction were carried out as described in example 1. The results of the study are presented in table 4 and in FIG. 4.

Из данных спектрограмм элюатов РНК проб вируса ящура (Фиг. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышали OD260-262, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидин-HCl, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах (фиг. 4) отсутствовали выраженные пики при X 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции R1 для проб вируса ящура штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-З/Бечуаналенд/65 составляют 1,992; 2,000; 1,988; 2,000; 1,992; 2,000, что приближено к значению нормы 2,000 и означает высокую степень чистоты элюатов РНК вируса ящура, практически полное отсутствие белка. Коэффициент экстинкции R2 для проб вируса ящура штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65 соответствовали значению нормы 2,000, что обуславливало высокую чистоту препаратов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [15, 16] и их можно использовать для дальнейших исследований.From these spectrograms of RNA eluates of FMD virus samples (Fig. 4), it can be seen that the average extinction values at wavelengths 205-259 and 263-325 nm did not exceed OD 260-262 , in other words, the RNA eluates were characterized by a high degree of purity. The extracts were not contaminated with impurities of phospholipids, polysaccharides and guanidine-HCl residues, polypeptides and large conglomerates, since there were no pronounced peaks at X 205, 235, 270, 280 and 320 nm in the spectrograms (Fig. 4), respectively. Extinction coefficient R 1 for FMD virus samples of A / Zabaikalsky / 2013, O / Saudi Arabia / 2008, Asia-1 / Tajikistan / 2011, CAT-1 / Akhalkalaki / 62, CAT-2 / Saudi Arabia / 2000, CAT-Z / Bechuanaland / 65 are 1.992; 2,000; 1,988; 2,000; 1.992; 2,000, which is close to the normal value of 2,000 and means a high degree of purity of FMD virus RNA eluates, almost complete absence of protein. Extinction coefficient R 2 for FMD virus samples of strains A / Zabaikalsky / 2013, O / Saudi Arabia / 2008, Asia-1 / Tajikistan / 2011, CAT-1 / Akhalkalaki / 62, CAT-2 / Saudi Arabia / 2000, CAT-3 / Bechuanaland / 65 corresponded to the value of the norm of 2,000, which determined the high purity of the preparations. Thus, the obtained preparations met the purity requirements [15, 16] and they can be used for further research.

С полученными элюатами неинактивированного вируса ящура проводили реакцию амплификации РНК. С помощью разработанного способа опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов получали данные, отраженные в таблице 4. Из данных таблицы 4 следует, что средние значения пороговых циклов амплификации РНК для проб штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, САТ-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65 составляли 12,72±0,01, 11,91±0,02, 7,73±0,01, 12,62±0,03, 11,18±0,03, 12,05±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной показательной функцией

Figure 00000010
(R2=0,9966, Е=98,89%), рассчитали средние значения титра вируса ящура для проб штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65: 106,76, 107,00, 108,23, 106,79, 107,21, 106,95 ТЦД50/см3, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации РНК составило 11,88±0,01, что соответствовало титру вируса ящура 107,00 ТЦД50/см3. Для отрицательного контроля график экспоненты не был сформирован, что означало отсутствие вируса ящура в данном образце.With the obtained eluates of non-inactivated FMD virus, an RNA amplification reaction was carried out. Using the developed method for the indirect determination of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology, the data shown in Table 4 were obtained. 12 , 72 ± 0.01, 11.91 ± 0.02, 7.73 ± 0.01, 12.62 ± 0.03, 11.18 ± 0.03, 12.05 ± 0.01, respectively. Using the developed exponential function
Figure 00000010
(R 2 = 0.9966, E = 98.89%), calculated the average titer of the foot and mouth disease virus for samples of strains A / Zabaikalsky / 2013, O / Saudi Arabia / 2008, Asia-1 / Tajikistan / 2011, CAT-1 / Akhalkalaki / 62, CAT-2 / Saudi Arabia / 2000, CAT-3 / Bechuanaland / 65: 10 6.76 , 10 7.00 , 10 8.23 , 10 6.79 , 10 7.21 , 10 6.95 TCD 50 / cm 3 , respectively. For the positive control, the value of the threshold cycle of RNA amplification was 11.88 ± 0.01, which corresponded to a FMD virus titer of 10 7.00 TCD 50 / cm 3 . For the negative control, the exponential graph was not formed, which meant the absence of FMD virus in this sample.

Исследуемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии IB-RS-2. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100%. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.The studied samples and controls were also tested by the classical titration method in the monolayer cell line IB-RS-2. It was found that the data obtained using the developed method correlated with the titration method in cell culture by 99-100%. The results obtained indicated a high degree of accuracy of the developed method for indirect determination of the FMD virus titer in non-inactivated vaccine raw materials during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology.

Таким образом, предложенный способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов позволяет оценивать титр вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.Thus, the proposed method for the indirect determination of the FMD virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology makes it possible to estimate the titer of the FMD virus in non-inactivated raw materials for a vaccine.

Пример 3. Определение аналитической чувствительности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.Example 3. Determination of the analytical sensitivity of the method for indirect estimation of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology.

Для определения аналитической чувствительности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов использовали неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013. Подготавливали калибровочную панель стандартов вируса ящура с титрами: 100, 100,5, 101,0, 101,5, 102,0, 102,5, 103,0, 104,0, 105,0, 106,0, 107,0, 108,0, 109,0 ТЦД50/см3. Испытуемые контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 5, в которой представлен сравнительный анализ определения титра вируса ящура разработанным способом в сравнении с прототипным способом. Выявлено, что с достоверностью 96% разработанным способом определены титры вируса ящура со значениями от 102,5 до 109,0 ТЦД50/см3, с достоверностью 93-96% - с титрами от 101,5 до 102,5 ТЦД50/см3, с достоверностью 91-94%) - с титрами от 100,5 до 101,5 ТЦД50/см3. При сравнении результатов определения титра вируса ящура предложенным способом с эталонными значениями достоверность составила для диапазона 107,0-109,0 ТЦД50/см3 99-100%), для 104,0-107,0ТЦД50/см3 - 98-99%, для 102,5 - 104,0 ТЦД50/см3 96-97%, для 101,5 - 102,5ТЦД50/см3 - 94-96%, для 100,5 - 101,5 ТЦД50/см3 - 93-94%. Наиболее часто для производства противоящурных вакцин применяют неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами более 106,75, ТЦД50/см3, следовательно, для данных образцов достоверность определения титра вируса 97-100%. При анализе проб с титрами от 100,0 до 100,5 ТЦД50/см3 титры вируса ящура были определены с достоверностью 40-91%, однако, прототипными методами определить значения вирусной нагрузки суспензии не удалось, поскольку аналитическая чувствительность тест-систем, применяемых при титровании вируса в культуре клеток и методом ОТ-ПЦР-РВ, выше, чем 100,5 ТЦД50/см3 To determine the analytical sensitivity of the method for indirect estimation of the FMD virus titer in non-inactivated raw materials for vaccines during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology, a non-inactivated suspension of the cultured FMD virus strain A / Zabaikalskiy / 2013 was used. Prepared a calibration panel of FMD virus standards with titers: 10 0 , 10 0.5 , 10 1.0 , 10 1.5 , 10 2.0 , 10 2.5 , 10 3.0 , 10 4.0 , 10 5, 0 , 10 6.0 , 10 7.0 , 10 8.0 , 10 9.0 TCD 50 / cm 3 . Test control samples were tested in five replicates. The stages of RNA isolation, assessment of their purity and the setting of the amplification reaction of viral RNA were carried out as described in example 1. The results of the study are presented in table 5, which presents a comparative analysis of determining the titer of the foot and mouth disease virus by the developed method in comparison with the prototype method. It was revealed that with a reliability of 96%, the developed method determined the titers of the FMD virus with values from 10 2.5 to 10 9.0 TCD 50 / cm 3 , with a reliability of 93-96% - with titers from 10 1.5 to 10 2.5 TCD 50 / cm 3 , with a reliability of 91-94%) - with titers from 10 0.5 to 10 1.5 TCD 50 / cm 3 . When comparing the results of determining the titer of the FMD virus by the proposed method with the reference values, the reliability was for the range 10 7.0 -10 9.0 TCD 50 / cm 3 99-100%), for 10 4.0-10 7.0 TCD 50 / cm 3 - 98-99%, for 10 2.5 - 10 4.0 TCD 50 / cm 3 96-97%, for 10 1.5 - 10 2.5 TCD 50 / cm 3 - 94-96%, for 10 0.5 - 10 1.5 TCD 50 / cm 3 - 93-94%. Most often, for the production of FMD vaccines, non-inactivated suspensions of the foot-and-mouth disease virus with titers of more than 10 6.75 , TCD 50 / cm 3 are used , therefore, for these samples, the reliability of determining the titer of the virus is 97-100%. When analyzing samples with titers from 10 0.0 to 10 0.5 TCD 50 / cm 3, the titers of the FMD virus were determined with a reliability of 40-91%, however, prototype methods could not determine the values of the viral load of the suspension, since the analytical sensitivity of the test systems used for titration of the virus in cell culture and by RT-PCR-RT, higher than 10 0.5 TCD 50 / cm 3

