RU2751248C2 - Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena - Google Patents
Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena Download PDFInfo
- Publication number
- RU2751248C2 RU2751248C2 RU2019140937A RU2019140937A RU2751248C2 RU 2751248 C2 RU2751248 C2 RU 2751248C2 RU 2019140937 A RU2019140937 A RU 2019140937A RU 2019140937 A RU2019140937 A RU 2019140937A RU 2751248 C2 RU2751248 C2 RU 2751248C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- monilinia
- species
- primers
- dna
- laxa
- Prior art date
Links
- 241001518729 Monilinia Species 0.000 title claims abstract description 38
- 241000862466 Monilinia laxa Species 0.000 title abstract description 9
- 241001518836 Monilinia fructigena Species 0.000 title abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 25
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 101150034285 cytB gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 241000770646 Monacha fruticola Species 0.000 description 4
- 241001518731 Monilinia fructicola Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 3
- 101100275988 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis cyt2Ba1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100007933 Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis cyt2Aa1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150001086 COB gene Proteins 0.000 description 3
- 101100139611 Corynebacterium diphtheriae (strain ATCC 700971 / NCTC 13129 / Biotype gravis) qcrB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 3
- 244000007021 Prunus avium Species 0.000 description 3
- 235000010401 Prunus avium Nutrition 0.000 description 3
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 101150017854 petB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 244000233576 Feijoa sellowiana Species 0.000 description 2
- 235000012068 Feijoa sellowiana Nutrition 0.000 description 2
- 235000017784 Mespilus germanica Nutrition 0.000 description 2
- 244000182216 Mimusops elengi Species 0.000 description 2
- 235000000560 Mimusops elengi Nutrition 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 2
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 2
- 244000277586 Prunus pissardii Species 0.000 description 2
- 235000009836 Prunus pissardii Nutrition 0.000 description 2
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 2
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 2
- 235000007837 Vangueria infausta Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000675108 Citrus tangerina Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000858267 Homo sapiens Cytochrome b Proteins 0.000 description 1
- 101710205162 Laccase-2 Proteins 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Substances ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 1
- 230000010244 detection of fungus Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к тест-системе для обнаружения ДНК фитопатогенных грибов рода Monilinia, содержащей олигонуклеотидные праймеры и зонд. Изобретение позволяет оперативно распознавать фитопатогены Monilinia laxa, Monilinia fruticola, Monilinia fructigena и может быть использовано для экспресс-диагностики и фитокарантинного контроля. 5 табл., 5 пр., 6 ил.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ выявления видов Monilinia laxa, М. fruticola, М. fructigena с помощью полимеразной цепной реакции. Способ предусматривает выделение ДНК, амплификацию участка гена cytB с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам гена cytB, идентичному у всех видов Monilinia, амплификацию участка района ITS2 с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам района ITS2 идентичному у всех видов царства Грибы и Растения, в качестве контроля выделения ДНК; и регистрацию процесса в «реальном времени» путем одновременного измерения интенсивности флуоресценции на нескольких длинах волн, соответствующих использованным красителям. Для определения видовой принадлежности Monilinia образцы положительные по накоплению флуоресценции в канале, соответствующем зонду cytB, подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. Способ позволяет проводить определение трех видов М. laxa, М. fruticola, М. fructigena. Способ может быть использован для оперативного распознавания фитопатогена, экспресс-диагностики и фитокарантинного контроля.
Уровень техники
Аналоги изобретения: CN106755476A, ЕР1157129А2, RU 2422533 С1
В настоящее время разработано несколько молекулярно-генетических методов для идентификации видов монилии на основе ПЦР. Большинство из них направлено на идентификацию М. fructicola от остальных видов монилии, как наиболее частого объекта карантинного контроля. Идентификация различных видов монилии проводится либо электрофоретически после моноплексных постановок со специфичными праймерами, либо после мультиплексирования нескольких пар праймеров в одной пробирке.
Рост флуоресценции может быть обеспечен двумя разными способами. Во-первых, используется неспецифический флуоресцентный краситель, который флуоресцирует при взаимодействии с двухцепочечной ДНК - например, SYBR. При накоплении в пробирке продуктов амплификации можно наблюдать рост флуоресценции за счет связывания красителя с двухцепочечной ДНК. Данный метод выявления Monilinia fructicola был предложен в статье (Luo et al. 2007). К сожалению данный метод не позволяет отличать специфичный продукт амплификации от неспецифичного, так как SYBR связывается с любой ДНК, накопление которой идет в ПЦР.