Таким образом, аналитическая чувствительность способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов составляет 10 ТЦД50/см с достоверностью результатов исследования 91-100%.Thus, the analytical sensitivity of the method for indirect estimation of the FMD virus titer in non-inactivated vaccine raw materials during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology is 10 TCD 50 / cm with the reliability of the research results 91-100%.

Пример 4. Оценка специфичности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.Example 4. Evaluation of the specificity of the method for indirect assessment of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for the vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology.

Для оценки специфичности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов, исследовали неинактивированные суспензии вируса ящура штаммов А/Забайкальский/13, О/Приморский/14, Азия-1/Шамир/89, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-З/Бечуаналенд/65. Также тестировали суспензии вирусов бешенства, инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, весенней виремии карповых, инфекционного некроза поджелудочной железы, везикулярной болезни свиней, везикулярного стоматита. Титр вирусов в суспензиях составлял 103,0 ТЦД50/см3. Исследования проводили в трех повторностях.To assess the specificity of the method for indirect estimation of the FMD virus titer in non-inactivated raw materials for vaccines during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology, non-inactivated suspensions of the FMD virus strains A / Zabaikalsky / 13, O / Primorsky / 14, Asia 1 / Shamir / 89, SAT-1 / Akhalkalaki / 62, CAT-2 / Saudi Arabia / 2000, SAT-Z / Bechuanaland / 65. Suspensions of rabies viruses, infectious necrosis of hematopoietic tissue of salmonids, spring viremia of cyprinids, infectious necrosis of the pancreas, porcine vesicular disease, and vesicular stomatitis were also tested. The titer of viruses in suspensions was 10 3.0 TCD 50 / cm 3 . The studies were carried out in triplicate.

Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили так, как описано в примере 1. Выделенные экстракты РНК характеризовались высокими показателями степени чистоты, поскольку коэффициенты экстинкции R1 и R2 находились в диапазоне 1,995-2,002, что соответствовало требованиям [15, 16].The stages of RNA isolation, assessment of their purity and the setting of the amplification reaction of viral RNA were carried out as described in example 1. The isolated RNA extracts were characterized by high levels of purity, since the extinction coefficients R 1 and R 2 were in the range of 1.995-2.002, which corresponded to the requirements [15, 16].

С полученными элюатами неинактивированного вируса ящура проводили реакцию амплификации РНК, как отражено в примере 1. В ходе реакции амплификации РНК вирусов с олигонуклеотидами, специфичными 5'-NTR вируса ящура, фиксировали экспоненциальные графики накопления флуоресцентного сигнала только для штаммов вируса ящура. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,0125 у.е.) (таблица 6). Иными словами, подтверждена специфичность способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконовWith the obtained eluates of non-inactivated FMD virus, an RNA amplification reaction was carried out, as described in example 1. During the amplification reaction of RNA viruses with oligonucleotides specific for the 5'-NTR of the FMD virus, exponential graphs of the fluorescent signal accumulation were recorded only for FMD virus strains. For samples containing other viruses, the formation of exponent curves was not observed, and they did not go beyond the threshold level of the fluorescent signal (0.0125 cu) (Table 6). In other words, the specificity of the method for indirect estimation of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw material for the vaccine was confirmed during the amplification of viral nucleic acid and the detection of RNA amplicons using the molecular beacon technology.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения по сравнению со способом титрования в культуре клеток является возможность снизить время проведения анализа неинактивированных вируссодержащих суспензий для определения титра вируса ящура до 3-4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование. В предлагаемом изобретении между титром вируса ящура и пороговым циклом амплификации РНК установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации (R=0,9966) и эффективностью амплификации 98,89%. Предложенная математическая модель