В статье (Papavasileiou et al. 2016) описан способ, который основан на интеркалирующем красителе, однако, позволяет идентифицировать разные виды Monilinia в одной пробирке. В данном способе используется амплификация участка гена сурВ с помощью праймеров, комплементарных идентичной последовательности для всех видов Monilinia. Амплификация проводится в присутствии интеркалирующего красителя SYTO 9 Green. После амплификации проводится съем «кривой плавления», которая представляет собой зависимость логарифма изменения флуоресценции от температуры образца. В момент расплавления ампликона происходит резкое падение флуоресценции, что отражается на графике в виде пика, максимальная точка которого отражает характерную температуру плавления ампликона. Разные длина ампликона и его нуклеотидный состав приводят к разной температуре плавления ампликона. Однако, данная методика сложно стандартизуется и мало подходит для рутинных диагностических работ в связи с вариативностью значения температуры плавления ампликона от состава буфера для проведения ПЦР, а также прибора, на котором проводится амплификация и алгоритма обсчета данных программным обеспечением прибора.
Второй способ детекции накопления ПЦР продукта основан на резонансном переносе энергии флуоресценции. В данном случае флуорофор и его «тушитель» находятся на одном зонде, комплементарном средней части амплифицируемого фрагмента. Когда Taq-полимераза разрушает зонд в ходе ПЦР реакции за счет экзонуклеазной активности, сопряженной с синтезом ДНК, флуоресцентная группа переходит в раствор и отдаляется от «тушителя». Данный способ позволяет повысить специфичность определения ПЦР-продукта за счет введения дополнительного специфичного олигонуклеотида - зонда Реализация данного метода в отношении выявления видов Monilinia предложена в статье (van Brouwershaven et al. 2010). Авторы сконструировали праймеры и зонды на основании последовательности ITS региона таким образом, что один набор праймеров/зондов работает только на ДНК М. fructicola, а другой работает на всех других видах Монилии. К сожалению, данный подход не позволяет провести видовую идентификацию М. laxa и М. fructigena, а также в системе не предусмотрен внутренний контроль амплификации, что может приводить к появлению ложноотрицательных результатов.
Также Taq-man-система идентификации видов Monilinia используется в патенте CN106755476A. Патент основан на уникальных последовательностях гена laccase 2 у разных видов Monilinia (6 видов). Для каждого вида подобраны специфичные праймеры и зонды. Однако в разработанной системе все зонды содержат один флуорофор, таким образом для каждого образца требуется постановка 6 реакций. Также в предлагаемой тест-системе нет внутреннего контроля, что может приводить к появлению ложноотрицательных результатов.
Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ, предложенный (С. Guinet et al. 2016). Данный метод основан на мультиплексной амплификации видоспецифичного маркера MO368 для трех видов Monilinia (laxa, fruticola, frutigena) с использованием зондов, несущих красители, флуоресцирующие в трех различных каналах. Также для внутреннего контроля используется ITS2 локус, консервативный для грибов и растений. Этот метод мог бы служить прототипом создания тест-системы для выявления Monilinia, однако, он не позволяет использовать его в лабораториях где нет приборов с возможностью регистрации флуоресценции в режиме реального времени или если есть прибор с возможностью регистрации флуоресценции в режиме реального времени только по двум каналам. Также использование трех пар праймеров и трех зондов значительно удорожает производство такой тест-системы.
Сущность изобретения
Технической задачей изобретения является разработка точного, быстрого и дешевого способа идентификации заражения растений грибами рода Monilinia, а также возможности видовой идентификации для трех видов Монилии (М. laxa, М. fruticola, М. frutigena).
Техническим результатом, достигаемым при использовании способа, является:
• Прямое распознавание патогена и 100% специфичность анализа независимо от присутствия других возбудителей в пробах
• Возможность различать три вида Monilinia (М. laxa, М. fruticola, М. frutigena)
• Наличие внутреннего контроля для отслеживания качества выделения ДНК из образца
• Диагностика заболевания на начальных стадиях (чувствительность не менее 1 нг)
• Скорость выполнения анализа в течении 1 рабочего дня (возможность детекции в реальном времени)
• Доступность проведения анализа для лабораторий без возможности детекции результатов в режиме реального времени
• Снижение стоимости производства набора для детекции трех видов Monilinia.