Figure 00000011
дает возможность оценивать значение титра вируса ящура разных типов в неинактивированном сырье для производства вакцины.The main advantages of the present invention in comparison with the method of titration in cell culture is the ability to reduce the time of analysis of non-inactivated vaccinated suspensions for determining the titer of the foot and mouth disease virus to 3-4 hours; eliminate the likelihood of contamination; increase the specificity and sensitivity of the assay; reduce the cost of research. In the proposed invention between the titer of the FMD virus and the threshold cycle of RNA amplification, a relationship is established, reflected in the form of an exponential function with a base 10 with high accuracy of approximation (R = 0.9966) and an amplification efficiency of 98.89%. The proposed mathematical model
Figure 00000011
makes it possible to assess the value of the titer of the FMD virus of different types in non-inactivated raw materials for the production of a vaccine.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять значение титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов и с последующим применением разработанной математической модели.The proposed invention makes it possible to quickly and with a high degree of reliability determine the titer of the foot-and-mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine based on amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology and subsequent application of the developed mathematical model.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов»:Sources of information taken into account in the preparation of the description of the invention to the application for the grant of a patent of the Russian Federation for the invention "Method for the indirect determination of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology":

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.2. Ponomarev A.P., Uzyumov V.L. FMD virus: structure, biological and physicochemical properties. Vladimir: Foliant, 2006 .-- 250 p.

3. Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A.L. and Garland, A.J.M. (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease. J. Compr. Pathol., V. 129. - P. 268-282.3. Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A.L. and Garland, A.J.M. (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease. J. Compr. Pathol., V. 129. -P. 268-282.

4. Lubroth, J., Rodriguez, L. and Dekker, A. (2006) Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. P. 517-536.4. Lubroth, J., Rodriguez, L. and Dekker, A. (2006) Vesicular diseases. In: Straw, BE, Zimmerman, JJ, D'Allaire, S. and Taylor, DJ, editors. Diseases of Swine. 9 th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. P. 517-536.

5. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Дис… канд. ветер, наук: 16.00.03. -Владимир, 2008. - 146 с.5. Zhiltsova M.B. Biological properties of epizootic isolates of the FMD virus types A, O and Asia-1: Dis ... cand. wind, sciences: 16.00.03. -Vladimir, 2008 .-- 146 p.

6. Baeumner, A.J., Humiston, М.С, Montagna, R. A., and Durst, R.А. (2001) Detection of viable oocysts of Cryptosporidium parvum following nucleic acid sequence based amplification. Anal. Chem. - Vol.73. - P. 1176-1180.6. Baeumner, A. J., Humiston, M. C, Montagna, R. A., and Durst, R. A. (2001) Detection of viable oocysts of Cryptosporidium parvum following nucleic acid sequence based amplification. Anal. Chem. - Vol.73. - P. 1176-1180.

7. Blok, M.J., Goossens, V.J., van Herle, S.J., et al. (1998a) Diagnostic value of monitoring human cytomegalovirus late pp67 mRNA expression in renalallograft recipients by nucleic acid sequence-based amplification. J. Clin. Microbiol. - Vol. 36. - P. 1341-1346.7. Blok, M. J., Goossens, V. J., van Herle, S. J., et al. (1998a) Diagnostic value of monitoring human cytomegalovirus late pp67 mRNA expression in renalallograft recipients by nucleic acid sequence-based amplification. J. Clin. Microbiol. - Vol. 36. - P. 1341-1346.

8. Mahony, J.В., Song, X., Chong, S., Faught, M., Salonga, Т., and Kapala, J. (2001) Evaluation of the NucliSens Basic Kit for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genital Tract Specimens Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of 16S rRNA. J. Clin. Microbiol. - Vol.39. - P. 1429-1435.8. Mahony, J. B., Song, X., Chong, S., Faught, M., Salonga, T., and Kapala, J. (2001) Evaluation of the NucliSens Basic Kit for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genital Tract Specimens Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of 16S rRNA. J. Clin. Microbiol. - Vol.39. - P. 1429-1435.