Поставленная техническая задача достигается тем, что:
1) подбор праймеров и зондов для ДНК-тестирования осуществлялся таким образом, чтобы они были комплементарны области 100% гомологии гена cytB среди всех видов Monilinia и значительно отличалась от других видов грибов;
2) подбор праймеров для ДНК-тестирования осуществлялся таким образом, чтобы получаемый амплификационный фрагмент имел разную длину для разных видов Monilinia
3) для внутреннего контроля использовались праймеры для ITS2 локуса, консервативного для грибов и растений (G. Zhou et al.)
Предлагаемый способ заключается в том, что для выявления наличия Монилии анализируемую ДНК подвергают ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам гена cytB идентичному у всех видов Монилии (фиг. 1), а также двух праймеров и олигонуклеотидного зонда, 5'- и 3'-концы которого связаны с парой флуоресцентный краситель/«тушитель», комплементарных участкам района ITS2 идентичному у всех видов царства Грибы и Растения, в качестве контроля выделения ДНК (табл. 1).
Длительность анализа занимает 1,5 часа рабочего времени. Предлагаемый способ применим для образцов ДНК, выделенных из разных источников (плоды, листья, чистые культуры) и разными способами (СТАВ-хлороформной экстракции, сорбции на силикагеле). Для определения видовой принадлежности Монилии образцы положительные по накоплению флуоресценции в канале, соответствующем зонду cytB, подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. Способ позволяет проводить определение трех видов Monilinia: laxa, fruticola, fructigena по различию в электрофоретической подвижности за счет различной длины продуктов амплификации (табл. 2).
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1. Для детекции результатов ПЦР используется только две пары праймеров и два зонда (включая внутренний контроль), что удешевляет использование метода
2. Для выявления различных видов Монилии используется форезная детекция, основанная на разной длине амплификационного продукта, что позволяет проводить детекцию и при отсутствии возможности проведения «ПЦР в реальном времени».
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 представлено расположение праймеров и зонда для выявления монилии. Область комплементарная последовательностям праймеров и зонда показана черным прямоугольником (А. прямой праймер, Б. зонд, В. Обратный праймер). Нижние три строки - другие виды фитопатогенных грибов.
На фиг. 2 показаны кривые накопления флуоресценции в образцах, выделенных из чистых культур различных видов Monilinia. (канал Fam - праймеры и зонд Mon-cytB, канал Hex - праймеры и зонд FP-ITS2(внутренний контроль).
На фиг. 3 представлены результаты электрофореза: 1 - М. laxa; 2 - М. fructicola; 3 - М. fructigena; М - маркер молекулярной массы (100 п.н).
На фиг. 4 представлен пример кривых накопления флуоресценции для разных концентраций ДНК М. laxa.
На фиг. 5 показана встречаемость различных видов Monilinia на плодах и деревьях Черноморского побережья и Абхазии.
На фиг. 6 Представлено филогенетическое древо для участка гена CYTB (жирным выделены виды, полученные в нашем исследовании).
Осуществление изобретения.
Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами выполнения способа:
Пример 1. Идентификация грибов рода Монилия (Monilinia) с помощью предложенного способа по ДНК, выделенной из чистых микробиологических культур.
Выделение изолятов грибов в чистую культуру проводили из пораженных монилиозом плодов и плодовых образований. Для выделения чистой культуры патогенного гриба мы использовали агаризованную синтетическую среду Чапека, в состав которой входят такие компоненты, как: MgSO4, безводный K3PO4, KCl, Fe2(SO4)3, NaNO3, декстроза, агар, дистиллированная вода. Моноспоровые изоляты грибов культивировали при комнатной температуре (22°С) в течении 3-5 дней.
Выделение ДНК из полученных чистых культур проводили с использованием коммерческого набора «Проба-НК» (ДНК-Технология, Россия) согласно инструкциям производителя. В качестве материала для выделения отделяли с помощью скальпеля часть мукора гриба с чашки. Степень очистки выделенных препаратов ДНК и их концентрацию определяли спектрофотометрическим методом на анализаторе NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Для оценки качества (содержания примесей) препарата нуклеиновых кислот используют отношение А260/А280, которое для чистого препарата ДНК приблизительно равно 1,8.
ПЦР в режиме реального времени проводили в суммарном объеме смеси 25 мкл. Стандартная реакционная смесь содержала 10 нг ДНК-матрицы, 1x qPCRmix-HS (Евроген, Россия), 10 пкмоль каждого праймера и 10 пкмоль флуоресцентного зонда. Амплификацию и учет уровня флуоресценции проводили в амплификаторе «"QuantStudio® 3 Real-Time PCR System"» (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США) (табл. 3).
Реакционную ПЦР смесь, содержащую продукты амплификации, подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле при постоянном напряжении 5 В/см в буфере 1x ТАЕ. Гель окрашивали интеркалирующим красителем SYBR® Safe и визуализировали в УФ свете с использованием гель-документирующей системы ChemiDoc XRS+ (BioRad, США).
Пример 2. Определение чувствительности.
Для определения аналитической чувствительности разработанных праймеров и зонда были получены серийные 5-ти кратные разведения препарата ДНК. Для воспроизводимости определения показателя чувствительности данный эксперимент был повторен дважды (табл. 4).
ПЦР в режиме реального времени проводили в суммарном объеме смеси 25 мкл. Стандартная реакционная смесь содержала 10 нг ДНК-матрицы, 1x qPCRmix-HS (Евроген, Россия), 10 пкмоль каждого праймера и 10 пкмоль флуоресцентного зонда. Амплификацию и учет уровня флуоресценции проводили в амплификаторе «ДТ» (ДНК-технологии, Россия). Детекция уровня флуоресценции проводилась по каналу FAM.
Было показано, что минимальное количество ДНК, которое способны выявлять разработанные праймеры и зонд составило 0,08 нг на реакцию.
Пример 3. Определение специфичности.
Анализ специфичности проводился на панели образцов плодов, зараженных различными фитопатогенами грибковой и бактериальной природы (табл. 5).
Пример 4. Выявление грибов рода Монилия (Monilinia) с помощью разработанной тест-системы на растениях Черноморского побережья России и Абхазии.
В исследовании было проанализировано 106 образцов различных частей растений, с подозрением на заражение монилиозом по визуальным признакам. Сбор образцов проводился на территориях Сочинского, Туапсинского, Апшеронского и Крымского районов Краснодарского края, а также на территории черноморского побережья Абхазии. Среди исследуемых плодовых культур были яблоня, персик, слива, абрикос, черешня, груша, алыча, фейхоа, мандарины и мушмула.
Гомогенизацию исследуемых плодов проводили путем их растирания в фарфоровых ступках с 300 мкл стерильного физраствора. Выделение ДНК проводили с использованием набора «Проба-НК» (ДНК-технологии, Россия) согласно инструкции производителя.
ПЦР в режиме реального времени проводили в суммарном объеме смеси 25 мкл. Стандартная реакционная смесь содержала 10 нг ДНК-матрицы, 1x qPCRmix-HS (Евроген, Россия), 10 пкмоль каждого праймера. Амплификацию и учет уровня флуоресценции проводили в амплификаторе «ДТ» (ДНК-технологии, Россия). Видовую идентификацию выявленных изолятов грибов рода Monilinia проводили определением длины наработанных ампликонов. Разделение ампликонов проводилось электрофорезом в 2% агарозном геле.
По результатам ПЦР с использованием разработанных праймеров нами было выявлено 25 образцов (23%), содержащих ДНК монилий. На черноморском побережье Краснодарского края и Абхазии монилиоз, согласно данным исследования, может поражать яблоню, персик, сливу, мушмулу, алычу и черешню. Наиболее часто монилиозами инфицированы слива, персик и черешня. Исследованные образцы абрикоса, груши и фейхоа генетического материала монилии не содержали, что вероятнее всего связано с небольшой по объему выборкой данных видов плодов.
Пример 5. Определение нуклеотидных последовательностей и видовой принадлежности исследованных грибов рода Монилия (Monilinia).
Для подтверждения правильности видового определения обнаруженных грибов рода Monilinia было проведено секвенирование некоторых ампликонов методом Сенгера (секвенирование было проведено в ЦКП Геномика СО РАН, ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). По полученным нуклеотидным последовательностям была, построена дендрограмма с использованием метода максимального правдоподобия (2-х параметрическая модель Кимуры, индекс поддержки ветвей рассчитан для 500 реплик (бутстреп анализом). Все определенные виды, кластеризовались в одни клады с такими же видами из других источников, что свидетельствует о правильности проведенной видовой идентификации.