9. Morre, S. A., Sillekens, P. Т., Jacobs, M. V., et al. (1996) RNA amplification by nucleic acid sequencebased amplification with an internal standard enables reliable detection of Chlamydia trachomatis in cervical scrapings and urine samples. J. Clin. Microbiol. - Vol. 34. - P. 3108-3114.9. Morre, S. A., Sillekens, P. T., Jacobs, M. V., et al. (1996) RNA amplification by nucleic acid sequencebased amplification with an internal standard enables reliable detection of Chlamydia trachomatis in cervical scrapings and urine samples. J. Clin. Microbiol. - Vol. 34 .-- P. 3108-3114.

10. Ovyn, C, van Strijp, D., Ieven, M., Ursi, D., van Gemen, В., and Goossens, H. (1996) Typing of Mycoplasma pneumoniae by Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA®. Molecular and Cellular Probes - Vol. 10 - P. 319-324.10. Ovyn, C, van Strijp, D., Ieven, M., Ursi, D., van Gemen, B., and Goossens, H. (1996) Typing of Mycoplasma pneumoniae by Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA® ... Molecular and Cellular Probes - Vol. 10 - P. 319-324.

11. Song, X., Coombes, В. K., and Mahony, J.B. (2000) Quantitation of Chlamydia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent microtiter plate assay. Comb. Chem. High Throughput Screening. - Vol. 3. - P. 303-313.11. Song, X., Coombes, B. K., and Mahony, J.B. (2000) Quantitation of Chlamydia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent microtiter plate assay. Comb. Chem. High Throughput Screening. - Vol. 3. - P. 303-313.

12. Van der Vliet, G., Cho, S-N., Kampirapap, K., et al. (1996) Use of NASBA® RNA amplification for detection of Mycobacterium leprae in skin biopsies from untreated and treated leprosy patients. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis.-Vol.64.-P. 396-4103.12. Van der Vliet, G., Cho, S-N., Kampirapap, K., et al. (1996) Use of NASBA® RNA amplification for detection of Mycobacterium leprae in skin biopsies from untreated and treated leprosy patients. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis.-Vol. 64.-P. 396-4103.

13. Van Deursen, P.В. H., Gunther, A. W., Spaargarenvan Riel, С.C, et al. (1999) A novel quantitative multiplex NASBA method: application to measuring tissue factor and CD14 mRNA levels in human monocytes. Nucleic Acids Res. - Vol. 27, e15 (i-vi).13. Van Deursen, P. B. H., Gunther, A. W., Spaargarenvan Riel, C. C, et al. (1999) A novel quantitative multiplex NASBA method: application to measuring tissue factor and CD14 mRNA levels in human monocytes. Nucleic Acids Res. - Vol. 27, e15 (i-vi).

14. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Hansen C.L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.14. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Hansen C. L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.

15. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 02.11.2019).15. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Electronic resource] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Date of treatment 11/02/2019).

16. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.16. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.

17. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol.20. - P. 163-179.17. Deiman B., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol.20. - P. 163-179.

18. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.18. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.

19. Lambrechts, A.C, Bosma, A.J., Klaver, S.G., et al. (1999) Comparison of immunocytochemistry, reverse transcriptase polymerase chain reaction, and Nucleic Acid Sequence-Based Amplification for the detection of circulating breast cancer cells. Breast Cancer Res. Treat. - Vol. 56. - P. 219-231.19. Lambrechts, A. C, Bosma, A. J., Klaver, S. G., et al. (1999) Comparison of immunocytochemistry, reverse transcriptase polymerase chain reaction, and Nucleic Acid Sequence-Based Amplification for the detection of circulating breast cancer cells. Breast Cancer Res. Treat. - Vol. 56. - P. 219-231.