--->
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:1 ggaaggtgagtaggaaatacaga
SEQ ID NO:2 gtatagaaagcaattaaataacagatgt
SEQ ID NO:3 agttccgttaaatggataggtt
<---
Claims (1)
- Тест-система для обнаружения ДНК фитопатогенных грибов рода Monilinia методом полимеразной цепной реакции, содержащая олигонуклеотидные праймеры, имеющие следующую структуру: SEQ ID NO: 1 5'-ggaaggtgagtaggaaatacaga-3' и SEQ ID NO: 2 5'-gtatagaaagcaattaaataacagatgt-3', соответствующие последовательности гена ITS2 идентичному у всех видов царства Грибы и Растения, и зонд SEQ ID NO: 3 5'-agttccgttaaatggataggtt-3', комлементарный участку гена cytB, идентичному у всех видов рода Monilinia.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019140937A RU2751248C2 (ru) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019140937A RU2751248C2 (ru) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019140937A RU2019140937A (ru) | 2021-06-09 |
| RU2019140937A3 RU2019140937A3 (ru) | 2021-06-09 |
| RU2751248C2 true RU2751248C2 (ru) | 2021-07-12 |
Family
ID=76296752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019140937A RU2751248C2 (ru) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2751248C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101857894A (zh) * | 2009-04-10 | 2010-10-13 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及方法 |
| RU2465332C1 (ru) * | 2011-08-08 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лесная диагностика" | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней лиственных пород - гриба polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции |
| CN106755476A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-31 | 中国农业大学 | 用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
-
2019
- 2019-12-09 RU RU2019140937A patent/RU2751248C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101857894A (zh) * | 2009-04-10 | 2010-10-13 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及方法 |
| RU2465332C1 (ru) * | 2011-08-08 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лесная диагностика" | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней лиственных пород - гриба polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции |
| CN106755476A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-31 | 中国农业大学 | 用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GUINET C. et al., One-Step Detection of Monilinia fructicola, M. fructigena, and M. laxa on Prunus and Malus by a Multiplex Real-Time PCR Assay, Plant Dis., 2016, Volume 100, Issue 12, pp. 2465-2474. * |
| GUINET C. et al., One-Step Detection of Monilinia fructicola, M. fructigena, and M. laxa on Prunus and Malus by a Multiplex Real-Time PCR Assay, Plant Dis., 2016, Volume 100, Issue 12, pp. 2465-2474. WANG J. et al., Detection and Identification of Six Monilinia spp. Causing Brown Rot Using TaqMan Real-Time PCR from Pure Cultures and Infected Apple Fruit, Plant Dis., 2018, Volume 102, Issue 8, pp. 1527-1533. * |
| WANG J. et al., Detection and Identification of Six Monilinia spp. Causing Brown Rot Using TaqMan Real-Time PCR from Pure Cultures and Infected Apple Fruit, Plant Dis., 2018, Volume 102, Issue 8, pp. 1527-1533. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019140937A (ru) | 2021-06-09 |
| RU2019140937A3 (ru) | 2021-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| US20180195111A1 (en) | 16s ribosomal rna universal primers and use thereof in microbiological analysis and diagnostics | |
| US20070072212A1 (en) | Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material | |
| AU2020102244A4 (en) | Primer group, kit and detection method for rapidly detecting carbapenemases genes | |
| CN113201594A (zh) | 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法 | |
| CN111440886A (zh) | 一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法 | |
| Ishii et al. | PCR primers for assessing community structure of aquatic fungi including Chytridiomycota and Cryptomycota | |
| RU2612137C1 (ru) | Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica | |
| RU2332464C1 (ru) | Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба | |
| RU2751248C2 (ru) | Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena | |
| CN107849566B (zh) | 用于检测白粉病的方法和试剂盒 | |
| WO2014189398A1 (en) | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by pcr, primers as well as bacteria and fungi detection kit | |
| RU2550257C2 (ru) | СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПИЧНЫХ И АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ Yersinia pestis СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ | |
| Castanha et al. | Strain discrimination among B. anthracis and related organisms by characterization of bclA polymorphisms using PCR coupled with agarose gel or microchannel fluidics electrophoresis | |
| US6518020B1 (en) | Haemobartonella PCR methods and materials | |
| RU2644236C1 (ru) | Способ генетического типирования штаммов yersinia pestis и yersinia pseudotuberculosis на основе анализа 13 vntr локусов в мультиплексной пцр реакции | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| RU2478717C1 (ru) | Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 | |
| US20020086313A1 (en) | Application of bioinformatics for direct study of unculturable microorganisms | |
| RU2583924C1 (ru) | СПОСОБ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-ДЕТЕКЦИИ Atopobium vaginae, Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens И Eggerthella spp. В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | |
| RU2755690C1 (ru) | Способ детекции генов метициллин-резистентности mecA и mecC у стафилококков | |
| RU2486252C1 (ru) | СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica | |
| KR102492587B1 (ko) | Ganoderma 속 미생물 검출 및 뿌리 썩음병 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 방법 | |
| US20050048524A1 (en) | Molecular biological identification techniques for microorganisms |