20. Loeffler, J., Hebart, H., Cox, P., Flues, N., Schumacher, U., and Einsele, H. (2001) Nucleic acid sequence-based amplification of aspergillus RNA in blood samples. J. Clin. Microbiol. - Vol. 39. - P. 1626-1629.20. Loeffler, J., Hebart, H., Cox, P., Flues, N., Schumacher, U., and Einsele, H. (2001) Nucleic acid sequence-based amplification of aspergillus RNA in blood samples. J. Clin. Microbiol. - Vol. 39. - P. 1626-1629.

21. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.12.2019).21. GenBank. [Electronic resource] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Date of treatment: 02.12.2019).

22. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form.cgi (Дата обращения: 21.12.2019).22. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Electronic resource] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form.cgi (Date of access: 21.12.2019).

23. Uyttendaele, M., Bastiaansen, A., and Debevere, J. (1997) Evaluation of the NASBA nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni. Int. J. Food Microbiol. - Vol.37. - P. 13-20.23. Uyttendaele, M., Bastiaansen, A., and Debevere, J. (1997) Evaluation of the NASBA nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni. Int. J. Food Microbiol. - Vol.37. - P. 13-20.

24. Van Strijp D., van Aarle P. NASBA: a method for nucleic acid diagnostics // Methods in molecular medicine-Totowa, NJ: Humana press. - 1995. - P. 331-340.24. Van Strijp D., van Aarle P. NASBA: a method for nucleic acid diagnostics // Methods in molecular medicine-Totowa, NJ: Humana press. - 1995. - P. 331-340.

Figure 00000012
Figure 00000012

Figure 00000013
Figure 00000013

Figure 00000014
Figure 00000014

Figure 00000015
Figure 00000015

Figure 00000016
Figure 00000016

Figure 00000017
Figure 00000017

Claims (17)

1. Способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов, отличающий тем, что включает следующие стадии и разработанную математическую модель:1. A method for the indirect determination of the titer of the foot and mouth disease virus in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of RNA amplicons using molecular beacon technology, characterized in that it includes the following stages and a developed mathematical model: - подготовка калибровочной панели стандартов вируса ящура, в качестве которых используют неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ТЦД50/см3 (положительные контроли), а также суспензию клеток из почки свиньи IB-RS-2, не зараженную вирусом ящура (отрицательный контроль);- preparation of a calibration panel of FMDV standards, which are used as non-inactivated suspensions of FMDV with titers: 10 0 , 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 TCD 50 / cm 3 (positive controls), as well as a cell suspension from pig kidney IB-RS-2, not infected with FMD virus (negative control); - выделение РНК вируса ящура из неинактивированного сырья для вакцины, образцов отрицательного и положительных контролей;- Isolation of FMD virus RNA from non-inactivated vaccine raw materials, negative and positive control samples; - добавление элюатов РНК вируса ящура к смеси компонентов для проведения реакции амплификации РНК в соотношении 1:5;- addition of FMD virus RNA eluates to the mixture of components for carrying out the RNA amplification reaction in a ratio of 1: 5; - проведение реакции амплификации РНК с последующей детекцией РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного детектора, анализ полученных данных;- carrying out the RNA amplification reaction with subsequent detection of RNA amplicons using a fluorescent detector, analysis of the data obtained; - определение величины порогового цикла амплификации РНК;- determination of the value of the threshold cycle of RNA amplification; - установление зависимости между пороговым циклом амплификации РНК и титром вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины в виде показательной функции с основанием 10;- establishing the relationship between the threshold cycle of RNA amplification and the titer of the FMD virus in non-inactivated raw materials for the vaccine in the form of an exponential function with a base 10; - оценка величины эффективности реакции амплификации (Е) и достоверности аппроксимации (R2);- evaluation of the magnitude of the effectiveness of the amplification reaction (E) and the reliability of the approximation (R 2 ); - на основании установленной в реакции амплификации РНК величины порогового цикла амплификации (Ct) рассчитывают значение титра вируса ящура (ТВЯ) в образцах ненактивированного сырья для противоящурной вакцины с применением разработанной математической модели: - on the basis of the threshold amplification cycle value (C t ) established in the RNA amplification reaction, the value of the FMD virus titer (T VV ) in samples of non-activated raw materials for FMD vaccine is calculated using the developed mathematical model:
Figure 00000018
Figure 00000018
 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения реакции амплификации РНК включает в свой состав следующие компоненты: Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-, и Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймеры и флуоресцентно-меченый молекулярный бикон 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3 (каждый) - по 15 пМ, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) и рибонуклеозидтрифосфатов (каждый) - по 0,25 мМ, MgCl2 - 12 мМ, буферный раствор (×10) - 10% от объема реакционной смеси, AMV-ревертаза - 10 ед., РНКаза Н Е. coli - 10 ед., Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза - 10 ед.2. The method according to claim 1, characterized in that the mixture of components for carrying out the RNA amplification reaction includes the following components: Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-, and Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV- primers and fluorescently labeled molecular beacon 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5 / BHQ3 (each) - 15 pM each, a mixture of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP) and ribonucleoside triphosphates (each) - 0.25 mM each, MgCl 2 - 12 mM, buffer solution (× 10) - 10% of the volume of the reaction mixture, AMV-revertase - 10 units, E. coli RNase H - 10 units, T7 DNA-dependent RNA polymerase - 10 units. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию амплификации РНК проводят с соблюдением следующих режимов:3. The method according to claim 1, characterized in that the RNA amplification reaction is carried out in compliance with the following regimes: - стадия плавления РНК: 65°С в течение 5 мин (1 цикл);- stage of RNA melting: 65 ° С for 5 min (1 cycle); - реакция амплификации РНК (отжиг прямого праймера, элонгация комплементарной ДНК, разрушение гибрида РНК/ДНК, отжиг обратного праймера, элонгация ДНК, активация промотора РНК-полимеразы и синтез РНК): 41°С в течение 3 мин (35 циклов).- RNA amplification reaction (annealing of the forward primer, elongation of complementary DNA, destruction of the RNA / DNA hybrid, annealing of the reverse primer, DNA elongation, activation of the RNA polymerase promoter and RNA synthesis): 41 ° C for 3 min (35 cycles). 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра вируса ящура снижается до 2-3 ч.4. The method according to claim 1, characterized in that the analysis time of vaccinated suspensions to determine the titer of the foot and mouth disease virus is reduced to 2-3 hours. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличивается степень чистоты РНК вируса ящура за счет применения латексных частиц белого цвета диаметром 300 нм в присутствии 3М гуанидин-HCl.5. The method according to claim 1, characterized in that the degree of purity of the FMD virus RNA is increased by using white latex particles with a diameter of 300 nm in the presence of 3M guanidine-HCl. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ по определению титра вируса ящура предполагает применение молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine5 и неизлучающим тушителем свечения BHQ3 (Black Hole Quencher-3).6. The method according to claim 1, characterized in that the analysis to determine the titer of the foot and mouth disease virus involves the use of a molecular beacon labeled with a maleimide fluorophore Cyanine5 and a non-emitting luminescence quencher BHQ3 (Black Hole Quencher-3).
RU2020136076A 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology RU2756557C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020136076A RU2756557C1 (en) 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020136076A RU2756557C1 (en) 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2756557C1 true RU2756557C1 (en) 2021-10-01

Family

ID=78000021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020136076A RU2756557C1 (en) 2020-11-02 2020-11-02 Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2756557C1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4253560A1 (en) * 2022-03-31 2023-10-04 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Enhanced detection of single-stranded nucleic acids using fokl-assisted digestion
RU2817382C1 (en) * 2023-08-15 2024-04-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Test system for quantitative detection of antibodies against 146s component of foot-and-mouth disease virus genotype o/ea-3 in animal blood serum based on liquid-phase enzyme immunoassay

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015082570A1 (en) * 2013-12-03 2015-06-11 Hookipa Biotech Ag Cmv vaccines
RU2674076C1 (en) * 2017-12-25 2018-12-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Method for determining the infectivity titer of the fmd virus in non-inactivated raw materials for vaccines using the method of reverse transcription-polymerase chain reaction in real time

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015082570A1 (en) * 2013-12-03 2015-06-11 Hookipa Biotech Ag Cmv vaccines
RU2674076C1 (en) * 2017-12-25 2018-12-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Method for determining the infectivity titer of the fmd virus in non-inactivated raw materials for vaccines using the method of reverse transcription-polymerase chain reaction in real time

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
БОЛЕЗНИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ВСЕХ ИЛИ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ - ЯЩУР, МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫДЕЛЕНИЮ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА ЯЩУРА, ОДОБРЕНЫ И РЕКОМЕНДОВАНЫ 15 октября 1973 г., б/н. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4253560A1 (en) * 2022-03-31 2023-10-04 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Enhanced detection of single-stranded nucleic acids using fokl-assisted digestion
WO2023187193A1 (en) * 2022-03-31 2023-10-05 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Enhanced detection of single-stranded nucleic acids using foki-assisted digestion
RU2817382C1 (en) * 2023-08-15 2024-04-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Test system for quantitative detection of antibodies against 146s component of foot-and-mouth disease virus genotype o/ea-3 in animal blood serum based on liquid-phase enzyme immunoassay
RU2823765C1 (en) * 2023-08-29 2024-07-29 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Method for indirect determination of number of colony-forming units of mycoplasma arginini using quantitative hybridization-fluorescence detection and quantitative assessment cycle of amplification reaction

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sykes et al. Detection of feline calicivirus, feline herpesvirus 1 and Chlamydia psittaci mucosal swabs by multiplex RT-PCR/PCR
CN107868816B (en) Method for determining the amount of a nucleic acid of interest in an untreated sample
JP2006516193A (en) Rapid identification of pathogens in humans and animals
JP2006508696A (en) Rapid identification of pathogens in humans and animals
WO2021046278A1 (en) Systems, methods, and compositions for the rapid early-detection of host rna biomarkers of infection and early identification of covid-19 coronavirus infection in humans
CN103045755A (en) Fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) method, primer and kit for detecting EBOV (Ebola virus)
CN115852055A (en) Universal fluorescent quantitative RT-PCR primer for pangolin pestivirus and detection method thereof
Hiney et al. Validation of polymerase chain reaction-based techniques for proxy detection of bacterial fish pathogens: framework, problems and possible solutions for environmental applications
Viedma et al. Optimization of qRT-PCR assay for zika virus detection in human serum and urine
RU2756557C1 (en) Method for indirect identification of the fmd virus titer in non-inactivated raw materials for a vaccine during amplification of viral nucleic acid and detection of rna amplicons applying the molecular beacon technology
CN103045754A (en) One-step process real-time fluorescent quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) method and kit for detecting Z/S subtype ebola viruses
CN111206122A (en) Novel coronavirus nucleic acid detection kit
JP2016019495A (en) Nucleic acid amplification technique
CN109628640B (en) RPA-LFD primer, method and kit for rapidly detecting spring viremia of carp virus
Chen et al. Sensing platform for nucleic-acid detection based on a 2-aminopurine probe sheared by trans-cleavage activity of the CRISPR/Cas12a system
Liu et al. Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Batai virus in cattle and mosquitoes
RU2761535C1 (en) Method for indirect determination of the number of infectious doses of rabies virus strain pb -97 in raw materials for attenuated rabies vaccine by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time
RU2756472C1 (en) Method for mediated determination of the infectious titer of the rabies virus in non-inactivated raw materials for rabies vaccines in transcriptional amplification and detection of reaction products using the beacon technology
KR20230097514A (en) Composition For Detecting White Spot Syndrom Virus and Method of Detecting White Spot Syndrom Virus Using the Same
WO2013090613A1 (en) Compositions and methods for functional quality control for human blood-based gene expression products
CN111778343A (en) Primer pair and kit for detecting Brucella S2 vaccine strain and application of primer pair and kit
RU2809221C1 (en) Method for indirect determining of the titer of infectious activity of feline calicivirus in raw materials for vaccine using real-time pcr
RU2812858C1 (en) Method of indirect determination of titer of infectious activity of canine mastadenovirus in raw materials for vaccines using real-time pcr
RU2823930C1 (en) Method for indirect determination of concentration of a-antigen of industrial strain "vgnki" of causative agent of infectious hepatitis of dogs in raw material for cultural vaccines according to quantitative assessment cycle during amplification of target region of orf25-gene
RU2755925C1 (en) Method for mediated determination of the titer of infectious activity of the rabies virus of the arriah strain in raw materials for an inactivated rabies vaccine by means of pcr in real time